CN101386842B

CN101386842B - 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其反义核苷酸序列

Info

Publication number: CN101386842B
Application number: CN2008101199939A
Authority: CN
Inventors: 王宏芝; 魏建华; 王彦珍; 李瑞芬; 马荣才
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2028-10-21
Also published as: CN101386842A

Abstract

本发明公开了脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其抑制该基因表达的方法与专用反义核苷酸序列。本发明的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶，选自如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的由(a)衍生的蛋白质。本发明中利用DHS的反义核苷酸序列抑制植物内源DHS基因的正常表达，进而提高了植物对多种不同胁迫环境的抗性，如抗旱性、耐低温性和抗盐性，每种抗性都显著高于阴性对照，而且这几种抗性都是同时得到提高的。因此，本发明脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其反义核苷酸序列与本发明方法对提高作物的产量有重要意义。

Description

脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其反义核苷酸序列

技术领域

本发明涉及脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其反义核苷酸序列，特别涉及脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因及其抑制该基因表达的方法与专用反义核苷酸序列。

背景技术

植物的生长发育受环境影响很大。各种环境胁迫会严重影响作物的生长情况，造成作物减产，引发全球粮食和生态危机。在当今粮食供给全球紧张的情况下，提高作物的抗性，使其克服各种不良环境，如低温、高温、干旱、盐渍等，进而提高作物产量，对缓解粮食压力尤为必要。

随着分子生物学的发展，人们已能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的耐(抗)性机理。经过大量研究，人们已在植物抗逆的形态学、生理生化、生物物理、生态及细胞遗传学方面取得了广泛进展，并已克隆到在植物抗逆反应中起重要作用的一些基因(梁慧敏，夏阳，王太明，植物抗寒冻、抗旱、耐盐基因工程研究进展，草业学报，2003，12(3)：1-7)。

目前业已分离和鉴定了大量的抗逆基因。这些基因主要有以下几类：一类为渗透保护剂类基因，这类基因能够增加植物渗透性代谢产物的合成能力，使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质(如甘露醇、甜菜碱、海藻糖等)，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性；这些基因包括脯氨酸合成酶基因(如脯氨酸合成酶P5cs)、果聚糖合成酶基因(如果聚糖蔗糖酶基因sac B)、甜菜碱合成相关酶基因(如甜菜碱醛脱氢酶BADH)、海藻糖生物合成相关基因(如细菌的6-磷酸海藻糖合成酶基因otsA，细菌的6-磷酸海藻糖磷酸化酶基因otsB)等；这类基因主要用于改良植物的抗旱性。第二类为清除活性氧的相关酶类基因；对干旱胁迫下的植物体内抗氧化防御***的研究表明，此***是由一些能够清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如超氧化歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸(AsA)等，它们协同抵抗干旱胁迫诱导的氧化伤害。第三类为编码转录因子的调节基因；这些转录因子能调节功能基因的表达和信号转导，它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因的表达，因此，可以通过转化调节基因来提高植物的耐旱性。其中DREB转录因子是目前研究较多的抗非生物胁迫的转录因子，响应抗盐和低温胁迫。由于生长在自然界中的植物，常常同时受到一种或几种环境逆境的威胁，因此，寻找对各种胁迫均产生响应的基因，会更有效地改良农林作物的抗逆特性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种脱氧羟腐胺赖氨酸合酶及其编码基因。

本发明所提供的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶，来源于本生烟草(Nicotianabenthamiana)，为如下(a)或(b)的蛋白：

(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列4由379个氨基酸组成。

为了使(a)中的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶便于纯化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)和(b)中的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。(b)中的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的编码基因可通过将序列表中序列3的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明所提供的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的编码基因选自如下(1)、(2)或(3)：

(1)核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的DNA分子。

上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种专用反义核苷酸序列。

本发明所提供的专用反义核苷酸序列，可以为上述编码基因的反义核苷酸序列中的任一段大于等于25bp的序列；具体可以为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

含有本发明任一专用反义核苷酸序列的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围；所述重组载体中还可以包括用于实现反义多核苷酸转录的调节序列，如启动子、终止子。

