CN101402676A - 聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，由下式组成：X－Y－BNEP－OH或H－BNEP(i－Y－X)－OH其中，X为聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇；Y为连接基；i为1或3或13或14，代表侧链氨基被修饰的赖氨酸在氨基酸序列中的位数；BNEP为杀菌/中和内毒素多肽，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；本发明的修饰多肽在保留BNEP的中和内毒素活性的同时，延长了BNEP的体内半衰期，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力，可为脓毒症、脓毒性休克等危重病患者的治疗提供新的治疗药物；本发明还公开了该修饰多肽的制备方法，产品收率高、纯度高，可以实现合成多肽的聚乙二醇类定点修饰。

Description

聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多肽，特别涉及一种聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，还涉及该修饰多肽的制备方法和应用。

背景技术

脓毒症(sepsis)是革兰氏阴性(G^-)菌感染所致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是严重创伤、大面积烧伤等临床急危重患者的严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克(septic shock)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要原因。根据美国疾病控制中心的统计调查结果，美国每年大约有75万人感染脓毒症，超过21万人因此而丧生。已经证明，存在于G^-菌细胞外膜上的内毒素(lipopolysaccha-rides，LPS)在SIRS中起着启动子的作用，进入血中的LPS能诱导多种炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的释放，并激活凝血、纤溶、补体***，通过这些因子直接或间接导致微循环障碍、器官功能衰竭。

近年来虽然大量广谱、高效抗生素的应用，为临床治疗感染性疾病提供了有力武器，但并没有从根本上改变脓毒症患者高死亡率的现状，原因在于抗生素虽然能抑制和杀灭细菌，但却不能拮抗内毒素的作用，而且可能在杀灭细菌同时引起内毒素的释放，从而加重炎症反应。国际上关于脓毒症的防治研究已有数十年历史，直接针对LPS或针对由LPS介导的各种炎症因子的调控措施不断提出，主要有抗类脂A抗体、各种抗炎症因子抗体及受体拮抗剂等，但至今尚无一种安全有效的药物应用于临床。因此，寻找既能杀菌又能中和LPS的药物是许多医学工作者研究的目标。

杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)是一种存在于人及哺乳动物中性粒细胞(PMN)嗜天青颗粒中的带正电荷的蛋白质，由456个氨基酸组成，具有特异性杀灭G^-菌及中和LPS的活性。BPI经弹性蛋白酶有限水解后生成两个主要片段，其中N端第1～199位氨基酸的25kDa片段(BPI₂₅)具有BPI的全部生物学活性。国外基于N端靶点设计的重组BPI₂₃(rBPI₂₃)及其突变体rBPI₂₁的开发研究已进入扩大的III期临床试验，初步结果证明，rBPI₂₃和rBPI₂₁对严重G^-菌感染具有显著的疗效，但其生物半衰期短，存在需连续给药、用药量大、成本高等问题，难以推广应用。

Little等研究发现，rBPI₂₃的杀菌、中和LPS及与肝素结合活性分别对应N端三个分离的功能区域：第17～45位、第65～99位、第142～169位氨基酸(LittleRG，et al.J.Bio.Chem.，1994，269(3)：1865～1872)。基于此发现，许多医学工作者开始进行具有杀菌和中和LPS活性的小分子多肽的研究，以利用小分子多肽合成可靠、成本低、活性强的优点来克服rBPI₂₃和rBPI₂₁的缺陷。

中国专利ZL 94191894.7和ZL 94194835.8公开了来自BPI的功能区的生物活性肽的氨基酸序列或其亚序列，以及这些序列的变异体，它们具有BPI的至少一种生物学活性，如肝素结合、肝素中和、LPS结合、LPS中和或杀菌活性。

中国专利ZL 01104591.4根据对BPI N端三个loop区的空间构象分析及物理性质分析，利用计算机辅助药物设计技术，设计并合成了一系列小分子模拟肽，通过生物活性筛选，得到66个杀菌/中和LPS模拟肽(bactericidal/neutralizing-endotoxin peptide，BNEP)，体内外试验显示：BNEPs对E.coliβ-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619和PA103等细菌有不同程度的杀菌活性；可明显降低血清中TNF-α高峰浓度，具有延长脓毒症动物生存时间、提高动物生存率的作用；具有中和LPS的能力，对LPS诱导的人单核细胞TNF-α和IL-6的分泌具有抑制作用；对内毒素攻击小鼠具有保护作用，对内毒素介导的大鼠TNF-α和IL-6的产生具有抑制作用，对大鼠内毒素血症具有治疗作用；可以用于治疗G^-菌感染和人内毒素血症。

与rBPI₂₃和rBPI₂₁相比，上述中国专利中公开的具有杀菌和中和LPS活性的小分子多肽具有分子量小，可以稳定重复生产，成本低的优点，但仍然存在半衰期较短、需连续给药的问题。

文献报道中，对分子结构进行修饰或改造是解决半衰期较短、需连续给药问题的常用方法，其中以化学修饰应用最为广泛，常用的化学修饰剂有聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、葡聚糖、聚氨基酸、聚酸酐等。PEG具有无毒、无免疫原性、水溶性好的特点，被美国食品与药物管理局(FDA)认可作为药品的辅助原料和修饰剂。蛋白质类药物经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过率减少，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白水解酶水解，同时减少了中和抗体的产生，这些均有助于蛋白质类药物生物半衰期的延长。目前已有多种PEG修饰的蛋白质类药物上市销售。但PEG修饰同时也可能影响蛋白质的生物学活性，其影响大小与修饰剂、修饰条件及蛋白质本身的性质有关。对于具体的蛋白质，其最佳修饰需通过制备PEG修饰的蛋白质及生物活性研究来决定。合成小分子多肽的PEG修饰研究起步较晚，但已引起不少研究者的关注。

本发明人在中国专利申请200710092699.9中公开了一种肽链碳(C)端被PEG类修饰的BNEP，具有下列结构通式：Y-BNEP-Z-amPEG(Y是氢或其它修饰基团，Z是各种连接基或没有连接基)。生物活性检测表明，该衍生物不仅保留了BNEP的中和内毒素活性，而且延长了BNEP的体内半衰期，显示了进一步开发成为新型中和内毒素药物的潜力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种肽链氮(N)端或侧链氨基被PEG类修饰的BNEP，在保留BNEP的中和内毒素活性的同时，延长BNEP的体内半衰期。

