CN101389651A - 受体特异性肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(trail)的突变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，其能通过死亡受体4(DR4)选择性地发出信号，其包含位置189的Y。优选，TRAIL还包含19IL和/或199V；优选，201R、213W和215D，和/或优选还包含193S。本发明还涉及能经由DR4选择性地发出信号的此类TRAIL突变体在治疗癌症中的用途，以及在制备用于治疗癌症的药物中的用途。优选，癌症是慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。本发明还涉及包含它们的试剂盒。

Description

受体特异性肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的突变体

技术领域

本发明属于肿瘤坏死因子-(TNF-)相关的细胞凋亡诱导配体(tumornecrosis factor-(TNF)-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL))领域。特别是，本发明涉及TRAIL受体1(TRAIL-R1，有时称为死亡受体4(DR4)选择性TRAIL突变体。

背景技术

TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是一种跨膜蛋白，其可在细胞表面切割形成可溶的配体。TRAIL通过在TRAIL-R1(死亡受体4(DR4)或TRAIL-R2(死亡受体5(DR5/TRICK2))处结合，诱导细胞凋亡。TRAIL在癌细胞系中诱导细胞凋亡，但不能在正常细胞中诱导细胞凋亡。TRAIL有时也称为细胞凋亡诱导配体2(apoptosis-inducing ligand 2，Apo2L)。

经由DR5发出信号在诸如肺癌、乳腺癌、大肠癌和其他癌症的癌症和癌症模型中非常重要。经由DR4发出信号在诸如慢性淋巴细胞白血病(CLL)的癌症和癌症模型中非常重要。

Kelley等(2005 J Biol Chem Volum 280，第2205-2212页)公开了受体选择性的TRAIL突变体的研究。这项研究的焦点是DR4和DR5活性之间的不同。研究了各种TRAIL突变体，结论是，在表达DR4和DR5这两种死亡受体的癌细胞中，DR5可能比DR4更有助于TRAIL诱导的细胞凋亡。利用噬菌体显示法，选择对DR4或DR5具有相对结合选择性的配体变体。在各种癌细胞系和正常肝细胞中研究了这些突变体的作用。结果显示在介导细胞凋亡中DR5比DR4起着更突出的作用。据报道，在TRAIL中用Ala取代Tyr-189对DR4的选择性非常重要，因为作为DR4的选择性变体而研究的所有4个克隆都具有这种突变。而且，据报道，H264R和/或D267Q取代能产生针对DR4结合的进一步选择性，并能在DR5亲和性和生物活性上获得适度改进。

MacFarlane等(2005 Cell Death and Differentiation Vol.12第773-782页)公开了多种细胞系和原发性细胞(primary cell)对经由TRAIL-R1或TRAIL-R2发出信号的应答的广泛评述。这篇文献的主要教导是在慢性淋巴细胞白血病细胞(CLL细胞)中TRAIL诱导的细胞凋亡主要是在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)存在的情况下，经由TRAIL-R1而进行的。因此，为了使治疗效果最大化，必须在开始治疗前，先查明原发性肿瘤(primary tumour)是否经由TRAIL-R1或TRAIL-R2发出信号。并建议治疗CLL的具体治疗组合。而且，公开了不同形式的TRAIL的细微变化会改变它们激活不同TRAIL受体的倾向。这就清晰而显著地改变了它们的生物学活性。该文献教导了使用TRAIL靶向治疗需要在体外试验前，先评估不同肿瘤对TRAIL-R1或TRAIL-R2的敏感性。

Kaufmann和Steensma(2005 Leukemia vol 19第2195-2202页)综述了TRAIL的生物学功能、细胞毒性机制和TRAIL对体外各种细胞的作用。Kaufmann和Steensma认识到DR5应该是参与TRAIL诱导性杀死肿瘤细胞的最主要受体。他们评论了不能验证TRAIL对人肝细胞有毒的证据，特别是通过针对DR5的试剂。这强化了本领域中DR5信号传输仍然是有效治疗的最佳候选者的观点。该评论接着详细讨论了(见上文)MacFarlane等的文章(同上)。Kaufmann和Steensma没有公开任何TRAILS。

WO97/25428公开了Apo-2配体。该文献描述了Apo-2 L的cDNA和克隆。描述了Apo-2 L片段，并且提及了与Apo-2 L序列具有各种序列同一性水平的分子。在其最广泛的方面内，该文献教导了与Apo-2 L的氨基酸114-281具有至少80％同源性的Apo-2配体，该配体在至少一种类型的哺乳动物细胞中诱导细胞凋亡。没有有关Apo-2 L序列突变的教导。没有有关功能保留的内容。没有有关哪一个残基可以发生变化，以及为了保持Apo-2 L功能而保留哪个残基的教导。没有指向具体受体或受体亚型的活性的教导。尽管该文献涉及Apo-2 L的多种截短的序列变体，但没有公开显示哪一个变体可能有活性，或者怎样选择它们。而且，没有对DR4的选择性有教导。

WO 99/36535描述了Apo-2配体多肽。而且权利要求中涉及了这些肽片段，如包含Apo-2 L的氨基酸91-281或包含Apo-2 L的氨基酸91-281的多肽。描述了Apo-2配体的三个具体突变。公开的突变是D203A、D218A和D269A。除了这三个具体突变外，该申请没有给出对于生物活性而言应该保留什么残基，和什么残基可以进行突变的教导。没有讨论具体受体或受体亚型的活性。没有指向DR4受体活性的教导。

WO 2004/101608描述了一系列Apo-2L受体结合肽。具体来说，该文献的表8公开了91种不同的据报道能结合Apo-2L受体的肽。这些肽的长度为大约10个氨基酸到大约25个氨基酸。而且，公开了具体的半胱氨酸相关基元，这些肽优选包含该基元。尽管提到了DR4和DR5受体，但其焦点主要是集中于抑制Apo-2 L和这些受体之间的相互作用。该文献总的教导是通过使用这些抑制性肽抑制Apo-2 L发出信号。在该文献中没有教导新的TRAIL突变体。在该文献中没有教导如何能经由DR4来产生信号。没有对于可能对发出信号来说非常重要的TRAIL残基的教导。

Kelley等在2005年教导了为了让DR4发出信号，TRAIL的Tyr 189必须是Ala。

现有技术存在的问题是大多数研究是在培养的细胞系中而不是在原发性细胞中进行的。

现有技术强调了DR5发出信号的重要性。

现有技术的研究集中于受体结合，但很少提供或未曾提供有关生物学功能性的数据。

完整的野生型TRAIL能引起细胞凋亡性细胞死亡。然而，在DR4和DR5背景中的水平相似。这导致肝毒性的问题。可将肝毒性归因于肝细胞中TRAIL/细胞凋亡的激活。认为该信号是经由DR5而进行。使用野生型TRAIL的治疗方法已经遇到了问题。

本发明试图克服与现有技术的有关问题。

发明概述

本发明基于意外发现了具有DR4选择性的特异性TRAIL突变体。

本发明人已证明，据报道具有DR4特异性的现有技术的配体令人意想不到地没有生物学活性。这可能是因为现有技术数据集中于对受体结合的研究而不是功能性的生物学分析。然而，本发明的优势在于提供了具有DR4生物学发信号能力的TRAIL突变体。

而且，由于认为肝细胞中的肝毒性主要经由DR5起作用，因此本发明的优势是DR4选择性的TRAIL突变体有助于降低或消除肝毒性。

现有技术研究集中于利用野生型TRAIL结合作为参考点。在现有技术中，对DR4或DR5的‘选择性’已用于描述与DR4或DR5的强结合性，而不是选择性的生物学效果。如本发明所指出的，这种结合并不总会转变为实际的生物学活性。本发明的优势在于，对于DR4发出信号，TRAIL序列中生物学上重要的残基已得以确定。

在现有技术中，认为Y189A突变对DR4发出信号非常重要。然而，本发明人发现具有这种突变的TRAIL突变体没有生物学活性。与现有技术的教导相反，本发明人发现Y189对DR4发出信号非常重要。因此，一方面，本发明提供了能经由DR4选择性发出信号的TRAIL，其包含189位置处的Y。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其还包含193S。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其还包含191L。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其还包含199V。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其还包含201R、213W和215D，优选与199V组合。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其包含与TRAIL的至少氨基酸95-281相对应的序列。

另一方面，本发明提供了如上所述的TRAIL，其还包含非肽多聚体。TRAIL与非肽多聚体的连接会有利地稳定TRAIL。多聚体可以是本领域中已知的用于此目的的任何适宜的多聚体。优选，所述的多聚体选自如下组成的组：聚乙二醇、聚丙二醇和聚醚(polyoxyalkylene)。

现有技术关注的是DR5在癌症发出信号中的重要性，并且目的在于在消耗DR4的情况下产生DR5信号。然而，本发明人已经意识到DR4信号的价值与现有技术的教导相反。因此，另一方面，本发明提供了能经由DR4选择性发出信号的TRAIL在治疗癌症中的用途。优选，癌症是B细胞恶性肿瘤。优选，癌症是慢性淋巴细胞白血病或套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)或B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)。

本发明人已发现一些癌症经由DR5发出信号/应答，而有些则经由DR4。实际上，现有技术如此强调DR5的一个原因是其主要基于体外永生细胞系(immortalized cell lines)的研究。相反，本发明人洞察了原发性癌细胞(primarycancer cells)的信号情况，并令人惊讶地发现它们经由DR4来应答。因此，确定待治疗的疾病是否对DR4应答还是对不同的信号应答是非常重要的，并据此来指导治疗。所以，另一方面，本发明提供了通过施用能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL治疗受试者癌症的方法，所述的方法包括，确定所述受试者的靶细胞是否经由DR4发出信号，其中，如果所述靶细胞的确经由DR4发出信号，则施用能通过DR4选择性地发出信号的TRAIL。另一方面，本发明涉及辅助诊断受试者DR4应答性张障碍症(DR4-responsive disorder)的方法，所述方法包括确定所述受试者的靶细胞是否经由DR4发出信号，其中，如果所述靶细胞的确经由DR4发出信号，那么DR4应答障碍症的诊断就得到确认。

“靶细胞”是指临床上期望从受试者中除去、杀死、破坏或者以其他方式抑制或消除的细胞。优选，所述抑制或消除是通过诱导细胞凋亡的方式。优选，靶细胞是与疾病有关或是导致疾病形成的实际细胞，如癌/肿瘤细胞。

