CN101390872A - 人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,提供人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用。所述人参皂甙Rb1具有以下功能:长期给药可降低遗传性扩张型心肌病的死亡率、改善扩张型心肌病的心功能、减轻左心室的扩张;减轻扩张型心肌病心肌细胞的肥大及间质胶原的增生;减轻扩张型心肌病心肌纤维粗细不均、排列紊乱、线粒体肿胀、嵴断裂、肌浆网扩张、闰盘连接破坏;提高心肌细胞间连接蛋白Cx40的表达,提高钙粘素E-cadherin和P-cadherin的表达,增加成纤维生长因子FGF2、FGF7、FGF8和FGF10的表达。降低整合素Itga8、Itgbp的表达。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,特别是涉及人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用。
背景技术
扩张型心肌病,是以心室扩张和心肌收缩功能受损为主要特征的心肌疾病,临床表现以进行性心力衰竭、心律失常、血栓栓塞,甚至猝死为基本特征,预后极差,5年生存率不及50%。典型病理特征是心室腔扩张,心壁变薄,心肌细胞凋亡,主要病因是病毒性心肌炎和基因突变,占扩张型心肌病发病率的70%。
临床研究中发现了多种与扩心病相关的突变基因,但多数基因突变会同时导致HCM和DCM,而cTnT蛋白的R141W突变(肌钙蛋白的精氨酸Arg→色氨酸Trp)仅导致DCM,因此该突变的基因模型对于研究扩心病的发病具有特异性。中国医学科学院实验动物研究所遗传中心建立的转基因扩张型心肌病模型cTnTR141W为目前国内仅有的扩心病基因工程动物模型,该模型小鼠表现为心室扩张、室壁变薄、心功能下降,与人类扩心病的病理表型相似。
而人参皂甙Rb1(C54H92O23·H2O)是一种存在于许多植物如人参中的已知化学单体,其结构及有关生物活性已报道于有关教科书及已发表的文献中,但人参皂甙Rb1作为制备治扩张型心肌病药的用途至今未见报道。
发明内容
本发明的主要目的在于提供人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用。
本发明提供的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物:
所述人参皂甙Rb1包括人参皂甙Rb1单体及赋形剂或载体;
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W(肌钙蛋白T的精氨酸Arg→色氨酸Trp)导致的死亡。
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W导致的左心室进行性扩张,心功能进行性减退。
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W导致的左心室心肌细胞的不规则肥大,间质的胶原纤维增生。
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W导致的心肌纤维粗细不均,排列紊乱,线粒体肿胀、嵴断裂,肌浆网扩张,闰盘连接破坏。
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W导致的心肌细胞间连接蛋白Cx40,钙粘素E-cadherin、P-cadherin表达的降低,整合素Itga8、Itgbp表达的增加。
所述的扩张型心肌病是指cTnTR141W导致的心肌成纤维生长因子FGF2,FGF7,FGF8,FGF10表达的降低。
本发明的人参皂甙Rb1一般以药物组合物的形式使用,也可以单体的形式使用。可通过口服、注射给药,可以这种组合物含有治疗有效计量的作为活性成分的人参皂甙Rb1和可药用辅料。含有人参皂甙Rb1的药物组合物可通过口服、注射给药,可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂,或口服液等剂型供临床应用。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的人参皂甙Rb1具有以下功能:可减轻肌钙蛋白突变导致的左心室的进行性扩张及心功能的减退;减轻心肌细胞的不规则肥大,减少间质胶原纤维的生成;改善心肌纤维排列及闰盘结构,减轻线粒体肿胀,肌浆网扩张;增加心肌细胞间连接蛋白、钙粘素的表达,降低整合素的表达;其机制与调节生长因子表达有关。从而为人参皂甙Rb1应用于扩张型心肌病的防治提供了直接有力的实验依据和理论基础,既有很强的科学性和创新性,又有很高的开发应用价值。
本发明利用实验室建立的cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型,对20种低毒、结构明确、对心血管***有治疗潜力的中药单体成分进行筛选,结果显示人参皂甙Rb1对扩张型心肌病具有较好的防治作用。人参皂甙Rb1长期给药可降低扩心病的死亡率,改善扩张型心肌病的心功能,减轻左心室的扩张;减轻扩心病心肌细胞的肥大及间质胶原的增生;减轻扩心病心肌纤维粗细不均,排列紊乱,线粒体肿胀、嵴断裂,肌浆网扩张,闰盘连接破坏;提高心肌细胞间连接蛋白Cx40,钙粘素E-cadherin、P-cadherin的表达,降低整合素Itga、Itgbp表达;增加生长因子FGF2,FGF7,FGF8,FGF10的表达。
