CN101394860A - 用丹参酮抑制炎性细胞因子产生 - Google Patents

Abstract

提供减弱促炎细胞因子从哺乳动物细胞释放的方法。还提供抑制或治疗哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法。进一步提供治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物处于脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的风险中或遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。还提供减弱NO从哺乳动物细胞释放的方法。还提供减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物处于由过量NO产生介导的障碍的风险中或患有由过量NO产生介导的障碍。

Description

用丹参酮抑制炎性细胞因子产生

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年1月13日提交的美国临时申请号60/759,237的利益。

关于联邦政府资助的研究或研发的声明

美国政府拥有本发明中已付清的许可以及在限制性条件下要求专利权人基于合理条款许可其他人的权利，所述合理条款由国立综合医学科学研究院(The NationalI nstitute of General MedicalSciences)授予的准许号R01GM063075和R01GM070817的条款提供。

发明背景

(1)技术领域

本发明一般涉及炎症治疗。更具体地，本发明涉及丹参酮和丹参酮衍生物抑制炎性细胞因子产生的用途。

(2)相关技术描述

“重症脓毒症”是一种以器官功能失调为征兆定义的综合征，所述征兆包括体温、心率、呼吸频率和白细胞计数异常。尽管目前在抗生素疗法和重症监护方面的进步，脓毒症仍然是重症监护病房中最常见的死亡原因，声称每年仅美国约有225000名受害者。脓毒症的发病机理至少部分归因于失调的全身性炎症反应，其特征在于各种促炎介质例如肿瘤坏死因子(TNF)(Tracey等人1987)、白介素(IL)-1(Dinarello和Thompson 1991)、干扰素(IFN)-γ(Heinzel

1990)、一氧化氮(Dinapoli等人1996)和巨噬迁移抑制因子(MIF)(Calandra等人2000；Hotchkiss和Karl 2003；Riedemann等人2003b)的过度积累。

一种遍在蛋白，高迁移组盒1(HMGB1)由活化的巨噬细胞/单核细胞释放(Chen等人2004；Rendon-Mi tchell等人2003；Tang等人2006；Wang等人1999)，并作为致死性内毒素血症和脓毒症的晚期介质发挥作用(Wang等人1999；Wang等人2004b；Wang等人2004c；Yang等人2004)。在内毒素血症和脓毒症小鼠(Wang等人1999；Yang等人2004)和患有脓毒症的病人(Wang等人1999)体内循环的HMGB1水平以延迟的方式升高(16-32小时后)。给小鼠施用重组的HMGB1后扼要再现了脓毒症的许多临床征兆，包括发烧(O′Connor等人2003)、肠道屏障功能扰乱(Sappington等人2002)、组织损害(Abraham等人2000)、和多器官衰竭(Wang等人1999)。施用抗-HMGB1抗体或抑制剂(例如，丙酮酸乙酯、尼古丁或硬脂酰基溶血磷脂酰胆碱)显著地保护小鼠免于LPS-诱导的急性组织损伤(Abraham等人2000；Ueno等人2004)，和致死性内毒素血症(Chen等人2005；Wang等人1999；Wang等人2004b；Wang等人2004a)。特别地，甚至在脓毒症发作后24小时首次给药时这些抗-HMGB1试剂仍能挽救致死性试验性脓毒症的小鼠(Qin等人2006；Ulloa等人2002；Wang等人2004b；Yang等人2004)，表明HMGB1-靶向的治疗方案具有较宽的时间窗。因此，那些已经证实为临床安全、并还能减弱HMGB1释放的试剂可能在预防和治疗炎症疾病方面具有潜力。

贯穿人类历史，草药已经形成各种炎性疾病民间药物的基础。在公元前第5世纪希腊医生(希波克拉底)记载了使用柳树皮提取物来减轻疼痛和发热，随后水杨酸作为减轻疼痛/发热的活性成分的发现导致了第一个合成的非-甾族抗炎药(NSAID)—阿司匹林，以及制药工业的产生。在数千种中草药中，只有少数命名为“参”[例如，人参(ginsen)、丹参(Salvia miltiorrhiza)]。丹参指一种草药(称为“参”)，其包含具有主要医学价值的物质(称为“丹”，朱砂)，并且在中国被广泛用于心血管障碍的患者(Ji等人2000)。其有益作用归因于几种红颜料，包括丹参酮I、II、IV和隐丹参酮(Wu等人1993；Yagi等人1994)，它们表现出不同的抗炎性质(Jang等人2003；Kang等人2000；Kim等人2002)。

几个方面的证据表明许多丹参成分(例如丹参酮I、II和IV)具有一些抗炎活性(Jang等人2003；Kang等人2000；Kim等人2002；Li和Tang1991；Shilin等人1987)。因此，需要进一步表征这些化合物或其衍生物对炎症和炎症介质(特别是“晚期”炎症介质)释放的影响。本发明解决了这些需要。

发明概述

因此，本发明人发现丹参酮在预防和治疗促炎细胞因子引起的炎症中是有效的。

因此，本发明涉及减弱促炎细胞因子从哺乳动物细胞释放的方法。所述方法包括使所述细胞与有效减弱促炎细胞因子从所述细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

本发明还涉及抑制哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括用有效抑制炎性细胞因子级联的量的水溶性丹参酮治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述哺乳动物患有炎性细胞因子级联介导的病症。

此外，本发明涉及治疗哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括用有效抑制炎性细胞因子级联的量的丹参酮治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述哺乳动物患有炎性细胞因子级联介导的病症。

本发明进一步涉及治疗遭受脓毒症、败血病、休克和/或内毒素性休克风险中的哺乳动物的方法。所述方法包括，以有效减少或防止内毒素性休克生理效应的方式用丹参酮IIA磺酸钠治疗所述哺乳动物。

本发明进一步涉及治疗遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的哺乳动物的方法。所述方法包括以有效减少或防止脓毒症、败血病、和/或内毒素性休克生理效应的方式，给所述哺乳动物施用纯化的丹参酮。

本发明还涉及治疗遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的哺乳动物的其他方法。所述方法包括以有效减少或防止脓毒症生理效应的方式，用包含丹参或其提取物的组合物治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述组合物不包含降香(lignumda lbergiae odoriferae)。

本发明还涉及减弱NO从哺乳动物细胞释放的方法。所述方法包括使所述细胞与有效减弱NO从所述细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

本发明进一步涉及减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物处于由过量NO产生介导的障碍的风险中。所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱哺乳动物中NO产生的量的水溶性丹参酮。

此外，本发明涉及减弱哺乳动物中的NO产生的方法，所述哺乳动物患有由过量NO产生而介导的障碍。所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱哺乳动物中NO产生的量的纯化丹参酮。

附图说明

图1为图片、蛋白印迹的照片和化学结构，其显示丹参提取物的(图A)和成分(丹参酮I、IIA和隐丹参酮，图B，C)减弱内毒素-诱导的HMGB1释放。在不存在或存在草药提取物(图A)、丹参酮I(TSNI)、丹参酮IIA(TSNIIA)或隐丹参酮(C-TSN)(图B，C)下，用LPS刺激小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞16小时，通过蛋白印迹分析确定培养基中HMGB1的水平。在图A和C下面的图是具有类似结果的三个独立实验的代表性蛋白印迹照片。*，P<0.05与对照(仅+LPS)。图D显示TSNIIA-SS制剂的HPLC图谱。

图2是图片和蛋白印迹的照片，其显示TSNIIA-SS特异性地阻断内毒素-诱导的HMGB1释放。在不存在或存在指定浓度的TSNIIA-SS下，用LPS刺激小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞、原代小鼠腹膜巨噬细胞或人外周血单核细胞。在LPS刺激后16小时，分别通过蛋白印迹分析(图A，B)、Griess反应(图A)、ELISA(图B)或细胞因子阵列(图C)测定培养基中HMGB1(图A，B)、一氧化氮(图A)或TNF(图B，C)的水平。注意在完全阻断LPS-诱导的HMGB1释放的浓度下，TSNIIA-SS不完全阻断LPS-诱导的一氧化氮(图A)、TNF(图B)、IL-1α、PF-4、IL-12(p70)和MCP-5(图C)的释放。在图C中显示具有类似结果的两个独立试验的代表性细胞因子阵列。