为达到此目的，本发明的PEG类修饰的BNEP，由下式组成：

X-Y-BNEP-OH或H-BNEP(i-Y-X)-OH

其中，X为PEG或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)；Y为连接基；i为1或3或13或14，代表侧链氨基被修饰的赖氨酸在氨基酸序列中的位数；BNEP为杀菌/中和内毒素多肽，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

进一步，所述连接基选自-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)、-NH(CH₂)_nCO-(n为1至8的任一整数)、-NHCOArCO-(Ar为各种芳香环)、-NH(CH₂)_pAr(CH₂)_pCO-(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、-NHCOCyCO-(Cy为各种环状结构)和-NH(CH₂)_qZCO-(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)中的任一种；

进一步，所述连接基为-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)；

进一步，所述连接基为-NHCOCH₂CH₂CO-；

进一步，所述PEG或mPEG的平均分子量为2000至20000。

本发明的目的之二在于提供一种制备所述PEG类修饰的BNEP的方法，具有产品收率高、纯度高的特点。

本发明的制备所述PEG类修饰的BNEP的方法，包括以下步骤：

a、母体肽树脂的制备通法

在合成柱中加入多肽合成树脂(Resin)，洗涤、溶胀树脂，备用；称取Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Lys(Y-X)-OH，加入二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷-N，N-二甲基甲酰胺(DCM-DMF)混合溶液使其溶解，再加入N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并***(HOBt)/N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再加入乙酸酐(Ac₂O)和吡啶(Py)反应以封闭树脂末端氨基，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再取出树脂，真空干燥，制得Fmoc-Lys(Boc)-Resin或Fmoc-Lys(Y-X)-Resin；

在合成柱中加入Fmoc-Lys(Boc)-Resin或Fmoc-Lys(Y-X)-Resin，洗涤、溶胀树脂后，加入浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应以脱除树脂上氨基的Fmoc保护基，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂；按照合成多肽的氨基酸序列，称取从肽链C端计第2位的保护氨基酸(Fmoc-AA-OH)，加入DCM或DCM-DMF的混合溶液使其溶解，再加入偶联剂DIC/HOBt/DIPEA活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再加入浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应以脱除树脂上氨基的Fmoc保护基，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂；重复上述“加入羧基被活化的Fmoc-AA-OH-偶联-洗涤-脱除氨基的Fmoc保护基-洗涤”步骤，使肽链从C端逐个向N端延伸直至完成整个肽链的合成，充分洗涤树脂，取出树脂，冷冻干燥，制得母体肽树脂；

b、PEG类修饰的BNEP的制备

采用固相逐步合成法或者液相片段合成法制备。

固相逐步合成法如下：

b1、X-Y-BNEP-OH的制备

将肽树脂

与X-YOBt反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的三氟乙酸-甲基苯基硫醚-三乙基硅烷-苯甲醚(TFA-PhSMe-TES-PhOMe)混合溶液进行裂解反应，制得X-Y-BNEP-OH；

b2、H-BNEP(1-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，先制得

再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂

b3、H-BNEP(3-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，先制得

再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-Y-X)-OH；

b4、H-BNEP(13-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，将Fmoc-Lys(Boc)-Resin与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-Y-X)-OH；

b5、H-BNEP(14-Y-X)-OH的制备

将肽树脂与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(14-Y-X)-OH；

液相片段合成法如下：

b2’、H-BNEP(1-Y-X)-OH的制备

将肽树脂与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(1-Y-X)-OH；

b3’、H-BNEP(3-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得将与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-Y-X)-OH；

b4’、H-BNEP(13-Y-X)-OH的制备

将肽树脂与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将Fmoc-Lys(Y-X)-OH与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-Y-X)-OH；

b5’、H-BNEP(14-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Y-X)-OBzl偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与H₂反应制得

以活性炭负载的氢氧化钯[Pd(OH)₂/C]为催化剂；将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(14-Y-X)-OH；

在上述各化合物的分子式中，X为PEG或mPEG；Y为连接基。

进一步，所述连接基选自-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)、-NH(CH₂)_nCO-(n为1至8的任一整数)、-NHCOArCO-(Ar为各种芳香环)、-NH(CH₂)_pAr(CH₂)_pCO-(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、-NHCOCyCO-(Cy为各种环状结构)和-NH(CH₂)_qZCO-(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)中的任一种；

进一步，所述连接基为-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)。

进一步，所述连接基为-NHCOCH₂CH₂CO-。

在本发明中，Fmoc是9-芴甲氧羰基，Boc是叔甲氧羰基，二者均为氨基的保护基；Bzl是苄基，tBu是叔丁基，二者均为羧基的保护基；X’-Lys(Y’)-O(Z’)表示α-氨基未被保护(X’为H)或被X’基团保护、ε-氨基被Y’基团保护或修饰、羧基未被保护(Z’为H)或被Z’基团保护的赖氨酸；

或

表示侧链被全部保护的BNEP或BNEP多肽片段(第a～b位氨基酸)；BNEP表示全部脱保护的多肽。

本发明的目的之三在于提供所述PEG类修饰的BNEP在制备中和内毒素药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明以中国专利ZL 01104591.4中公开的BNEP9901315(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)为母体分子，对其肽链N端以及侧链氨基进行了定点PEG类修饰，制得多种PEG类修饰的BNEP，并考察了这些修饰多肽的生物学活性，结果显示，PEG类修饰的BNEP不仅具有延长生物半衰期的特性，而且保留了与Lipid A结合的能力，结合的强度随PEG类修饰位点的变化而不同，个别位点被修饰后，其结合Lipid A的能力增强，显示了进一步开发成为新型中和LPS药物的潜力，可为脓毒症、脓毒性休克等危重病患者的治疗提供新的治疗药物和方法；本发明的PEG类衍生物的制备方法、Lys的PEG类衍生物的制备方法以及PEG类修饰的BNEP的制备方法，具有产品收率高、纯度高的特点，可以实现合成多肽的PEG类定点修饰，具有良好的推广应用价值和广阔的发展前景。

