CN101392229B - 一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,涉及一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用,主要是对妥布霉素产生菌中氨甲酰转移酶基因实施了破坏,菌种不再产生氨甲酰妥布霉素,而是产生妥布霉素。本发明通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因,包括构建tacA基因阻断质粒、阻断质粒pSPU303转化黑暗链霉菌H6、筛选双交换菌株与发酵产物检测、新组分鉴定。框架内删除失活的方法为PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段,将两者同时连接到pIJ2925中,再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因ermE,利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。本发明可以简化生产工艺、降低生产成本,便于进行产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于抗生素制药领域,涉及一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用,具体地说,本发明是利用分子生物学操作技术,阻断黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)生物合成基因tacA,获得直接产生妥布霉素的基因工程菌株,可以在抗生素制药中应用。
背景技术
黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)是1967年美国礼莱公司的研究人员从土壤中分离得到的,该菌株能产生一组抗生素,其中2、4、5’为主组分。组分2为安普霉素(Apramycin,Am),组分4为6”-O-氨甲酰卡那霉素B(6”-O-Carbamoylkanamycin B,CKB),组分5’为6”-O-氨甲酰妥布霉素(6”-O-Carbamoyl tobramycin,CTB)。组分4、5’经高温水解后分别形成卡那霉素B和妥布霉素。
妥布霉素是一种广谱高效的抗生素,在体外对多种细菌有抗菌活性,特别是某些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效,而且妥布霉素的耳、肾毒性相对较低,是临床上广泛应用的抗菌药。
多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和优化生产工艺等方面取得一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究,已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得长足的进步。在分子水平,李天伯等克隆到一段50Kb区域,证明其中含有参与妥布霉素合成的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶。Madan Kumar Kharel等利用同源杂交的方法克隆到一段13.8Kb氨甲酰妥布霉素生物合成基因簇,证明了其中tbmA、tbmB的基因功能,推断出氨甲酰妥布霉素的生物合成途径。
目前,妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中分离得到氨甲酰妥布霉素,再经碱性条件下高温水解获取妥布霉素。该方法的缺点是杂质多,产品收率低,生产成本高。
随着分子生物学技术的发展,使得利用基因工程的方法改造抗生素组分成为可能。Madan Kumar Kharel等克隆到黑暗链霉菌中妥布霉素部分合成基因簇,Blastn发现其中基因TacA为氨甲酰基转移酶,可能与6”位氨甲酰基合成有关。
发明内容
本发明的目的是通过对tacA失活的方法,获得能直接产生妥布霉素的工程菌,该菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏,保藏编号为CGMCC No.2409。
本发明通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因,主要包括以下几个步骤:
A、tacA基因阻断质粒的构建;
B、阻断质粒转化黑暗链霉菌;
C、转化子的筛选;
D、新组分妥布霉素的鉴定。
框架内删除失活的方法为PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段,将两者同时连接到pIJ2925中,再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因ermE,利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。
其中转化是以E.coliET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。筛选为先筛选红霉素抗性(ermR)菌株,无药传代后再从中筛选到红霉素敏感(ermS)菌株,从中筛选到产新组分的转化子。鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用MS分析和HPLC-ELSD。
本发明既简化了生产工艺、又降低了生产成本,同时也更便于进行产品的质量控制。
本发明所述菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)登记保藏,其分类命名为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius),保藏编号为CGMCC No.2409。
附图说明
图1是tacA基因双交换原理及酶切位点示意图
图2是基因工程菌发酵产物组分TLC分析
1为妥布霉素标准品,2为黑暗链霉菌H6(pSPU303-3),3为野生型菌株黑暗链霉菌H6。A为氨甲酰妥布霉素,B为妥布霉素,C为安普霉素。
图3是妥布霉素标准品和新组分的HPLC-ELSD图谱
A为妥布霉素标准品,B为新组分
图4是新组分的质谱分析图谱
具体实施方式
实施例1:
本发明主要包括以下主要步骤:
1.构建tacA基因阻断质粒
根据Madan Kumar Kharel等发表的妥布霉素生物合成基因簇序列(GenBank Accession Number AJ579650),分别在tacA基因上下游设计两对引物,以黑暗链霉菌总DNA为模板进行PCR扩增获得两个片段PCR1-2和PCR3-4。将两片段连接产物命名为ΔtacA,其删除了tacA基因5’端111个碱基、内部260个碱基和3’端88个碱基。将ΔtacA连到载体pIJ2925中获得pSPU301。再往pSPU301中的KpnI位点连入红霉素抗性基因ermE(pXZ1经KpnI酶切回收约1.6Kb大小片段)获得重组质粒pSPU302,最后利用BglII酶切将ΔtacB+ermE连接到载体pHZ132中BamHI位点,获得 阻断质粒pSPU303。
