CN101397584A - 在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合str测定方法以及试剂盒 - Google Patents
在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合str测定方法以及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合STR测定方法。更具体地,公开了一种对中国人群进行基因分型的方法,该方法包括同时扩增和分析包含下列基因座的基因座组:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818;和D6S1043与D12S391中的至少一个。还公开了用于上述方法的试剂盒和引物。
Description
技术领域
本发明一般地涉及在个体中检测短串联重复序列(short tandem repeats,STR)多态性的遗传分析方法。具体地,本发明涉及一种在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合STR测定方法以及试剂盒。
背景技术
短串联重复序列(STR)是人类基因组中具有高度多态性的遗传性标志,PCR-STR DNA基因分型技术被应用于法医学鉴定后,取得了令人瞩目的成绩;而其检测方法又以复合位点扩增检测最受广大实验技术人员的欢迎,其设备简单,使用检材少,方法易行,可在较短的时间内获得更多的多态性信息。尤其是在建立DNA数据库方面,STR复合扩增技术具有极大的优越性。美国FBI选择了13个STR基因座用于建立数据库Combined DNAIndex System(CODIS)。这些SRT基因座通常被称为13个核心基因座。
本申请人(美国应用生物***公司(ABI))先前向市场推出的新一代法医鉴定及亲子鉴定试剂盒AmpFLSTR IdentifilerTM PCR扩增试剂盒(货号,4322288)是一个多重短串联重复序列(STR)检测试剂盒。它采用美国应用生物***公司(ABI)最新的五色荧光、一个泳道技术,可以同时扩增和同时检测16个STR位点(15个4核苷酸重复位点加上Amelogenin性别判定标记)。5色荧光中,6-FAM(兰色)、VIC(绿色)、NED(黄色)和PET(红色)用于标记样品,LIZ(橙黄色)用于标记GeneScan-500分子量内标。
IdentifilerTM PCR扩增试剂盒包含美国Combined DNAIndex System(CODIS)所要求的全部13个位点,另外增加2个位点:D2S1338和D19S433。 IdentifilerTM STR位点组成:6-FAMdye:CSF1PO,D7S820,D8S1179,D21S11;VIC dye:D2S1338,D3S1358,D13S317,D16S539,TH01;NED dye:D18S51,D19S433,TPOX,vWA;PETdye:Amelogenin,D5S818,FGA(如表1所示)。它整合了ABI公司先前推出的Profiler PlUs、COfiler和SGM Plus试剂盒中的全部STR位点,满足目前所有国际罪犯数据库的要求,如CODIS、ENFSI、Interpol以及SGMPlus体系。
表1 AmpFlSTR Identifiler试剂盒STR位点
位点名称 | 染色体定位 | Identifiler Allelic Ladder的等位基因 | 染料标记 | 对照DNA9947A* |
D8S1179 | 8 | 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 | 6-FAM | 13 |
D21S11 | 21q11.2-q21 | 24,24.2,25,26,27,28,28.2,29,29.2,30,30.2,31,31.2,32,32.2,33,33.2,34,34.2,35,35.2,36,37,38 | 6-FAM | 30 |
D7S820 | 7q11.21-22 | 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 | 6-FAM | 10,11 |
CSF1PO | 5q33.3-34 | 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 | 6-FAM | 10,12 |
D3S1358 | 3p | 12,13,14,15,16,17,18,19 | VIC | 14,15 |
TH01 | 11p15.5 | 4,5,6,7,8,9,9.3,10,11,13.3 | VIC | 8,9.3 |
D13S317 | 13q22-31 | 8,9,10,11,12,13,14,15 | VIC | 11 |
D16S539 | 16q24-qter | 5,8,9,10,11,12,13,14,15 | VIC | 11,12 |
D2S1338 | 2q35-37.1 | 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 | VIC | 19,23 |
D19S433 | 19q12-13.1 | 9,10,11,12,12.2,13,13.2,14,14.2,15,15.2,16,16.2,17,17.2 | NED | 14,15 |
vWA | 12p12-pter | 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 | NED | 17,18 |
TPOX | 2p23-2per | 6,7,8,9,10,11,12,13 | NED | 8 |
D18S51 | 18q21.3 | 7,9,10,10.2,11,12,13,13.2,14,14.2,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 | NED | 15,19 |
Amelogenin | X:p22.1-22.3 | X,Y | PET | X |
Y:p11.2 | ||||
D5S818 | 5q21-23 | 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 | PET | 11 |
FGA | 4q28 | 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,26.2,27,28,29,30,30.2,31.2,32.2,33.2,42.2,43.2,44.2,45.2,46.2,47.2,48.2,50.2,51.2 | PET | 23,24 |
*对照DNA 9947A:女性人细胞株DNA
长期的DNA检验实践表明,短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异,各个基因座之间的差别也很大。即使是在美国FBI推荐的13个核心基因座中,也有部分基因座遗传多态性不高,或者在不同人群间的差异较大,由此给DNA检验技术的应用及其效率造成一定影响。
发明内容
本发明人经过深入研究,发现人基因组上D6S1043和D12S391这两个基因座在中国人群中更具有鉴别力。因此,发明人将这两个基因座分别替代原 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒中最不具有鉴别力的两个基因座:TH01和TPOX。实验证明,将这两个基因座标记加入试剂盒将增加在中国人群中的鉴别力。
