CN101405320B - 含有交联聚合物的微粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有交联聚合物的微粒，所述聚合物由式(I)所表示的可交联化合物组成，其中，X是多官能可自由基聚合化合物(具有至少等于n的官能度)的残基；各个Y独立地存在或不存在，如果存在的话，各个Y独立地代表选自O、S、NR0的片段；各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N，具体地，各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的烷基，所述烷基可选包含一个或多个杂原子，具体地，一个或多个杂原子选自P、S、O和N；各个Z独立地选自O和S；各个R1独立地选自被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N；各个R2独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N，具体地，各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的烷基，所述烷基可选包含一个或多个杂原子，具体地，一个或多个杂原子选自P、S、O和N；且n至少为2；各个R3选自氢、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOC4H9。

Description

含有交联聚合物的微粒
本发明涉及一种含有交联聚合物的微粒，涉及一种用于制备此类微粒的方法以及所述微粒的用途。
WO98/22093中描述了含有交联聚合物的球形微粒(微球)。该微球可用作可释放化合物(药物)的输送体系。该文献提到用于制备粒子的可交联聚合物并不是最重要的。在这篇文献中涉及的合适聚合物是可交联的水溶性右旋糖苷、衍生的右旋糖苷、淀粉、淀粉衍生物、纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、蛋白质和衍生的蛋白质。
这种微球的缺点在于，交联聚合物的孔尺寸必需小于可释放化合物的粒子尺寸。因此，在微球制成后，该微球不能加载可释放化合物。因此，先制备没有可释放化合物的微球母料，稍后再确定哪种可释放化合物包含在微球中就不可行了。
然而，人们希望能够稍后加载微粒，原因在于，这允许放大粒子的制备工艺规模从而得到大批量的粒子，如果需要的话，可以在所述微粒的不同部分以为了特定目的的有效量加载不同的活性试剂。而且，希望能够稍后加载微粒，以防由微粒释放出的试剂在粒子的制备过程中受到不利影响，例如降解、变性或以其它方式失活。
US-B-6228423描述了含有非交联可生物降解聚酯的微粒。所述聚酯的侧链上含有氨基。这种微粒可用作能够引起免疫响应的生物活性材料的载剂。
而且US2005/0013869公开了一种微粒，其可用于治疗用活性化合物的缓释配制品。该微粒包括非交联可生物降解聚合物，具体是聚酯、聚(磷酸酯)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)或其混合物。所述治疗用活性化合物是氨基甲酸盐，其是有效的AChE抑制剂或结合剂。
已报道了由于剧烈加工(例如冷冻干燥)的影响已知微粒的性质会受到不利影响。尤其在医药应用中，具体在药物释放应用中，经药物加载的微粒的良好的储存稳定性很重要。用于获得具有长期产品稳定性的药物释放体系的合适方法是冻干(冷冻-干燥)。
为了克服受到不利影响的微粒所具有的上述问题，使用防冻剂以保持原有的微粒特征，例如尺寸和形状(参见，Saez等的European Journal ofPharmaceutics or Biopharmaceutics50(2000)379-387，Chacon等的EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences，8(1999)99-107)。
对于替代性的或性质改进的含有交联聚合物的微粒具有持续的需求。具体地，希望得到一种含有交联聚合物的微粒，其可以在剧烈的加工条件下被适当地加工，而将其损害至不可接受程度的风险较低。剧烈加工条件具体意指，促使被处理的粒子遭受物理冲击(physical shock)的条件，诸如在冷冻干燥过程中所发生的温度(快速)变化(例如变化为至少每秒1℃)或者例如在(重复)的加压和/或卸压过程中压力突然变化。例如，在造粒机中，使用的压力为每cm2每秒0.5T。
进一步希望得到一种含有交联聚合物的微粒，其可以在微粒形成过程中和/或在制备微粒以后被适当地加载诸如生物活性试剂的活性物质。
因此，本发明的目的在于提供一种新型的微粒，其至少可以作为已知微粒的替代品。具体地，本发明的目的在于提供一种微粒，其具有有利的性质，诸如对物理冲击具有良好的承受能力。
而且，本发明的目的在于提供一种可被有效加载活性试剂的微粒。
本发明的另一个目的在于提供一种具有一个或多个本文如下所指出的其它有利性质的微粒。已发现提供了一种含有交联聚合物的微粒，所述聚合物由下式所表示的可交联化合物组成：
Figure G200780010215XD00021
     式I
其中：
X是多官能可自由基聚合化合物(具有至少等于n的官能度)的残基；
各个Y独立地存在或不存在，如果存在的话，各个Y独立地代表选自O、S、NR0的片段；
各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N，具体地，各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的烷基，所述烷基可选包含一个或多个杂原子，具体地，一个或多个杂原子选自P、S、O和N；
各个Z独立地选自O和S；
各个R1独立地选自被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N；