具体实施方式

本发明以中国专利ZL 01104591.4中公开的BNEP 9901315(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)为母体分子，对其肽链N端的α-氨基和Lys的ε-氨基进行了定点PEG类修饰，制得多种PEG类修饰的BNEP，并考察了这些修饰多肽的生物学活性。

PEG类分子的末端醇羟基不活泼，为了实现PEG类分子的稳定/有效修饰，需要先对PEG类分子进行活化，即采用不同的化学反应使PEG类分子的末端羟基连接上不同的活化官能团，使PEG修饰反应能够在比较温和的条件下进行。PEG类分子活化的常用方法是羟基氨基化或羧基化，然后根据待修饰多肽的分子特点，采用直接连接或进一步修饰后再连接的方法。

活化的PEG类分子(平均分子量一般为2000～20000)可与多肽分子主链或侧链上的各种化学基团反应而与多肽相连接。其中，亲核性官能团为主要反应位点，包括巯基、氨基、羧基、羟基等。但在多肽分子中，巯基较为少见且常常为药物活性位点；羧基在PEG与分子中的氨基连接之前不容易被修饰，因此，多肽的PEG类修饰主要选择分子中的氨基，主要是肽链N端的α-氨基和Lys的ε-氨基。

肽链N端的α-氨基修饰采用如下方法：首先，制备PEG类的衍生物，包括但不限于：mPEG-NHCO(CH₂)_mCOOBt(m为1至8的任一整数)、mPEG-NH(CH₂)_nCOOBt(n为1至8的任一整数)、mPEG-NHCOArCOOBt(Ar为各种芳香环)、mPEG-NH(CH₂)_pAr(CH₂)_pCOOBt(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、mPEG-NHCOCyCOOBt(Cy为各种环状结构)和mPEG-NH(CH₂)_qZCOOBt(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)；然后，采用固相逐步合成法将PEG类的衍生物偶联到BNEP肽链的N端，制得N端修饰的BNEP。

Lys的ε-氨基修饰采用如下方法：首先，制备Lys的PEG类衍生物，包括但不限于：Fmoc-Lys[CO(CH₂)_mCONH-mPEG)]-OH、H-Lys[CO(CH₂)_mCONH-mPEG)]-OBzl(m为1至8的任一整数)、Fmoc-Lys[CO(CH₂)_nNH-mPEG)]-OH、H-Lys[CO(CH₂)_nNH-mPEG)]-OBzl(n为1至8的任一整数)、Fmoc-Lys(COArCONH-mPEG)-OH、H-Lys(COArCONH-mPEG)-OBzl(Ar为各种芳香环)、Fmoc-Lys[CO(CH₂)_pAr(CH₂)_pNH-mPEG)]-OH、H-Lys[CO(CH₂)_pAr(CH₂)_pNH-mPEG)]-OBzl(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、Fmoc-Lys(COCyCONH-mPEG)-OH、H-Lys(COCyCONH-mPEG)-OBzl(Cy为各种环状结构)、Fmoc-Lys[COZ(CH₂)_qNH-mPEG)]-OH、H-Lys[COZ(CH₂)_qNH-mPEG)]-OBzl(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)等；然后，采用固相逐步合成法将Lys的PEG类衍生物适时偶联到BNEP肽链中，或者采用液相片段合成法将Lys的PEG类衍生物与合成的多肽片段相连接，制得侧链氨基修饰的BNEP。

PEG类修饰可以采用具有两个醇羟基的PEG，也可以采用具有一个醇羟基的mPEG(CH₃O-PEG)，mPEG的特点是在反应时不容易发生交联和团聚。

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、mPEG-NHCOCH₂CH₂CO-BNEP-OH的制备(固相逐步合成法)

1、mPEG-NH₂的制备

(1)mPEG-OTs的制备

称取18.000g(3mmol)mPEG(分子量6000)，加入45mL DCM使其溶解，再加入14.958g(75mmol)对甲苯磺酰氯(TsOCl)和6mL Py，在室温、氮气保护条件下搅拌反应，用薄层色谱法(TLC)监测反应进度，40小时后停止反应，在温度32℃条件下减压蒸馏至原体积的1/3后，在室温、氮气保护条件下继续搅拌反应3小时，再在温度32℃条件下减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、剧烈搅拌条件下加入150mL冰***(即预冷至温度4℃的***)，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，用乙醇(EtOH)重结晶，置放有五氧化二磷(P₂O₅)的真空干燥器中真空干燥，得白色粉末状固体21.577g，收率116.5％；红外光谱(IR)和核磁共振氢谱(¹HNMR)鉴定为mPEG-OTs，IR：1705cm^-1处出现羰基特征吸收峰；¹HNMR：7.80ppm(d，J＝9.0Hz)和7.33ppm(d，J＝9.0Hz)处出现苯环氢的一组对称特征峰；

(2)mPEG-Th的制备

称取21.927g(3.563mmol)mPEG-OTs和9.180g(49.6mmol)邻苯二甲酰亚胺钾盐(Th-K)，加入60mL DCM使其溶解，在温度170℃、氮气保护条件下回流反应，用TLC法监测反应进度，12小时后停止反应，在室温下搅拌过夜，抽滤，滤液在温度42℃条件下减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、搅拌条件下加入300mL冰***，有固体析出，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，用体积比为1∶10的DCM-***混合溶液重结晶，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色粉末状固体19.235g，收率88.1％；IR和¹HNMR鉴定为mPEG-Th，IR：1713cm^-1处出现强的羰基特征吸收峰，强度超过mPEG-OTs；¹HNMR：7.85ppm(m，J＝3.0Hz)和7.73ppm(m，J＝3.0Hz)处出现苯环氢的一组对称特征峰；