图3是图片和蛋白印迹的照片，其显示TSNIIA-SS的延迟施用仍显著地减弱内毒素-诱导的HMGB1释放。用LPS刺激小鼠巨噬细胞类RAW264.7细胞，并且在LPS刺激后0、2、6和12小时加入TSNIIA-SS(25μM或50μM)。在LPS刺激后16小时确定培养基中HMGB1的水平，并表示为两个独立实验(N＝2)的平均值±S.D.(以任意单位，AU)。每个图片下面是代表性蛋白印迹。*，P<0.05与对照(仅+LPS)。

图4是显微图和蛋白印迹的照片，其显示TSNIIA-SS阻断内毒素-诱导的细胞质HMGB1迁移。在不存在或存在TSNIIA-SS下，用LPS刺激巨噬细胞培养物，并在LPS刺激后16小时通过免疫组织化学(图A)或细胞分级分离/蛋白印迹(图B)测试HMGB1细胞质迁移。注意HMGB1主要定位在未刺激的巨噬细胞的核区域(“对照”，图A，左图)、LPS-刺激的巨噬细胞的细胞质和核区域中(图A，中图)。TSNIIA-SS(100μM)将HMGB1保留在核区域中(图A，右图)。LPS刺激后，分离细胞质(“C”)和核(“N”)级分，并通过蛋白印迹分析测定HMGB1、细胞核(PCNA)或细胞质(β-肌动蛋白)蛋白的水平。通过具有细胞质(β-肌动蛋白)或细胞核(PCNA)蛋白标记的级分的蛋白印迹分析确认样品的等量装载。印迹代表具有类似结果的两个独立实验。

图5是化学结构、蛋白印迹的照片和图片，其显示TSNIIA-SS使用糖皮质激素受体非依赖性机理减弱LPS-诱导的HMGB1释放。在不存在或存在单独的***、可的松或TSNIIA-SS，或***、可的松或TSNIIA-SS与糖皮质激素受体拮抗剂RU486组合下，用LPS刺激小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞。刺激后16小时，分别通过蛋白印迹分析和ELISA确定培养基中HMGB1(图B)或TNF(图C)的水平。图B是具有类似结果的两个独立实验的代表性蛋白印迹。*，P<0.05与单独的LPS；#，P<0.05与“+LPS+Dex”。

图6是显示TSNIIA-SS剂量依赖性地保护小鼠对抗致死性内毒素血症(图A)和致死性脓毒症(图B)的图片。使Balb/C小鼠遭受致死性内毒素血症(LPS，15mg/kg，i.p.)或脓毒症(由CLP诱导)。在内毒素血症发作后+0.5、+24、+48和+72小时，或在脓毒症发作后+24、+48、+72、+96小时，腹膜内给动物施用盐水(0.2ml/小鼠)，或TSNIIA-SS(0.2ml/小鼠，以指定剂量)，监测动物存活为期两周。使用Kaplan-Meier方法来比较组之间死亡率的差异。*，P<0.05与盐水。

图7是图片、蛋白印迹的照片和显微图，其显示TSNIIA-SS减弱脓毒症-诱导的全身性HMGB1累积(图A)和肝损伤(图B)。通过CLP使Balb/C小鼠遭受致死性脓毒症，在CLP后的+24、+48小时腹膜内施用对照盐水(0.2ml/小鼠)或TSNIIA-SS(以指定剂量)。脓毒症发作后52小时，确定血清HMGB1水平(图A)，并表示为平均值±SD(n＝10)。*，P<0.05(ANOVA，Tukey检验)。在平行实验中，CLP后48小时处死动物，并对各种组织切片，用苏木精和曙红染色(图B)。左显微图，具有坏死损伤的脓毒症小鼠的肝(“CLP”)(用空心箭头标记)，如细胞的损失和肝腺泡的结构所示。右显微图，用TSNIIA-SS(15mg/kg)治疗的脓毒症小鼠的肝脏显示中心静脉(实心箭头)并在正常肝细胞周围。

图8是显示TSNIIA-SS预防脓毒症-诱导的心血管功能失调的图片。通过CLP使雄性Sprague-Dawley大鼠(290-310g)遭受致死性脓毒症，在CLP后5小时使用Harvard泵(Harvard Apparatus，Holliston，MA)经由股静脉导管施用TSNIIA-SS。如前所述(Yang等人2002b)，CLP或假手术后20小时，使用放射性微粒确定总外周阻力(“TPR”)、心博量(“SV”)和心输出量(“CO”)。数据表示为平均值±S.D.(n＝6/组)并通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey检验比较。*，P<0.05相对进行假手术的动物(“-“)；#，P<0.05相对用载体处理的CLP动物(“+CLP”)。

发明详述

因此，本发明人发现丹参酮在预防和治疗促炎细胞因子引起的炎症中是有效的。参见实施例。

因此，本发明涉及减弱促炎细胞因子从哺乳动物细胞释放的方法。所述方法包括使所述细胞与有效减弱促炎细胞因子从所述细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

如本文所述，丹参酮是具有氢-菲并[1，2-b]呋喃-10，11-二酮的四环结构化合物，显示于图1B中，其能抑制HMGB1从巨噬细胞释放。实例包括天然存在的丹参酮I(1，6-二甲基-6，7，8，9-四氢-菲并[1，2-b]呋喃-10，11-二酮)、隐丹参酮(1，6，6-三甲基-1，2，6，7，8，9-六氢-菲并[1，2-b]呋喃-10，11-二酮)和丹参酮IIA(1，6，6-三甲基-6，7，8，9-四氢-菲并[1，2-b]呋喃-10，11-二酮)(图1B)。水溶性丹参酮的极性部分使其比图1B中的三种天然存在的丹参酮溶解性更好。所述极性部分的非限制性实例包括磺酸基、氨基、硝基、羧基和磷酸基。所述极性部分可以在五元环上如丹参酮IIA磺酸钠(图1B)或在丹参酮任何其他部分上，只要所述化合物仍具有抑制HMGB1释放的活性。优选地，所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。

这些方法对产生促炎细胞因子的任何细胞是有效的。优选地，所述细胞是巨噬细胞。

如下述实施例1和2所示，丹参酮抑制促炎细胞因子TNF-α(TNF)和HMGB1之一或两者的释放，TNF-α(TNF)和HMGB1为优选的受本发明方法影响的促炎细胞因子。这些方法还能用于抑制一个或多个其他促炎细胞因子例如白介素(IL)-1、干扰素-γ和巨噬移动抑制因子(MIF)的释放。

用于这些方法的细胞可以在哺乳细胞中，所述哺乳动物处于促炎细胞因子介导的病症的风险或患有促炎细胞因子介导的病症。所述方法不限制于任何具体的哺乳动物，且可以用于居住在动物园或野外的哺乳动物(例如，鹿、熊、非人灵长类等)，宠物哺乳动物(例如，狗、猫、仓鼠、豚鼠、雪貂等)，家畜(例如，牛、猪、马等)，试验动物(大鼠、小鼠等)，或优选人。

当治疗动物时，丹参酮应该在药学可接受的赋形剂中。关于“药学可接受的”指这样一种材料，(i)其与所述组合物的其他组分相容，而不产生不适合预期目的的组合物，并且(ii)如本文所提供的其适用于受试者而没有过度不利副作用(例如毒性、发炎和过敏反应)。当其危险超过所述组合物提供的益处时，副作用是＂过度的＂。药学可接受载体的非限制性实例包括但不限于任何标准的药学载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如水包油乳液、微乳液等。

无需过度实验可以配制上述化合物，以根据特定应用的需要施用于哺乳动物(包括人)。此外，无需过度实验通过标准剂量-响应方案可以确定所述组合物的适当剂量。

因此，无需过度实验通过本领域已知的方式可以制备设计用于口服、舌、舌下、颊和颊内施用的所述组合物，例如用惰性稀释剂或用可食用载体。所述组合物可以被封装入胶囊或压成片剂。出于口服治疗施用的目的，本发明的药物组合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸囊剂、口香糖等的形式使用。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等还可以包含结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂和调味剂。一些结合剂的实例包括微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。一些崩解剂的实例包括海藻酸、玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的实例是二氧化硅胶体。一些甜味剂的实例包括蔗糖、糖精等。调味剂的实例包括胡椒薄荷、水杨酸甲酯、橙味剂(orange flavoring)等。用于制备所述各种组合物的材料在所使用的量下应该是药学纯和无毒的。