各个R2独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N，具体地，各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的烷基，所述烷基可选包含一个或多个杂原子，具体地，一个或多个杂原子选自P、S、O和N；
n至少为2；
各个R3选自氢、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOC4H9。
具体地，R0是氢或含有至多12个碳的烃。R0可以是氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基。R0还可以是被取代的或未被取代的环烷基，更具体地可以是被取代的或未被取代的C1-C3烷基或氢。环烷基可以是环戊基、环己基或环庚基。所述烷基可以是线性烷基或支化烷基。优选的支化烷基是叔丁基。
可选地，R0可以包括碳碳双键或三键，例如R0可以包括-CH＝CH2基团。
R0可以包括杂原子，例如为酯片段，诸如为-(C＝O)-O-(CH2)i-CH3或-(C＝O)-O-(CH2)i-CH＝CH2，其中i是整数，通常在0-8的范围内，优选在1-6的范围内。杂原子还可以是酮片段，诸如为-(C＝O)-(CH2)i-CH3或-(C＝O)-(CH2)i-CH＝CH2，其中，i是整数，通常在0-8的范围内，优选在1-6的范围内。含有杂原子的R0基团优选包括NR’R”基团，其中，R’和R”各自独立地是氢或烃基，具体是C1-C6烷基。
更优选地，R0是氢或烷基。还要更优选地，R0是氢或甲基。
优选地，R1包括1-20个碳原子。更优选地，R1是被取代地或未被取代地C1-C20亚烷基，具体地是被取代的或未被取代的C2-C14亚烷基。R1可以包括芳族片段，诸如为邻亚苯基、间亚苯基或对亚苯基。芳族片段可以未被取代，或被例如酰胺取代，例如乙酰胺。
R1可以包括-(O-C＝O)-、-(N-C＝O)、-(O-C＝S)-官能团。R1还可以包括脂环族片段，例如亚环戊基、亚环己基或亚环庚基片段，上述片段可选包括一个或多个杂原子，例如N-基和/或酮基。
可选地，R1包括碳碳双键或三键，具体地，R1可以包括-CH＝CH2基团。在优选的实施方式中，R1选自-CH2-CH2-O-C(O)-、-CH2-CH2-N-C(O)-或-CH2-CH2-O-C(S)-。
R2例如是氢或含有至多12个碳的烃。具体地，R2可以是氢、被取代的或未被取代的C1-C6烷基，更具体地可以是被取代的或未被取代的C1-C3烷基。可选地，R2包括碳碳双键或三键，具体地，R2可以包括-CH＝CH2基团。n优选为2-8。
R3优选为氢。
R0、R1和/或R2上的取代基例如可以选自氢原子和羟基。优选的取代基是羟基。具体地，R1为-CH2OH基团，因为这种化合物可商购。
聚合物通常由式I所示的化合物通过乙烯基键的反应交联得到。
附图说明
图1是本发明的微粒的SEM照片。
图2是本发明的多个微粒的尺寸分布。
图3是采用药物加载的本发明的微粒的释放谱图。
优选地，在交联聚合物是氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲基或酰胺共聚物的情况下，微粒(可以是微球)是硬质的，但仍然是具有弹性的。考虑到允许在诸如压力突然变化、高温、低温和/或高剪切条件的剧烈条件下进行加工，这是相当有益的。
本发明的微粒对于温度突然降低具有良好的承受能力，例如在冻干微粒时会出现这种温度突然降低的情况。
在优选的实施方式中，本发明的微粒甚至基本上不含防冻剂。防冻剂是一种保护微粒材料免于受到冷冻损害(由于形成冰而造成的损害)的物质。防冻剂的实例包括二醇，例如乙二醇、丙二醇和丙三醇或二甲基亚砜(DMSO)。
进一步发现本发明的微粒对加热具有良好的承受能力，例如在120℃以上的温度下对该粒子消毒的情况下或者在高温(例如高于100℃的温度下)下采用活性物质加载该粒子的情况下会出现这种加热的情况。
本发明的微粒可被用作活性试剂的输送体系，所述活性试剂具体为药物、诊断助剂或成像助剂。还可以采用高压使所述微粒填充胶囊或导管，或者所述微粒可被压缩成小球，而基本上不会对所述微粒造成损害。所述微粒还可以采用可注射形式或可喷射形式被用作自由形式的悬浮液或原位形成凝胶配制品。而且，所述微粒可以掺入例如(快速成型的)支架、涂层、贴剂、复合材料、凝胶或软膏中。
本发明的微粒可被注射、喷射、植入或吸入。
式I中的Y任选地存在，如果存在的话，各个Y独立地代表选自O、S和NR0的片段。
式I中的X是多官能可自由基聚合化合物的残基，优选地，X是-OH、-NH2、-RNH或-SH多官能聚合物或低聚物的残基。具体地，多官能聚合物或低聚物选自生物稳定的或可生物降解的聚合物或低聚物，它们可以是天然的或合成的。
术语“可生物降解”指通过水解、通过酶作用或通过环境中存在的生物试剂(诸如细菌和真菌)的作用而发生降解的材料。上述降解可归因于微生物，并且/或者上述降解可以在动物体内或人体内发生。
术语“生物稳定”指在生物环境中基本上不会分解的物质，即植入体至少在植入体被植入的对象(特别是人)的通常寿命内不会明显分解。
可生物降解聚合物的实例是聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚二噁酮、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-聚二噁酮)、聚酸酐、聚(乙交酯-共-碳酸丙二酯)、聚(乙交酯-共-己内酯)、聚(碳酸丙二酯)、脂族聚酯、聚(原酸酯)、聚(羟基酸)、聚氨基-碳酸酯或聚(ε-己内酯)(PCL)。