(3)mPEG-NH₂的制备

称取19.038g(3.1mmol)mPEG-Th，加入56mL无水EtOH，再在搅拌条件下加入11mL水合肼，在温度100℃条件下回流反应，用TLC法监测反应进度，24小时后停止反应，在室温下静置冷却，抽滤，滤液在冰浴、搅拌条件下加入200mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，用体积比为1∶10的DCM-***混合溶液重结晶，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色粉末状固体16.778g，收率90.1％，茚三酮反应显深蓝色，表明mPEG被氨基化；IR和¹HNMR鉴定为mPEG-NH₂，IR：1713cm^-1处的羰基特征吸收峰消失；¹HNMR：7.85ppm(m，J＝3.0Hz)和7.73ppm(m，J＝3.0Hz)处苯环氢的一组对称特征峰消失，表明mPEG-Th被肼解，转化为氨基；

2、mPEG-NHCOCH₂CH₂COOBt的制备

(1)mPEG-NHCOCH₂CH₂COOH的制备

称取6.000g(1.0mmol)mPEG-NH₂，加入3mL DCM，搅拌使其溶解；另称取0.150g(1.5mmol)丁二酸酐(Suc₂O)，加入4mL DCM使其溶解，再加入0.128mL Py和18mg(0.15mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)；混合上述两种溶液，在室温下搅拌反应，用茚三酮反应监测反应进度，43小时后停止反应，减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、搅拌条件下加入100mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，用体积比为1∶5的无水乙醇-无水***混合溶液重结晶，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色粉末状固体5.806g，收率95.2％，茚三酮反应显无色，IR鉴定为mPEG-NHCOCH₂CH₂COOH，1737cm^-1处附近出现两重吸收峰；

(2)mPEG-NHCOCH₂CH₂COOBt的制备

称取1.396g(0.2mmol)mPEG-NHCOCH₂CH₂COOH，加入6mL DCM使其溶解，再在冰浴、搅拌条件下加入0.061g(0.3mmol)N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，在冰浴下搅拌反应30分钟，再加入0.037g(0.3mmol)HOBt，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，19小时后停止反应，在室温下静置至固体析出完全，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、搅拌条件下加入50mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得白色固体1.156g，收率93.2％，鉴定为mPEG-NHCOCH₂CH₂COOBt。

2、mPEG-NHCOCH₂CH₂CO-BNEP-OH的制备

(1)Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin的制备

称取1.500g王树脂(Wang Resin，sub＝0.85mmol/g，sub为替代度，即每1g样品中所含氨基的摩尔数)加至合成柱中，依次用DMF和DCM洗涤树脂，再加入15mL DCM，浸泡30分钟溶胀树脂，除去DCM；称取0.375g(0.8mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，加入少量体积比为1∶1的DCM-DMF混合溶液使其溶解，再在冰浴下加入0.101g(0.8mmol)DIC和0.099g(0.7mmol)HOBt，反应30分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂偶联反应过夜，取少量树脂，用紫外分光光度法(UV)测得sub＝0.217mmol/g，除去反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂，再加入1mL Ac₂O和0.85mL Py，反应12小时以封闭树脂末端氨基，除去反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF和MeOH洗涤树脂，取出树脂，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin 1.761g，用UV法测得sub＝0.223mmol/g；

(2)

的制备

称取1.741g(0.388mmol)Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin加至合成柱中，依次用DCM和DMF洗涤，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应10分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；按照BNEP的氨基酸序列(SEQ ID No.1)称取第13位的Fmoc-AA-OH，加入少量DCM-DMF(1∶1，体积比)使其溶解，再在冰浴下按Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt/DIPEA的投料摩尔比为4∶6∶4.4∶4加入DIC、HOBt和DIPEA，反应6分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，用茚三酮监测反应进度，反应完毕后除去反应液，用DMF洗涤树脂，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应10分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；重复上述“加入羧基被活化的Fmoc-AA-OH-偶联-洗涤-脱除氨基的Fmoc保护基-洗涤”步骤，使肽链从C端逐个向N端延伸直至完成整个肽链的合成，Fmoc-AA-OH、DIC、HOBt和DIPEA的投料量见表1；用MeOH洗涤树脂，取出树脂，冷冻干燥，得

1.801g；

表1、

制备投料表

(3)的制备

称取0.318g(0.05mmol)

加至合成柱中，加入3mLDCM，浸泡30分钟使溶胀，再加入1.156g(0.2mmol)mPEG-NHCOCH₂CH₂COOBt，在温度32℃、氮气保护条件下反应，用茚三酮反应监测反应进度，6天后停止反应，砂芯漏斗抽滤，用DCM洗涤树脂，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得

0.337g；

(4)mPEG-NHCOCH₂CH₂CO-BNEP-OH的制备

称取0.200g

在冰浴、氮气保护条件下加入1.5mL体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液，在室温、搅拌条件下进行裂解反应，用TLC法监测反应进度，150分钟后停止反应，抽滤，滤液中加入30mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，离心，沉淀用冰***洗涤后，用2mL浓度为200mL/L的EtOH水溶液溶解，冷冻干燥，得固体0.075g，鉴定为mPEG-NHCOCH₂CH₂CO-BNEP-OH。

实施例2、H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(固相逐步合成法)

1、mPEG-NH₂的制备

(1)mPEG-OTs的制备

称取18.000g(3mmol)mPEG(分子量6000)，加入150mL四氢呋喃(THF)，搅拌使其溶解，再加入3mL浓度为1mol/L的萘钠的THF溶液，在室温、搅拌条件下通氮气30分钟，再加入0.686g(3.6mmol)TsOCl，在氮气保护条件下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，5小时后停止反应，抽滤，滤液在搅拌条件下加入100mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置1小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，用EtOH重结晶，置P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得白色粉末状固体16.605g，收率89.9％，IR和¹HNMR鉴定为mPEG-OTs；

(2)mPEG-Th的制备和(3)mPEG-NH₂的制备与实施例1所述方法相同。

2、Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

(1)Fmoc-Lys(Boc)-OBzl的制备

称取5.05g(11mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，加入15mL乙酸乙酯(EtOAc)使完全溶解，再加入1.5mL(11mmol)三乙胺(Et₃N)，缓慢滴加2.2mL(11mmol)溴化苄(PhCH₂Br)，在温度78～82℃回流反应5小时，再在室温下搅拌反应12小时，抽滤，滤液依次用浓度为0.5mol/L的碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，最后用浓度为1.7mol/L的氯化钠溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、研磨条件下加入100mL石油醚，有固体析出，抽滤，滤渣用石油醚洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得粗品6.278g，用柱层析法纯化(石油醚-EtOAc梯度洗脱)，得白色固体5.823g，收率90.3％，熔点78.5～79.4℃；IR、¹HNMR和MS鉴定为Fmoc-Lys(Boc)-OBzl；