另一方面，本发明提供了如上所述的治疗方法，其还包括施用敏化剂(sensitizing agent)。优选，所述敏化剂是HDAC抑制剂。优选，所述HDAC抑制剂是丙戊酸(valproate)，优选，丙戊酸钠(sodium valproate)。

另一方面，本发明提供了能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症细胞经由DR4发出信号。优选，本发明提供了能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL在制备癌症药物中的用途，其中所述癌症细胞经由DR4发出信号。优选，所述细胞主要经由DR4发出信号。另外，本发明提供了用于治疗癌症的TRAIL，其能经由DR4选择性地发出信号，优选所述癌症是CLL、MCL或NHL。

另一方面，本发明提供了治疗受试者B细胞恶性肿瘤或受试者B细胞非霍奇金氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括向所述受试者施用能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL。

另一方面，本发明提供了如上所述的方法，其还包括向所述受试者施用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。

优选，在施用HDACi后施用TRAIL。

优选，在施用HDACi至少8小时后施用TRAIL。

优选，在施用HDACi至少16小时后施用TRAIL。

优选，在约8-16小时的时间段内施用HDACi。

优选，在约4-8小时的时间段内施用TRAIL，优选约4小时。

优选，向所述受试者多次施用TRAIL和/或HDACi。

另一方面，本发明提供了在血液恶性细胞中诱导死亡诱导性信号复合物(death inducing signaling complex，DISC)形成的方法，其包括使所述细胞与组蛋白脱酰酶抑制剂(HDACi)以及能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL接触。

另一方面，本发明提供了在血液恶性细胞中诱导凋亡蛋白酶(caspase)激活的方法，其包括使所述细胞与组蛋白脱酰酶抑制剂(HDACi)以及能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL接触。

优选，HDACi选自下组：缩酞(depsipeptide)、曲古霉素A(trichostatin A，TSA)和丙戊酸。优选，HDACi是丙戊酸。

另一方面，本发明提供了包含能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL和敏化剂的试剂盒。

在如上所述的方法和试剂盒中，优选TRAIL是如本文所述的TRAIL。

优选，本发明涉及TRAIL R1(DR4)的应用，如TRAIL R1(DR4)选择性TRAIL突变体。

发明详述

TNF受体细胞凋亡-诱导配体(TRAIL)和其激动性抗体(agonisticantibodies)——其目前正用于治疗各种恶性肿瘤的早期临床试验中，通过触发TRAIL-R1或R2来诱导细胞凋亡。我们目前明确地证明了来自患有某种恶性淋巴瘤(lymphoid malignancies)的患者的原发性细胞几乎毫无例外地通过TRAIL-R1向细胞凋亡发出信号。因此，我们认为用目前临床试验中的主要通过TRAIL-R2，如HGS-ETR2(Human Genome Science)或通过Apo-2L/TRAIL(Genentech)发出信号的药剂来治疗此类患者不会产生治疗效果。根据本发明，确定来自具体肿瘤的原发性细胞是否经由TRAIL-R1或-R2发出信号是非常有利的。此类信息为优化TRAIL治疗提供了新的合理方法。

然而，许多癌细胞系都对TRAIL敏感。来自患者如患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的大多数原发性细胞都具有抗性。与化学治疗剂组合治疗可以用于增强抗性细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性。我们证明通过促进TRAIL DISC形成的增加，组蛋白脱酰酶抑制剂(HDACi)如缩酞会使CLL细胞对TRAIL-诱导的细胞凋亡变敏感。

TRAIL在大范围的肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡，但对大多数正常细胞和组织是无毒的。已用HGS-ETR1和HGS-ETR2(Human Genome Science)进行了临床试验，其分别是TRAIL-R1和TRAIL-R2的选择性激动抗体，也用Apo2L/TRAIL(Genentech)进行了临床试验。尽管TRAIL可经由TRAIL-R1或-R2发出细胞凋亡信号，但大多数的研究表明TRAIL-R2是导致细胞死亡的原发性受体(primary receptor)。然而，这些研究大部分使用细胞系；仅少数使用来自患者的原发性肿瘤细胞。利用与细胞系组合的抗体和各种TRAIL配体，所述细胞系主要通过TRAIL-R1(Ramos)或TRAIL-R2(Jurkat)发出信号，我们认为临床上相关的细胞如原发性CLL细胞主要通过TRAIL-R1发出信号。

使用定点诱变，我们已合成了一系列选择性地与TRAIL-R1或-R2结合的TRAIL突变体。TRAIL-R1但非TRAIL-R2的选择性突变体在原发性CLL细胞和原发性套细胞淋巴瘤(MCL)细胞中诱导细胞凋亡，因此确凿地证明这些原发性淋巴细胞通过TRAIL-R1而不是通过TRAIL-R2发出信号。

我们公开了CLL细胞经由TRAIL-R1发出信号来诱导细胞凋亡。这对于将在临床使用的TRAIL形式非常重要。现有技术的Apo2L/TRAIL主要通过TRAIL-R2发出信号，而且它对于CLL和其他通过R1发信号的恶性肿瘤没有作用。

我们根据现有技术合成了假想的TRAIL-R1(DR4)选择性突变体，发现它们是没有活性的。现有技术有关TRAIL-R1重要性的结论是错误的。我们已经对该结构进行了修饰，并获得了选择性对TRAIL-R1起作用的突变体。这些DR4选择性突变体对CLL细胞是有活性的，而TRAIL-R2选择性突变体就没有活性。这确凿地证明了TRAIL-R1(DR4)在CLL中发出信号的重要性，如同典型的DR4发出恶性肿瘤信号一样。

TRAIL-R1在原发性肿瘤中比TRAIL-R2重要。因此，本发明发现了在治疗经由DR4(TRAIL-R1)发出信号的肿瘤或恶性肿瘤中的应用。

TRAIL

野生型TRAIL序列是本文在描述本发明的TRAIL突变体序列中所用的参考序列。野生型TRAIL序列优选是人TRAIL，优选的登录号是NM_003810。TRAIL的参照物(references to TRAIL)包含可溶的TRAIL(有时称为“sTRAIL”)。优选可溶的TRAILs或TRAIL突变体，因为它们的优势是更易于制备或施用。可溶的TRAIL(sTRAIL)指TRAIL的aa95-281；aa1-94表示跨膜结构域，因此aa95-281是可溶的TRAIL。通常，本发明的“TRAIL”或“TRAIL突变体”的参照物指具有相关取代的sTRAIL或aa95-281，其根据本发明的内容是显而易见的。

长度

本发明的TRAIL突变体在长度上可以变化，如在它们的N末端。His-TRAIL编码氨基酸95-281和N末端的His标签。Apo2L包含氨基酸114-281。没有实验证据表明在TRAILN末端的短区域(如氨基酸95-114)能在TRAIL与其受体的结合中发挥任何关键性作用。因此，依赖于操作者的选择，本发明的TRAIL突变体可包括或不包括在该N末端区域的氨基酸。本发明的关键性教导在于对TRAIL区域所作的氨基酸变化对DR4特异性来说是非常重要的。与此相一致，我们对Kelley等(2005 J Biol Chem Volume 280，第2205-2212页)建议的相同残基进行了突变，产生了Apo2L的TRAIL-R2特异性突变体，并且获得了His-TRAIL的相似的TRAIL-R2特异性形式(TRAIL--R2-6)，从而证明本发明有关突变的教导可应用于根据本发明的不同的TRAIL环境中。

优选，根据本发明的TRAIL突变体包含与TRAIL的至少25个aa相对应的氨基酸序列，优选至少50个aa，优选至少100个aa，优选至少150个aa，优选至少161个aa，优选至少167个aa，优选至少190个aa，优选至少200个aa，优选至少240个aa，优选全部的281个aa。当本发明的突变体包含总计小于TRAIL全长281个aa的氨基酸序列时，优选，序列是来自TRAIL全部281个aa的C末端，优选来自可溶的三聚体TRAIL序列。下文将更详细地讨论包含小于全长的TRAIL突变体。

可溶的三聚体TRAIL的晶体结构是基于残基114-281，而与DR5络合的TRAIL晶体结构显示，在各TRAIL单体中的残基120-135以及146-281对于与DR5的相互作用是非常关键的。因此，优选，根据本发明的TRAIL包含至少残基120-135以及146-281。优选，根据本发明的TRAIL-R1/2的最小长度是残基120-281。优选，本发明的TRAIL突变体包含TRAIL的aa120-aa281；优选，aa114-aa281，优选aa95-aa281，优选aa92-aa281，优选aa91-aa281，或全长TRAIL。显然，关于TRAIL1-281序列长度的讨论仅适用于根据本发明的多肽的TRAIL部分，即，任何标签或融合体均在上述TRAIL残基之外。而且，当讨论“长度”时，说配体包含例如TRAIL的120-281并不暗示该配体恰好包含该氨基酸序列，必须还要关注本发明的关键特征即所做的具体氨基酸取代。必须从上下文来理解长度的讨论。作为缺省，除非上下文给出了不同的意思，优选未指定的TRAIL氨基酸残基与野生型人TRAIL的氨基酸残基一样。这同样适用于编码本发明的TRAIL多肽的任何核酸。

本文所讨论的TRAIL突变体残基的编号方式采用本领域中已建立的常规方法，即，所用的编号对应于野生型TRAIL序列上的位置。

术语“其片段”可理解为仅涉及指定的TRAIL突变体能发出信号的片段。参考本文提出的DR4发出信号/死亡诱导试验，很容易对片段(或配体)是否能发出信号这一问题得以确认。能发出信号的片段不需要具有全长TRAIL的全部活性，但必须具有相同性质的活性，即，必须是DR4选择性/特异性的。DR4选择性/特异性的相同标准适用于TRAIL突变体片段，如同适用于配体自身一样。无论如何，片段必须包含对应于TRAIL的至少25个aa的氨基酸序列。

TRAIL突变体：序列取代

如本文所用的，术语“突变体”具有本领域的正常涵义。具体来说，“TRAIL突变体”是在其序列优选氨基酸序列的至少一个位置处与野生型TRAIL不同的TRAIL。本文详细讨论了单突变体和其突变。