其中，所述重组载体可以为将本发明任一专用反义核苷酸序列***载体pBI121的多克隆位点得到的；所述重组载体具体可以为将序列表中序列2所示的专用反义核苷酸序列***载体pBI121的XbaI和SacI位点间得到的。

本发明的最后一个目的是提供一种培育抗逆性提高的植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性植物的方法，是将上述任一所述专用反义核苷酸序列导入植物中，培育得到抗逆性植物。

一般可以采用如下常规方法将所述专用反义核苷酸序列导入植物中，例如基因枪法，高压电穿孔法，脂质体法，农杆菌介导的植物转化方法或转染等。

本发明是利用农杆菌介导的转化方法将所述反义核苷酸序列导入植物中的，具体如下：首先通过重组DNA技术将所述专用反义核苷酸序列导入载体中，得到含有所述专用反义核苷酸序列的重组载体，再将所述重组载体导入农杆菌中，得到含有所述专用反义核苷酸序列的重组农杆菌；再利用农杆菌介导的转化方法把重组DNA分子导入到植物中，从而使植物体的相应遗传性状发生改变。

本发明方法中所用的重组载体可以为将上述任一专用反义核苷酸序列***载体pBI121的多克隆位点得到的，具体可以为将序列表中序列2所示的专用反义核苷酸序列***载体pBI121的XbaI和SacI位点间得到的。

所述抗逆性可以为抗干旱性和/或抗低温性和/或抗盐性。

上述方法可以应用于双子叶植物中，具体可应用于烟草中。

本发明中所述编码基因的序列是指编码基因中编码链的序列；所述编码基因的反义核苷酸序列(5′至3′)是指上述编码链的互补链从5′端至3′端的序列。

脱氧羟腐胺赖氨酸合酶参与翻译起始因子的翻译后活化，翻译起始因子通过控制特定mRNA的运输而调控特定蛋白的翻译。本发明是通过抑制脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的表达，从而抑制某些与植物抗逆性相关的蛋白的表达，进而提高植物的抗逆性。

本发明的培育抗逆性植物的方法是利用脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因(DHS)的反义核苷酸序列，抑制了植物内源DHS基因的正常表达，进而提高了植物对多种不同胁迫环境的抗性，如抗旱性、耐低温性和抗盐性。实验表明，本发明方法得到的植物，其抗旱性、耐低温性和抗盐性均显著高于阴性对照，而且这几种抗性都是同时得到提高的。另外，本发明方法还省时省力，降低了成本。因此，本发明的培育抗逆性植物的方法可用于农作物抗逆遗传改良及开发，对提高作物的产量有重要意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为本生烟草NbDHS cDNA克隆的PCR检测结果。

图2为XbaI和SacI酶切T-NbDHS-1质粒的检测结果。

图3为转基因烟草在分化培养基中生长结果。

图4为T0代转化植株Southern鉴定结果。

图5为T1代转基因烟草种子的筛选鉴定。

图6为T1代转基因植株PCR鉴定。

图7为干旱胁迫处理下转基因烟草生长情况。

图8为低温胁迫处理下转基因烟草生长情况。

图9为高盐胁迫下转基因烟草生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因DHS cDNA序列的分离

脱氧羟腐胺赖氨酸合酶编码基因DHS全长cDNA序列是通过反转录PCR(RT-PCR)方法结合cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得的。具体地说，首先以来源于本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶片的总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA第一链；再以cDNA第一链为模板，根据已发表的拟南芥、普通烟草(Nicotiana tabaccum)同源基因的保守区域设计引物进行扩增，获得868bp DHS cDNA片段。然后在此片段内部分别设计正向和反向引物，通过RACE方法，分别获得cDNA的3’和5’末端序列，进而再通过RT-PCR方法克隆出全长基因。