IRυ_max(cm^-1)：3352(s，NH)，1750(s，COOR)，1718(s，CONH)，1689(vs，CONH)，1527(vs，Ar)，1268(vs，C-N-C)，1252/1172(vs，C-O-C)，737/697(s，C-H(Ar))；

¹HNMR δ：1.32(m，2H，γ-CH₂)，1.43(s，9H，CH₃)，1.64(m，2H，δ-CH₂)，1.69(m，2H，β-CH₂)，3.06(t，2H，CH₂N)，4.21(t，1H，J＝6.1Hz，CH-N)，4.40(m，3H，CH₂CH)，5.18(dd，2H，J＝12.3Hz，PhCH₂)，7.42～7.26(m，9H，Ar-H)，7.60(d，2H，J＝7.2Hz，Ar-H)，7.76(d，2H，J＝7.5Hz，Ar-H)；

MS：459.2(M-100)，460.2(M-99)，581.2(M+22)，582.2(M+23)；

(2)Fmoc-Lys-OBzl·HCl的制备

称取1.114g(2mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OBzl，加入10mL饱和盐酸的乙酸乙酯(HCl-EtOAc)溶液(将氯化钠与浓硫酸反应产生的HCl气体经浓硫酸和无水氯化钙干燥后，在冰浴条件下通入无水EtOAc中，待无水EtOAc中的HCl浓度达到饱和后，即得HCl-EtOAc溶液，密闭冷冻保存，备用)，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，1.5小时后停止反应，打开瓶塞，搅拌至无白烟冒出，再减压蒸馏至无液体馏出，残余液用EtOAc洗涤(10mL/次×2次)后，加入5mL冰EtOAc(即预冷至温度4℃的EtOAc)，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用冰EtOAc洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得淡黄色固体0.968g，经TLC法(以体积比为8∶1的DCM-EtOH混合溶液为展开剂)检验为纯品，收率98.0％，熔点119.9～120.9℃，IR、¹HNMR和MS鉴定为Fmoc-Lys-OBzl·HCl；

IRυ_max(cm^-1)：3322(vs，NH)，2949(vs，d，NH)，1720(s，COOR)，1689(vs，CONH)，1526(s，Ar)，1271(vs，C-N-C)，1251/1170(vs，C-O-C)，736/687(vs，C-H(Ar))；

¹HNMR δ：1.25(s，2H，NH₂)，1.40～1.76(m，6H，CH₂CH₂CH₂)，2.90(t，2H，CH₂N)，4.04～4.17(m，1H，NCH)，4.28～4.34(m，3H，CHCH₂)，5.12(s，2H，PhCH₂)，7.28～8.18(m，13H，Ar-H)；

MS：459.1(M-37)，460.2(M-36)，461.1(M-35)；

(3)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂COOH)-OBzl的制备

称取0.494g(1mmol)Fmoc-Lys-OBzl·HCl，加入5mL DCM使完全溶解，再缓慢滴加153μL(1.1mmol)Et₃N，在室温下搅拌反应30分钟，再加入0.156g(1.5mmol)Suc₂O，缓慢滴加121μL(1.5mmol)Py，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，5小时后停止反应，减压蒸馏至无液体馏出，加入30mL冰水，有固体析出，抽滤，滤渣用冰水洗涤后，干燥，得粗品0.530g，用柱层析法纯化(石油醚-EtOAc-丙酮梯度洗脱)，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色固体0.469g，收率78.5％，熔点131.4～132.8℃，IR、¹HNMR和MS鉴定为Fmoc-Lys(COCH₂CH₂COOH)-OBzl；

IRυ_max(cm^-1)：3317(vs，NH)，1737(vs，COOR)，1689(vs，d，CONH)，1269(vs，C-N-C)，1256/1178(vs，C-O-C)，736/696(vs，C-H(Ar))；

¹HNMRδ：1.31～1.69(m，6H，CH₂CH₂CH₂)，2.41～2.64(m，4H，COCH₂CH₂CO)，2.90(t，2H，CH₂N)，4.04～4.16(m，1H，NCH)，4.22～4.46(m，3H，CHCH₂)，5.05～5.19(m，2H，PhCH₂)，5.65(s，1H，NH)，7.33～7.78(m，13H，Ar-H)；

MS：559.2(M)，560.2(M+1)，561.2(M+2)，581.2(M+22)；

(4)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl的制备

称取0.335g(0.6mmol)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂COOH)-OBzl，加入6mL体积比为1∶1的DCM-DMF混合溶液使其溶解，在冰浴、搅拌条件下加入0.075g(0.6mmol)DIC、0.081g(0.6mmol)HOBt和0.077g(0.6mmol)DIPEA，在冰浴下搅拌反应30分钟，再在室温、搅拌条件下加入3.000g mPEG-NH₂，用TLC法监测反应进度，20小时后停止反应，减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、搅拌条件下加入60mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置2小时，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色固体2.656g，收率81.2％；将此固体用10mL蒸馏水溶解，抽滤，滤液用DCM萃取(10mL/次×6次)，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、搅拌条件下加入60mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置过夜，抽滤，滤渣用***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色固体2.160g，收率66.1％，茚三酮反应显浅蓝色；将此固体用Ac₂O和Py封闭末端氨基后，得浅黄色固体1.938g，茚三酮反应显无色，表明已无游离氨基存在，¹HNMR鉴定为Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl，用UV法测定sub＝0.117mmol/g；

(5)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

称取2.142g Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl，加入30mL EtOH和3滴AcOH，搅拌使其溶解，再加入0.214g质量百分浓度为5％的Pd(OH)₂/C，重复“抽真空、通氢气”3次后，在温度36℃、搅拌条件下进行氢解反应，用TLC法监测反应进度，11小时后停止反应，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，加入100mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得白色粉末状固体1.835g，收率86.5％，鉴定为Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