所述化合物可以容易地通过肠胃外施用，例如，通过静脉内、肌肉内、鞘内或皮下注射。通过将所述化合物掺入溶液或悬浮液中来实现肠胃外施用。所述溶液或悬浮液还可以包括无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。肠胃外制剂还可以包括抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，以及螯合剂例如EDTA。还可以加入缓冲溶液例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节渗透压的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可将肠胃外制剂装入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

直肠施用包括将药物组合物中的化合物施用到直肠或大肠中。这可以通过使用栓剂或灌肠剂实现。通过本领域已知的方法可以容易地制备栓剂。例如，栓剂可以通过将甘油加热到约120℃来制备，将组合物溶于甘油中，混合加热的甘油后加入纯净水，将热的混合倒入栓剂模具中。

经皮施用包括组合物通过皮肤的经皮吸收。透皮制剂包括贴剂(例如熟知的尼古丁贴剂)、软膏、霜剂、凝胶、油膏等。

本发明包括鼻内给所述哺乳动物施用治疗有效量的所述化合物。如本文所述，鼻内施用包括将化合物施用给患者的鼻通道或鼻腔的粘膜。如本文所述，用于化合物鼻内施用的组合物包括治疗有效量的由熟知方法制备的化合物，其例如作为鼻喷雾、滴鼻剂、悬浮剂、凝胶、软膏、霜剂或粉剂施用。化合物的施用还可以使用鼻塞或鼻海绵(nasalsponge)进行。

当所述化合物外周施用使其必须经过血脑屏障时，所述化合物优选制成药物组合物，所述药物组合物提高化合物穿过哺乳动物血脑屏障的能力。所述制剂在本领域中是已知的并包括亲脂化合物以促进吸收。通过与亲脂物质的组合可以增强非亲脂化合物的摄取。能增强化合物通过鼻粘液的递送的亲脂物质包括但不限于脂肪酸类(例如，棕榈酸)、神经节苷脂类(例如，GM-1)、磷脂类(例如，磷脂酰丝氨酸)和乳化剂(例如，聚山梨糖醇酯80)、胆汁盐例如，脱氧胆酸钠和去污剂样的物质包括，例如聚山梨糖醇酯80例如Tween^TM、辛苯昔醇例如Triton^TMX-100、和tauro-24，25-二氢夫西地酸(dihydrofusidate)钠(STDHF)。参见Lee等人，Biopharm.，1988年4月3037期。

在本发明的具体实施例中，所述化合物与由亲脂性物质组成的微胶粒组合。所述微胶粒能改变鼻膜渗透性以增强化合物的吸收。合适的亲脂性微胶粒包括但不限于神经节苷脂类(例如GM-1神经节苷脂)和磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸)。微胶粒制剂中还包括胆汁盐及其衍生物和去污剂样的物质。所述化合物可以与一或几种类型微胶粒组合，并且还包含在微胶粒内或与它们的表面结合。

或者，所述化合物可以与脂质体组合(脂囊泡)以增强吸收。所述化合物可以包含或溶解在脂质体内和/或与其表面结合。合适的脂质体包括磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸)和/或神经节苷脂类(例如，GM-1)。关于制备磷脂囊泡的方法，参见例如Roberts等人的美国专利4,921,706和Yiournas等人的美国专利4,895,452。脂质体制剂中还可以包括胆汁盐及其衍生物和去污剂样的物质。

由促炎细胞因子介导的并能用本发明方法有效治疗的病症的实例为：阑尾炎、胃溃疡、胃或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、急性或缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、弛缓不能、胆管炎、胆囊炎、肝炎、克罗恩氏病、肠梗阻、肠炎、惠普耳氏病(Whipple′s disease)、哮喘、***反应、过敏性休克、免疫复合疾病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血病、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜曙红细胞肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、***、***炎、***炎、尿道炎、支气管炎、气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、矽肺病(pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis)、肺泡炎(alvealitis)、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、窦炎、流行性感冒、呼吸道合胞体病毒感染、疱疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、弥漫性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿米巴病、包虫囊肿(hydatid cysts)、烧伤、皮炎、皮肌炎、晒伤、荨麻疹、疣、风疹块、血管炎(vasulitis)、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉硬化症、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、阿尔茨海默症、乳糜泄、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、脑梗塞、脑栓塞、Guillame-Barre综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、瘫痪、葡萄膜炎、关节炎疹、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎(thryoiditis)、***性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、白塞氏综合征、同种异体移植物排异反应、移植物抗宿主疾病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔氏病、Retier氏综合征或何杰金氏病。优选地，所述病症是阑尾炎、胃溃疡、胃或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、急性或缺血性结肠炎、肝炎、类风湿性关节炎、克罗恩病、哮喘、***反应、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血病、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、弥漫性菌血症、烧伤、阿尔茨海默症、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑梗塞、脑栓塞、脊髓损伤、瘫痪、同种异体移植物排异反应和移植物抗宿主疾病。在最优选的实施例中，所述病症是脓毒症、败血病、和/或内毒素性休克。

本方法还进一步包括给所述哺乳动物施用第二种消炎药。非限制性的实例包括NSAID、细胞因子抑制剂、水杨酸酯、COX抑制剂、COX-2抑制剂或甾族化合物。在特别优选的方法中，所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，并且第二种治疗是施用毒蕈碱激动剂、肾上腺髓质素、肾上腺髓质素结合蛋白、乳脂肪球表皮生长因子VIII、激活蛋白C或α_2A-肾上腺素能拮抗剂。

本发明还涉及抑制哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括以有效抑制炎性细胞因子级联的量的水溶性丹参酮治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述哺乳动物患有炎性细胞因子级联介导的病症。

如上面的方法所述，所述水溶性丹参酮优选为天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物，最优选为丹参酮IIA磺酸钠。这些方法的受试者可以是任何哺乳动物。优选地，所述哺乳动物是人。

最优选地，所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，所述哺乳动物是人并且所述丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

此外，本发明涉及治疗哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括以有效抑制炎性细胞因子级联的量的丹参酮治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述哺乳动物患有炎性细胞因子级联介导的病症。

优选地，丹参酮是水溶性丹参酮，更优选地是天然存在丹参酮的磺酸钠衍生物，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。这些方法的受试者可以是任何哺乳动物。最优选地，所述病症为脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，所述的哺乳动物是人并且所述丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

本发明进一步涉及治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物处于脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的风险中。所述方法包括以有效减少或防止内毒素性休克生理效应的方式，采用丹参酮IIA磺酸钠治疗所述哺乳动物。可以测量内毒素性休克的任何生理效应来确定治疗功效。本文中优选的生理效应是HMGB1释放、TNF释放、一氧化氮(NO)释放或致死性脓毒症。最优选地，所述哺乳动物是人。

本发明进一步涉及治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。所述方法包括以有效减少或防止脓毒症、败血病、和/或内毒素性休克生理效应的方式，给所述哺乳动物施用纯化的丹参酮。这些方法中有效的丹参酮包括丹参酮I、丹参酮IIA、或隐丹参酮。更优选的丹参酮是水溶性丹参酮，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。

可以测量内毒素性休克的任何生理效应来确定治疗功效。本文优选的生理效应是HMGB1释放、TNF释放、一氧化氮(NO)释放或致死性脓毒症。最优选地，所述哺乳动物是人。

本发明还涉及治疗哺乳动物的其他方法，所述哺乳动物遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。所述方法包括以有效减少或防止脓毒症生理效应的方式，采用包含丹参或其提取物的组合物来治疗所述哺乳动物。在这些方法中，所述组合物不包含降香。所述组合物可以包含丹参或优选地丹参的提取物(参见实施例)。优选的提取物包含有机成分，其中至少5wt％的有机成分是丹参酮。更优选地，至少10wt％，甚至更优选地至少25wt％，仍更优选地至少50wt％或至少80wt％的有机成分是丹参酮。最优选地，至少95wt％的有机成分是丹参酮。

可以测量内毒素性休克的任何生理效应来确定治疗功效。本文优选的生理效应是HMGB1释放、TNF释放、一氧化氮(NO)释放或致死性脓毒症。最优选地，所述哺乳动物是人。

本发明还涉及减弱NO从哺乳动物细胞释放的方法。所述方法包括使所述细胞与有效减弱NO从所述细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

如上面的方法所述，优选的水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。优选地，至少80％的丹参酮制剂是磺化的。

所述细胞优选是活的哺乳动物的部分，所述哺乳动物处于由过量NO生产介导的障碍的风险中，或患有由过量NO生产介导的障碍。所述障碍的非限制性实例是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾变病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症，痴呆(包括AIDS相关的神经退化的、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′schorea)、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。本文最优选的障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。最优选地所述哺乳动物是人。