本文所公开的两种最优选的TRAIL突变体，相对于野生型TRAIL配体，具有5和4个氨基酸的变化。

当这些氨基酸中仅有某两个发生改变(TRAIL.R1-2：Y213W；S215D)时，不能获得相同的活性。因此，本发明明确放弃这种TRAIL突变体的权利。

另外的两个氨基酸突变体TRAIL(N199V；K201R)，和三个氨基酸突变体TRAIL(Q193S；N 199V；K201R)可以获得特异性。

当仅在氨基酸199处进行单个N199V取代时，可有利地赋予特异性。因此，这种单突变体TRAIL是本发明优选的TRAIL。

Y189

除了现有技术教导了Y189A对DR4的特异性非常重要以外，TRAIL-R1和-R2(DR4和5)似乎在与TRAIL的Y189相互作用的受体区域中是保守的。因此，在不知道本发明的情况下，很难预测TRAIL该区域中的突变是可选择的。

弱疏水性(small hydrophobic)：根据我们的结构模型，似乎Y189A会获得与-R1和-R2大约相同程度的弱蛋白-蛋白相互作用。这与本文提供的试验数据一致。

强疏水性(larger hydrophobic)：预料Phe或Leu会减弱蛋白-蛋白相互作用(失去氢键，但保持疏水相互作用)，而以大约相同的程度影响-R1和-R2的结合。

如上文所指出的，现有技术教导了Y189A取代对DR4选择性非常重要。相反，本发明人发现Y189A突变体在生物学相关的DR4信号传输中并没有功能活性。事实上，在氨基酸189处取代为小极性残基(Y189Q)或非极性残基(Y189A)会导致DR4明显丧失活性。因此，优选，本发明的TRAIL突变体不包含Y189Q或Y189A。优选，本发明的TRAIL突变体包含Y189，即位置189是野生型。

在现有技术中，Kelley等的教导在选择具体的突变(对应于本文的TRAIL.R1-6)中占统治地位。然而，我们已证明这6种氨基酸取代会获得无活性型配体，而且活性和特异性仅保留于可替代的突变体中，如本发明优选的4或5种氨基酸TRAIL突变体种类(例如TRAIL.R1-4/5)。

R191

根据我们的模型(TRAIL/TRAIL-R1)，我们预测氨基酸191对TRAIL与TRAIL.R1的相互作用很重要。为了对其进行评价，我们对R191L进行了突变(使其变为疏水)，接着根据这种单个取代的效果，我们随后对该氨基酸进行了***性突变。例如，R191Q(极性，更短，但不带电荷)、R191A(非极性且小)，以及R191E(电荷反转)。据此，R191Q和R191E的比较能确定电荷的作用。

R191与TRAIL R2中的ASP(67)结合，形成盐桥(2.6A)，其对TRAIL R2的稳定化非常重要。在本申请中，用于TRAIL-R2受体的残基编号与Hymovitz等(Molcecular Cell Volume 4，563-571，1999)的文献中所用编号相同，并且指没有其N末端信号肽的TRAIL-R2。为了进一步阐明这一点，在成熟的TRAIL-R2中，Asp 67对应于全长TRAIL-R2序列中的Asp 120，包括N末端的信号肽。TRAIL的R191通过中间水分子还与TRAIL R2中的Ser(68)形成间接的氢键。因为该丝氨酸残基在TRAIL R1中是保守的，因此，如果需要，可以对R1中的该间接氢键进行作用。因此，该位点上的突变将增强DR4。优选，在该位点引入负电荷的突变。

根据本发明，在R191处可产生各种突变。依赖于所进行的取代，可获得不同的效果。其中一些将在下文讨论。优选，将R191突变为除Ser之外的残基。

R191L可引入疏水性。

R191Q使其具有极性并且更短，但没有电荷。

R191A完全除去侧链。

R191E导致电荷反转。这是化学性强作用。R191Q和R191E的比较能更详细地确定电荷的作用。

因此，总之，我们教导了将R191取代为疏水性残基(Leu)或电荷反转性残基(Glu)能赋予一定程度的对TRAIL-R1的特异性。

对电荷反转进行解释：R191E/D可具有与TRAIL-R2的D67不利的相互作用，而且还通过与TRAIL-R1的K67的有利相互作用而增强与TRAIL-R1的相互作用。在本申请中，用于TRAIL-R1受体的残基编号是指如图3A和Hymovitz等的文献中所表示的没有N末端信号肽的TRAIL-R1序列编号。为了进一步阐明这一点，在成熟的TRAIL-R1中，K67对应于全长TRAIL-R1序列中的K171。优选R191E。

极性、无电荷：R191Q/N可能没有R191E有效，但其可消除或者弱化与TRAIL-R2的D67的相互作用，从而增强与TRAIL-R1的结合。

疏水性：R191L/V/A可以弱化蛋白-蛋白相互作用，在TRAIL-R2中比在TRAIL-R1中更是如此，因而据此可赋予对TRAIL-R1的特异性。优选R

191L。

本发明优选的R191突变是R191E。

具体的单突变体TRAIL R191L赋予DR4特异性，因此这种单突变TRAIL是本发明优选的TRAIL突变体。

N199

氨基酸N199从极性残基(Asn)取代为小的非极性残基(如Val/Ala/Leu)会赋予对TRAIL-R1(DR4)的特异性，因此是优选的突变位点。优选的突变是任何破坏或者改进氢结合的突变，如小的极性氨基酸。优选N199L或N199V，优选N199V。

对疏水性进行解释：预测N199A/V/L优选N199V会影响蛋白-蛋白相互作用，在TRAIL-R2中比在TRAIL-R1更是如此，因此预料会赋予对TRAIL-R1的特异性。这种突变可与本文所述的其他突变组合使用。对于Leu和/或Val来说特异性可能更强，其可与TRAIL形成疏水相互作用，从而可以补偿Cys[-R1和-R2两者]的羰基主链以及Arg[-R2)]侧链所损失的氢键。

D267和G160

根据我们的模型，我们鉴定出了TRAIL中的两个其他的氨基酸，即D267和G160，对与TRAIL-R1的相互作用非常重要。因而，这些氨基酸的***取代是本发明的一部分。

对于D267，较大的负电性残基如D267E可增强与TRAIL-R1(经由K67)的相互作用，因此是优选的。

Gly160Leu可增强TRAIL R1相互作用，因此是优选的。原因在于疏水性主体(hydrophobic bulk)：G160L可通过在空间上阻止盐桥(TRAIL-R2的R62至TRAIL的E155)而使TRAIL-R2和TRAIL之间的界面不稳定。另外，通过形成其他的疏水相互作用，能进一步增强与TRAIL R1的相互作用。

其他的TRAIL突变

辅助突变包括靶向TRAIL R1中赖氨酸67的相互作用。在不局限于理论的情况下，认为该残基可与TRAIL中的Asp 267相互作用。因此，TRAIL中的Asp 267是如上文所述的本发明的另外的取代靶点。

残基Asp203、Asp218或Asp269可有助于TRAIL/TRAIL-R1相互作用。优选，将这些残基中的一个或多个突变为Ala，或优选突变为除Ala以外的氨基酸。优选，本发明放弃Asp203Ala、Asp218Ala和Asp269Ala突变的权利。

优选保留Asp203作为Asp(野生型)。在该区域内，TRAIL-R1和-R2未显示不同。本发明优选放弃Asp203Ala的权利。

Asp218可与TRAIL-R2中的H53(等同的-R1残基是A53)形成盐桥。因此，优选疏水性取代：D218A可弱化TRAIL/TRAIL-R2相互作用，D218M既可弱化TRAIL/TRAIL-R2相互作用又可加强TRAIL/TRAIL-R1相互作用。因此，优选D218M。

优选，将Asp269突变为较大的负性残基：D269E可以增强TRAIL-R1结合并弱化TRAIL-R2结合。因此，优选D269E。

突变组合

为了便于理解，上文已单独描述了每一种突变。必须指出，本发明涉及单个突变，但也涉及与单个TRAIL配体中其它突变的组合突变。除非另有说明，本发明包括每一种组合。优选，本发明所有的TRAIL配体都包含位置189处的Tyr。因此，本文所描述或讨论的组合优选还包含189Y。

特别优选的是与R191L组合的Asn199Val突变。

优选，位置213和215保持野生型。

优选位置191和201两者相对于野生型都是突变的。

优选位置199和201两者相当对于野生型都是突变的。

在位置201处，优选突变成除Lys(野生型)以外的氨基酸，优选，突变成除Arg或Lys(野生型)以外的氨基酸。

优选，根据本发明的TRAIL突变体包含199处的单个突变或191处的单个突变，优选，191和199处的双突变，优选199和201处的双突变，优选，199和201以及213或215之一的三突变。优选，根据本发明的TRAIL突变体含有199、201和213、215处的四突变。如上文所述，优选，这些中的每一个都还包含189Y。

当使用199/201处的双突变时，优选该氨基酸是Val/Arg。

TRAIL突变体的其他特征

为了纯化和便于制备，可将本发明的TRAIL突变体加上标签，如FLAG-标记或His标记，优选HIS标记，优选用6His标签。优选，以未加标签的形式使用TRAIL突变体。

优选，TRAIL突变体是三聚体。His标记不会影响三聚化。

信号测定

当依据本发明使用试验***时，从生物信号方面，对经由TRAIL R1或TRAIL R2发出信号进行评估是非常重要的。不同的结果或作用如触发细胞凋亡，与TRAIL R1或TRAIL R2的表达水平无关，而与信号有关。因此，为了确定是否与信号相关，使用功能测定是非常重要的。当然，如果没有DR4存在于具体的细胞或者细胞类型中，那显然就没有DR4信号。然而，高水平的TRAIL R1表达未不表示高水平的TRAIL R1信号。例如，K562细胞能表达高水平的TRAIL R1，但对TRAIL-R1特异性抗体不敏感。

DR4选择性/DR4发出信号

DR4选择性意指优先选择针对DR4受体的配体。优选，针对DR4受体的特异性，即，优选，DR4选择性配体仅与DR4(并且优选不与DR5)复合。

一个DR4选择性试验是在细胞环境中的体内结合。优选，其是经由死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex，DISC)数据而进行的试验。在这点上，参考实施例部分，特别是参考图2A(Ramos细胞/TRAIL R1)以及图2B(Jurkat细胞/TRAIL R2)。优选，DR4选择性配体仅结合DR4。