3、H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

(1)Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin的制备

称取1.500g Wang Resin(sub＝0.85mmol/g)加至合成柱中，依次用DMF和DCM洗涤树脂，再加入15mL DCM，浸泡30分钟溶胀树脂，除去DCM；称取0.375g(0.8mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，加入少量体积比为1∶1的DCM-DMF混合溶液使其溶解，再在冰浴下加入0.101g(0.8mmol)DIC和0.099g(0.7mmol)HOBt，反应6分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂偶联反应过夜，取少量树脂，用UV法测得sub＝0.217mmol/g，除去反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂，加入1mL Ac₂O和0.85mL Py，反应12小时以封闭树脂末端氨基，除去反应液，依次用DMF、DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF和MeOH洗涤树脂，取出树脂，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin 1.761g，用UV法测得sub＝0.223mmol/g；

(2)

的制备

称取1.741g(0.388mmol)Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin加至合成柱中，依次用DCM和DMF洗涤，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应10分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；按照BNEP的氨基酸序列称取第13位的Fmoc-AA-OH，加入少量体积比为1∶1的DCM-DMF混合溶液使其溶解，再在冰浴下按Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt/DIPEA的投料摩尔比为4∶6∶4.4∶4加入DIC、HOBt和DIPEA，反应6分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，用茚三酮监测反应进度，反应完毕后除去反应液，用DMF洗涤树脂，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应10分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；重复上述“加入羧基被活化的Fmoc-AA-OH-偶联-洗涤-脱除氨基的Fmoc保护基-洗涤”步骤，依照KT-13的氨基酸序列，使肽链从C端逐个向N端延伸直至完成整个肽链的合成，Fmoc-AA-OH、DIC、HOBt和DIPEA的投料量见表2；用MeOH洗涤树脂，取出树脂，冷冻干燥，得

0.668g；

表2、制备投料表

(3)

的制备

称取0.200g(0.03mmol)加至合成柱中，加入2mLDCM，浸泡30分钟溶胀树脂，再加入1.500g(0.2mmol)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CO-NH-mPEG)-OH、2滴DIC、0.022g HOBt和4滴DIPEA，在温度32℃、氮气保护条件下反应，用茚三酮反应监测反应进度，6天后停止反应，砂芯漏斗抽滤，用DCM洗涤树脂，再加入5mL浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应10分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DMF和DCM洗涤树脂，取出树脂，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得

0.199g；

(4)H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

称取0.150g

在冰浴、氮气保护条件下加入1.5mL体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液，在室温、搅拌条件下进行裂解反应，用TLC法监测反应进度，200分钟后停止反应，抽滤，滤液中加入30mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，离心，沉淀用冰***洗涤后，用2mL浓度为200mL/L的AcOH水溶液使其溶解，冷冻干燥，得固体0.041g，鉴定为H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例3、H-BNEP(3-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(固相逐步合成法)

参照实施例2所述方法进行制备：

先制得

再与Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例4、H-BNEP(13-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(固相逐步合成法)

参照实施例2所述方法进行制备：

将Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resin与Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例5、H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(固相逐步合成法)

参照实施例2所述方法进行制备：

以Wang Resin和Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH为起始原料，先制得Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-Wang Resin，再按照BNEP的氨基酸序列，与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例6、H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(液相片段合成法)

1、mPEG-NH₂的制备

与实施例1所述方法相同。

2、H-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl的制备

(1)Fmoc-Lys(Boc)-OBzl的制备

称取0.469g(1mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，加入5mL无水DMF使其溶解，再加入180μL(1.5mmol)PhCH₂Br和0.332g(1mmol)碳酸铯(Cs₂CO₃)，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，12小时后停止反应，抽滤，滤液加入10mL EtOAc，依次用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，最后用浓度为1.7mol/L的氯化钠溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，在冰浴、研磨条件下加入10mL石油醚，有固体析出，抽滤，滤渣用石油醚洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得白色固体0.433g，经TLC法检验为纯品，收率77.6％，熔点78.5～79.4℃；IR、¹HNMR和MS鉴定为Fmoc-Lys(Boc)-OBzl；

(2)Fmoc-Lys-OBzl·HCl的制备、(3)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂COOH)-OBzl的制备、(4)Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl的制备与实施例2所述方法相同；

(5)H-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl的制备

称取1.209g Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl，加入10mL浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，30分钟后停止反应，在冰浴、搅拌条件下加入80mL冰***，搅拌10分钟，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得淡黄色固体1.085g，收率89.7％，茚三酮反应显深蓝色，鉴定为H-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl。

3、H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

(1)Fmoc-Lys(Boc)-CTC-R的制备

称取3.000g 2-氯三苯甲基氯树脂(CTC-Resin，sub＝0.65mmol/g)加至合成柱中，用DCM洗涤树脂，再加入10mL DCM，浸泡30分钟溶胀树脂，除去DCM；称取1.124g(2.4mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，加入4mL DCM使其溶解，再加入0.604g(4.8mmol)DIPEA，反应6分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂偶联反应2小时，取少量树脂，用UV法测得sub＝0.473mmol/g，除去反应液，依次用体积比为17∶3∶1的DMF-MeOH-Py混合溶液、DMF和DCM洗涤树脂，取出树脂，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得Fmoc-Lys(Boc)-CTC-Resin，用UV法测得sub＝0.291mmol/g；

(2)

的制备

称取1.718g(0.5mmol)Fmoc-Lys(Boc)-CTC-Resin加至合成柱中，依次用DCM和DMF洗涤，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应30分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应30分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；按照BNEP的氨基酸序列称取第12位的Fmoc-AA-OH，加入少量DCM使其溶解，再在冰浴下按Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt/DIPEA的投料摩尔比为4∶6∶4∶6加入DIC、HOBt和DIPEA，反应6分钟活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，用茚三酮监测反应进度，反应完毕后，用DMF洗涤树脂，再加入含有浓度为20mL/L的1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一烯-7(DBU)和浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，除去反应液，用DMF洗涤1次，再加入含有浓度为20mL/L的DBU和浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，反应5分钟，用茚三酮反应监测反应进度，待树脂上氨基的Fmoc保护基全部脱除后除去反应液，依次用DCM、MeOH、DMF、DCM和DMF洗涤树脂；重复上述“加入羧基被活化的Fmoc-AA-OH-偶联-洗涤-脱除氨基的Fmoc保护基-洗涤”步骤，使肽链从C端逐个向N端延伸直至完成整个肽链的合成，最后1个氨基酸偶联后不脱除Fmoc保护基，Fmoc-AA-OH、DIC、HOBt和DIPEA的投料量见表3；取出树脂，冷冻干燥，得用UV法测得sub＝0.291mmol/g；