具体地,本发明涉及一种在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合STR测定方法,其特征在于同时扩增分析基因组DNA样品中包含下列基因座的基因座组:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818;和D6S1043与D12S391中的至少一个。
在本发明的一个优选实施方案中,提供了一种多重短串联重复序列(STR)检测方法,其中同时扩增分析D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818,D6S1043和D12S391。优选地,本文所述扩增为PCR扩增。
在本发明的一个实施方案中,所述基因组DNA样品取自人的***、唾液、血液、体液、肌肉、头发或组织器官。
在本发明的另一个实施方案中,本发明的测定方法用于法医鉴定或亲子鉴定。
在本发明的一个优选实施方案中,用于扩增基因座的引物对如下(5’至3’方向):
CSF1P
正向引物:CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGT(SEQ ID NO:1)
反向引物:ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTT(SEQ ID NO:2)
D5S81
正向引物:GGGTGATTTTCCTCTTTGGT(SEQ ID NO:3)
反向引物:TGATTCCAATCATAGCCACA(SEQ ID NO:4)
FGA
正向引物:GGCTGCAGGGCATAACATTA(SEQ ID NO:5)
反向引物:ATTCTATGACTTTGCGCTTCAGGA(SEQ ID NO:6)
D3S1358
正向引物:ACTGCAGTCCAATCTGGGT(SEQ ID NO:7)
反向引物:ATGAAATCAACAGAGGCTTGC(SEQ ID NO:8)
D21S11
正向引物:GTGAGTCAATTCCCCAAG(SEQ ID NO:9)
反向引物:GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC(SEQ ID NO:10)
D18S51
正向引物:TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA(SEQ ID NO:11)
反向引物:ATTCTACCAGCAACAACACAAATAAAC(SEQ ID NO:12)
D16S539
正向引物:GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG(SEQ ID NO:13)
反向引物:GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC(SEQ ID NO:14)
D13S317
正向引物:ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA(SEQ ID NO:15)
反向引物:GGCAGCCCAAAAAGACAGA(SEQ ID NO:16)
AMEL
正向引物:ACCTCATCCTGGGCACCCTGG(SEQ ID NO:17)
反向引物:AGGCTTGAGGCCAACCATCAG(SEQ ID NO:18)
VWA
正向引物:CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG(SEQ ID NO:19)
反向引物:GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG(SEQ ID NO:20)
D8S1179
正向引物:TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCG(SEQ ID NO:21)
反向引物:CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTCA(SEQ ID NO:22)
D7S820
正向引物:TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG(SEQ ID NO:23)
反向引物:CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG(SEQ ID NO:24)
D2S1338
正向引物:GAGGGAGCCAGTGGATTTG(SEQ ID NO:25)
反向引物:CAGAGGCCCTTGTCAGTGTT(SEQ ID NO:26)
D19S433
正向引物:ATTTTGGTGCACCCATTACC(SEQ ID NO:27)
反向引物:ACTTGAGCCCAGGAGGTTG(SEQ ID NO:28)
D6S1043
正向引物:CCAGCTTACAGATGGCATATTG(SEQ ID NO:29)
反向引物:GCAATAGTGTGCAAGGATGG(SEQ ID NO:30)
D12S391
正向引物:AACAGGATCAATGGATGCAT(SEQ ID NO:31)
反向引物:GTGGCTTTTAGACCTGGACTG(SEQ ID NO:32)
在本发明的另一方面,提供了一种用于中国人群基因组DNA基因分型的PCR扩增试剂盒,其包含下列基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818;和D6S1043与D12S391中的至少一个。
优选地,所述扩增试剂盒包含下列基因座的特异寡核苷酸扩增引物对:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818,D6S1043和D12S391。
在本发明试剂盒的一个优选实施方案中,其中所述特异性寡核苷酸扩增引物对如SEQ ID Nos:1-32所示。
优选地,本发明的扩增试剂盒是Sinofiler multiplex PCR试剂盒,其为一种改进的 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒,其中用D6S1043和D12S391这两个基因座分别替代原 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒中的两个基因座:TH01和TPOX。相应地,用扩增D6S1043和D12S391的引物对分别替代原 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒中扩增TH01和TPOX的引物对。优选所述用于扩增D6S1043和D12S391的引物对如下所示:
D6S1043
正向引物:CCAGCTTACAGATGGCATATTG(SEQ ID NO:29)
反向引物:GCAATAGTGTGCAAGGATGG(SEQ ID NO:30)
D12S391
正向引物:AACAGGATCAATGGATGCAT(SEQ ID NO:31)
反向引物:GTGGCTTTTAGACCTGGACTG(SEQ ID NO:32)
在一个优选实施方案中,本发明的试剂盒可以用于法医鉴定或亲子鉴定。试剂盒分析的DNA样品可以取自人的***、唾液、血液、体液、肌肉、头发或组织器官。