可用R1/R2特异性阻抑抗体进行另一个试验。使用这些抗体是为了确定它们是否会中和具体配体的作用。如果R1(DR4)阻抑抗体会中和具体配体的作用，但R2(DR5)阻抑抗体并不中和该作用，那么该配体就是DR4选择性的。

另一个试验涉及测定在仅有R1-(DR4-)的细胞中的作用。这是如本文所讨论的DR4选择性的优选试验。优选，将配体应用于仅有R1-发出信号的细胞中。优选，该细胞是Ramos细胞。优选，信息显示(readout)是功能活性，优选，死亡诱导活性(细胞凋亡)。这对试验至关重要—仅结合并不是同功能性死亡诱导一样有力的指标。因此，优选，根据本发明的DR4选择性配体在仅有DR4发出信号的细胞如Ramos细胞中诱导死亡。更优选，所述配体不会在仅有DR5发出信号的细胞如Jurkat细胞中诱导死亡。

应该指出，本发明优选研究选择性作用，而不是仅仅是偏爱或者特异性作用。优选用于确定选择性的标准是：选择性地分离活性TRAIL-R1受体复合物的能力，以及特异性的TRAIL-R1阻抑抗体中和突变的TRAIL-R1特异性配体的能力。为了进行比较，可以进行与TRAIL-R2有关的相同试验，适当地替换R2试剂。

上文讨论了适合DR4选择性的序列特征。

致敏/组合治疗

优选，用TRAIL治疗是与敏化剂组合。对于施用来说，组合意指同时、顺序或一起。顺序意指TRAIL紧随敏化剂(sensitizer)之后，或意指敏化剂紧随TRAIL之后。施用间隔(若有的话)可以是适合实际或治疗理由而测定的任何适宜间隔。

HDAC抑制剂

优选，敏化剂是HDACi。优选，HDACi选择下组：缩酞、曲古霉素A(TSA)和丙戊酸。优选，HDACi是丙戊酸。之前，已知丙戊酸是抗痉挛剂并用于治疗疾病如癫痫症。本文令人惊讶地公开了丙戊酸在白血病如CLL中的应用。

这样，可使用TRAIL突变体，其以有利的低水平在非靶组织中是无活性或有活性的。然而，通过用敏化剂如HDACi，联合处理靶组织时，在该组织中的TRAIL活性会有利地得到增强，从而产生治疗上有用水平的细胞死亡。优选，至少一种TRAIL和敏化剂处理是定向靶组织的，优选，这两者都定向靶组织。靶向(targeting)意指非定向施用后，保留/结合/激活/切割成活性形式或其它能将药剂定向靶组织的方式，或靶向意指局部施用或限制形式的施用，其物理性地将该物质定向于靶组织。

优选，通过HDACi治疗来进行TRAIL治疗。这能有利地杀死现有技术不能杀死的细胞。例如，HDACi预治疗后，TRAIL-R1特异性突变体可杀死TRAIL-R1 Ab(HGS-ETR1)不能杀死的细胞。这项研究已在细胞系中进行。这表明配体的活性范围比Abs更广。在不限于理论的情况下，这种作用可能归因于配体和Ab诱导细胞凋亡的某种不同机制而造成的。

HDACi是与产瘤癌有关的优选敏化剂。HDACi是与CLL有关的特别优选的敏化剂。

在各类HDAC抑制剂中，将优选靶向I类HDAC的药剂优选用于致敏。

仅特异性地抑制II类HDAC的药剂不能将TRAIL诱导的细胞凋亡敏化至足够高的水平，因此本发明优选将其排除。因此，优选I类HDAC抑制剂。

在I类HDACi中，HDAC1和/或HDAC2的抑制剂是最优选的。

其他的敏化剂

蛋白酶体抑制剂可用作敏化剂，如PS-341(硼替佐米)、MG132或其他。

现有治疗剂可用作敏化剂，阿霉素、5FU、顺铂(Cisplatin)、夫拉平度(Flavopiridol)、CD20(利妥昔单抗(Rituximab))、白藜芦醇(Resveratrol)或其它。

通过正调节TRAIL-R1受体水平，可实现CLL细胞(以及事实上其他的经由TRAIL-R1发出信号的原发性肿瘤)的敏化。这可在使用靶向AP1的化学治疗剂或受到HBV感染后(例如，下列文献中所描述的：Guan等，Oncogene.2002，21：3121-9；Guan等，J.Cell Physiol.2001，188:98-105；Janssen等，JHepatol.2003，39：414-20)进行。

优选，对AP1转录进行正调节从而敏化细胞。

其他的致敏方式包括调节p53。

其他的致敏方式包括放射治疗。优选，本发明的治疗与放射治疗进行组合，从而增强对TRAIL的敏感性。

其他的敏化剂包括HepV病毒、PKC抑制剂(PKCi)和蛋白酶体抑制剂，在每种情况下都应适当留意细胞环境。

疾病

我们已经证明来自CLL和MCL患者的原发性细胞主要通过TRAIL-R1发出信号，因此，本发明在这些疾病中具有特别的作用。本发明还发现可施用于包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)特别是B细胞NHL的血液谱系(haematological lineage)的其他原发性肿瘤中，并且可应用于在其细胞主要经由TRAIL-R1发出信号的其他疾病中。

因此，TRAIL-R1/R2相互之间的关联(relative involvement)取决于细胞谱系，或者说，在原发性细胞和永生细胞之间存在差异。在此情况下，获得的大部分支持TRAIL-R2发出信号起主要作用的数据是在永生细胞而非原发性细胞环境中。然而，有些使用细胞系的报告也支持TRAIL-R1在某些非血液恶性肿瘤中具有潜在的关键作用。这些包括***、NSCLC、大肠和直肠肿瘤，以及转化的人角化细胞。因此，本发明还发现可用于治疗这些疾病。

优选，本发明应用于血液谱系细胞，如非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia)或其他细胞，如Jurkat细胞系、Ramos细胞系、T细胞或B细胞或其衍生物。优选，本发明应用于B细胞谱系细胞。

因为许多培养的细胞系都可能优先通过DR5发出信号，所以优选在原发性肿瘤细胞中进行确认。

在广泛的方面中，本发明涉及DR4选择性TRAIL在治疗其细胞主要通过TRAIL-R1发出信号的疾病中的用途。

药物组合物

本发明也提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明TRAIL和/或敏化剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合物)。

药物组合物可以在人类医学和畜牧医学中用于人或动物，并且通常包含任何一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。治疗用的可接受载体或稀释剂在药学领域中是熟知的，并且描述于如Remington’s PharmaceutialSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。可根据预期的施用途径和标准的药物惯例来进行药用载体、赋形剂或者稀释剂的选择。药物组合物除载体、赋形剂或稀释剂以外，还可包含任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。

防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂可提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

依赖于不同的递送***，可有不同的组合物/剂型要求。根据实例，可将本发明的药物组合物配制成使用微泵或通过粘膜途径施用，如配成吸入用鼻腔喷雾剂(nasal spray)或气溶胶喷雾剂或可口服溶液，或通过可注射形式配制组合物用于非肠道施用，通过如静脉内、肌肉内或皮下途径来施用。另外，可将剂型设计成可采用多种途径来施用。

当通过胃肠道粘膜施用药剂时，在通过胃肠道的运输过程中，它应该保持稳定；例如，应该抵抗蛋白水解酶的降解作用、在酸性pH下稳定且抵抗胆汁的净化作用。

适当的时候，药物组合物可以以下述方式施用，吸入施用、栓剂或***栓剂的形式、以洗剂、溶液、乳剂、药膏或撒布粉(dusting powder)的形式和皮肤用药膏的形式局部施用；以含有赋性剂如淀粉或乳糖的片剂形式口服，或以胶囊或卵形囊剂(ovules)的形式单独或与赋形剂混合口服，或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浊液形式口服，或将它们经非肠道注射，例如静脉内、肌肉内或皮下注射。对于非肠道施用，组合物最好以无菌水溶液的形式施用，所述溶液可以含有其他的物质，如足够的盐或单糖，从而使得该溶液与血液等渗。对于口腔或舌下施用，可以以常规方式配制的片剂或锭剂的形式来施用组合物。

对于某些实施方案，本发明的TRAIL/敏化剂可与环糊精组合使用。已知环糊精可与药物分子形成包合物或非包合复合物。药物-环糊精复合物的形成可改善药物分子的溶解性、溶解率、生物利用率和/或稳定性。药物-环糊精复合物通常可用于大多数剂型和施用途径。作为对直接与药物混合的替代方法，环糊精可用作辅助性添加剂，例如，作为载体、稀释剂或增溶剂。α、β、γ环糊精是最常用的，适宜的实例描述于WO-A-91/11172、WO-A-94/02518以及WO-A-98/55148中。

可在正接受治疗的受试者中原位制备TRAIL。在此情况下，编码所述TRAIL的核苷酸序列可通过使用非病毒技术(如通过使用脂质体)和/或病毒技术(如通过用逆转录病毒)来递送，以便所述TRAIL蛋白可以由所述核苷酸序列表达。

在优选的实施方案中，本发明的药物经局部施用。优选，药物的形式适宜局部递送的形式。

施用

术语“施用”包括通过病毒或非病毒技术递送。病毒递送机制包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录酶病毒载体、慢病毒载体以及杆状病毒载体。非病毒递送机制包括脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体、阳离子脂质体(Lipofectin)、阳离子表面两性分子(cationic facial amphiphiles，CFAs)以及其组合。

可以单独施用本发明的组分，但通常以药物组合物施用，例如，当组分是以与根据预期的施用途径和标准药物惯例而选择的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体混合。

例如，可以以片剂、胶囊、卵形囊剂、酏剂、溶液或悬浊液的形式施用(如口服或局部)组分，其可含有调味剂或着色剂，用于速释、缓释、修饰释放、持续释放、脉冲释放或控释的用途。

如果药物是片剂，那么所述片剂可含有赋形剂(如微晶质纤维素、乳糖、醋酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钙和糖胶)、崩解剂(如淀粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠(sodium starch glycollate)、交联羟甲纤维素钠和某些复合硅酸盐)，和颗粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和***树胶)。另外，还包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯以及云母。

