CN101393208A

CN101393208A - 一种黄曲霉毒素b1的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101393208A
Application number: CN 200810155491
Authority: CN
Inventors: 黄飚; 金坚; 张艺; 高雷
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2008-10-07
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2028-10-07
Also published as: CN101393208B

Abstract

一种黄曲霉毒素B₁的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析技术领域。包被AFB₁－BSA发光微粒加入微孔板，顺序加入AFB₁标准或样品、兔抗AFB₁抗体和生物素化羊抗兔抗体避光反应，避光加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。包被在发光微粒上AFB₁－BSA与标准或样品中AFB₁竞争连接到AFB₁抗体，与生物素化羊抗兔抗体及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中AFB₁浓度成反比，对照标准曲线确定被测样品中AFB₁含量。本发明用于对粮食，饲料及其制品中AFB₁含量检测，提供的试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

Description

一种黄曲霉毒素B1的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法

技术领域

一种黄曲霉毒素B₁的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于对饲料，谷物及其制品中AFB₁含量的检测。

背景技术

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是真菌黄曲霉Hspergillus flavus和寄生曲霉A.parasilicus菌株产生的一组强毒性的次生代谢产物，尤其是AFB₁为强污染物质，分布范围广，能引起人类、各种饲料动物的急性中毒死亡，还能引起致癌，致畸，致突变，即使几十μg/kg的含量仍有很大的毒性。食品和饲料中黄曲霉毒素1mg/kg以上有剧毒。其毒性为氯化钾的10倍，为砒霜的68倍。食用被黄曲霉毒素污染严重的食品后可出现发热，腹痛，呕吐，食欲减退，严重者在2～3周内出现肝脾肿大，肝区疼痛，皮肤黏膜黄染，腹水，下肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状，也可能出现心脏扩大，肺水肿，甚至痉挛，昏迷等症。由于不易防止食物被真菌污染，因此人们对长期食用低剂量黄曲霉毒素污染的可能性非常关注。由于黄曲霉毒素特别是B₁是潜在的致癌物质，人长期接触低剂量的黄曲霉毒素可能会有影响，1988年国际癌症研究机构将AFB₁列为1A类致癌物质。

AFB₁是最强的致癌物质，它在食物中的法定限量非常低，其限量标准为2μg/kg。欧盟委员会对婴幼儿食品中的毒素限量标准进行了补充。草案规定，在包括谷类食品在内的婴幼儿食品中，毒性最大的AFB₁的最大限量为0.05μg/kg。

目前AFB₁的测定方法有多种，如：薄层色谱法TLC(灵敏度为5μg/kg)，高效液相色谱法HPLC(灵敏度为0.02μg/kg)，但由于费时，灵敏度低，仪器设备昂贵，操作复杂且不适用于大批量样品的检测等缺点。酶联免疫测定法(ELISA)，由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，不需直接接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们重视和采用。

光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。LICLIA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒的表面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。

LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测AFB₁的试剂盒及其检测方法，采用光激化学发光免疫分析法(LICLIA)检测AFB₁，用于对饲料、谷物及其制品中AFB₁含量的检测。

本发明其技术方案：一种黄曲霉毒素B₁的光激化学发光免疫分析试剂盒，黄曲霉毒素B₁简称AFB₁，其由白色不透明微孔板(1)，AFB₁标准(2)，连接AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒(3)，兔抗AFB₁的抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。

连接AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％的Tween-20，0.05mg AFB₁-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL 0.3M、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接AFB₁-BSA的发光微粒，稀释后备用。

AFB₁标准(3)，从AFB₁纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水体积比3∶7，AFB₁标准共6瓶，AFB₁浓度分别为：0ng/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL。

用所述的试剂盒检测AFB₁的方法，取包被有AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗AFB₁抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着暗处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入AFB₁标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。

检测AFB₁的具体操作为：取20μL包被有AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗AFB₁抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。

样品处理，玉米、谷物样品处理：将样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5mL，提取液为甲醇∶水体积比7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

本发明的有益效果：本发明测定的基础是标记免疫反应。该检测试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

附图说明

图1：检测AFB₁的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、AFB₁标准，3、连接AFB₁人工抗原的发光微粒，4、AFB₁的抗体冻干品，5、生物素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。

图2：AFB₁-LICLIA反应示意图。

图3：AFB₁-LICLIA标准曲线图。

具体实施方案

实施例1：制备试剂盒和检测玉米样品

发光微粒和包被有链霉亲和素的感光微粒均购于博阳生物科技(上海)有限公司。

包被有AFB₁人工抗原的发光微粒制备：

在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1％Tween-20，0.05mgAFB₁-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL0.3M、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接AFB₁-BSA的发光微粒，稀释后备用。

试剂的配制：

AFB₁标准品的配制：AFB₁标准(0ng/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL)，从AFB₁纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝3∶7。

试剂盒的组成：

(1)、白色不透明微孔板(12条×8孔，可以拆分为单孔)。

(2)、1×包被有AFB₁人工抗原的发光微粒：2mL。

(3)、6×AFB₁标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，0.05，0.5，1，10，100ng/mL。

(4)、1×兔抗AFB₁抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(5)、1×生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(6)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒：20mL。

测定时注意事项

1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、在所有恒温孵育过程中避免光线照射。

具体检测步骤如下：

先将样品进行处理：将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5mL(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

取20μL包被有AFB₁-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的AFB₁标准品或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗AFB₁抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。结果见表1，由标准曲线求得该例样品所含AFB₁浓度为0.45ng/mL。

表1

实施例2：大麦样品测定

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测大麦样品。

具体检测步骤如下：

先将大麦样品进行处理：将大麦样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5mL(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

取20μL包被有AFB₁-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗AFB₁抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。结果见表2，由标准曲线求得该例样品所含AFB₁浓度为0.17ng/mL。

表2

Claims

1、一种黄曲霉毒素B₁的光激化学发光免疫分析试剂盒，黄曲霉毒素B₁简称AFB₁，其特征是由白色不透明微孔板(1)，AFB₁标准(2)，连接AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒(3)，兔抗AFB₁的抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是连接AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％的Tween-20，0.05mg AFB₁-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL 0.3M、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接AFB₁-BSA的发光微粒，稀释后备用。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是AFB1标准(3)，从AFB₁纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水体积比3∶7，AFB₁标准共6瓶，AFB₁浓度分别为：0ng/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL。

4、一种用权利要求1所述的试剂盒检测AFB₁的方法，其特征是取包被有AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗AFB₁抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着暗处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入AFB₁标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。

5、根据权利要求4所述的检测AFB₁的方法，其特征是操作为：取20μL包被有AFB₁-BSA人工抗原的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗AFB₁抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的AFB₁含量。

6、根据权利要求4所述的检测AFB₁的方法，其特征是样品处理，玉米、谷物样品处理：将样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5mL，提取液为甲醇∶水体积比7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。