本发明进一步涉及减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物处于由过量NO产生介导的障碍的风险中。所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱哺乳动物中NO产生的量的水溶性丹参酮。优选地，所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。

对于这些方法，优选的障碍是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾变病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症，痴呆(包括AIDS相关的神经退化的、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。最优选地，所述障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。所述哺乳动物优选是人。

此外，本发明涉及减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物患有由过量NO产生介导的障碍。所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱哺乳动物中NO产生的量的纯化丹参酮。优选地，所述丹参酮是丹参酮I、丹参酮IIA或隐丹参酮，更优选地是水溶性丹参酮，最优选地是丹参酮IIA磺酸钠。

对于这些方法，优选的障碍是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾变病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症，痴呆(包括AIDS相关的神经退化的、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′schorea)、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。最优选地，所述障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。所述哺乳动物优选是人类。

在下述实施例中描述本发明优选的实施方案。考虑到本文公开的说明书或实践，在本文权利要求范围内的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。认为本说明书与实施例只是示例性的，本发明的范围和意图由实施例后面的权利要求表示。

实施例

心血管药物通过选择性减弱晚期作用的促炎介质HMGB1来挽救患有致 死性脓毒症的小鼠

实施例概述

脓毒症的发病机理部分由细菌内毒素介导，所述细菌内毒素刺激巨噬细胞/单核细胞连续释放早期促炎细胞因子(例如，TNF、IL-1和IFN-□)和晚期促炎细胞因子(例如，HMGB1)。HMGB1作为致死性脓毒症的晚期介质的近期发现促进了开发新实验疗法的研究。发现很多甾族(例如***和可的松)和非甾族抗炎药(例如阿司匹林、布洛芬、和吲哚美辛)甚至在超药理学浓度时(高达10-25□M)不能影响内毒素-诱导的HMGB1释放。然而，一种常见的中药(丹参)的几种甾族样色素(丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮)剂量依赖性地减弱内毒素-诱导的HMGB1在巨噬细胞/单核细胞培养物中释放。水溶性丹参酮IIA衍生物(磺酸钠)，即TSNIIA-SS，作为中药已经被广泛地用于心血管障碍的患者，其以糖皮质激素受体-非依赖性方式选择性地阻断内毒素-诱导的HMGB1细胞质迁移和释放。TSNIIA-SS的施用显著地保护小鼠对抗致死性内毒素血症，并甚至在脓毒症发作后24小时首次给药挽救患有致死性脓毒症的小鼠。治疗作用部分归因于：1)减弱HMGB1的全身性累积(但不减弱TNF和一氧化氮)；2)防止肝损伤；并且3)改善脓毒症动物的心血管生理参数(例如，总外周血管阻力降低和心搏量增加)。总之，这些数据加强了HMGB1在致死性脓毒症中的致病作用，并支持TSNIIA-SS在人脓毒症治疗中的治疗潜力。

介绍

如上面证实的，丹参提取物以及几种成分(丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮)显著地减弱HMGB1从细菌内毒素-刺激的巨噬细胞培养物中释放。用水溶性丹参酮IIA衍生物(丹参酮IIA磺酸钠)治疗动物显著减弱HMGB1在内毒素血症和脓毒症中的全身性累积，并赋予剂量依赖性保护来对抗致死性内毒素血症和脓毒症，甚至当脓毒症发作后24小时首次给予丹参酮IIA磺酸钠。

材料和方法

细胞培养物 如前所述(Chen等人2004；Rendon-Mi tchell等人2003)，小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞获自美国典型培养物中心(ATCC，Rockville，MD)，且原代腹膜巨噬细胞分离自腹膜内注射2ml硫乙醇酸盐肉汤(4％)后2-3天的Balb/C小鼠(雄性，7-8周，20-25g)。在RPMI1640培养基(Gibco BRL，Grand Island，NY)中预培养小鼠巨噬细胞，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS)和2mmol/L谷氨酰胺。如前所述(Rendon-Mitchell等人2003)，通过Ficoll(Ficoll-Paque PLUS，Pharmacia，Piscataway，NJ)经密度梯度离心，将人外周血单核细胞(HuPBMCs)从健康供体的血(Long IslandBlood Bank，Melville，NY)中分离，并培养在补充有10％热灭活人血清/0.2mML-谷酰胺的RPMI1640中。

LPS刺激 如前所述(Chen等人2004；Rendon-Mitchell等人2003；Wang等人1999)，轻轻的用无血清OPTI-MEM I培养基洗涤粘连的巨噬细胞或单核细胞，并将其培养在无血清OPTI-MEM I培养基中两个小时，然后用细菌内毒素刺激(脂多糖、LPS、大肠杆菌0111：B4，Sigma-Aldrich)。在LPS刺激后16小时，测定所述培养基中HMGB1的水平。

草药提取物的制备 各种中草药获自NY-Tongrentang，Inc.(Flushing，New York，USA)，并在水中萃取4个小时(85℃)。通过离心(3300g，20min，4℃)连续除去水溶性级分并过滤(通过0.2μm滤片)，并检查过滤级分的HMGB1-抑制活性。

化学药物来源和原液 ***、可的松和RU486获自Sigma(St.Louis，MO)，并在100％乙醇中制备10mM原液。阿司匹林(Cat.No.A0819)、布洛芬(Cat.No.I0481)、吲哚美辛(Cat.No.I5315)获自LKT Laboratories Inc.(St.Paul，MN，USA)，并在水中制备10mM原液(20mM)。丹参酮I(Cat.No.T0153，98.6％HPLC纯度)，丹参酮IIA(Cat.No.T0154，93.0％HPLC纯度)，和隐丹参酮(Cat.No.C7097，98.8％HPLC纯度)获自LKT Laboratories Inc.，并在二甲亚砜(DMSO)中配制20mM的原液。丹参酮IIA磺酸钠(TSNIIA-SS)获自上海第一生化药业公司，LTD(上海，中国)，并通过使用Nova-pakC18柱(3.9 x 150mm)以及0.065％三氟乙酸(TFA，v/v，在水中)作为流动相的HPLC确定其纯度。样品在1.0ml/min的流速下用0-59％乙腈(v/v，在0.065％TFA中)的线性梯度洗脱12分钟，并在452.2nm波长处监测。使用液相色谱-质谱联用(LC-MS，LCQ DECA XPPLUS，Thermo Electron Corporation)分析每个HPLC峰。主峰(保留时间8.3min)占>80％的HPLC峰下总面积(图1D)，并含有m/z＝373.07(100.0％)的红颜料，对应于C19H17O6S-(丹参酮I IA磺酸盐)的经验式。

内毒素血症和脓毒症的动物模型 本研究获得批准并依据纽约曼哈塞特Feinstein医学研究所的实验动物保护和使用指南进行。如前所述(Chen等人2005；Wang等人1999；Wang等人2006)，通过腹膜内注射细菌内毒素(LPS，15mg/kg)在Balb/C小鼠(雄性，7-8周)中诱导内毒素血症。如前所述(Wang等人2006；Yang等人2002b)，通过盲肠结扎和穿孔(CLP)在雄性Balb/C小鼠(7-8周，20-25g)或Sprague-Dawley大鼠(290-310g)中诱导脓毒症。以指定的剂量和时间点给小鼠腹膜内施用草药成分，监测小鼠存活为期两周。在平行实验中，内毒素血症后28小时(在-0.5和+24h的两剂草药成分后)和在CLP后52小时(在+24和+48h的两剂草药成分后)安乐处死小鼠以收集血液。

TNF ELISA 如前所述(Chen等人2004；Rendon-Mitchell等人2003；Wang等人2006)，使用商购酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Catalog no.MTA00，R & D Systems，Minneapolis，MN)确定培养基或血清中TNF水平，并参考不同稀释度下纯化重组的TNF的标准曲线。

一氧化氮测试 通过基于Griess反应的比色测定测量NO^2-产生来间接确定一氧化氮在培养基中的水平(Rendon-Mitchell等人2003)。NO^2-浓度参照不同稀释度下得到的硝酸钠的标准曲线确定NO^2-浓度。

HMGB1蛋白印迹分析 如前所述(Chen等人2004；Rendon-Mitchell等人2003；Wang等人1999)，通过蛋白印迹分析确定培养基或血清中HMGB1水平。使用NIH image1.59软件定量相对谱带强度以确定HMGB1水平，参照用纯化HMGB1得到的标准曲线。