在明胶胶囊中，也可将相似类型的固体组合物作为填充剂。在此情况下，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量的聚乙二醇。对于含水悬浊液和/或酏剂，所述药剂可与各种增甜剂或调味剂、着色剂或染料、与乳化剂和/或悬浊剂、以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和丙三醇，及其组合进行组合。

施用(递送)途径包括但不限于下列中的一种或多种：口部(如作为片剂、胶囊，或作为可摄食溶液)；局部、粘膜(如作为吸入用鼻腔喷雾剂或气溶胶喷雾剂)；鼻腔；非肠道(如通过可注射的形式)；胃肠道；脊柱内；腹膜内；肌肉内；静脉内；子宫内；眼内(intraocular)；皮内；头颅内；气管内(intratracheal)；***内；侧脑室内(intracerebroventricular)；大脑内；皮下；眼部(ophthalmic，包括玻璃体内或房室内(intracameral))；透皮(transdermal)；直肠；口腔；***；舌下。

优选，药物组合物是局部递送的。

可以理解，并非药物的所有组分都通过相同的途径施用。同样，如果组合物含有多于一种的活性组分，则那些组分可通过不同的途径施用。

如果非肠道施用本发明的组分，则这种施用的实例包括下列中的一种或多种：静脉内、动脉内、腹膜内、胸内、心室内、尿道内、胸骨内(intrasternally)、头颅内、肌肉内或皮下施用所述组分；和/或通过使用输注技术(infusiontechniques)。

对于非肠道施用，组分最好是以无菌水溶液的形式使用，其可含有其他的物质，例如足够的盐或葡萄糖，以获得与血液等渗的溶液。如果需要，含水溶液可进行适当的缓冲(优选至pH3-9)。通过本领域技术人员熟知的标准药物技术，可很容易地实现适宜的非肠道剂型的制备。

如上所述，本发明的组分可鼻内施用，或通过吸入施用，可方便地以干粉吸入剂或气溶胶喷雾剂的形式由加压容器、泵、喷雾容器或喷雾器递送，使用适宜的推进剂给药，适宜的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、氢氟烷(hydrofluoroalkane)如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A^TM)或1，1，1，2，3，3，3，-七氟丙烷(HFA 227EA^TM)、二氧化碳或其他适宜的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供一个阀以释放一个计量的量而确定。加压容器、泵、喷雾容器或喷雾器可含有活性化合物的溶液或悬浊液，例如，使用乙醇和推进剂作为溶剂的混合物，它们可另外含有润滑剂，如脱水山梨醇三油酸酯(sorbitan trioleate)。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药盒(例如由明胶制备)可配制为含有药剂和适宜粉末载体例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

可选地，本发明的组分物可以以栓剂或***栓剂的形式施用，或以凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳剂、药膏或撒布粉的形式局部施用。本发明的组分也可皮肤施用或透皮施用，例如，通过使用皮肤用药膏。它们也可通过肺部或直肠途径施用。它们也可通过眼部途径施用。对于眼部使用(ophthalmicuse)，可将化合物配制为等渗、pH调节的无菌盐微粉悬浊液，或优选配制为等渗、pH调节的无菌盐溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵(benzylalkoniumchloride)组合。另外，它们可以配制在药膏如凡士林中。

对于局部皮肤施用来说，可将本发明的化合物配制为适宜的药膏，其含有悬浮或者溶解于混合物中的活性化合物，所述混合物与下述一种或多种物质混合：矿物油、液体凡士林(liquid petrolatum)、白凡士林、丙二醇、聚乙烯聚丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，可将其配制成适宜的洗剂或乳剂，其悬浮或溶解于例如一种或多种下列物质的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸(sorbitan monostearate)、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60(polysorbate 60)、十六烷基酯蜡(cetyl esters wax)、鲸蜡醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇(octyldodecanol)、苯甲醇和水。

可将本发明的TRAIL和/或敏化剂与一种或多种其他药学活性物一起施用。根据实例，本发明涵盖了用本发明的TRAIL和/或敏化剂以及一种或多种类固醇、止痛剂、抗病毒剂或其他药学活性物质一起同时或顺序治疗。

可以理解，这些治疗方案包括顺序地、同时地或一起施用所述物质。

由于在胃肠道中存在TRAIL遭破坏的风险，优选，不将TRAIL施用至胃肠道或口腔或直肠。优选，TRAIL通过注射施用。优选，以注射施用配制的TRAIL。

可以胃肠道的方式施用敏化剂如HDACi。在优选的实施方案中，HDACi是丙戊酸钠，优选以适合口服施用来配制，并优选采用口服施用。

剂量水平

通常，医师可确定最适宜个体受试者的实际剂量。对任何特定患者来说，具体的剂量水平和剂量频率可以变化，并且依赖于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、综合健康、性别、饮食、施用方式和时间、***速率、药物组合、具体病症的严重性，以及个体正经受的治疗。

根据需要，药剂的使用剂量可以为0.01-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重。

剂型

可将本发明的组分配制至药物组合物内，如通过利用本领域已知的技术与一种或多种适宜的载体、稀释剂或赋形剂混合。

药物活性盐

本发明的TRAIL和/或敏化剂可作为药学上可接受的盐来施用。通常，通过适当的使用期望的酸或碱，可很容易地制备药学上可接受的盐。盐可从溶液中沉淀，并通过过滤收集，或可通过蒸发溶剂回收。

其他的优势和应用

已证明现有技术的“DR4”TRAIL突变体在DR4细胞系中没有活性。本发明人已制备了对DR4受体具选择性的新型突变体。这些突变配体可用于治疗和试验***中，特别是，在治疗癌症如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和主要经由DR4(TRAIL R1)发出信号的其他癌症中。

正常的肝细胞是经由TRAIL R2(DR5)发出信号，因此，DR4选择性的TRAIL配体可有利地减少肝毒性。

因此，本发明的配体比现有技术的TRAIL突变体具有更强的特异性和更低的肝毒性。

优选，本发明的TRAIL突变体包含TRAIL的氨基酸95-281。特别优选TRAIL突变体TRAIL.R1-4以及TRAIL.R1-5，如表1中所示。更优选，不具有His标签的TRAIL突变体。

TRAIL.R1-4包含具有199Val、201Arg、213Trp以及215Asp的6HisTRAIL 95-281。

TRAIL.R1-5包含具有193Ser、199Val、201Arg、213Trp以及215Asp的6His TRAIL 95-281。

本发明也涉及非血液癌(如非B细胞衍生的癌症)的治疗，如乳癌。

本发明也涉及如上文所述的用作药物的TRAIL；如上文所述的TRAIL用于制备癌症用药物的用途；以及如上文所述的TRAIL用于治疗癌症的用途。

现在，将通过实施例的方式来描述本发明，所述实施例本质上并非旨在限制而是为了阐明和帮助理解本发明。

附图的简要说明

图1示出可视化蛋白的曲线图、柱状图和照片。

图2示出可视化蛋白照片和标绘图。

图3示出有注释的序列比较以及TRAIL结构可视模型。

图4示出曲线图和柱状图。

图5示出印迹照片。

图6示出印迹照片、细胞的显微照片和柱状图。

更具体来说：

图1示出由TRAIL受体突变体引起的细胞凋亡的细胞型特异性诱导。用一定浓度的野生型TRAIL(●-●)、TRAIL.R1-5(□-□)、TRAILR2-6(◆-◆)以及TRAIL.R1-6(☆-☆)将A：Jurkat细胞和B：Ramos细胞培养4个小时，并测量细胞凋亡。细胞还暴露于HGS-ETR1或HGSETR2(1μg ml^-1)中。C：将Ramos或Jurkat细胞单独或用TRAIL-R1封闭Ab(TRAIL-R1blocking Ab)或TRAIL-R2中和Ab(TRAIL-R2neutralizing Ab)(5μgml^-1)预温浴30分钟。随后，将Ramos细胞暴露于wt TRAIL、TRAIL.R1-5(500ng ml^-1)，或HGS-ETR1(1μg ml^-1)中4小时，并将Jurkat细胞暴露于TRAIL-R2-6(250ng ml^-1)、TRAIL-R1-5(1μg ml^-1)，或HGS-ETR1和ETR2(1μg ml^-1)中，评估细胞凋亡。D：将Ramos和Jurkat细胞暴露于如上文所述的wt TRAIL或TRAIL突变体中，并处理通过Western印迹分析法测定的凋亡蛋白酶-3和-8。星号表示非特异性条带。用于检测凋亡蛋白酶-8 p18亚基的下组印迹的暴露时间是上组的两倍。通过磷脂酰丝氨酸外翻(phosphatidylserine externalization)评估细胞凋亡，并将结果用至少3个单独测量的平均值±SEM来表示。

图2示出在不同的细胞类型中TRAIL突变体选择性地诱导DISC形成。A：将Ramos细胞和B：Jurkat细胞暴露于500ng ml^-1的生物素化型wt TRAIL(His-T)、TRAIL.R1-5—一种TRAIL.-R1选择性突变体、TRAIL.R2-6—一种TRAIL-R2选择性突变体，以及TRAIL.R1-6—一种相关但无活性突变体中。在细胞暴露30分钟后，分离DISC复合物并通过Western印迹法分析显示的蛋白。为了提供未受刺激的受体对照(u/s)，将生物素化wt或突变体TRAIL加入到未处理的细胞裂解物中。C：将从患有CLL患者获得的新鲜分离细胞单独或在缩酞(10nM)存在的情况下温浴16小时。随后，将细胞在wtTRAIL(100ng ml^-1)或1μg ml^-1的TRAIL.R1-5、TRAIL.R2-6、HGS-ETR1(ETR1)或HGS-ETR2(ETR2)中再暴露6小时，并评估细胞凋亡。用TRAIL.R1-5或TRAIL.R2-6(100ng ml^-1)获得事实上相同的结果，但较高浓度显示缺乏TRAIL.R2-6活性。用不同符号表示来自6个独立患者的数据，实线表示平均值。为了清楚，省略了来自另一个患有高水平自发性细胞凋亡症的患者数据，但其显示了相同的趋势。