生物稳定或合成聚合物的实例是聚(氨基甲酸乙酯)；聚(乙烯基醇)(PVA)；聚醚，诸如聚亚烷基二醇，优选聚(乙二醇)(PEG)；聚硫醚、芳族聚酯、芳族硫酯、聚氧化亚烷基(优选选自聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯))；泊洛沙姆(poloxamer)、美罗沙波(meroxapol)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚碳酸酯、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)。
天然聚合物的实例是多肽、多糖(例如聚蔗糖)、透明质酸、右旋糖苷及其衍生物、肝磷脂硫酸盐、软骨素硫酸盐、肝磷脂、海藻酸盐和蛋白质，诸如明胶、胶原质、清蛋白、卵清蛋白、淀粉、羧甲基纤维素或羟烷基化纤维素及其共聚低聚物、共聚物和共混物。
式I中的X可以根据其生物稳定性/生物降解性来选择。为了提供具有高生物稳定性的微粒，聚醚、聚硫醚、芳族聚酯或芳族硫酯通常特别合适。为了提供具有高生物降解性的微粒，脂族聚酯、脂族聚硫酯、脂族聚酰胺、脂族聚碳酸酯或多肽特别合适。优选地，X选自脂族聚酯、脂族聚硫酯、脂族聚硫醚、脂族聚醚或多肽。更优选的是含有PLA、PGA、PLGA、PCL和/或聚(氧化乙烯)-共-聚(氧化丙烯)嵌段共聚低聚物/共聚物的共聚物混合物。
将形成X的两个或多个不同片段进行组合可以调节粒子的降解速率和/或加载到所述粒子中或所述粒子上的活性试剂的释放速率，而不必改变粒子尺寸，当然如果希望的话可以改变粒子尺寸。形成X的两个或多个不同片段例如可以为共聚物或共聚低聚物(即含有两个或多个不同单体残基的聚合物或低聚物)。将形成X的两个或多个不同片段进行组合还可以改变加载能力，改变微粒的机械性质和/或亲水性/疏水性。
X片段的(数均)分子量通常被选定在100至100000g/mol的范围内。具体地，(数均)分子量可以为至少200、至少500、至少700或至少1000g/mol。具体地，(数均)分子量可以为至多50000或至多10000g/mol。在本发明中，(数均)分子量利用实施例中所述方法通过尺寸排斥色谱(GPC)来测定。
在优选的实施方式中，交联聚合物中的X片段以具有至少两个如下官能团的化合物为基础，所述官能团可以与异氰酸酯发生反应从而形成氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯或脲键。在这种实施方式中，式I具有Y基。X片段通常是具有最少两个反应性基团的聚合化合物或低聚化合物，所述反应性基团诸如为羟基(-OH)、氨基或硫醇基。
在另一实施方式中，X是含胺化合物的残基，从而提供烯酰基脲(alkenoyl urea)，即提供式X-(N-CO-NR-CO-CH＝CH2)n或X-(N-CO-NR-CO-C(CH3)＝CH2)n所表示的化合物。所述化合物的实例具体为聚(丙烯酰脲)、聚(甲基丙烯酰脲)或聚(丁烯酰脲)。本文中，各个R独立地表示烃基，如以上所述。
在另一实施方式中，X是含硫醇化合物的残基，从而提供式X-(S-C(S)-NH-苯基-CH＝CH2)2所代表化合物，诸如聚(氨甲酰基连二硫酸烷烯基)酯(poly(alkenyl carbamodithioic)ester)。
在另一实施方式中，X是含羧酸化合物的残基，从而提供式X-(C(O)-NR-C(O)-CH＝CH2)n所代表的化合物。本文中，各个R独立地表示烃基，如以上所述。所述化合物的实例为聚(甲基)-氧杂-丙烯酰胺。
本申请使用的术语“低聚物”意指基本上由少量如下单元组成的分子，所述单元实际上或在概念上由具有相对较低分子量的分子衍生。应当注意到，如果分子的性质随着一个或几个单元的去除而发生显著变化，那么该分子被认为具有相对中等的分子量。还应当注意到，如果一部分或者全部分子具有相对中等的分子量并且基本上包括少量实际上或在概念上由具有相对较低分子量的分子衍生的单元，那么该分子可被描述为低聚物或通过形容词形式使用的低聚物来描述。一般而言，低聚物的分子量大于200Da，例如大于400、800、1000、1200、2000、3000或大于4000。上限由聚合物质量的下限来限定(参见下段)。
相应地，术语“聚合物”表示基本上包括多个重复的如下单元的结构，所述单元实际上或在概念上由具有相对较低分子量的分子衍生。上述聚合物可以包括交联的网络、支化聚合物和线性聚合物。应当注意到，在一些情况下，尤其对于合成聚合物，如果一个或几个单元的添加或去除对分子性质的影响可忽略，那么该分子可被认为具有相对较高的分子量。上述声明不包括某些大分子的性质主要依赖于分子结构的细节的情况。还应当注意到，如果一部分或者全部分子具有相对较高的分子量并且基本上包括多个重复的实际上或在概念上由具有相对较低分子量的分子衍生的单元，那么该分子可被描述为大分子或聚合物，或通过形容词形式使用的聚合物来描述。一般而言，聚合物的分子量大于8000Da，例如大于10000、12000、15000、25000、40000、100000或大于1000000Da。
以各种不同方式对微粒进行了定义和分类，这依赖于所述微粒的特定结构、尺寸或组成，参见Encyclopaedia of Controlled drugdelivery Vol2M-Z Index，章节：Microencapsulation Wiley Interscience，从493页开始，具体参见第495页至496页。
本文使用的微粒包括微米尺寸或纳米尺寸的粒子，所述粒子通常由固体或半固体材料组成，并且能够承载活性试剂。通常，通过Fraunhofer理论以体积百分率计算的微粒的平均直径在10nm至1000μm的范围内。优选的平均直径依赖于所需用途。例如，在微粒被意欲用作可注射药物输送体系的情况下，具体被用作血管内药物输送体系时，理想的平均直径至多为10μm，具体为1-10μm。
平均直径小于800nm，具体为500nm或更小的微粒可用于细胞内目的。对于上述目的，平均直径优选为至少20nm或至少30nm。在其它应用中，需要较大的直径，例如在1-100μm或10-100μm范围内的直径。具体地，本文所用粒子直径是通过LST230系列的激光衍射粒子尺寸分析仪(Beckman Coulter)测定的直径，使用UHMW-PE(0.02-0.04μm)作为标样。由Fraunhofer衍射数据估算平均粒子尺寸分布，并以体积(％)表示。