细胞因子抗体阵列 根据制造商的说明使用小鼠细胞因子抗体阵列(Cat.No.M0308003，RayBiotech Inc.，Norcross，GA，USA)来测定培养基中细胞因子的性质，所述小鼠细胞因子抗体阵列在一个膜上检测62个细胞因子。简言之，所述膜依次用等体积的细胞条件培养基、第一生物素偶联抗体和辣根过氧物酶偶联的链霉抗生物素温育。暴露于X射线胶片后，参照膜上阳性对照采用NIH image1.59软件确定相对信号强度。

免疫细胞化学和细胞分级分离/蛋白印迹 如前所述(Chen等人2004；Rendon-Mitchell等人2003)，LPS刺激后16小时，用抗-HMGB1多克隆抗体免疫染色细胞HMGB1，使用荧光显微镜获得图象(CarlZeiss Microimaging，Inc.，Thornwood，NY)。或者如前所述(Tang等人2006)，通过细胞分级分离/蛋白印迹技术确定HMGB1的定位。细胞分级分离基于非离子去污剂(NP-40)对血浆和细胞核膜的分化溶解。简言之，质膜在低盐缓冲溶液(10mM HEPES，pH7.9；10mM KCl；0.1mM EDTA；0.1mM EGTA；1mM DTT；0.5mM PMSF，1％NP-40)中选择性溶解后，通过快速离心步骤(7,000g，1min，4℃)收集完整的细胞核，将细胞质级分留在上清液中。将所述细胞核沉淀重新悬浮在NP-40高盐缓冲溶液中(20mM HEPES，pH7.9；0.4M NaCl；1mM EDTA；1mM EGTA；1mM DTT；1mM PMSF，1％NP-40)，并简单地超声处理以生成细胞核级分。分级分离后，由Bradford方法确定不同级分的蛋白含量，并通过蛋白印迹分析使用对HMGB1、细胞质蛋白(β-肌动蛋白，Santa Cruz Biot echnology)和细胞核蛋白(PCNA，BD Biosciences)特异性的一抗测试每个级分的各种蛋白质水平。

细胞存活率的测定 如前所述(Rendon-Mitchell等人2003)，通过台盼蓝拒染法估计细胞活力。简言之，将终浓度为0.08％的台盼蓝添加入到细胞培养物中。在25℃温育5分钟后，通过在五个40倍镜下不染色细胞的百分数估计细胞存活率。

组织组织学 在CLP后48小时，将小鼠在CO₂箱中安乐处死，并立即用磷酸缓冲盐溶液和4％多聚甲醛灌注(经心)。收获各种组织，切片，并用苏木精和曙红染色以用于形态学评价。

测量心输出量 如前所述(Yang等人2002b)，在CLP或假手术后20小时使用放射性标记微球技术测量心输出量。简言之，将¹⁴¹Ce-标记微球(4.0μCi，DuPont NEN，Boston，MA)快速注射到左心室，在左心室中其与氧合血在主动脉根部均匀混合，然后经由主动脉血流分配到每个器官中的毛细血管床。参照血样品用泵(Harvard Apparatus，Holliston，MA)从股动脉导管(以0.7ml/min的速率)抽取，之后手工输注等渗氯化钠溶液来替代损失的血液体积。在CLP后20小时，处死动物以收获各种器官，用自动γ计数器(1470 Wizard；Wallac，Gaithersburg，MD)测量放射性。根据下述等式计算心输出量和器官血流量：心输出量＝[(RBF×CT)/Cr]×1/100和器官血流量＝[(RBF×Ct)/Cr]×1/100，其中RBF是参考血样的回流速率(0.7ml/min)，CT是每分钟总注射剂量的计数，Ct是每分钟每克组织的计数，且Cr是每分钟在参考血液样品中的计数。如前所述(Yang等人2002b)，计算心博量(SV)和总外周阻力(TPR)。

统计学分析 数据表示为一式三份的两个独立实验的平均值±SD(n＝2)。使用单因素方差分析比较所有不同组。当ANOVA显著时，使用Tukey检验进行组间差异的事后检验(post-hoc testing)。使用Kaplan-Meier方法比较组间死亡率的差异。认为P值小于0.05是统计学上显著的。

结果

丹参提取物和成分减弱内毒素-诱导的HMGB1释放 成功鉴定水杨酸为柳树皮降低热和疼痛的活性成分导致了第一个合成的非甾族消炎药(NSAID)-阿司匹林。许多NSAIDs(例如阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛)能抑制环氧合酶，但不能保护动物对抗致死性脓毒症(Hasselgren等人1985；Noronha-B l ob等人1993；Vil la等人1995)。所测试的环氧合酶抑制剂(例如，阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛)不能显著地影响LPS-诱导的HMGB1释放，甚至在超药理学浓度时(1-25μM，数据没有显示)。还测试了25种药草。丹参提取物剂量依赖性地减弱内毒素-诱导的HMGB1释放(图1A)。

为了确定丹参的活性成分，检查其抗炎成分的HMGB1-抑制活性。一种潜在的抗炎成分，阿魏酸有效减弱LPS-诱导的一氧化氮产生，但不影响LPS-诱导的HMGB1释放(Wang等人2006)。丹参还含有充足的红颜料(称为丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮)(图1B)，为一组对心血管异常的患者具有药用价值的物质(Ji等人2000)。所有三种丹参酮(I、IIA和隐丹参酮)有效减弱LPS-诱导的HMGB1释放，估计的IC₅₀<25μM(图1C)。

水溶性丹参酮IIA磺酸钠(TSNIIA-SS)选择性减弱内毒素-诱导 的HMGB1 释放大多数丹参酮在生理温度下几乎不溶于水，这种差的水溶性不利地影响其在体内的生物利用度。因此检测了水溶性丹参酮IIA衍生物、TSNIIA-SS(图1B)对于HMGB1的抑制活性。TSNIIA-SS是广泛用于心血管障碍患者的中药(Ji等人2000)，获自上海第一生化药业公司，LTD。HPLC分析(图1D)揭示主峰(>80％，8.3分钟的保留时间)含有m/z＝373.07的红颜料，对应于C19H17O6S-(丹参酮IIA磺酸盐)的经验式。小的HPLC峰(<20％，6.8分钟的保留时间)含有m/z＝389.11的红颜料，对应于C19H17O7S-(丹参酮IIA磺酸盐的未知类似物)的经验式。高度纯化的TSNIIA-SS(通过HPLC>99.0％)剂量依赖性抑制HMGB1释放，估计的IC₅₀<5μM(图2A)。类似地，其有效抑制原代人外周血单核细胞培养物(图2B)和小鼠腹膜巨噬细胞(数据未显示)中LPS-诱导的HMGB1释放。

为了进一步评价其抗炎性质，根据LPS-诱导的其它促炎介质的释放来确定其潜在作用。在完全阻断LPS-诱导的HMGB1释放的浓度(100μM)下，TSNIIA-SS不完全阻断LPS-诱导的一氧化氮(图2A，下图)或TNF(图2B，下图)的释放。此外，当用LPS在高浓度(>200ng/ml)下刺激巨噬细胞时，其对TNF(但不对HMGB1)释放的抑制作用常常丧失，表明对HMGB1抑制的选择性。为了评价该特异性，使用细胞因子蛋白阵列确定其对62个细胞因子释放的影响。在完全阻断LPS-诱导的HMGB1释放的浓度(100μM，数据未显示)下，TSNIIA-SS不抑制RAW264.7细胞(图2C，上排)或原代腹膜巨噬细胞(图2C，下排)中大多数细胞因子的释放，所述细胞因子包括IL-6、IL-12p40/p70、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1γ、MIP-2和TNF。与先前的报导一致(Kang等人2000)，仅TSNIIA-SS部分减弱LPS-诱导的IL-12p70(45±5％)与一些其它细胞因子的释放，例如IL-1α(50±7％)、血小板因子4(PF-4，35±6％)和MCP-5(25±5％)。总之，这些数据表明与其它促炎细胞因子相反，TSNIIA-SS选择性减弱LPS-诱导的HMGB1释放。

TSNIIA-SS 的延迟施用显著减弱内毒素-诱导的HMGB1释放与早期促炎细胞因子(例如TNF)相比，HMGB1在内毒素刺激后以延迟的方式释放。感兴趣的是，如果在LPS刺激后添加TSNIIA-SS是否能抑制HMGB1释放。而同时施用TSNIIA-SS和LPS在抑制HMGB1释放是最有效的，当在LPS后2-6小时加入TSNIIA-SS能保持显著的抑制(图3)。因此通过以延迟方式策略性地施用TSNIIIA-SS使得药理学上减弱晚期作用的促炎介质(例如HMGB1)是可行的。