1、总RNA提取

采用TRIzol(Invitrogen)提取本生烟草(Nicotiana benthamiana)(国家种质库)正在衰老叶片的总RNA。取100mg植物叶片材料，液氮研磨后，转移到1.5ml离心管中，迅速加入1ml TRIzol试剂，25℃下温育5min；4℃下12000rpm离心10min；取上清水相，转移到一新的离心管中，加0.2ml氯仿，剧烈震荡；25℃下温育3min；4℃下12000rpm离心15min；取上清水相，转移到一新的离心管中；加等体积5M LiCl，混匀；-20℃下静止1hr，沉淀RNA；12000rpm离心45min，4℃；弃上清，加1ml75％乙醇，7500rpm离心5min，2-8℃；重复3次；弃乙醇，超镜台中空气干燥10min；加50μl DEPC处理的双蒸水溶解10min，55-60℃。

2、DHS868bp cDNA片段的克隆

(1)cDNA第一链的合成

使用ThermoScript^TM RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，按照说明书的说明合成cDNA第一链。以oligo(dT)₂₀为引物，42℃保温1hr，之后加入1μlRNase H(2U/μl)，37℃保温10分钟。

(2)cDNA片段的PCR扩增

以1μlcDNA第一链反应混合物为模板，聚合酶链式反应(PCR)扩增DHScDNA片段，上游引物为DHSf1：5’-TTCACTTCAAACCTTGTTTCTTC，下游引物为DHSr1：5’-CCATGATACAGCTTCATCAGG。反应体系为25μl，其中包含：2.5μl10X PCR Buffer、1.5μlMgCl₂(25mM)、0.5μl dNTP mix(10mM each)、各1μl的上游引物DHSf1和下游引物DHSr1(10μM)、1μlcDNA第一链反应混合物、0.15μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)和17.35μlH₂O。PCR反应运行条件如下：95℃，5min；94℃，30s，62℃，30s，-1℃/cycle，72℃，40s，12cycles；94℃，30s，50℃，30s，72℃，40s，30cycles；72℃，5min。反应结束后，取20μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图1所示，其中M为marker，泳道1为PCR扩增产物。

(3)DNA片段的电泳纯化回收

采用Vitagene-DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，纯化DHS cDNA片段：电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，放在1.5ml EP管中；加入3倍体积的凝胶熔化剂，混合后75℃温浴8分钟，期间间断混合，使凝胶彻底熔化；加0.5倍凝胶熔化剂体积的高离液序列溶液，混合均匀；取一新的离心吸附柱，置于2ml离心管中，将上一步所得的溶液加入离心吸附柱中，3600rpm，离心1min，弃滤液；将离心吸附柱置回离心管中，加0.5ml洗涤液W1，3600rpm，离心30s，弃滤液；将离心吸附柱置回离心管中，加0.7ml洗涤液W2，3600rpm，离心30s，弃滤液，重复上步操作一次；将离心吸附柱置回离心管中，12000rpm离心1min，尽量除去漂洗液；将离心吸附柱置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl水，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA，得到纯化的DHS cDNA片段。

(4)DHS cDNA片段克隆及测序

使用pGEM-T Easy(promega)载体克隆DHS cDNA片段：取4μl纯化的cDNA片段，依次加入5μl2xT4连接酶缓冲液，0.5μlpGEM-T Easy vector(50ng/μl)，0.5μl T₄DNA连接酶(3U/μl)，4℃温浴过夜。获得DHS cDNA片段与pGEM-T Easy载体的连接产物。

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自invitrogen(货号：18265017)，超净台内，将连接产物加入到50μlDH5α感受态细胞中，混匀，置冰上30分钟；42℃，热激90s；冰浴2min；250μl LB液体培养基，37℃培养1hr；将150μl细胞悬液混匀涂布在含100μg/ml Amp、X-gal(40mg/L)，IPTG(40mg/L)的LB固体培养基上，37℃避光倒置培养过夜。

挑取LB平板上的白色克隆3个，分别置于3ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜；随后的质粒DNA提取和EcoRI限制性内切酶反应参照《分子克隆》(ColdSpring Harbor Laboratory Press，edition1，1989)进行。电泳检测酶切片段的大小。含重组克隆的质粒经双氧法测序，获得的DHS cDNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，长度为868bp。将含序列表中序列1所示核苷酸序列的质粒载体命名为T-NbDHS。