如果粒子过小或者由于其光学性质不可通过光散射分析，那么可以使用扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)。
可以根据本发明制备数种类型的微粒结构。这些结构包括基本上均匀的结构，包括纳米球和微米球等。然而，在必须释放一种以上活性试剂的情况下，或者在需要一个或多个官能团的情况下，优选为微粒提供包括内部核和外部壳的结构。核/壳结构能够在例如不相容化合物的药物释放中或在成像中具有多种作用模式。在形成核后可以利用喷雾干燥器涂敷壳。核和壳可以包括相同的或不同的交联聚合物，这些交联聚合物具有不同的活性试剂。在这种情况下，可以以不同速率释放活性试剂。活性试剂仅存在于核中而壳由能够提供润滑性的交联聚合物组成的情况也是可以的。
在另一实施方式中，微粒可以包括如下结构，核包括本发明的交联聚合物，壳包括磁性材料或可磁化材料。
在另一实施方式中，微粒可以包括磁性或可磁化核，并且可以包括含有本发明的交联聚合物的壳。合适的磁性材料或可磁化材料是本领域已知的。上述微粒可用于能够被包括金属(具体为钢)的物体吸引，例如诸如移植物或支架的植入物体。上述微粒还可以进一步用于纯化或分析目的。
在另一实施方式中，所述微粒可以通过特定技术成像。合适的成像技术为MRI、CT、X射线。成像试剂可以掺入粒子内部或者偶联到粒子表面。上述粒子可用于使粒子在例如血液或细胞中如何迁移可见。合适的成形试剂例如为钆。
根据本发明的微粒可以承载一种或多种活性试剂。活性试剂可以或多或少地均匀分散在微粒中或微粒核中。活性化合物也可以存在于微粒壳中。
具体地，活性试剂可以选自营养品、医药品、蛋白质和肽、疫苗、遗传物质(诸如多核苷酸、寡核苷酸、质粒、DNA和RNA)、诊断试剂和成像试剂。诸如活性药理成分(API)的活性试剂可以具有任何类型的活性，这依赖于所需用途。
活性试剂能够刺激或抑制生物响应。活性试剂可以例如选自生长因子(VEGF、FGF、MCP-1、P1GF)、抗生素(例如盘尼西林类，诸如B-内酰胺、氯霉素)、消炎化合物、抗血栓化合物(antithrombogeniccompound)、抗跛行药物(anti-claudication drug)、抗心律失常药物、抗粥样动脉硬化药物、抗组胺剂、癌症药物、血管药物、眼科药物、氨基酸、维生素、激素、神经传递素、神经激素、酶、信号分子和精神药物。
具体活性试剂或药物的实例是神经药物(安非他明(amphetamine)、哌甲酯(methylphenidate))、α1肾上腺素受体拮抗剂(哌唑嗪(prazosin)、四唑嗪(terazosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、酮色林(ketenserin)、乌拉地尔(urapidil))、α2阻滞剂(精氨酸、***油)、降压药(氯压定(clonidine)、甲基多巴(methyldopa)、莫索尼定(moxonidine)、肼屈嗪(hydralazine)、米诺地尔(minoxidil))、缓激肽、血管紧缩素受体阻滞剂(苯那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazepril)、依拉普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)、群多普利(trandolapril)、佐酚普利(zofenopril))、血管紧缩素-1阻滞剂(坎地沙坦(candesartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、洛沙坦(losartan)、替米沙坦(telmisartan)、缬沙坦(valsartan))、肽链内切酶(奥帕拉特(omapatrilate))、β2激动剂(醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、噻利洛尔(celiprolol)、艾丝洛尔(esmodol)、美托洛尔(metoprolol)、萘必洛尔(nebivolol)、倍他洛尔(betaxolol))、β2阻滞剂(卡维地洛(carvedilol)、拉贝洛尔(labetalol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、吲哚洛尔(pindolol)、***(propanolol))、利尿剂(氯噻酮(chlortalidon)、***(chlorothiazide)、依匹噻嗪(epitizide)、氢***(hydrochlorthiazide)、吲哒帕胺(indapamide)、阿米洛利(amiloride)、氨苯蝶啶(triamterene))、钙通道阻滞剂(氨氯地平(amlodipin)、巴尼地平(barnidipin)、地尔硫卓(diltiazem)、非洛地平(felodipin)、依拉地平(isradipin)、拉西地平(lacidipin)、lercanidipin、尼卡地平(nicardipin)、硝苯地平(nifedipin)、尼莫地平、尼群地平(nitrendipin)、维拉帕米(verapamil))、抗arthymic活性剂(胺碘酮(amiodarone)、solatol、双氯酚酸(diclofenac)、依那普利(enalapril)、氟卡尼(flecainide))或环丙沙星(ciprofloxacin)、拉坦前列素(latanoprost)、氟氯西林(flucloxacillin)、雷帕霉素(rapamycin)及其类似物和limus衍生物、紫杉醇(paclitaxel)、泰素(taxol)、环孢霉素(cyclosporine)、肝磷脂、皮质类固醇(曲胺萘德(triamcinolone acetonide)、***(dexamethasone)、醋酸服轻松(fluocinolone acetonide))、拮抗剂(iRNA、VEGF拮抗剂：贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib))、生长因子、锌指纹转录因子、三氯沙(triclosan)、胰岛素、舒喘宁(salbutamol)、***、去甲斑蝥素(norcantharidin)、microlidil类似物、***素、他汀(statins)、软骨素酶(chondroitinase)、二酮哌嗪、大环化合物(macrocycli compounds)、neuregulins、骨桥素(osteopontin)、生物碱、免疫抑制剂、抗体、抗生物素蛋白、生物素、氯硝西泮(clonazepam)。