TSNIIA-SS 通过阻断其细胞质迁移抑制内毒素-诱导的HMGB1释放 为了研究丹参酮-介导的抑制HMGB1释放的机制，根据内毒素-诱导的HMGB1细胞质迁移(HMGB1释放的基本步骤)确定其作用(Chen等人2004；Gardella等人2002；Rendon-Mitchell等人2003)。与先前的报导一致(Chen等人2004)，静态巨噬细胞组成性地表达HMGB1并主要在细胞核内维持细胞内HMGB1“池(pool)”(图4A，左显微图)。在LPS刺激后16小时，在细胞质囊泡中观察到显著的HMGB1染色(图4A，中间显微图)，证实LPS刺激巨噬细胞积极地将核HMGB1迁移至细胞质中，然后将其释放到胞外环境中。尽管TSNIIA-SS不影响HMGB1在静息细胞中的核定位(数据未显示)，其几乎完全阻断大多数内毒素-刺激细胞中LPS-诱导的HMGB1细胞质迁移(图4A，右显微图)，表明TSNIIA-SS通过干扰其细胞质迁移来减弱HMGB1释放。

为了进一步证实上述假设，分离细胞质和细胞核级分，并用分别对HMGB1、PCNA(核蛋白)或β-肌动蛋白(细胞质蛋白)特异性的抗体免疫印记。一致的是，细胞质级分中的HMGB1水平在LPS刺激后显著增加(数据未显示)，但TSNIIA-SS处理后显著降低(图4B)，证实TSNIIA-SS通过干扰细胞质迁移来减弱HMGB1释放。

TSNIIa-SS 以糖皮质激素受体非依赖性机制抑制内毒素-诱导的 HMGB1 释放根据丹参酮和甾族消炎药之间的结构相似(即，四稠合环结构的存在)(图5A)，评价：1)是否皮质甾类类似地减弱LPS-诱导的HMGB1释放；并且2)TSNIIA-SS是否以糖皮质激素受体依赖型机制阻断HMGB1释放。甚至在高至10μM的浓度，***和可的松不能降低LPS-诱导的HMGB1释放(图5B)，尽管它们有效地减弱LPS-介导的TNF分泌(图5C)。甾族消炎药通过结合细胞内糖皮质激素受体来抑制细胞因子(Waage等人1990)，其能被特异性糖皮质激素拮抗剂(例如RU486)抵消。确实，RU486几乎完全阻断***-介导的TNF分泌的抑制(图5C)，但不影响TSNIIA-SS-介导的TNF(图5C)或HMGB1释放(数据未显示)的抑制。总之，这些数据表明TSNIIA-SS和***利用不同机制抑制内毒素-诱导的细胞因子释放。

TSNIIA-SS 对抗致死性内毒素血症的保护作用 根据TSNIIA-SS减弱LPS-诱导的HMGB1释放的能力，在致死性内毒素血症的动物模型中评价其功效。在L.D.₇₅剂量的LPS之后30分钟施用单一剂量的TSNIIA-SS没有显著地改善动物存活率(接受盐水的对照为25％，n＝20小鼠/组；相对接受15mg/kg的TSNIIA-SS的实验组为37.5％，N＝20小鼠/组；P>0.05)。通过用三个附加剂量的TSNIIA-SS(+24，+48和72hr)治疗动物，在存活动物中观察到剂量依赖性改善(从20％到80％，图6A)。此外，施用TSNIIA-SS剂量依赖性地减弱循环的HMGB1水平(140±20ng/ml，LPS+载体；相对40±25ng/m l；n＝10，p<0.01)，表明TSNI IA-SS部分通过减弱全身性HMGB1积累来保护动物对抗致死性内毒素血症。

TSNIIA-SS 挽救患有致死性脓毒症的小鼠 尽管内毒素血症对于研究复杂的细胞因子级联是有用的，但需要更多临床相关的动物模型来研究用于治疗人脓毒症的治疗剂。一个很好表征的、标准的脓毒症动物模型由CLP诱导。根据实验脓毒症中HMGB1积累的晚期和延长动力学(Yang等人2004)，理论认为甚至在脓毒症发作后施用TSNIIA-SS也可能挽救患有脓毒症的小鼠。在脓毒症发作后24小时给予第一剂量的TSNIIA-SS，在该时间点小鼠表现明显脓毒症征兆(包括瞌睡、腹泻竖毛)。在脓毒症发作后24小时，腹膜内施用单一剂量的TSNIIA-SS不能改善存活率(接受盐水的对照为33％，n＝24小鼠/组；相对接受15mg/kg的TSNIIA-SS的实验组为50％，n＝24小鼠/组，P>0.05)。然而，在脓毒症发作后24小时开始重复施用TSNIIA-SS(接下来在脓毒症后48、72和96小时施用附加剂量)，赋予对抗致死性脓毒症的剂量依赖性保护(N＝30小鼠/组，图6B)，显著增加了动物存活率从33％到73％(P<0.05)。

TSNIIA-SS  减弱脓毒症-诱导的全身性HMGB1积累和肝损伤为了了解其保护机制，评价了TSNIIA-SS对TNF、一氧化氮和HMGB1的全身性积累的影响。与早期报导一致(Villa等人1995)，全身性TNF仅在脓毒症晚期能检测到。在脓毒症发作后52小时的延迟施用TSNIIA-SS没有减弱循环TNF水平(TNF＝65+15ng/L，载体对照组，N＝10小鼠/组；相对TNF＝85+23ng/L，TSNIIA-SS组，N＝10小鼠/组；P>0.05)。类似地，在脓毒症发作后52小时的延迟施用TSNIIA-SS没有减弱循环一氧化氮水平(18.0±4.5μmol/L，载体对照组；相对15.5±3.3μmol/L，TSNIIA-SS；n＝3，P>0.05)。相反，重复施用TSNIIA-SS剂量依赖性地、和显著地减弱脓毒症小鼠中循环HMGB1水平(图7A，P<0.05)，表明TSNI IA-SS部分通过减弱全身性HMGB1积累来赋予对抗致死性脓毒症的保护作用。

为了确定全身性HMGB1积累的减弱是否通过对抗脓毒症-诱导的组织损伤的保护作用实现，进行验尸，其中在脓毒症发作后48小时通过组织学检查组织。与先前报导一致(Zhou等人1998)，在心、肾、肠和大脑中没有显著的组织学变化(数据未显示)，证实了这个想法：脓毒症与这些组织中的任何病理特征变化无关(Hotchkiss and Karl2003)。然而，与先前的报导一致(Ayala等人2000；Qin等人2006)，在对照组(盐水)的2个(总共12个)存活动物中发现肝坏死病灶(图7B)。值得注意的是，在对照组的3个(总共15个)动物中不能评价肝损伤，所述三个动物死于早期(CLP后36-48小时)，在接下来的器官损伤评估中排除这3只死亡的动物可能导致低估TNSIIA-SS-介导的保护作用。相反，在15个实验组存活动物中没有观察到这些肝坏死的征兆(TSNIIA-SS，15mg/kg，图7B)。

TSNIIA-SS 对抗脓毒症-诱导的心功能不全的保护作用 因为TSNIIA-SS已经成功地用于心血管障碍的患者(Ji等人2000)，我们还评价了其是否能改善脓毒症动物的心血管功能。尽管没有心肌损伤(Zhou等人1998)，在心血管功能上有心力不足的变化，体现在晚期阶段(例如，脓毒症发作后20小时)心输出量的显著降低(Yang等人2002b)。施用TSNIIA-SS没有显著影响平均动脉血压(106.1±4.7mmHg，CLP组；相对96.4±8.7mmHg；n＝6，p>0.05)，但轻微降低了心率(378.3±25.1心跳/分钟，CLP组；相对334.1±25.8心跳/分钟，CLP+TSNIIA-SS，15mg/kg，n＝6，p<0.05)。更重要地，其剂量依赖性地降地总外周血管阻力(图8A)，并仍然显著增加心脏心博量(图8B)和心输出量(图8C)。总之，这些数据表明TSNIIA-SS(在中国用于心血管障碍患者的一种有效药物)似乎在对抗脓毒症动物模型中的脓毒症-诱导的心血管功能障碍具有保护作用。