图3示出TRAIL/TRAIL-R1复合物的模型以及TRAIL/TRAIL-R2复合物的晶体结构。A：TRAIL-R1和TRAIL-R2的序列比对。显示的残基编号是TRAIL-R2的编号(无其N末端的信号肽)；青色背景中的残基在两个结构中相同，而且黄色背景中的那些残基是保守的；在本文中讨论了残基Glu98(以蓝色星号表示)和Arg(Ser)104(以红色星号表示)在TRAIL/TRAIL-R1/R2相互作用中的作用。B：TRAIL的序列和晶体学二级结构(蓝色)，示出TRAIL.R1(红色向下箭头)和TRAIL.R2(蓝色向上箭头)取代的位置。C：TRAIL Asn199在TRAIL(黄色)/TRAIL-R1(青色)/R2(绿色)相互作用中的作用。在TRAIL-R1和-R2两者中都存在的氢键显示为黑色虚线，仅在TRAIL-R2中存在的氢键显示为红色虚线。由于TRIAL取代N199V而使这些氢键消失也进行了图解。D：TRAIL Tyr 189在TRAIL(黄色)/TRAIL-R1/R2(绿色)的相互作用中的作用。在TRAIL-R1/R2中从酪氨酸到保守的谷氨酸的氢键显示为虚线。在TRAIL参与与Tyr189疏水相互作用的残基——在Y189取代的TRAIL中相互作用丢失—也已示出。使用ESPript(Gouet等，1999 Bioinformatics Vol.15，pp 305-308)获得图A和图B(Panels A and B)，使用PyMol(DeLano，2002：http://www.pymol.org)获得图C和图D。

具体实施方式

实施例利用下面的核心方法：

淋巴细胞的纯化、细胞系和培养物

如MacFarlane等(2005.Cell Death and Dfferentiation vol.12第773-782页)所述，培养Ramos和Jurkat T细胞，其中所述Ramos细胞是EB病毒阴性巴克氏淋巴细胞系(Epstein-Barr virus-negative Burkitt’s lymphoma cellline)。在患者同意和当地伦理道德委员会批准的情况下，从CLL患者中获得血液样品，按MacFarlane等(2002.Oncogene 21，6809-6818)所述进行CLL细胞纯化。用E.Sausville博士(NCI，USA)提供的缩酞(10nM)，将细胞温育16小时。随后，分别用下列材料将细胞再培养6小时：HGSETRI或HS-ETR2，(Human Genome Sciences，Roceville，MD)，其分别为TRAIL-R1或-R2的激动性mAbs，His-TRAIL-LE(含有低内毒素的重组TRAIL—Alexis Corporation，Nottingham，UK)，His-TRAIL，一种类似型的人重组TRAILE(MacFarlane等，1997.J.Biol.Chem 272，25417-25420)但不另外进行纯化而减少内毒素水平或一种如MacFarlan等(2005，同上)所描述的突变体型His-TRAIL突变体。在暴露于TRAIL之前，用分别来自Alexis和R&D***的TRAIL-R1阻抑Ab和TRAIL-R2中和Ab将细胞系预温育30分钟。将来自患有MCL患者的新鲜分离细胞分离、纯化并与上文描述CLL细胞所用形式不同的TRAIL温育。马上分析样品的细胞凋亡或者保存于-80℃供随后的Western印迹使用。其他的方法和试剂如Inoue(004 Cell Death Differ 11 Suppl 2，S193-206)和MacFarlane等(2005，同上)所述。

细胞凋亡的定量和Western印迹分析

如MacFarlane等所述(2002，同上)在存在碘化丙啶的情况下，通过磷脂酰丝氨酸(PS)外翻来对细胞凋亡进行定量。如Inoue等(2004，同上)和MacFarlane等(2005，同上)所述，制备用于Western印迹分析的样品并进行凋亡蛋白酶处理检测。

TRAIL突变体的合成

使用Quik-Change定点诱变试剂盒(Stratagene，CA，USA)，产生His-TRAIL突变体(残基95-281)，利用DNA测序进行确认，并随后在大肠杆菌中表达并纯化，如前所述(MacFarlane等，1997，同上)。

DISC分析

将Ramos或Jurkat细胞(每次处理5×10⁷个细胞)暴露于生物素标记的重组His-TRAIL(生物素化TRAIL)或其一种突变体形式(500ng ml^-1)中30分钟，随后评估DISC形成，如前所述(MacFarlane等，2002同上)。

构建TRAIL/TRAIL-R1复合物模型

基于TRAIL/TRAIL-R2复合物的晶体结构，我们构建了TRAIL/TRAIL-R2复合物模型。首先，基于TRAIL-R2的结构，用同源性模式化(“Modeller”)获得TRAIL-R1的结构模型。随后，在具有TRIAL的复合物中，通过让TRAIL-R1模型的骨架原子与TRAIL-R2的相应原子重叠，而构建出TRAIL/TRAIL-R2复合物模型。

实施例1：示例性和比较性的TRAIL突变体序列

下列表格显示与现有技术相比(“Genentech”)在选择位点处的野生型TRAIL序列以及本发明的TRAIL突变体。特别优选的本发明的TRAIL突变体是TRAIL.R1-4和TRAIL.R1-5。

另外，该实施例的突变体比现有技术的突变体长，因为他们含有TRAIL的残基95-281，而Genentech版本仅含有残基114-281。

TRAIL.R1-5突变体仅有一个氨基酸(＝残基189)不同于Genentech突变体。本发明的突变体保留了野生型酪氨酸，而Genentech突变体含有一个丙氨酸取代。通过体外结合测定，Genentech突变体显示了对TRAIL R1(DR4)的选择性结合，但在经由R1发出信号的细胞中没有信号活性。

我们证明，尽管Genentech突变体显示了对R1的选择性结合，但其不具有任何R1特异性活性，即，其在经由R1发出信号的细胞中不会诱导细胞凋亡。而且，我们已经证明，突变体TRAIL.R1-5的确会诱导R1选择性细胞凋亡活性。这是本发明配体的意外作用，因为现有技术教导了用Ala取代Tyr-189对DR4选择性很重要。

TRAIL.R1-4也显示了良好的R1选择性活性，从而强化了在位置189处的酪氨酸对R1选择性细胞凋亡活性很重要这一发现。

实施例2：在原发性恶性淋巴瘤中TRAIL受体选择性突变体经由TRAIL-R1向细胞凋亡发出信号

综述

基于使用激动单克隆抗体(Mab)的研究，我们证明了尽管TRAIL-R2在细胞表面表达，但原发性慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞可能主要通过TRAIL-R1发出信号。我们已合成了对TRAIL-R1或TRAIL-R2具有特异性的突变体型TRAIL。这些突变体在细胞系中选择性诱导细胞凋亡是因为它们选择性结合其同源受体，从而通过形成死亡诱导信号复合物(DISC)而导致细胞凋亡。使用这些突变体，我们确凿地证明了，CLL和套细胞淋巴瘤细胞几乎无一例外地通过TRAIL-R1发出细胞凋亡信号。这些数据证实这两种TRAIL死亡受体可独自发出信号，并且证明DR4受体-特异性突变体型TRAIL具有治疗实用性。

TRAIL受体选择性突变体的细胞凋亡活性

最近，基于对适当的受体-Fc的亲和性，利用新型噬菌体显示法选择出选择性结合TRAIL-R1或-R2的TRAIL突变体。只有选择性结合TRAIL-R2的突变体会在几个细胞系中诱导细胞凋亡，而导致作者得出结论：经由TRAIL-R2而不是TRAIL-R1发出信号对于诱导细胞凋亡更重要(Kelley等(2005 J Bio Chem Volume 280，第2205-2212页))。然而，我们发现CLL细胞几乎完全通过TRAIL-R1发出信号。为了解决这个矛盾，我们合成了两种突变体：TRAIL.R1-6和TRAIL.R2-6(表1)，据报道分别对TRAIL-R1或-R2具有选择性，并且评估了它们在Ramos和Jurkat细胞中诱导细胞凋亡的能力，这两种细胞分别主要通过TRAIL-R1和TRAIL-R2发出信号(MacFarlane等(2005 Cell Death and Differentiation volume 12第773-782页))。HGS-ETR2和TRAIL.R2-6两者，其为TRAIL-R2选择性突变体，都有力地在Jurkat细胞中诱导细胞凋亡，但在Ramos细胞中没有诱导，如通过磷脂酰丝氨酸(PS)外翻所评估的(图1A和B)。这些数据与以前的研究相一致，支持TRAIL.R2-6(表1)是选择性TRAIL-R2突变体的结论。然而，TRAIL.R1-6—推荐的TRAIL-R1选择性突变体(Kelley等，2005)，在Jurkat细胞中如预料的一样没有活性，但在Ramos细胞中也大体没有活性(图1A&B和表1)。我们原本预测这种突变体在Ramos细胞中会有活性，分析观察到无活性(Kelley等，2005)的原因是由于使用了主要通过TRAIL-R2而不是TRAIL-R1发出信号的细胞系。活性的丢失显然是因为对TRAIL.R1-6中6个靶氨基酸残基中的一些或者全部进行了取代。为了证明这一点，我们合成了在野生型(wt)蛋白和TRAIL.R1-6(表1)之间具有中间取代的TRAIL突变体，并检测了它们在Ramos和Jurkat细胞中的活性，目的是获得在Ramos细胞中选择性诱导细胞凋亡的突变体。首先，由于两个氨基酸取代Tyr213Trp和Ser215Asp都包括在噬菌体显示文库中的全部TRAIL-R1突变体中，我们检测了TRAIL.R1-2，因为它们对TRAIL-R1-Fc具有相似的亲和性，但对TRAIL-R2-Fc的亲和性则低10倍(Kelley等，2005)。然而，这种突变体在Ramos和Jurkat细胞中对wt TRIAL都具有非常相似的活性(表1)，表明其既对TRAIL-R1没有特异性，也对R2没有特异性。接下来，我们检测了TRAL.R1-4突变体，其在Ramos细胞中对wt TRAIL诱导相似水平的细胞凋亡，但在Jurkat细胞中则显示活性降低(表1)，表明对TRAIL-R1具有一定程度的选择性。在Tyr189Ala处进行另外的取代获得TRAIL.R1-5a突变体，由于其对Jurkat细胞完全无活性且对显著地减少了对Ramos细胞的活性(表1)，因此该突变体丢失了对TRAIL-R2的所有活性但也丢失了对TRAIL-R1的许多活性。这就促使我们对仅有Try189Ala的单个氨基酸取代的作用进行了检测。与wt TRAIL相比，TRAIL.R1在Ramos细胞和Jurkat细胞中显现的诱导细胞凋亡的能力降低(表1)。由于TRAIL.R1-5a突变体中的Tyr189Ala取代导致在Ramos细胞中没有活性，因此我们选择从原始的TRAIL.R1-6中忽略这种取代。所得的突变体，TRAIL.R1-5，保留了对Ramos细胞的大部分wt TRAIL活性，但丢失了许多其对Juarkat细胞的wt TRAIL活性(表1)。其他的研究显示，这种突变体显示在Ramos细胞中，与wt TRAIL非常相似的浓度反应，但在Jurkat细胞中就比wt TRAIL的活性要低很多(图1A和B)。因此，这种突变体显示出主要通过经由TRAIL-R1发出信号来诱导细胞凋亡的所需特性。TRAIL.R1-5突变体在Ramos细胞中通过TRAIL-R1发出信号的特异性是通过对TRAIL-R1而非TRAIL-R2特异性的阻抑抗体抑制细胞凋亡而得到证实的(图1C)。TRAIL-R2中和性Ab的特异性是从其在Jurkat细胞中抑制TRAIL.R2-6和HGS-ETR2-诱导性细胞凋亡的能力而得以证实的(图1C)。