所述活性试剂可被输送用于局部输送或者作为术前或术后治疗剂用于处理疼痛、骨髓炎、骨肉瘤、关节感染、黄斑变性、糖尿病眼、糖尿病、牛皮癣、溃疡、动脉粥样硬化、跛行、血栓、病毒感染、癌症或用于治疗氙气。
根据本发明，如果存在活性试剂，那么一种或多种活性试剂在微粒中的浓度基于所述微粒的总重优选为至少5wt％，具体为至少10wt％，更具体为至少20wt％。正如所希望的，所述浓度可以高达90wt％，高达70wt％，高达50wt％或高达30wt％。
本发明的微粒可以使用的领域包括皮肤科、血管、整形外科、眼科、脊髓麻醉、肠内、肺部、鼻或耳等领域。
除了用在医药应用中以外，本发明的微粒还可以用在农业应用中。具体地，所述微粒可以包括杀虫剂或植物营养剂。
还可以通过至少为微粒的表面提供官能团，具体提供信号分子、酶或受体分子(诸如抗体)，来至少使所述微粒的表面官能化。所述受体分子可以例如为感兴趣组分的受体分子，该受体分子利用本发明的粒子被纯化或被检测(例如作为诊断测试的一部分)。合适的官能方法可以以本领域已知的方法为基础。具体地，受体分子可以通过残基X中的反应性片段结合到构成粒子的交联聚合物上。残基X中的反应性片段的实例是碳化二亚胺基团或琥珀酰胺基团。
如果所述微粒例如在X片段中包括例如-OH和/或-COOH基团，那么可以采用碳化二亚胺对上述-OH或-COOH基团进行官能化，所述碳化二亚胺可以进一步与待偶联到粒子上的目标官能片段的羟基发生反应。
为了偶联含有酰胺基团的目标官能片段，可以使用N-羟基琥珀酰胺(NHS)。具体地，如果微粒包括诸如PEG片段的聚亚烷基二醇片段，那么NHS可被偶联到所述微粒上。上述聚亚烷基二醇片段具体可以为式I所指出的X残基或其一部分。
目标官能片段还可以包括-SH基团，例如巯基丙氨酸残基，所述片段可以通过所述微粒首先与乙烯基砜进行反应而被偶联到所述微粒上。具体地，在微粒包括诸如PEG片段的聚亚烷基二醇片段的情况下，乙烯基砜可被偶联到所述微粒上。上述聚亚烷基二醇片段具体可以为式I所指出的X基团或其一部分。各种其它偶联剂是已知的(参见Fisher等的Journal ofControlled release111(2006)135-144和Kasturi等的Journal of Controlledrelease113(2006)261-270)。
原则上，可以采用本领域已知的方式来制备微粒，前提条件是现有技术中使用的聚合物(至少部分)被式I的可交联化合物替换。
除了式I所表示的可交联化合物以外，本发明的微粒还可以进一步包括一种或多种选自如下的其它化合物：聚合物和可交联或可聚合化合物。所述聚合物具体可以为上述聚合物。所述可交联或可聚合化合物具体为选自如下的化合物：丙烯酸化合物和其它烯属不饱和化合物，例如乙烯基醚、烯丙基醚、烯丙基氨基甲酸酯、富马酸酯、马来酸酯、衣康酸酯或不饱和丙烯酸酯单元。合适的不饱和丙烯酸酯例如为不饱和氨基甲酸酯丙烯酸酯、不饱和聚酯丙烯酸酯、不饱和环氧丙烯酸酯和不饱和聚醚丙烯酸酯。
可以使用其它聚合物或可聚合化合物来调整微粒的性质，例如调整活性试剂的释放谱图或者达到完全聚合(即可能具有细胞毒素的反应性不饱和键没有残留)或者使微粒的尺寸分布变窄。在由式I化合物和一种或多种其它可聚合化合物的组合来制备微粒的情况下，交联聚合物可以由式I化合物和一种或更多种其它化合物二者形成并组成。
其它聚合物和可聚合化合物与式I所表示化合物的重量比可以为0或更高。如果存在其它聚合物或可聚合化合物，那么其它聚合物和可聚合化合物与式I所表示化合物的比通常为至少10：90，具体为至少25：75或至少为45：55。优选地，所述比为90：10或更小，具体为55：45或更小或35：65或更小。
所述微粒例如通过如下步骤来制备：
使所述多官能可自由基聚合化合物X与式II所表示的异氰酸酯进行反应
Figure G200780010215XD00131
      式II
其中X、R1、R2和R3如上所定义；
形成含有所述(由式I表示的)反应产物的液滴；
使所述反应产物交联。
上述方法的优点在于简单，其中所述微粒可以仅由两种原料来制备：提供X的化合物和式II化合物，尤其是可商购的式II化合物。
另一种制备路线是通过如下反应：
Figure G200780010215XD00132
其中，R4是脂族、脂环族或芳族基团，其中R5是烷基(C2-C4)，其中，A选自O或N，R2如式I中所定义。上述替代制备方法从实践上来说是有利的，尤其考虑到具有各种R基团的原料在商业上获取的难易程度。还可以使用硫代异氰酸酯替代异氰酸酯。
优选通过如下来形成液滴：制备反应产物在非连续相中的乳液。式I化合物可以例如在水、水性溶液或其它液体或溶剂中乳化。通过使用已知的表面活性剂，例如triton X、聚乙二醇或吐温80来提高所述乳液的稳定性。乳液聚合简单且特别适用于间歇工艺。