3、DHS基因cDNA3’和5’末端扩增

通过RACE技术扩增DHS cDNA3’和5’末端区域。根据上面获得的DHS868bp cDNA片段的序列设计套式特异性引物DHSf2：5’-GAGGCTGTCCATGCTGGTTCGAG、DHSf3：5’-GCCTAAGCATCATGTTTGCAATG和DHSr2：5’-GGCGTCACCAAGATTAGCAGCTTGG、DHSr3：5’-CAATCTTCTATGGGCTGCTCATGTG，使用5’/3’RACE试剂Kit(罗氏应用科学公司，目录号：03353621001)，按照说明书提供的方案，通过多重PCR，分别扩增出DHS cDNA3’和5’末端区域。扩增的PCR片段经电泳纯化回收、克隆、测序，获得DHS cDNA3’和5’末端序列。所得的序列与前面获得的868bp cDNA片段的序列拼接后，获得该基因的全长编码区核苷酸序列(即开放阅读框)，如序列表中序列3所示。通过DNAMAN软件推断该开放阅读框编码的蛋白质序列如序列表中序列4所示。

实施例2、烟草抗逆性提高实验

一、植物表达重组载体pAND的构建

以T-NbDHS质粒为模板，利用引物DHS5’：GAGCTCCTCATAAAATGCCTTGCACC(引入SacI位点)和DHS3’：TCTAGAACCATTTCGCATCATATTG(引入XbaI位点)进行PCR扩增，获得516bp的DHS cDNA片段，所得的PCR片段与pGEM-T Easy载体连接获得T-NbDHS-1载体，导入大肠杆菌感受态中，鉴定后提取质粒。质粒经XbaI和SacI双酶切后，电泳检测，结果如图2所示，表明切出3.0kb和516bp的条带，回收516bp的片段，再进行测序，其序列如序列表中序列1自5′末端第268-783位核苷酸所示，表明片段序列正确。

植物表达载体pBI121中含有花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)和农杆菌胭脂碱合成酶基因3’终止子(NOS终止子)，其可以调节反义核苷酸序列的转录。用限制性内切酶XbaI和SacI酶切植物表达载体pBI121(Clontech，美国)，回收13kb的片段；

取1ul的516bp片段和10ul的13bk片段，加入10ul的连接缓冲液I，16℃连接过夜，转化大肠杆菌，提取质粒，进行PCR检测、酶切检测和测序，获得含有516bpDHS反义核苷酸序列的重组质粒载体，516bp DHS反义核苷酸序列(自5′端至3′端)如序列表中序列2所示，516bp DHS反义核苷酸序列位于载体中CaMV35S’启动子下游，将结构正确的重组载体命名为pAND载体。

二、植物表达重组载体pAND转化烟草

1、制备农杆菌感受态细胞：挑取农杆菌C58单菌落，接种在3ml LB培养基(含终浓度为5mg/L的四环素，终浓度为50mg/L的利福平)中，28℃震荡培养过夜；取1ml培养物接种在100ml LB培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5(约5-8hr)；用50ml聚丙稀管收集菌液，4000rpm离心10min，4℃；弃上清液，用15ml预冷纯水(18Ω)悬浮细胞沉淀，4000rpm离心10min，4℃；重复上步一次；弃上清液，用10ml预冷的10％甘油(18Ω纯水配制)悬浮细胞沉淀，4000rpm离心10min，4℃；弃上清液，用0.75ml(每100ml菌液)预冷的10％甘油悬浮细胞沉淀；分装在1.5ml EP管中，每管40μl，液氮冷冻后，于-80℃冰箱内保存。

2、植物表达载体pAND电击转入农杆菌C58中：自冰箱中取出C58电击用感受态细胞，置冰上缓慢融化；将2μl质粒加入到感受态细胞中，混匀，置冰上；将感受态细胞和质粒pAND DNA混合物加入到预冷的电击杯中；2.5kv，400Ω，25μF条件下电击；迅速向电击杯加入1ml LB培养基；将电击杯中的全部溶液转移到1.5ml EP管中，28℃温育1hr；4000rpm离心2分钟，弃800μl上清，余200μl；重悬细胞，将细胞悬液混匀涂布在含5mg/L四环素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上；待液体完全吸收后，28℃避光倒置培养，3天可见菌落。经PCR检测阳性农杆菌转化子，获得含有植物表达载体pAND的农杆菌菌株。