讨论

致死性脓毒症的病因仍不清楚，但与异常调节的炎性反应、组织损伤和多器官功能失调有关。炎症反应部分由细菌内毒素介导(Ayala等人2000)，其刺激巨噬细胞/单核细胞连续释放早期促炎细胞因子(例如，TNF和IL-1)和晚期促炎细胞因子(例如，HMGB1)。尽管早期细胞因子在对抗感染方面具有保护作用(Es kandari等人1992)，由晚期作用的介质(例如HMGB1)维持的异常调节的炎症反应可能促进在致死性脓毒症晚期形成组织损伤和器官功能失调。因此，能选择性减弱全身性HMGB1累积的试剂可能具有治疗致死性脓毒症的潜力。

许多非甾族消炎药(NSAIDs，例如，阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛)不能抵御致死性脓毒症(Villa等人1995)，同样不能显著抑制LPS-诱导的HMGB1释放(Hasselgren等人1985；Noronha-Blob等人1993)。另一方面，中草药丹参包含药学物质(例如丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮)，所述药学物质能有效减弱巨噬细胞/单核细胞培养物中内毒素-诱导的HMGB1释放。然而，由于差的溶解性和生物利用度，丹参酮I和丹参酮IIA不能挽救患致死性脓毒症的小鼠，甚至在脓毒症发作后24、48、72、和96小时重复施用后(存活率＝50％，对照载体组；相对存活率＝57％，TSNI组，12mg/kg；存活率＝61％，TSNIIA组，12mg/kg；N＝14小鼠/组，p>0.05)，这迫使我们去研究作为潜在治疗剂的其它水溶性衍生物。

用于心血管障碍患者的临床批准药物TSNIIA-SS完全阻断巨噬细胞/单核细胞培养物中内毒素-诱导的HMGB1释放。TSNIIA-SS抑制内毒素-诱导的HMGB1释放的机理仍不清楚，但部分归因于其干扰LPS-诱导的HMGB1细胞质迁移的能力。尽管包含与糖皮质激素类似的骨架化学结构，因为特异性糖皮质激素受体拮抗剂RU486不能消除TSNIIA-SS-介导的HMGB1释放的抑制，所以TSNIIA-SS似乎不使用糖皮质激素受体来抑制HMGB1释放。有意思的是，丹参酮I能抑制磷酸脂酶A2(Kim等人2002)，磷酸脂酶A2为一种通过产生溶血磷脂酰胆碱来增强内毒素-诱导的HMGB1释放的酶(Chen等人2005)。类似地，隐丹参酮能抑制乙酰胆碱酯酶(Gardella等人2002)，乙酰胆碱酯酶为消除HMGB-1-抑制的神经递质、乙酰胆碱的酶(Borovikova等人2000；Ren等人2004；Wang等人2004b)。因此，在未来研究中确定TSNIIA-SS是否通过抑制sPLA2或乙酰胆碱而抑制HMGB1释放是重要的。

在完全阻断LPS-诱导的HMGB1释放的浓度下，TSNIIA-SS不影响大多数(62个中的58个)其它细胞因子的释放，表明在大多数其它细胞因子中对抑制HMGB1具有选择性。甚至当在LPS刺激后几个小时给药，TSNIIA-SS在阻断HMGB1释放方面仍是有效地，使其与所有先前已知的HMGB1抑制剂不同(包括丙酮酸乙酯、尼古丁和硬脂酰基溶血磷脂酰胆碱)(Chen等人2005；Ulloa等人2002；Wang等人2004b)。这些独特的性质使我们能以延迟的方式策略性地施用TSNIIA-SS选择性的减弱在脓毒症晚期的全身性HMGB1累积。确实，在CLP后24小时开始延迟施用TSNIIA-SS，在该时间点所有小鼠出现明显的脓毒症征兆(一些小鼠开始死亡)，显著地挽救患有脓毒症的小鼠。

TSNIIA-SS不能减弱全身性一氧化氮累积，并且不能增加脓毒症晚期的平均动脉压力的观察与一氧化氮依赖性保护机制有争议。尽管TSNIIA-SS有时能降低单核细胞中LPS-诱导的TNF分泌(但在巨噬细胞中不能)，其TNF-抑制活性不能说明其对抗致死性脓毒症的保护作用。首先，CLP后几个小时内TNF全身性地积累(Villa等人1995)，远远早于策略性延迟施用TSNIIA-SS(CLP后24小时)。同样地，我们观察到延迟施用TSNIIA-SS没有显著减弱在脓毒症晚期的TNF全身性积累。其次，TNF可能在脓毒症中具有保护作用，因为用中和抗体来抑制TNF活性没有改善，实际上反而恶化脓毒症动物模型中的存活(Eskandari等人1992)。然而，仍需要确定TSNIIA-SS的TNF抑制活性是否归因于其对抗致死性内毒素血症的保护作用。

形成强对比的是，延迟施用TSNIIA-SS显著减弱全身性HMGB1累积，表明TSNIIA-SS部分通过减弱晚期作用的促炎介质的全身性累积来挽救致死性脓毒症小鼠。然而，本研究不能消除这个可能性：TSNIIA-SS通过其它机理赋予对抗致死性内毒素血症或脓毒症(例如抑制HMGB1-介导的炎症反应)的保护作用。确实，我们初步的实验数据表明TNSIIA-SS在高达100μM的浓度下有效减弱小鼠巨噬细胞培养物中HMGB1-诱导的TNF(50-60％)和一氧化氮(90-95％)的释放，表明TSNIIA-SS可以通过抑制HMGB1释放和细胞因子活性来改善动物存活。

重复施用TSNIIA-SS阻断在脓毒症晚期形成肝损伤。值得注意的是，评估主要发生在脓毒症晚期(而不是早期)的器官损伤毫无疑问是有问题的。例如，肝损伤不能在死于早期(CLP后36-48小时)的3只(总共15只)动物中评价，尽管这些动物在死亡前可能类似遭受肝损伤。所以，在随后的器官损伤评估中排除死亡的动物会导致低估TNSIIA-SS-介导的对抗肝损伤的保护作用，特别是根据观察：HMGB1-特异性单克隆抗体类似地改善肝损伤(Qin等人2006)。

为了应答脓毒症损伤，啮齿动物发展了早期增强的心血管应答，其特征在于CLP后5小时心输出量的增加和总外周阻力的降低，之后为一个晚期衰弱的心血管应答，其表现为CLP后20-24小时心输出量的降低和总外周阻力的增加(Yang等人2002a)。作为用于中国心血管障碍患者的有效药剂，TSNIIA-SS显著降低脓毒症动物中总外周血管阻力，但显著增加心博量和心输出量。临床上，一些重症脓毒症患者具有正常或高的心输出量，这引起了一个关于提高重症脓毒症患者心输出量(改善氧的递送)和降低全身血管阻力(改善组织氧合作用)的必要性的持续争议，(Sharma and Dellinger 2003；Vincent 2003)。

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综上所述，将发现获得了本发明的几个优点和其他附带的优点。

由于在不背离本发明范围内可以对上述方法和组合物进行各种改变，意图将包含在上述描述中和显示于附图中的所有内容理解为是说明性的而不是限制性的。

本说明书中引用的所有文献通过参考并入本文。本文参考文献的讨论只是意图总结作者所作的***，并不承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留挑战所引用的参考的准确性和相关性的权利。

Claims (73)

1.减弱促炎细胞因子从哺乳动物细胞释放的方法，所述方法包括使所述细胞与有效减弱促炎细胞因子从该细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

2.权利要求1的方法，其中所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物。

3.权利要求1的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

4.权利要求1的方法，其中所述细胞是巨噬细胞。

5.权利要求1的方法，其中所述促炎细胞因子是HMGB1。

6.权利要求1的方法，其中所述促炎细胞因子是TNF。

7.权利要求1的方法，其中所述细胞在哺乳动物中，所述哺乳动物处于促炎细胞因子介导的病症的风险中或患有促炎细胞因子介导的病症。

8.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是人。

9.权利要求7的方法，其中所述病症是阑尾炎、胃溃疡、胃或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、急性或缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、弛缓不能、胆管炎、胆囊炎、肝炎、克罗恩氏病、肠梗阻、肠炎、惠普耳氏病、哮喘、***反应、过敏性休克、免疫复合疾病、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血病、内毒素性休克、恶病质、高热、嗜曙红细胞肉芽肿、结节病、肉状瘤病、脓毒性流产、***、***炎、***炎、尿道炎、支气管炎、气肿、鼻炎、囊性纤维化、肺炎、矽肺病、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、窦炎、流行性感冒、呼吸道合胞体病毒感染、疱疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、弥漫性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿米巴病、包虫囊肿、烧伤、皮炎、皮肌炎、晒伤、荨麻疹、疣、风疹块、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉硬化症、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌缺血、结节性动脉周围炎、风湿热、阿尔茨海默症、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化、脑梗塞、脑栓塞、Guillame-Barre综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、瘫痪、葡萄膜炎疹、关节炎疹、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、***性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、白塞氏综合征、同种异体移植物排异反应、移植物抗宿主疾病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔氏病、Retier氏综合征或何杰金氏病。