2.阻断质粒pSPU303转化黑暗链霉菌H6
将阻断质粒pSPU303转入E.coliET12567(pUZ8002)中,得到供体菌E.coliET12567(pUZ8002,pSPU303)。然后通过结合转移的方法转化黑暗链霉菌H6孢子,28℃培养20h后用红霉素和吡啶酸(终浓度分别为100μg/mL和50μg/mL)水溶液覆盖,28℃继续培养5-6天长出转化子,将所获得的ermR转化子在含有红霉素(200μg/mL)和PPA(50μg/mL)的R2YE培养基上42℃分区划线培养,48h长出菌落,因为阻断质粒不能在42℃复制,只能通过同源交换整合到染色体上之后结合子才能生长,表现出对红霉素抗性。证明结合子发生了单交换整合。随机挑起一株命名为黑暗链霉菌H6(pSPU303)。
3.筛选双交换菌株与发酵产物检测
将ermR转化子在无药合V平板上连续传三代后,挑取单菌落分别点种到无药合V平板和含药合V(红霉素100μg/mL)平板,从544株中筛选获得32个ermS菌株。分别命名为黑暗链霉菌H6(pSPU 303-1)至H6(pSPU303-32)。对该32个菌株进行发酵,过滤收集发酵液,滤液通过硅胶GF254薄层层析、生物显影发现,所有菌株均能正常产生安普霉素,但黑暗链霉菌H6(pSPU303-3)不再产生6”-O-氨甲酰妥布霉素,而产生一个Rf值与妥布霉素的Rf值相近的新组分。
4.新组分鉴定
提取发酵液中新组分有如下几个步骤:
A、粗提
发酵液稀释后分别酸化、碱化除蛋白后,用732树脂静态吸附6~8小时。而后用6倍量的3%氨水进行解吸,当流出液达pH 9.0以上时,串联到相当732树脂1/5体积的711树脂柱上,收集树脱液,浓缩为原体积的1/8~1/10。
B、分离
浓缩液(pH7.0~7.5)上D151树脂进行动态吸附。洗涤后分别用0.15mol/L和0.3mol/L的氨水进行洗脱,洗脱流速1/100~1/150/分,以磷钨酸控制终点,收集0.3mol/L的氨水洗脱液。硫酸调pH至7.0~7.5,D152动态吸附,无盐水洗涤后分别用0.1mol/L和0.15mol/L的氨水进行洗脱,洗脱流速1/100~1/150/分,以磷钨酸控制终点,收集0.15mol/L的氨水洗脱液。
C、精制、结晶
把0.15mol/L的氨水洗脱液进行浓缩,用硫酸调至pH 5.5~6.0,然后上已处理好的732树脂柱动态吸附,无盐水洗涤。再用3%氨水进行洗脱,收集解吸液2-3倍量。之后浓缩至10万单位/毫升,加入0.5%(w/v)活性炭,50~60℃搅拌脱色1小时,抽滤得脱色液。脱色液浓缩至20万单位 /毫升,得到浓缩液。
在搅拌下,缓慢向浓缩液中滴加入10倍量的乙醇进行结晶,此过程需要3~4小时,之后用离心机分离,85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。
将得到的湿成品真空干燥,真空度500mmHg以上,温度60℃,干燥6小时,即得成品。
成品用于HPLC-ELSD分析(图3)和质谱(图4)。液相条件:流动相0.2mol/L三氟乙酸溶液∶甲醇(95∶5),流速为1.0mL/min,检测器为SofTA200s ELSD,漂移管温度为105℃,雾化管温度为40℃,色谱柱Dikma C18(5μm,200×4.6mm)。
实施例2:利用妥布霉素基因工程菌生产妥布霉素
本发明提供的妥布霉素基因工程菌可直接用于生产,菌种经发酵后提取妥布霉素,作为抗菌药物。
1.妥布霉素基因工程菌的摇瓶发酵
种子培养基:生黄豆粉10g,葡萄糖10g,蛋白胨3g,酵母粉1g,玉米粉5g,CaCO3(轻质)1g,加自来水至1L。
发酵培养基:可溶性淀粉20,生黄豆粉20g,葡萄糖10g,NH4Cl5g,CaCO3(轻质)5g,MgSO4 4g,FeSO4 0.05g,ZnSO4 0.03g,MnCl2 0.3g,豆油0.6mL/40mL,加自来水至1L。
将实例1中步骤3获得的基因工程菌黑暗链霉菌H6(pSPU303-3)进行摇瓶发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于合成V号斜面,37℃培养7天,挖块接种于种子培养基(装量为20mL/250mL三角瓶),37℃摇床培养18h(转速为180rpm,偏心距4.0cm)。按10%接种量转种于发酵培养基(装量为40mL/250mL三角瓶),37℃摇床培养120h(转速为180rpm,偏心距4.0cm)。
2.发酵产物的HPLC-ELSD分析
1)样品提取纯化:按实例1中步骤4中离子交换法提取发酵液中的妥布霉素组分,省略了传统工艺中高温碱性水解步骤,提高了回收率,降低了生产成本。
2)HPLC-ELSD分析条件:Dikma C18反向柱(5μm,200×4.6mm),柱温25℃,流动相为0.2mol/L三氟乙酸溶液∶甲醇(95∶5),流速为1.0mL/min,进体积20μl,检测器为SofTA 200s ELSD,漂移管温度为105℃,雾化管温度为40℃。
3)标准品:妥布霉素标准品购自中国药品生物制品检定所。
HPLC-ELSD分析结果如图3所示,表明基因工程菌直接产生妥布霉素。
Claims (4)
1.一种直接产生妥布霉素的工程菌,其特征是:通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因,主要包括以下步骤:
A、tacA基因阻断质粒的构建;
B、阻断质粒转化黑暗链霉菌;
C、转化子的筛选;
D、新组分妥布霉素的鉴定;
所述的框架内删除失活的方法为:PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段,分别在tacA基因上下游设计两对引物,以黑暗链霉菌总DNA为模板进行PCR扩增获得两个片段PCR1-2和PCR3-4,将两片段连接产物命名为△tacA,其删除了tacA基因内部260个碱基,将两者同时连接到pIJ2925中,再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的红霉素抗性基因ermE,利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中;
所述的筛选为先筛选红霉素抗性菌株,无药传代后再从中筛选到红霉素敏感菌株,从中筛选到产新组分的转化子。
2.根据权利要求1所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌,其特征是所述的转化是以E.coliET12567介导的结合转移方法。
3.根据权利要求1所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌,其特征是所述的鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。
4.权利要求1所述的工程菌在直接发酵产生妥布霉素中的应用。
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