凋亡蛋白酶活性

为了证实突变体能诱导细胞凋亡，我们检测了它们对加工凋亡蛋白酶-8(在死亡受体-诱导性细胞凋亡中的顶端凋亡蛋白酶)和凋亡蛋白酶-3(效应器凋亡蛋白酶)的效力。在Ramos细胞中，wt TRAIL、TRAIL.R1-5以及HGS-ETR1，但非TRAIL.R2-6或HGS-ETR2，诱导凋亡蛋白酶-8加工成p43/41型和其p18催化活性大亚基，以及凋亡蛋白酶-3加工成其活性大亚基p19/17(图1D)。在Jurkat细胞的标记性对照中，wt TRAIL、TRAIL.R2-6和HGS-ETR2在诱导细胞凋亡(表1)和诱导凋亡蛋白酶-8和-3加工中(图1D，泳道2、3和6)都最有效。TRAIL.R1-5和HGS-ETR1都诱导了少量的凋亡蛋白酶加工(图1D，泳道4和5)，其与在Jurkat细胞中诱导低水平细胞凋亡的能力相当(图1A)并与少量残留的TRAIL-R1信号一致。我们的发现——在Jurkat细胞中，TRAIL-R1阻抑性Ab会阻抑TRAIL.R1-5和HGS-ETR1而非TRAIL.R2-6或HGS-ETR2-诱导性细胞凋亡为这种观点提供了支持(图1C)。将这些资料合在一起就证明了，TRAIL.R1-5和TRAIL.R2-6分别对TRAIL-R1和TRAIL-R2是相对特异性的。

TRAIL突变体蛋白诱导的DISC形成

因为形成活性DISC在许多类型的死亡受体诱导的细胞凋亡中经常是速度受限的，因此我们检测了突变体蛋白在Ramos细胞和Jurkat细胞两者中形成DISC的能力。生物素化的wt TRAIL结合TRAIL-R1和-R2两者，并且向Ramos细胞中的天然DISC募集FADD和凋亡蛋白酶-8，并且将凋亡蛋白酶-8加工为其p43和p41型(图2A泳道2)。推荐的TRAIL-R1选择性突变体即TRAIL.R1-6(Kelley等，2005)或TRAIL-R2选择性突变体即TRAIL.R2-6都不结合可检测量的TRAIL-R1或R2，因此不能向DISC募集FADD或凋亡蛋白酶-8(图2A泳道6和8)，据此解释了它们不能诱导细胞凋亡(图1和表1)。然而，TRAIL.R1-5，我们的选择TRAIL-R1突变体之一(图1和表1)，主要结合TRAIL-R1和小量TRAIL-R2，募集FADD和凋亡蛋白酶-8，并将后者加工为其p43/41形式(图2A泳道4)。因此，在Ramos细胞中，突变体如TRAIL.R1-5选择性地结合与TRAIL-R1，在DISC中募集FADD随后募集并活化凋亡蛋白酶-8。相反，在Jurakt细胞中，wt TRAIL和TRAIL.2-6(TRAIL-R2选择性突变体)在DISC中广泛结合TRAIL-R2并募集FADD和凋亡蛋白酶-8，凋亡蛋白酶-8也被加工为其p43/41的形式(图2B泳道2和8)。无活性的突变体TRAIL.R1-6既不结合TRAIL-R1也不结合-R2，并且不为DISC募集FADD或凋亡蛋白酶-8(图2B泳道6)。TRAIL.R1-5结合小量TRAIL-R1和-R2以及一些DISC中的FADD和小量凋亡蛋白酶-8，所述凋亡蛋白酶-8也进行了部分加工(图2B泳道4)，这些数据合在一起证明了在Ramos细胞和Jurkat细胞中分别形成主要含有TRAIL-R1或TRAIL-R2的DISC是至关重要的。因此，配体中的微小结构变化会使得其优先与TRAIL-R1或-R2结合，从而决定其在适当的靶细胞中形成DISC和诱导细胞凋亡的能力。

取代对TRAIL和TRAIL-R1相互作用的影响

为了获得TRAIL突变对TRAIL结合TRAIL-R1影响的了解(表1)，我们构建了TRAIL/TRAIL-R1复合物的结构模型，并将其与TRAIL/TRAIL-R2复合物的晶体结构进行了比较。两种蛋白(TRAIL-R1和TRAIL-R2在其胞外结构域中共享64％的氨基酸序列同一性)(图3A)间的序列相似性水平促进了该比较。如以前所观察的，TRAIL与TRAIL-R2发生相互作用是通过含对高亲和性结合重要的残基的两个主要的相互作用块(interaction patches)而进行的。第一个相互作用块是TRAIL/TRAIL-R2复合物顶部附近的疏水区，称为50s环(50s loop)，其在许多TNF超家族成员中是保守的。第二个块是称为受体环(receptor loop)的区域，其在细胞膜附近靠近该复合物的底部，含有对每一个单个家族成员具有特异性的特征并且调控受体选择性(图3A)。

受体环，其含有残基91-104，与在三聚体复合物底部附近的TRAIL的Gln205周围的残基簇相互作用(图3B)。与wt TRAIL相比，在TRAIL.R1-2中最初的取代，TRA213Trp和Ser215Asp，没有对Ramos或Jurkat细胞显示任何不同的作用(表1)。然而，进一步的两个取代，即Asn199Val和Lys201Arg，导致突变体TRAIL.R1-4，其保留了wt TRAIL对Ramos的活性，但失去了对Jurkat细胞的一些活性(表1)，因此，与TRAIL-R2相比，显示了一些对经由TRAILL-R1发出信号的选择性。对TRAIL/TRAIL-R1(我们的模型)和TRAIL/TRAIL-R2界面的分析表明，TRAIL-R1选择性的微小增加可能是因为Asn199Val(但不是Lys201Arg)取代。在TRAIL/TRAIL-R2中，预测这种取代会引起两个氢键的丢失(对Arg104的侧链以及对Cys125的羰基主链)。相反，Asn199Val取代可能导致TRAIL/TRAIL-R1中仅一个蛋白间氢键的丢失，因为在TRAIL-R1中，Arg104的等同物是一个更短的Ser残基，其不能与Asn199形成氢键(图3A和C)。Tyr189Ala取代存在于两种TRAIL突变体即TRAI.R1-6和TRAIL.R1-5a中，它们两个都显示了活性的显著丢失(表1)。在TRAIL-R1和-R2结合中Tyr189的重要性可通过直接和间接作用来合理化。Tyr189会与TRAIL-R1和R2两者中的保守Glu(对应于TRAIL-R2中的Glu98)形成氢键。Tyr189Ala取代除去了TRAIL/TRAIL-R1和-R2复合物中的氢键(图3D)。Tyr189Ala取代也会除去与接近TRAIL表面的Arg191、Asp267、Ala272HE Lys224的疏水相互作用(图3D)。因此，这种取代通过使TRAIL表面变形而间接地影响了配体结合。

实施例3：TRAIL-R1但非TRAIL-R2选择性突变体在癌细胞中诱导细胞凋亡

本实施例中的癌细胞是血液恶性肿瘤细胞如CLL细胞和MCL细胞。我们公开了，TRAIL通过经由TRAIL-R1但非TRAIL-R2发出信号而在CLL细胞中诱导细胞凋亡。选择性TRAIL突变体的合成使我们明确地证明了这一点。缩酞使CLL细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡变得敏感(图2C)。最重要的是，缩酞使CLL细胞对TRAILR1-5即TRAL-R1选择性突变体而不使TRAIL.R2-6即TRAIL-R2选择性突变体变得敏感(图2C)。而且缩酞使CLL细胞对HGS-ETR1即激动性TRAIL-R1Ab而不使HGS-ETR2即TRAIL-R2激动性Ab变得敏感(图2C)。

我们也从患套细胞淋巴瘤(MCI)的患者中获得了三个样品，套细胞淋巴瘤是一种不可治愈的侵入性疾病，其占所有非霍奇金氏淋巴瘤的～6％。对于MCL没有标准的治疗，并且特别是对于母细胞变异型(blastoid variant)的预后很糟。分离MCL细胞，在用缩酞(5nM)预处理16小时后，将其暴露于不同形式的TRAIL中。用原发性MCL细胞，获得基本上与CLL细胞相似的结果。wt TRAIL(25.5±3.8％)没有增加，但缩酞(35.4±5％)增加了自发性细胞凋亡(23.4±2.9％)。缩酞使MCL细胞对HGS-ETR1(68.2±6.1％)和TRAIL.R1-5(54.3±9.1％)但不对HGS-ETR2(38.3±4.3％)或TRAIL.R2-6(35.5±3.1％)变得敏感。这些数据合在一起明确地证明了TRAIL在包括CLL和MCL细胞的血液恶性肿瘤中，主要通过激活TRAL-R1而不是TRAIL-R2来向细胞凋亡发出信号。