3、烟草的转化

挑取一个新鲜的含有植物表达载体pAND的农杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中(含终浓度为5mg/L四环素，终浓度为50mg/L利福平，终浓度为50mg/L卡那霉素)，28℃振荡培养过夜。取1ml菌液加入新鲜40ml的LB液体培养基，28℃220转/分振荡培养2-3h(OD₆₀₀＝0.4-0.8)，待用。

采用叶盘法转化烟草：切取生长旺盛的烟草组培苗叶片，用刀片切成约1cm²；浸入稀释的农杆菌中，侵染5分钟；用灭菌滤纸吸干多余的菌液，置于共培养基上，暗中共培养；共培养两天后转移至分化培养基上光照培养；长出绿芽后(约2周左右)，转至继代培养基(即分化培养基)上继代培养，每经过2周继代培养一次；分化出的小芽长至此2-3cm时(图3)，转至生根培养基；生根后，移栽至花盆，温室培养。所需培养基如下：1)共培养培养基:MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L；2)分化筛选培养基：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+Kan200mg/L+cef500mg/L；生根培养基:MS+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+cef200mg/L。MS培养基的组成如表2所示。以转入空载体pBI121的烟草W38作为空白对照。

表2、MS培养基的组成

	名称	含量(mg/L)
			大量元素	NH₄NO₄	1650
	KNO₃	1900
				CaCl₂·2H₂O	440
	MgSO₄·7H₂O	370
				KH₂PO₄	170
微量元素	KI	0.83
				H₃BO₃	6.2
	MnSO₄·4H₂O	22.3
				ZnSO₄·7H₂O	8.6
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
				CuSO₄·5H₂O	0.025
	CoCl₂·6H₂O	0.025
			铁盐	Na₂-EDTA·2H₂O	37.3
	FeSO₄·7H₂O	27.8
			有机成分	烟酸	0.5
	盐酸吡哆醇(VB₆)	0.5
				烟酸硫胺素(VB₁)	0.1
	甘氨酸	2.0
				肌醇	100.0

从浸染至筛选分化50天的外植体的分化状态如图3所示，A为转入空载体pBI121的烟草W38阴性对照，其外植体几乎不分化或分化缓慢，在kan抗性的筛选下，逐渐发黄死去；B为经过含有pAND质粒的农杆菌菌液浸染的外植体，已经分化出数株独立小苗，此时便可以剪出转入筛选生根培养基中培养。

三、转化植株的鉴定

1、Southern分析鉴定T0代转化植株

Southern杂交按照《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，edition1，1989)的说明进行。使用HindIII和EcoRI双酶切植物基因组，酶切电泳结果如图4A所示，泳道1为pAND质粒阳性对照，泳道4和12为转入空载体pBI121的烟草W38阴性对照，泳道15为Marker，其余泳道为转化的烟草；结果表明，转基因植株的基因组DNA经酶切后，获得一条1.5kb的特异带。

Southern杂交结果如图4B所示。结果表明，除了第7泳道的转化株系外，其它的转化烟草苗均能杂交出1.5kb的目标带，由此表明这些植株的基因组中已经***烟草反义DHS基因片段。2个阴性对照W38(第4和第12泳道)均没有杂交出目标带，由于有DHS内源基因的存在，因此所有的植物基因组样品泳道均杂出了2条大于2kb的带。

2、T1代转基因烟草的筛选鉴定

将部分转基因T0代植株移栽至自然环境中，在自然条件下生长成熟，收下种子，种子消毒后在kan200-800mg/l的MS培养基上进行筛选，同时以转入空载体pBI121的烟草W38种子一起播种做对照。培养观察，Kan浓度≤400mg/l时W38种子仍然能正常生长，而当Kan浓度达到600mg/L时，转基因种子和对照种子的生长情况有明显区别，如图5所示：所有阴性对照W38种子在kan600mg/l的MS培养基中都不能发芽或发芽生长约10天后逐渐发黄死亡(图5B)；而转基因种子，由于F1代世代分离，一部分种子能够正常发芽生长，另外一部分和阴性对照W38种子表现一样(图5A)。