还可以利用挤出技术、喷雾干燥技术或喷墨技术来制备液滴。本文中，通常使用喷嘴将含有反应产物的液体挤入或“喷射”入合适的气体(例如空气、氮气、稀有气体等)中或液体和反应产物的非溶剂中。可以通过配制品的粘度、使用振动喷嘴和/或施加电场的喷嘴来控制液滴的尺寸。通过选择非溶剂或气体的合适温度和/或通过施加其它条件(例如辐射)来完成交联，从而形成本发明的微粒，例如在Espesito等的Pharm.Dev.Technol5(2)；267-278或Ozeki等的Journal of controlled release107(2005)387-394中进行描述。上述方法具体适于连续实施，这在制备大量微粒的情况下特别有利。
反应温度通常高于式I化合物的熔融温度。另一个选择是将化合物在低于或高于所述化合物的熔融温度下溶解在溶剂中。除了允许在相对较低的温度下形成液滴以外，这对制备多孔微粒是有益的。还可以使用反应性溶剂，例如可以与聚合试剂发生反应的溶剂，诸如是可自由基聚合单体的溶剂。以这种方式，可以获得网络密度被细微调整的微粒。温度通常低于液相的沸点。
可以采用任何已知的用于交联含乙烯基化合物的合适方法来实施交联，具体通过热引发(借助热引发剂，诸如过氧化物或偶氮引发剂，例如偶氮二异丁腈)；通过光引发(借助光引发剂，诸如Norrish I型或II型引发剂)；通过氧化还原引发或任何其它利用化学化合物和/或电磁辐射产生自由基的机制。合适交联剂的实例是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯或羟乙基丙烯酸酯。
如果需要的话，所述微粒可被加载一种或多种活性试剂。可以在形成微粒时存在活性试剂来实现加载或之后加载。为了获得具有大量活性试剂的微粒，通常优选在活性试剂的存在下制备微粒。具体地，在所述活性试剂对交联敏感或者直接或间接受到交联的不利影响或者干扰的情况下，优选在微粒形成以后加载所述微粒。这可以通过如下来实现：使所述微粒与活性试剂接触，并且允许所述试剂扩散到所述微粒中和/或附着/吸附到所述微粒的表面上。
本发明可以提供一种对于一种或多种活性试剂具有令人满意封装效率(即粒子中活性试剂的量除以所用活性试剂的量)的微粒。依赖于加载条件，至少约50％，至少约75％或至少90％或更高的效率是可行的。
现在通过以下实施例来阐述本发明，但并不局限于此。
材料和方法
聚(乙二醇)35kD(PEG)、乙基己酸锡(II)、过氧化二硫酸钾(KPS)、盐酸四唑嗪、二乙二醇二甲基丙烯酸酯(DEGDMA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)、Irgacure819、聚己内酯三醇(PCL300)、羟乙基丙烯酸酯(HEA)、2，4-甲苯二异氰酸酯(TDI)和Darocure1173购自Sigma-Aldrich。PTGL1000(即聚(-甲基-1，4-丁二醇)共(四亚甲基二醇)，Mw为1000g/mol)购自Desotech；异氰酸酯甲基丙烯酸乙酯(IEMA)购自KarenzMOI(纯度98％)。Irganox1035购自CibaSpeciality Chemicals。上述化学品原样使用，除非另有声明。
在Varian Inova300光谱仪上进行核磁共振(NMR)实验。
在Perkin Elmer Spectrum FT-IR光谱仪1760x，1720x上进行红外实验。将聚合物样品置于两片KBr片之间。
在安装有Golden Gate衰减全反射(ATR)附件的Perkin ElmerSpectrum One FTIR光谱仪上测量丙烯酸酯的转化率。Sectrum One由DTGS检测器和利用单反射钻石晶体的Golden Gate组成。以平均4次扫描来记录在4000至650cm-1之间的红外光谱，光谱分辨率为4cm-1。将透射光谱转换成吸收光谱。在1410、1630和810cm-1处测定峰高，从而测定丙烯酸酯的转化率。
使用Waters515HPLC泵、Waters410微分折射仪和安装有WatersStyragel HR2、3、4柱子的Servern Analytical SA6503可编程吸光率检测器，以1ml/min的流速，使用四氢呋喃(THF)作为洗脱液，来进行尺寸排斥色谱分析(SEC)。利用IR检测器收集SEC数据。该***采用窄分布的聚苯乙烯标样(EasyCal PS2，得自Polymer Laboratories，Heerlen)进行标定。
所有涉及四唑嗪浓度测量的实验通过液相色谱(对于TRH的duplot测量)来进行。HPLC***(HP1090液相色谱)由以下组件组成：DR5泵、二极管检测器(DAD)、内置自动取样器和ChemStation软件，版本Rev.A.08.03(Agilent Technologies)。在40.0℃下使用平均粒子尺寸为3.5μm的C18分析柱150×4.6mm(XTerra RP18，Waters)。流速为1.5ml/min。使用由流动相A(10mM磷酸盐缓冲液)和B(乙腈)组成的流动相梯度液。洗脱梯度如下：在14分钟的一个梯度循环中，流动相中的流动相B在8分钟内由10％变化至95％，将流动相B保持在95％下2分钟，此后在4分钟内将流动相B降至10％，其中保持所述流动相直到注射下一个样品。注射体积为50μl。在250至340nm处进行探测。
使用LST230系列激光衍射粒子尺寸分析仪(Beckman Coulter)测量微粒的尺寸分布。标样为UHMwPE(0.02-0.04μm)。
使用Leica DMLB显微镜(放大倍数×50至×400)分析微粒的形态。
使用Philips CP SEM XL30在5和10kV加速电压下检测所述微粒。将样本安装在SEM样品台上，并镀金(2×60s，20mA)。
实施例1：PTGL 1000 -(IEMA) 2 低聚物的合成