10.权利要求7的方法，其中所述病症是阑尾炎、胃溃疡、胃或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、急性或缺血性结肠炎、类风湿性关节炎、肝炎、克罗恩氏病、哮喘、***反应、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、器官坏死、花粉热、脓毒症、败血病、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、弥漫性菌血症、烧伤、阿尔茨海默症、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑梗塞、脑栓塞、脊髓损伤、瘫痪、同种异体移植物排异反应和移植物抗宿主疾病。

11.权利要求7的方法，其中所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。

12.权利要求7的方法，进一步包括给所述哺乳动物施用第二种抗炎药。

13.权利要求12的方法，其中所述第二种抗炎药是NSAID、水杨酸酯、COX抑制剂、COX-2抑制剂或甾族化合物。

14.权利要求12的方法，其中所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，并且第二种治疗是施用毒蕈碱激动剂、肾上腺髓质素、肾上腺髓质素结合蛋白、乳脂肪球表皮生长因子VIII、激活蛋白C或α_2A-肾上腺素能拮抗剂。

15.抑制哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法，所述方法包括用有效抑制炎性细胞因子级联的量的水溶性丹参酮治疗所述哺乳动物，其中所述哺乳动物患有由炎性细胞因子级联介导的病症。

16.权利要求15的方法，其中所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物。

17.权利要求15的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

18.权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人。

19.权利要求15的方法，其中所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，所述哺乳动物是人并且所述丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

20.治疗哺乳动物中炎性细胞因子级联的方法，所述方法包括用有效抑制炎性细胞因子级联的量的丹参酮治疗所述哺乳动物，其中所述哺乳动物患有由炎性细胞因子级联介导的病症。

21.权利要求21的方法，其中所述丹参酮是水溶性丹参酮。

22.权利要求21的方法，其中所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物。

23.权利要求21的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

24.权利要求20的方法，其中所述病症是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克，所述哺乳动物是人并且所述丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

25.治疗处于脓毒症、败血病和/或内毒素性休克风险中的哺乳动物的方法，所述方法包括以有效减少或防止内毒素性休克生理效应的方式，用丹参酮IIA磺酸钠治疗所述哺乳动物。

26.权利要求25的方法，其中所述生理效应是HMGB1释放。

27.权利要求25的方法，其中所述生理效应是TNF释放。

28.权利要求25的方法，其中所述生理效应是NO释放。

29.权利要求25的方法，其中所述生理效应是致死性脓毒症。

30.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物是人。

31.治疗遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的哺乳动物的方法，所述方法包括以有效减少或防止脓毒症、败血病和/或内毒素性休克生理效应的方式，给所述哺乳动物施用纯化丹参酮。

32.权利要求31的方法，其中所述丹参酮是丹参酮I、丹参酮IIA或隐丹参酮。

33.权利要求31的方法，其中所述丹参酮是水溶性丹参酮。

34.权利要求33的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

35.权利要求31的方法，其中所述生理效应是HMGB1释放。

36.权利要求31的方法，其中所述生理效应是TNF释放。

37.权利要求31的方法，其中所述生理效应是NO释放。

38.权利要求31的方法，其中所述生理效应是致死性脓毒症。

39.权利要求31的方法，其中所述哺乳动物是人。

40.治疗遭受脓毒症、败血病和/或内毒素性休克的哺乳动物的方法，所述方法包括以有效减少或防止脓毒症生理效应的方式，用包含丹参或其提取物的组合物治疗所述哺乳动物，其中所述组合物不包含降香。

41.权利要求40的方法，其中所述组合物包含丹参。

42.权利要求40的方法，其中所述组合物包含丹参的提取物。

43.权利要求40的方法，其中所述提取物包含有机组分，其中至少5wt％的有机组分是丹参酮。

44.权利要求43的方法，其中至少10wt％的有机组分是丹参酮。

45.权利要求43的方法，其中至少25wt％的有机组分是丹参酮。

46.权利要求43的方法，其中至少50wt％的有机组分是丹参酮。

47.权利要求43的方法，其中至少80wt％的有机组分是丹参酮。

48.权利要求43的方法，其中至少95wt％的有机组分是丹参酮。

49.权利要求40的方法，其中所述生理效应是HMGB1释放。

50.权利要求40的方法，其中所述生理效应是TNF释放。

51.权利要求40的方法，其中所述生理效应是NO释放。

52.权利要求40的方法，其中所述生理效应是致死性脓毒症。

53.权利要求40的方法，其中所述哺乳动物是人。

54.减弱NO从哺乳动物细胞释放的方法，所述方法包括使所述细胞与有效减弱NO从所述细胞释放的量的水溶性丹参酮接触。

55.权利要求54的方法，其中所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物。

56.权利要求54的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

57.权利要求54的方法，其中所述细胞是活的哺乳动物的部分，所述哺乳动物处于由过量NO产生介导的障碍的风险中或患有由过量NO产生介导的障碍。

58.权利要求57的方法，其中所述障碍是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症、痴呆(包括AIDS相关的神经变性、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏精神病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。

59.权利要求57的方法，其中所述障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。

60.权利要求57的方法，其中所述哺乳动物是人。

61.减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物处于由过量NO产生介导的障碍的风险中，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱所述哺乳动物中NO产生的量的水溶性丹参酮。

62.权利要求61的方法，其中所述水溶性丹参酮是天然存在的丹参酮的磺酸钠衍生物。

63.权利要求61的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

64.权利要求61的方法，其中所述障碍是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症、痴呆(包括AIDS相关的神经变性、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏精神病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。

65.权利要求61的方法，其中所述障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。

66.权利要求61的方法，其中所述哺乳动物是人。

67.减弱哺乳动物中NO产生的方法，所述哺乳动物患有由过量NO产生介导的障碍，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效减弱所述哺乳动物中NO产生的量的纯化丹参酮。

68.权利要求67的方法，其中所述丹参酮是丹参酮I、丹参酮IIA或隐丹参酮。

69.权利要求67的方法，其中所述丹参酮是水溶性丹参酮。

70.权利要求67的方法，其中所述水溶性丹参酮是丹参酮IIA磺酸钠。

71.权利要求67的方法，其中所述障碍是休克、回肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、哮喘、支气管炎、氧化剂诱导的肺损伤、慢性阻塞性气道疾病、角膜营养不良、高眼压症、沙眼、盘尾丝虫病、视网膜炎、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、牙周炎、关节炎、脓毒性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉状瘤、肾病、硬化性皮炎、晒伤、牛皮癣、湿疹、肌萎缩侧索硬化、硬化症、痴呆(包括AIDS相关的神经变性、阿尔茨海默病、脑脊髓炎、病毒或自体免疫脑炎)、免疫复合血管炎、***性红斑狼疮、缺血性心脏病、心力衰竭、心肌病、肾上腺机能不全、高胆固醇血症、动脉硬化症、骨质疏松症、先兆子痫、子痫、***并发症、慢性肝功能衰竭、中风、脑缺血、囊性纤维化、结核病、恶病质、缺血/再灌注、血液透析有关病症、肾小球性肾炎、再狭窄、病毒感染的炎性后遗症、低氧症、高压氧惊厥及中毒、痴呆、西登哈姆氏舞蹈病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、癫痫、科尔萨科夫氏精神病、脑血管障碍相关的低能、NO介导的脑外伤及相关后遗症、缺血性脑水肿(中风)、疼痛、偏头痛、呕吐、免疫复合疾病，如免疫抑制剂、急性同种异体移植物排异反应或癌症。

72.权利要求67的方法，其中所述障碍是脓毒症、败血病和/或内毒素性休克。

73.权利要求67的方法，其中所述哺乳动物是人。

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