附图说明
图1显示了1ng对照DNA 9947A的电泳图谱和基因型;
图2显示了使用中国女性DNA样品#33(从胰腺中提取)获得的电泳图谱和基因型;
图3显示了使用中国男性DNA样品#40(从脾脏中提取)获得的电泳图谱和基因型。
具体实施方式
以下将结合实施例参照附图对本发明作进一步阐述,这些实施例仅仅是用于举例说明的目的而决非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1 针对中国人群的复合STR测定方法
本实施例中所用的试剂盒是改进的 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒,Sinofiler multiplex PCR试剂盒,其中用D6S1043和D12S391替代原有的TH01和TPOX。实验试剂、实验仪器、实验操作和数据分析按照厂家提供的操作手册进行(同 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒用户手册,货号4323291)。以下详细描述实验细节。
PCR反应组分
Component | Vendor | Concentration range |
Tris-HCl | Invitrogen,Roche,Sigma-Aldrich | 8-20mM |
KCl | Invitrogen,Roche,Sigma-Aldrich | 40-75mM |
MgCl2 | Invitrogen,Roche,Sigma-Aldrich | 1.2mM-2.4mM |
BSA | Invitrogen,Sigma-Aldrich,Promega | 50-180ug/ml |
dNTP | Invitrogen,Qiagen,Roche | 0.1mM-0.25mM each |
Enzyme | Invitrogen,Qiagen,Roche | 0.1-0.2Unit/ul |
Primer set | Applied Biosystems,IDT | 0.1-0.5uM |
用于扩增本发明的各个基因座的引物如下表所示:
其中正向引物是5’荧光标记的寡聚物(Applied Biosystems,货号450007)。将Poly T尾部或非核苷酸接头用于促进基因座之间间隔。
扩增方案
为了制备反应体系:
进行PCR:
将热循环条件编程。在GeneAmp 9700热循环仪上使用9600 emulation模式。
图1显示了1ng对照DNA 9947A的电泳图谱和基因型。
图2显示了使用中国女性DNA样品#33(从胰腺中提取)获得的电泳图谱和基因型。
图3显示了使用中国男性DNA样品#40(从脾脏中提取)获得的电泳图谱和基因型。
从图1至图3可以看出,使用本发明的复合STR测定方法,可以在中国人群中同时扩增分析基因组DNA样品中包含下列基因座的基因座组:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818,D6S1043和D12S391。
实施例2本发明的复合STR测定方法对中国人群的改进的鉴别能力下表显示了目前市场上使用的 IdentifilerTM PCR扩增试剂盒中的15个STR基因座在不同人群中的同一性概率(probability ofidentity,PI)。在中国人群中的匹配概率(matching probability)要高于美籍非洲人,高加索人和美籍西班牙裔群体,提示 IdentifilerTM PCR试剂盒在中国人群中比在其它人群中具有较低的鉴别能力。
参考文献:
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序列表
<110>阿普里拉股份有限公司
<120>在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合STR测定方法以及试剂盒
<130>IA073732
<160>32
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<212>DNA
<213>人工的
<400>1
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Claims (15)
1.一种在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合STR测定方法,其特征在于同时扩增分析基因组DNA样品中包含下列基因座的基因座组:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818;和D6S1043与D12S391中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的方法,其中同时扩增分析D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818,D6S1043和D12S391。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述扩增为PCR扩增。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述基因组DNA样品取自人的***、唾液、血液、体液、肌肉、头发或组织器官。
5.根据权利要求1或2所述的方法,所述方法用于法医鉴定或亲子鉴定。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中用于扩增基因座的引物对如SEQ ID Nos:1-32所示。
7.一种用于中国人群基因组DNA基因分型的PCR扩增试剂盒,其包含下列基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818;和D6S1043与D12S391中的至少一个。
8.根据权利要求7所述的PCR扩增试剂盒,其包含下列基因座的特异寡核苷酸扩增引物对:D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,D18S51,AMEL,FGA,D5S818,D6S1043和D12S391。
9.根据权利要求7或8所述的PCR扩增试剂盒,其中所述特异性寡核苷酸扩增引物对如SEQ ID Nos:1-32所示。
10.根据权利要求7-9中任何一项所述的PCR扩增试剂盒在法医鉴定或亲子鉴定中的应用。
11.根据权利要求10的应用,其中所述试剂盒用于分析来自人的***、唾液、血液、体液、肌肉、头发或组织器官的DNA样品。
13.根据权利要求12的PCR试剂盒,其中用于扩增D6S1043和D12S391的引物对如下所示:
D6S1043
正向引物:CCAGCTTACAGATGGCATATTG(SEQ ID NO:29)
反向引物:GCAATAGTGTGCAAGGATGG(SEQ ID NO:30)
D12S391
正向引物:AACAGGATCAATGGATGCAT(SEQ ID NO:31)
反向引物:GTGGCTTTTAGACCTGGACTG(SEQ ID NO:32)。
14.根据权利要求12或13所述的PCR试剂盒在法医鉴定或亲子鉴定中的应用。
15.根据权利要求14的应用,其中所述试剂盒用于分析来自人的***、唾液、血液、体液、肌肉、头发或组织器官的DNA样品。
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