将51mg(相对于总重的0.1wt％)的Irganox1035、13.9g(0.09mol)的IEMA和11mg(相对于IEMA的0.1mol％)的2-乙基己酸锡(II)在干燥空气下的100ml反应烧瓶中进行搅拌。在恒定温度(20℃)下，30分钟内滴加45.6g(0.045mol)PTGL1000。然后，将反应混合物加热至60℃，并继续进行18小时。由如下分析结果证实了PTGL1000-(IEMA)2的形成：1H-NMR(300MHz，CDCl3，22℃)：δ(ppm)＝6.26-5.83(s，1H，H-CH＝CH(CH3)-)；5.78-5.77(s，1H，H-CH＝CH(CH3)-)；4.50-4.05(m，2H，-O-CH2-CH2-NH-)；4.05-3.88(m，2H，-O-CH2-CH2-NH-)；3.22-2.51(m，2H，-O-CH2-CH2-CH(CH3)-)；1.95-4.79(s，3H，CH2＝CH(CH3)-)；1.66-1.38(s，24H，-CH2-CH(CH3)-CH2-)；IR(纯，cm-1)：1723.59(C＝O，伸缩)，1638.14(C＝C)；SEC(IR检测器)：Mw4800，PDI＝1.57。
实施例2：PTGL 1000 -(IEMA) 2 微球的制备
在60℃下，将2g PTGL1000-(IEMA)2低聚物和20g PEG溶液(20％的软化水溶液)在1500rmp(Eurostar Power Control Visc，IKA-WERKE)下搅拌15分钟。停止搅拌使乳液稳定。15分钟后，加入4.5ml KPS溶液(50mg/ml)。在70℃下聚合2小时。微球通过离心(Harrier15/80，MSE，4500rpm下15分钟)分离并用20ml的软化水洗涤。通过显微镜检查微球的形态。粒子尺寸分析仪表明平均直径为25μm(d75/d25＝9)。
实施例3：PTGL 1000 -(TDI-HEA) 2 的合成
在0.3g(0.48mmol)的乙基己酸锡II的存在下，将75.48g(0.65mol)HEA滴加到113.20g(0.65mol)TDI中。通过滴定监测异氰酸酯基团(NCO)的转化率。将174.95g(0.60mol)的上述HEA-TDI混合物加入购自Hodogaya的301.33克PTGL1000(0.60mol OH)和0.3g Irganox1035中并进行搅拌。将温度逐渐升高至80℃。7小时后，NCO值为0.026％。过夜后将反应混合物冷却至50℃。另外16小时后，NCO含量为0.007％。氨基甲酸酯二丙烯酸酯低聚物的产量为450g(92％)。
实施例4：PTGL 1000 -(TDI-HEA) 2 微球的制备
在室温下，将1.70g PTGL1000-(TDI-HEA)2低聚物和15g PEG溶液(20％的软化水溶液)在1500rmp(Eurostar Power Control Visc，IKA-WERKE)下搅拌15分钟。停止搅拌使乳液稳定。15分钟后，加入5mlKPS水溶液(50mg/ml)。将乳液在500rpm下搅拌10分钟。在70℃下聚合2小时。微球通过离心(Harrier15/80，MSE，4500rpm下15分钟)分离并用20ml的软化水洗涤。通过显微镜检查微球的形态。粒子尺寸分析仪表明平均直径为130μm(d75/d25＝7)。
实施例5：PTGL 1000 -(IEMA) 2 /EGDMA/TMPTMA微粒的制备
采用1.4g PTGL1000(IEMA)2、0.5g DEGDMA、0.1g TMPTMA和20mg的Darocur1173来制备配制品。采用2g PEG和13g软化水来制备水溶液。将该配制品加入水溶液中，从而得到乳液。将乳液在500rmp(Heidolph MR3002)下搅拌30分钟。在UV光下(Macam Flexicure控制器，D-bulb，200mW/s/cm2)聚合30分钟。聚合后，微球通过离心(Harrier15/80，MSE，4500rpm下15分钟)分离并用20ml的软化水洗涤两次。通过扫描电子显微镜检查微球的形态(见图1)。粒子尺寸分析仪表明平均直径为100μm(d75/d25＝1.9)(见图2)。丙烯酸酯的转化率为80％。
实施例6：官能化PTGL 1000 -(TDI-IEMA) 2 /HEA微粒的制备
采用1.5g PTGL1000(TDI-HEA)2、1.5g HEA和30mg的Irgacure819制备配制品。采用4g PEG和21g软化水制备水溶液。将上述配制品滴加到水溶液中，从而得到乳液。将乳液在500rmp(Heidolph MR3002)下搅拌30分钟。在UV光下(Macam Flexicure控制器，D-bulb，200mW/s/cm2)聚合30分钟。聚合后，微球通过离心(Harrier15/80，MSE，4500rpm下15分钟)分离并用20ml的软化水洗涤两次。通过显微镜检查微球的形态。粒子尺寸分析仪表明平均直径为390μm(d75/d25＝2.5)。丙烯酸酯的转化率大于95％。这些微粒由羟基组成，这些羟基可以进一步用于官能化。
实施例7：PTGL 1000 -(IEMA) 2 /EGDMA/TMPTMA微粒的释放谱图
采用2ml的四唑嗪溶液(5mg/ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的溶液)培养三批次的100mg的干燥微粒(得自实施例5)。这导致加载率为10％。在60℃的烘箱中蒸发水过夜。将干燥的微粒用7.5ml PBS洗涤三次。测定洗涤步骤中的四唑嗪的浓度，从而确定封装效率。封装效率为75％。在37℃的PBS中研究释放谱图。结果表示在图3中。竖条表示标准偏差(n＝3)。
实施例8：PTGL 1000 -(TDI-HEA) 2 /HEA微粒的冷冻-干燥稳定性
将实施例6的微粒冷冻干燥整夜(安装有真空泵Edward5两阶段和压力控制器Vaccuubrand CVC2的Edwards冷冻干燥器Micro Modulyo)。在重新溶于软化水中后，通过显微镜检查微粒的形态(没有观察到破裂的微粒)。粒子尺寸分析仪表明平均直径为360μm，这表明与新鲜微粒的直径相比偏差小于7％。结果表明，这些微粒在物理冲击(冷冻干燥)的作用下对不利影响(尺寸降低)具有良好的承受能力。
实施例9：PTGL基微粒的压力稳定性