表3、

制备投料表

(3)

的制备

称取0.876g

加入10mL体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液，在室温、搅拌条件下进行裂解反应，用TLC法监测反应进度，2小时后停止反应，抽滤，滤液中加入100mL正己烷，在温度32℃条件下减压蒸馏至无液体馏出，加入100mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，先置放有氢氧化钾(KOH)的真空干燥器中真空干燥，再置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得浅黄色晶体0.400g，纯度70.72％，鉴定为

(4)

的制备

称取0.270g(0.092mmol)

加入13mL体积比为3∶10的DCM-DMF混合溶液，搅拌使其溶解，再在冰浴、搅拌条件下加入30mg(0.238mmol)DIC和18mg(0.113mmol)HOBt，在冰浴下搅拌反应50分钟，再加入0.800g H-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl(sub＝0.117mmol/g)，搅拌使其溶解，加入DIPEA调节pH值至8～9，在温度17℃条件下反应5小时，再在温度32℃条件下反应36小时，抽滤，滤液在温度32℃条件下减压蒸馏至无液体馏出，在搅拌条件下加入80mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用冰***洗涤后，加入20mL双蒸水，搅拌使其溶解，抽滤，滤渣用双蒸水洗涤后，冷冻干燥，得固体0.910g，鉴定为

用UV法测得sub＝0.074mmol/g；

(5)

的制备

称取0.533g Fmoc-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl，加入5mL浓度为200mL/L的哌啶的DMF溶液，在室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，30分钟后停止反应，加入100mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，抽滤，滤渣用无水***洗涤后，置放有P₂O₅的真空干燥器中真空干燥，得白色粉末状固体0.395g，收率87.6％，用UV法测得波长301nm处无吸收峰，表明氨基的Fmoc保护基已经全部脱除，鉴定为

(6)的制备

称取0.300g

加入10mL EtOH和2滴AcOH，搅拌使其溶解，再加入30mg质量百分浓度为5％的Pd(OH)₂/C，重复“抽真空、通氢气”3次后，在温度36℃条件下搅拌反应，用TLC法监测反应进度，23小时后停止反应，抽滤，滤液减压蒸馏至无液体馏出，加入50mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，离心，沉淀用冰***洗涤后，冷冻干燥，得白色粉末状固体0.227g，收率76％，鉴定为

(7)H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备

称取0.200g在冰浴、氮气保护条件下加入2.0mL体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液，在室温、搅拌条件下进行裂解反应，用TLC法监测反应进度，150分钟后停止反应，抽滤，滤液中加入30mL冰***，在温度4℃条件下静置至固体析出完全，离心，沉淀用冰***洗涤后，用2mL浓度为200mL/L的AcOH水溶液使溶解，冷冻干燥，得固体0.169g，鉴定为H-BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例7、H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(液相片段合成法)

参照实施例6所述方法进行制备：

先制得

再与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将先与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应脱除N末端Fmoc保护基，再与Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例8、H-BNEP(3-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(液相片段合成法)

参照实施例6所述方法进行制备：

先制得

再与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

先制得

再与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

实施例9、H-BNEP(13-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH的制备(液相片段合成法)

参照实施例6所述方法进行制备：

先制得再与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将Fmoc-Lys(COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH与H-Lys(Boc)-OtBu反应制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；

将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH。

参照上述实施例，可以制备出本发明其它PEG类修饰的BNEP，同样可以达到发明目的。

PEG类修饰的BNEP与Lipid A的亲和力鉴定

方法：根据生物传感器疏水样品池(Thermo公司)的操作说明书，将LipidA(Samonella Lipid A Re595，Sigma公司)包被于疏水样品池，并计算Lipid A的包被量，具体步骤如下：仪器参数设定为温度25℃、搅拌速率85次/秒、数据采集频率2次/秒；将疏水样品池置仪器中，加入异丙醇清洗(50μL/次×5次)，采集数据1分钟；加入PBS/AE(含有质量百分浓度为0.025％的叠氮化钠和浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液，调节pH值至6.0)清洗(60μL/次×7次)，采集数据10分钟；加入异丙醇清洗(50μL/次×7次)，采集数据1分钟；加入浓度为2mg/mL的Lipid A的氯仿溶液20μL，留置1分钟；加入PBS/AE清洗(50μL/次×7次)，采集数据5分钟；加入浓度为1mol/L的盐酸清洗(50μL/次×5次)，留置1分钟；加入PBS/AE清洗(60μL/次×7次)，采集数据5分钟；计算Lipid A的包被量；加入浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)90μL，留置5分钟；加入PBS/AE清洗(60μL/次×5次)，留置1分钟；

用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的无热原磷酸盐缓冲液(PBS)配制样品溶液进行生物传感器检测，具体步骤如下：仪器参数设定为温度25℃、搅拌速率98次/秒、数据采集频率3次/秒；将样品制成浓度为100μg/mL的溶液；将对照品多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)用PBS溶解，分别制成浓度为1.28、12.8和128μmol/L的对照溶液；在包被有Lipid A的疏水样品池中，加入PBS冲洗(50μL/次×5次)，基线平衡后吸出；加入PBS 45μL和对照溶液5μL，结合反应平衡后吸出；加入PBS冲洗(50μL/次×3次)，解离反应平衡后吸出；加入浓度为0.1mol/L的HCL冲洗(50μL/次×3次)，再生反应平衡后吸出；加入PBS冲洗(50μL/次×3次)，曲线回至基线后吸出；加入PBS 45μL和对照溶液5μL，进行下一次测定；共进行3个浓度的对照溶液的测定，用Thermo公司提供的FASTfit程序和FASTplot程序作图，计算PMB与Lipid A的亲和力；同法，取样品溶液5μL上样测定，并与PMB与Lipid A的亲和力相比较；