附图说明
图1本发明具体实施例1中的PCR产物电泳图;
图2为本发明具体实施例1中的生存率分析图;
图3为本发明具体实施例2中的超声数据统计图;
图4为本发明具体实施例4中的电镜图;
图5为本发明具体实施例5中的RT-PCR电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行进一步说明,但不作对本发明的限定:
实施例1
人参皂甙Rb1长期给药对扩心病模型小鼠生存率的影响:
1.cTnTR141W转基因阳性鼠的PCR法鉴定:
1)剪取0.5—1cm鼠尾置于EP管,加入0.5ml鼠尾裂解液,再加入20mg/ml蛋白酶K10μl,55℃振摇过夜;
2)次日,加入300μl饱和氯化钠,冰上静置15ming,13000rpm离心15min;
3)取上清600μl,加入等体积异丙醇,颠倒混匀,直至有絮状沉淀出现,13000rpm离心15min;
4)用70%乙醇洗涤沉淀一次,晾干沉淀约30min但不能干透;
5)沉淀溶于200μlTE中,55℃ 2小时将DNA完全溶解;
6)PCR(聚合酶链反应)体系:
7)PCR产物电泳如图1。
2.动物分组及给药:
将阴性鼠作为对照,阳性鼠在出生1.5个月后根据心脏超声结果将动物按体重、心功能均匀分为模型组及人参皂甙Rb1给药组,每组12只。人参皂甙Rb1,75mg/kg(国药准字Z2002716,云南特安呐制药股份有限公司),将药物放入动物饮水中,连续给药7个月。
3.生存分析:该cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型在饲养过程中有个体的死亡,我们将从给药开始到观察终点各组的动物死亡数记录下来,阴性对照组动物死亡数为0只,模型组动物死亡数为4只,人参皂甙Rb1组动物死亡数为2只。用spss10.0统计软件进行了生存率分析,结果如图2,显示Rb1可降低扩心病模型的死亡率。
实施例2
人参皂甙Rb1长期给药对扩心病模型小鼠心功能及构型的影响(超声):
每个月进行一次心脏超声检测,三溴乙醇麻醉,采用小动物超声仪(Vevo770小动物超声探测***,加拿大),30MHz的探头扫描,对左心室长轴M超结果进行心脏超声影像分析,比较各组动物的心脏形态及心功能,包括BW(body weight,体重)、LVPW;d(舒张期左室后壁的厚度)、LVPW;s(收缩期左室后壁的厚度)、LVAW;d(舒张期左室前壁的厚度)、LVAW;s(收缩期左室前壁的厚度)LV Mass(AW)(左室重量)、Diameter;s(收缩期左室内径)、Diameter;d(舒张期左室内径)、Volume;s(收缩期左室容积)、Volume;d(舒张期左室容积)、SV(Stroke Volume,每搏输出量)、EF(Ejection Fraction,射血分数)、FS(Fractional Shortening,短轴缩短率)、CO(Cardiac Output,心输出量)。结果显示人参皂甙Rb1可显著减轻扩心病模型心腔的扩张,改善心功能,具体结果见如表1及图3。
表1 给药7个月心脏超声结果
实施例3
人参皂甙Rb1长期给药对扩心病模型小鼠心脏显微结构的影响(HE及Masson染色):
1.方法:
1)固定心脏,石蜡切片,常规脱蜡至水;
2)常规HE染色;
3)asson复合染色液5min;
4)0.2%醋酸水溶液稍洗;
5)5%磷钨酸5-10min;
6)0.2%醋酸水溶液浸洗2次;
7)亮绿染色液5min。0.2%醋酸水溶液浸洗2次;
8)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;
9)光镜下观察:胶原纤维呈绿色,肌纤维呈红色,红细胞呈桔红色。
2.结果:
光镜下观察,模型组心肌纤维不均匀肥大,排列紊乱,部分细胞空泡样变性;心肌细胞核大,深染,伴异形;心肌局部有纤维组织增生。人参皂甙Rb1组心肌细胞的肥大及排列紊乱均有改善,间质的胶原纤维也显著减少。
实施例4
人参皂甙Rb1长期给药对扩心病模型小鼠左心室超微结构的影响(电镜):
1.方法:
新鲜心肌组织固定与2.5%戊二醛溶液,再用1%锇酸后固定,丙酮梯度脱水后用Epon812包埋,每例包埋5块,超薄切片用醋酸铀及枸橼酸铅双染色,JEM1230型投射电镜观察。仪器:JEM1230型透射电镜(日本电子公司),LEICA UCT型超薄切片机(德国莱卡公司)。
2.固定液配制:
磷酸缓冲液(0.2M)的配制方法如下:
甲液:71.64g Na2HPO4·12H2O,加ddH2O水溶解成1000ml
乙液:31.21g NaH2PO4·2H2O,加ddH2O溶解成1000ml
0.2M的磷酸缓冲液的配制(pH=7.2,50ml):甲液36.0ml+乙液14.0ml
0.1M的磷酸缓冲戊二醛固定液:0.2M的磷酸缓冲液50ml
3.结果:
模型组心肌纤维粗细不均,线粒体高度肿胀及空泡形成,肌质网中度扩张,闰盘连接破坏。人参皂甙Rb1组心肌纤维结构清晰,大部分线粒体结构正常,肌质网轻度扩张,闰盘结构较清晰,具体结果见图4。
实施例5
人参皂甙Rb1长期给药对扩心病模型小鼠心脏重要基因表达的影响(RT-PCR法):