随机抽取一部分Kan600mg/L的MS培养基筛选出的抗性苗，提取基因组DNA，做PCR鉴定，以如下引物进行PCR鉴定：DHS5’：GAGCTCCTCATAAAATGCCTTGCACC和DHS3’：TCTAGAACCATTTCGCATCATATTG，结果如图6所示，表明经过Kan筛选出来的小苗DNA样品都能检测到外源基因的存在，即能从kan600mg/L的MS培养基中生长出来的小苗均是转基因植株。能在kan600mg/l的MS培养基正常生长的植株均为PCR检测阳性苗，而W38的种子在该筛选强度上无法生长(图5和图6)。

3、转基因烟草的表型鉴定

(1)抗旱性鉴定

将上述筛选得到的阳性转基因小苗移栽至蛭石和肥料组成的营养土中培养2个月，小苗生长稳定，然后停止浇灌15天，以进行逆境胁迫，观察DHS下调表达的转基因植株表型性状。结果如图7所示(A组为W38阴性对照，B组为转基因植株)。显示停止浇灌15天的转基因植株和W38对照的表型性状。结果表明，2个W38对照都已经严重萎蔫，叶片全部干瘪皱缩，停止生长，临近死亡；而转基因植株中，各株系表现不同，有的株系长势很好，几乎没有萎蔫，而有的株系出现不同程度的萎蔫状，但是叶片持绿性相当好，而且叶表面光滑，尚未出现干瘪皱缩的现象。表明转入反义DHS基因的株系的抗干旱能力有明显的提高。

(2)耐寒性鉴定

将上述筛选得到的阳性转基因小苗移栽至蛭石和肥料组成的营养土中培养2个月，小苗生长稳定，然后将小苗从自然光温室中转入4℃冷害胁迫3天，之后室温下放置3天，观察小苗生长状况，结果如图8所示(A1和A2为W38阴性对照，B1和B2为转基因株系)。结果表明，W38阴性对照株表现为植株倒伏，叶片下垂腐烂，受到明显的低温伤害；而两个转基因株系仍然挺立，大部分叶片也没有下垂腐烂，保持绿色，继续生长，没有明显的受到冷害的现象。表明转入反义DHS基因的株系的抗寒能力有明显的提高。

(3)抗盐鉴定

将上述筛选得到的阳性转基因小苗移栽至蛭石和肥料组成的营养土中培养2个月，小苗生长稳定，然后从营养土中挖出小苗(小心挖掘，避免伤害其根系)，用清水洗净附在根系上的土壤，然后置于穿孔的漂浮板上，将其根系***含有3％NaCl的MS液体培养基中，培养6天，取出照相。结果如图9所示，其中左侧两株为W38阴性对照，右侧三株为转基因10号株系。表明，在3％的NaCl的MS培养基中生长6天后，左边2个对照株的所有叶片已经萎蔫，表面失去光泽，整个植株变得很瘫软柔弱，同时部分叶细胞已经破损，导致叶片变褐腐烂；而右侧3个DHS下调的转基因株的叶片仍保持自然光泽，整个植株仍然保持健壮直立，叶片也没有表现出褐化腐烂的现象，表现出良好的抗盐特征。表明转入反义DHS基因的株系的有明显的耐高盐能力。

序列表

<160>4

<210>1

<211>868

<212>DNA

<213>烟草属本生烟草(Nicotiana benthamiana)

<400>1

<210>2

<211>516

<212>DNA

<213>烟草属本生烟草(Nicotiana benthamiana)

<400>2

<210>3

<211>1140

<212>DNA

<213>烟草属本生烟草(Nicotiana benthamiana)

<400>3

<210>4

<211>379

<212>Pro

<213>烟草属本生烟草(Nicotiana benthamiana)

<400>4