利用KBr压力机压缩实施例5的微粒。将5吨压力保持5分钟。在重新溶于软化水中后，通过显微镜检查微粒的形态。没有观察到破裂的微粒。粒子尺寸分析仪表明平均直径为110μm，这表明与未遭受挤压的微粒的直径相比偏差仅为10％。
实施例10：漂浮(on-fly)PTGL 1000 -(TDI-HEA) 2 微粒的制备
将1.5g PTGL1000-(TDI-HEA)2、1.5g HEA和30mg Irgacure819混合在一起。将该配制品通过直径0.6mm的针头滴入空气中。当通过空气落下时，使微粒进行UV聚合(使用Macam Flexicure控制器，D-bulb，200mW/s/cm2)并收集在乙二醇中。使微粒在乙二醇中后固化30分钟。通过显微镜评估微粒的形态和尺寸：平均直径为1000μm，分布较窄(950-1050μm，利用显微镜目测)。
实施例11：PCL 300 -IEMA 3 的合成
将聚己内酯三醇(80克，0.266mol)、Irganox1035(0.2克，相对于总重为0.1wt％)搅拌10分钟。在90分钟内滴加IEMA(124克，0.800mol)。将反应混合物加热至60℃并搅拌4小时，直到IR和NMR表明反应完成。1H-NMR(300MHz，CDCl3，22℃，TMS)：δ(ppm)＝6.1(CH，甲基丙烯酸酯)，5.6(CH，甲基丙烯酸酯)，5.0(NH，氨基甲酸酯)，4，2(2H，-CH2-CH2-)，4.0(CH2-CO-)，3.5(2H，-CH2-CH2-)，2.4(CH3-CH2)，1.4-1.7(6H，-CH2-CH2-CH2-)，1.93H(CH3，甲基丙烯酸酯)-CH2)，0.93H(CH3-CH2)。
实施例12：可生物降解PCL 300 -IEMA 3 微粒的制备
将1g PCL300-IEMA3与1g PEG、6.5g软化水和70mg Darocur1173混合15分钟(Heidolph MR3002，1250rpm)。在UV光(MacamFlexicure控制器，D-bulb，200mW/s/cm2)下聚合60分钟。聚合后，将微粒在真空下(Gelman Sciences Supor-800)通过0.8μm的过滤器进行过滤并用100ml软化水冲洗。采用光显微镜检查形貌。丙烯酸酯的转化率为90％。平均尺寸为140μm(D75/D25＝3.2)。

Claims (17)

1.一种含有交联聚合物的微粒，所述聚合物由下式所表示的可交联化合物组成：
Figure FSB00000684163400011
式I
其中：
X是具有至少等于n的官能度的多官能可自由基聚合化合物的残基；
各个Y独立地存在或不存在，如果存在的话，各个Y独立地代表选自O、S、NR0的片段；
各个R0独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N；
各个Z独立地选自O和S；
各个R1独立地选自被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N；
各个R2独立地选自氢、被取代的和未被取代的脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基，所述基团可选包含一个或多个选自如下的片段：酯片段、醚片段、硫酯片段、硫醚片段、氨基甲酸酯片段、硫代氨基甲酸酯片段、酰胺片段和其它含有一个或多个杂原子的片段，具体地，一个或多个杂原子选自S、O、P和N；
n至少为2；
各个R3选自氢、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOC4H9。
2.如权利要求1所述的微粒，其中，X是-OH、-NH2、-RNH或-SH多官能聚合物或低聚物的残基。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的微粒，其中，X选自生物稳定或可生物降解聚合物或低聚物的残基。
4.如权利要求3所述的微粒，其中，X选自脂族聚酯、脂族聚硫酯、脂族聚硫醚、脂族聚醚或多肽。
5.如权利要求1所述的微粒，其中，R0是氢或烷基。
6.如权利要求1所述的微粒，其中，R1包括2-20个碳原子。
7.如权利要求1所述的微粒，其中，R2是氢或包括1-6个碳原子。
8.如权利要求1所述的微粒，其中，平均直径在10nm至1000μm的范围内。
9.如权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒被提供为具有内部核和外部壳的结构。
10.如权利要求1所述的微粒，包括一种或多种活性试剂。
11.如权利要求10所述的微粒，其中，所述活性试剂选自药物、蛋白质、肽、疫苗、诊断试剂或成像试剂。
12.如权利要求1所述的微粒，其中，所述交联聚合物是氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲或酰胺共聚物。
13.一种用于制备前述权利要求中任意一项所述的微粒的方法，所述方法包括如下步骤：
使带有残基X的多官能可自由基聚合化合物与式II所表示的异氰酸酯进行反应
Figure FSB00000684163400021
式II
其中X、R1、R2和R3如权利要求1所定义；
制备含有所述反应产物的液滴；
使所述反应产物交联。
14.如权利要求1-12中任意一项所述微粒作为活性化合物输送体系的用途，所述活性化合物具体为药物、诊断助剂或成像助剂。
15.如权利要求14所述的微粒作为活性化合物输送体系的用途，用于皮肤科、血管、整形外科、眼科、骨髓麻醉、肠、肺部、鼻或耳中。
16.如权利要求14-15中任意一项所述的微粒作为活性化合物输送体系的用途，用在悬浮液、胶囊、导管、小球、快速成型的支架、涂层、贴剂、复合材料、凝胶或软膏或原位形成凝胶中。
17.如权利要求16所述的微粒作为活性化合物输送体系的用途，其中，所述微粒可被注射、喷射、植入或吸入。
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