结果：见表4，样品1为mPEG的衍生物，样品2为Lys的mPEG衍生物，二者与Lipid A均无亲和力；样品3、4和5为未修饰的BNEP或其片段，样品6～9为mPEG修饰的BNEP，等摩尔浓度的样品与Lipid A的亲和力大小顺序为：BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl＞BNEP≈BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH＞mPEG-NHCOCH₂CH₂CO-BNEP-OH＞PMB＞BNEP_1-13≈BNEP(1-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OH＞BNEP_2-14；BNEP(14-COCH₂CH₂CONH-mPEG)-OBzl具有比BNEP更强的结合Lipid A的能力。

表4、样品与Lipid A的亲和力测定结果

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>西南大学

<120>聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽及其制备方法和应用

<160>1

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：杀菌/中和内毒素多肽(BNEP)

<400>1

Lys Thr Lys Gly Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys

  1              5                   10

Claims (10)

1、聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，由下式组成：

X-Y-BNEP-OH或H-BNEP(i-Y-X)-OH

其中，X为聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇；Y为连接基；i为1或3或13或14，代表侧链氨基被修饰的赖氨酸在氨基酸序列中的位数；BNEP为杀菌/中和内毒素多肽，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2、根据权利要求1所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，其特征在于：所述连接基选自-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)、-NH(CH₂)_nCO-(n为1至8的任一整数)、-NHCOArCO-(Ar为各种芳香环)、-NH(CH₂)_pAr(CH₂)_pCO-(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、-NHCOCyCO-(Cy为各种环状结构)和-NH(CH₂)_qZCO-(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)中的任一种。

3、根据权利要求2所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，其特征在于：所述连接基为-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)。

4、根据权利要求3所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，其特征在于：所述连接基为-NHCOCH₂CH₂CO-。

5、根据权利要求1所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽，其特征在于：所述聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇的平均分子量为2000至20000。

6、制备权利要求1所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽的方法，包括以下步骤：

a、母体肽树脂的制备通法

在合成柱中加入多肽合成树脂，洗涤、溶胀树脂，备用；称取Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Lys(Y-X)-OH，加入DCM或DCM-DMF混合溶液使其溶解，再加入偶联剂DIC/HOBt/DIPEA活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再加入Ac₂O和Py反应以封闭树脂末端氨基，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再取出树脂，真空干燥，制得Fmoc-Lys(Boc)-Resin或Fmoc-Lys(Y-X)-Resin；

在合成柱中加入Fmoc-Lys(Boc)-Resin或Fmoc-Lys(Y-X)-Resin，洗涤、溶胀树脂后，加入浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应以脱除树脂上氨基的Fmoc保护基，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂；按照合成多肽的氨基酸序列，称取从肽链C端计第2位的Fmoc-AA-OH，加入DCM或DCM-DMF混合溶液使其溶解，再加入偶联剂DIC/HOBt/DIPEA活化羧基，转移至合成柱中，与树脂进行偶联反应，反应完毕后除去反应液，充分洗涤树脂，再加入浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应以脱除树脂上氨基的Fmoc保护基，充分洗涤树脂；重复上述“加入羧基被活化的Fmoc-AA-OH-偶联-洗涤-脱除氨基的Fmoc保护基-洗涤”步骤，使肽链从C端逐个向N端延伸直至完成整个肽链的合成，充分洗涤树脂，再取出树脂，冷冻干燥，制得母体肽树脂；

b、PEG类修饰的BNEP的制备

采用固相逐步合成法或液相片段合成法制备。

固相逐步合成法如下：

b1、X-Y-BNEP-OH的制备

将肽树脂

与X-YOBt反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得X-Y-BNEP-OH；

b2、H-BNEP(1-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，先制得再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(1-Y-X)-OH；

b3、H-BNEP(3-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，先制得

再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-Y-X)-OH；

b4、H-BNEP(13-Y-X)-OH的制备

按照母体肽树脂的制备通法，将Fmoc-Lys(Boc)-Resin与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

再继续与Fmoc-AA-OH逐步偶联，最后脱除氨基的Fmoc保护基制得肽树脂将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-Y-X)-OH；

b5、H-BNEP(14-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(14-Y-X)-OH；

液相片段合成法如下：

b2’、H-BNEP(1-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与Fmoc-Lys(Y-X)-OH偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(1-Y-X)-OH；

b3’、H-BNEP(3-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(3-Y-X)-OH；

b4’、H-BNEP(13-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将Fmoc-Lys(Y-X)-OH与H-Lys(Boc)-OtBu偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

再与

偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(13-Y-X)-OH；

b5’、H-BNEP(14-Y-X)-OH的制备

将肽树脂

与体积比为2∶1∶7的TFE-AcOH-DCM混合溶液进行裂解反应，制得

将

与H-Lys(Y-X)-OBzl偶联制得

以DIC/HOBt/DIPEA为偶联剂；将

与浓度为100～500mL/L的哌啶的DMF溶液反应制得

将

与H₂反应制得

以Pd(OH)₂/C为催化剂；将

与体积比为90∶5∶3∶2的TFA-PhSMe-TES-PhOMe混合溶液进行裂解反应，制得H-BNEP(14-Y-X)-OH；

在上述各化合物的分子式中，X为PEG或mPEG；Y为连接基。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述连接基选自-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)、-NH(CH₂)_nCO-(n为1至8的任一整数)、-NHCOArCO-(Ar为各种芳香环)、-NH(CH₂)_pAr(CH₂)_pCO-(p为1至6的任一整数，Ar为各种芳香环)、-NHCOCyCO-(Cy为各种环状结构)和-NH(CH₂)_qZCO-(q为1至10的任一整数，Z为O、S或NH)中的任一种。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述连接基为-NHCO(CH₂)_mCO-(m为1至8的任一整数)。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述连接基为-NHCOCH₂CH₂CO-。

10、权利要求1所述的聚乙二醇类修饰的杀菌/中和内毒素多肽在制备中和内毒素药物中的应用。