通过使用TRAIL-R1或TRAIL-R2选择性突变体，我们已经明确地证明了新鲜分离的CLL和MCL细胞，其直接从患者获得，几乎无一例外地经由TRAIL-R1而非TRAIL-R2向细胞凋亡发出信号。无论其他的肿瘤亚型的细胞凋亡信号传输优选通过一种TRAIL受体还是其他的TRIAL受体，其都可以相同的方式方便地进行测定。这些结果对于用TRAIL或其激动性Abs的合理治疗具有显著的意义。如果原发性肿瘤，如CLL或MCL，主要通过TRIAL-R1发出信号，那么根据本发明，应该不要制备几乎无一例外地通过TRAIL-R2发出信号的TRAIL，如HGS-ETR2(Human Genome Science)或Apo2L/TRAIL(Genentech)，并且作为替代，应该使用根据本发明的DR4选择性TRAIL。

我们的数据强调，在开始治疗前，即在诊断环境中，确定原发性肿瘤细胞是否经由TRAIL-R1或经由-R2发出信号是非常关键的。而且，我们的数据证明，TRAIL中的微小结构变化会让其优先与TRAIL-R1或TRAIL-R2结合，随后通过募集FADD和凋亡蛋白酶-8来形成TRAIL-R1或-R2DISC。显然，此类突变的配体在治疗中有用。

表1 各种TRAIL突变体的细胞凋亡诱导能力

^a从His标记的TRAIL(95-281)中产生突变体。突变体用如R1或R2标记显示，合成的该突变体分别对TRAIL-R1或-R2有特异性。突变体最后的数字表示与wt TRAIL相比的氨基酸取代数目。

^b氨基酸相对于野生型TRAIL的变化以粗体显示。破折号表示在来自野生型TRAIL的氨基酸中没有变化。

^c在TRAIL或其突变体(500ng ml-1)中暴露4小时后，采用磷脂酰丝氨酸外翻，在指定的细胞类型中测量细胞凋亡。结果表示为至少三个独立测定的平均值±SEM。

实施例4：受体选择性TRAIL突变体和对不同癌症的应用

在本实施例中，我们进一步提供了优选的突变TRAIL配体。我们还证明了本发明对非血液癌(如非B细胞衍生的癌症)如乳腺癌的应用。

材料和方法

如MacFarlane等(2005，同上)所述，培养Ramos细胞和Jurkat细胞(克隆E6-1)。如以前所述(MacFarlane等，2000 J.Cell Biol.148，1239-1254)，培养乳腺癌细胞系MCF-7(克隆F43)。细胞用His-TRAIL(MacFarlane等，1997JBiol Chem 272，25417-25420)、HGS-ETR1或HGS-ETR2(Human GenomeSciences)，或突变体型His-TRAIL(MacFarlane等，2005同上)培养4小时(Ramos和Jurkat)或6小时(MCF-7)。如MacFarlane等所述(2005同上；MacFarlane等，2002 Oncogene 21，6809-6818)，分析样品的细胞凋亡、Western印迹或TRAIL DISC激活。如MacFarlane等(1997同上)所述，利用Quik-Change定点诱变试剂盒(Stratagene，CA)，产生His-TRAIL突变体(残基95-281)，通过DNA测序进行证实，在大肠杆菌中进行表达，并纯化。对于靶向TRAIL-R1/-R2的siRNA来说，在具有Ren等(2004 Mol.Biol.Cell第15卷第5064-5074页)所述的序列和有效性的情况下，在用阴性对照siRNA(30nM，Ambion，#4611)或TRAIL-R1或TRAIL-R2的预退火的siRNA寡核苷酸进行effectene介导的RANi转染(effectene-mediated RNAi transfection)前，直接将MCF-7细胞接种到6孔板中。转染40小时后，收集细胞，并评估总的TRAIL-R1或TRAIL-R2水平。特别注明，对RANi转染的MCF-7细胞不进行处理或者将其暴露于wt TRAIL中，并根据Bax激活的程度评估细胞凋亡，所述激活程度利用构象特异性Bax Mab(conformation specific Bax MAb)即克隆3进行测定(Dewson等，2003 Oncogene第22卷第2643-54页)。

另外的TRAIL-R1选择性TRAIL突变体

在本实施例中，我们证明了TRAIL中的单个氨基酸取代可赋予对TRAIL-R1的特异性。参阅图4：用浓度增加的His-TRAIL(100-1000ng/ml)或His-TRAIL(500ng/ml)的Arg191Leu或Asn199Val单突变体、ETR1或ETR2(1000ng/ml)将Ramos细胞(A)和Jurkat细胞(B)培养4小时。通过测量％PS+细胞，定量细胞凋亡，显示于图4中的结果为三次独立测定的平均值±SEM。因此，在TRAIL-R1选择性中TRAIL残基R191和N199的生物重要性得以显示。而且，显示TRAIL R191L和TRAIL N199V是TRAIL-R1选择性TRAIL突变体。

不同癌症细胞对DR4选择性TRAILs的应答

使用本发明的受体-选择性sTRAIL突变体揭露了乳腺癌细胞系MCF-7经由TRAIL-R1向细胞凋亡发出信号。参阅图5：(A)用浓度增加的wt TRAIL、TRAIL.R1-5、TRAIL.R2-6(500-1000ng/ml)或ETR1、ETR2(500-2000ng/ml)将MCF-7细胞培养6小时。利用Western印迹法，通过测量加工的凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-7和PARP来对细胞凋亡进行定量。将凋亡蛋白酶-8加工为其p43/p41型和其p18大亚基，凋亡蛋白酶-7加工为其p19大亚基，PARP加工为其p85切割产物。(B)通过TRAIL DISC激活分析，进一步证实MCF-7细胞中的TRAIL.R1-5选择性，其揭露了仅TRIAL.R1-5即TRAIL-R1-选择性突变体会导致在DISC募集和加工凋亡蛋白酶-8，根据三次独立试验的一个试验代表显示结果。

靶向TRAIL-R1和TRAIL-R2的siRNA也揭露了sTRAIL在乳腺癌细胞系MCF-7中经由TRAIL-R1向细胞凋亡发出信号。仅用effectene或存在阴性对照siRNA(30nM)或TRAIL-R1或TRAIL-R2(30nM)的预退火的siRNA寡核苷酸时用effectene转染MCF-7细胞。参阅图6：(A)转染40小时后，收集细胞，并评估总的TRAIL-R1或TRAIL-R2的水平。(B)将RNAi转染的MCF-7细胞暴露于wt-TRAIL下，根据Bax的激活程度，评估细胞凋亡，所述激活程度利用构象特异性Bax MAb即克隆3来测定。根据三个独立试验的一个试验代表显示结果。(C)在三个独立的试验中，在存在或不存在指定的siRNA的情况下，评估Bax激活的程度。显示的结果为平均值±SEM。

这些数据显示乳腺癌细胞，如MCF7细胞系，通过DR4发出信号，并且因此，肯定地证明了DR4信号传输在不同癌症以及血液衍生性癌症中是非常重要的。因此这些发现还阐明了本发明的DR4特异性(DR4选择性)突变体TRAILs的工业应用。

引入以上说明书中提到的所有出版物作为参考。在没有偏离本发明范围的情况下，对本发明描述的方法和***作各种修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管根据具体优选的实施方案，已对本发明作了描述，但应该理解，不应该将如权利要求所述的本发明不适当地限制于此类具体的实施方案。事实上，为了实施本发明，对所述的模式作各种修改——这些修改对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言是显而易见的，都意欲落在下列权利要求的范围内。

序列表

<110>医药研究委员会(MEDICAL RESEARCH COUNCIL)

<120>肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)

<130>P023755WO

<150>0524316.7

<151>2005-11-29

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>281

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，His-TRAIL

<400>2

<210>3

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-6

<400>3

<210>4

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-2

<400>4

<210>5

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-4

<400>5

<210>6

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-5a

<400>6

<210>7

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-1

<400>7

<210>8

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R1-5

<400>8

<210>9

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TRAIL突变体，TRAIL.R2-6

<400>9

Claims (29)

1.能通过DR4选择性地发出信号的TRAIL，其包含位置189处的Y。

2.根据权利要求1所述的TRAIL，其还包含：

(i)191L；或

(ii)199V；或

(iii)193S。

3.根据权利要求1或2所述的TRAIL，其还包含201R、213W和215D。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的TRAIL，其包含对应于TRAIL的至少氨基酸95-281的序列。

5.能通过DR4选择性地发出信号的TRAIL在治疗癌症中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述癌症是慢性淋巴细胞白血病或套细胞淋巴瘤或B细胞非霍奇金氏淋巴瘤。

8.通过施用能通过DR4选择性地发出信号的TRAIL来治疗受试者癌症的方法，所述方法包括确定所述受试者的靶细胞是否经由DR4发出信号，其中如果所述靶细胞经由DR4发出信号，则施用能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL。

9.根据权利要求8所述的方法，其还包括施用敏化剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述敏化剂是HDAC抑制剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸。

12.能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症细胞通过DR4发出信号。

13.治疗受试者B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL。

14.治疗受试者B细胞非霍奇金氏淋巴瘤或套细胞淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括向所述受试者施用能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其还包括向所述受试者施用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在施用所述HDACi后，施用所述TRAIL。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述HDACi至少8个小时后，施用所述TRAIL。

18.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述HDACi至少16个小时后，施用所述TRAIL。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中在约8-16小时的时间段内施用所述HDACi。

20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法，其中在约4小时的时间段内施用TRAIL。

21.在血液恶性细胞中诱导死亡诱导性信号复合物(DISC)形成的方法，其包括使所述细胞与组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)和能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL接触。

22.在血液恶性细胞中诱导凋亡蛋白酶激活的方法，其包括使所述细胞与组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)和能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL接触。

23.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述HDACi选自如下组成的组：缩酞、曲古霉素A(TSA)和丙戊酸。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述HDACi是丙戊酸。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述丙戊酸是丙戊酸纳。

26.根据权利要求1-4中任一项所述的TRAIL，其还包含非肽多聚体。

27.根据权利要求26所述的TRAIL，其中所述多聚体选自如下组成的组：聚乙二醇、聚丙二醇和聚醚。

28.试剂盒，其含有能经由DR4选择性地发出信号的TRAIL和敏化剂。

29.根据权利要求8-11或权利要求13-25所述的方法，或根据权利要求5、6、7或12所述的用途，或根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述TRAIL是根据权利要求1-4、权利要求26或权利要求27中任一项所述的TRAIL。

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