1.RNA的提取
1)将组织在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨;
2)研磨液室温放置5分钟,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,剧烈摇荡离心管15秒;
3)取上层水相于一新的离心管,加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟,4℃下12000g离心10分钟;
4)弃去上清液,加入1ml 75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟;
5)小心弃去上清液,然后室温干燥5—10分钟。然后将RNA溶于水中。
2.RT-PCR(反转录.聚合酶链反应)
65℃,5min,放置于冰上1min以上。
将上述的混合液加入步骤1中的管巾,42℃,2min。
3)加入1μl SuperScript.II RT,42℃,50min。
4)70℃,15min,置于冰上。
5)加入1μl的RNase H,37℃,20min。
6)PCR反应体系如下:
7)PCR反应的通用条件如下:94℃预变性30min,72℃延伸30min,退火温度及时间、引物序列、循环数如表2所示:
表2 RT-PCR引物序列及反应条件
其中,Gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)为内参照;
Cx40,43为connexin40,43(连接蛋白);
E-,P-,N-cad为E-,P-,N-cadherin(钙粘素);
Itga为integrin alpha 8(整合素);
Itgbp为integrin beta 1binding protcin 3(整合素);
Fgf2,Fgf7,Fgf8,Fgf10为fibroblast growth factor 2,7,8,10(心肌成纤维生长因子)。
3.结果:
人参皂甙Rb1提高心肌细胞间连接蛋白Cx40的表达,提高钙粘素E-cadherin、P-cadherin的表达,降低整合素Itga8、Itgbp表达,增加成纤维生长因子FGF的表达,具体结果见图5。
以上已对其发明内容作了详尽说明。对本领域一般技术人员而言,在不背离本发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动,都不会超出本申请所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1、人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用。
2、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述人参皂甙Rb1包括人参皂甙Rb1单体及赋形剂或载体。
3、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的死亡。
4、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述的扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的左心室进行性扩张,心功能进行性减退。
5、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述的扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的左心室心肌细胞的不规则肥大,间质的胶原纤维增生。
6、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述的扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的心肌纤维粗细不均,排列紊乱,线粒体肿胀、嵴断裂,肌浆网扩张,闰盘连接破坏。
7、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述的扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的心肌细胞间连接蛋白Cx40,钙粘素E-cadherin、P-cadherin表达的降低,心脏整合素Itga8、Itgbp表达的增加。
8、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述的扩张型心肌病是指cTnT蛋白的R141W突变导致的心肌成纤维生长因子FGF2,FGF7,FGF8,FGF10表达的降低。
9、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述人参皂甙Rb1以药物组合物的形式使用。
10、根据权利要求1所述的人参皂甙Rb1作为制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用,其特征在于,所述人参皂甙Rb1以单体的形式使用。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |