CN101384757A - 小分子印渍 - Google Patents

Abstract

本发明提供促进鉴别能够与所关注生物大分子相互作用的化合物的组合物和方法。在一个方面中，提供一种组合物，其包含使用异氰酸酯或异硫氰酸酯化学结构与固态载体连接的一种或一种以上类型的化合物的阵列，其中所述化合物阵列的密度为至少1000点/平方厘米。一般来说，这些本发明阵列由以下步骤产生：(1)提供固态载体，其中所述固态载体经能够与所需化合物相互作用以形成共价连接的异氰酸酯或异硫氰酸酯部分官能化；(2)提供待与所述固态载体连接的一种或一种以上类型的化合物的一种或一种以上溶液；(3)将所述一种或一种以上类型的化合物传递到所述固态载体上；以及(4)催化所述化合物与所述固态载体的连接，由此形成阵列且此化合物阵列具有至少1000点/平方厘米的密度。在另一个方面中，本发明提供利用这些阵列来鉴别所关注生物大分子的小分子配合物的方法。

Description

小分子印渍

相关申请案

本申请案根据35 U.S.C.§119(e)规定主张2006年1月3日申请的美国临时专利申请案USSN 60/755,946的优先权，所述文献是以引用的方式并入本文中。

政府资助

本文中所述的研究由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIHR01-AR049832)、美国国立综合医学研究所(National Institute of General MedicalSciences)(GM38627)和美国国家癌症研究所的化学遗传学初步方案(National CancerInstitute′s Initiative for Chemical Genetics)(20XS139A，N01-CO-12400)同意部分资助。美国政府可对本发明具有某些权利。

技术领域

无

背景技术

鉴别所关注的任何蛋白质或生物分子的小分子配体的能力具有深远含义，其可用于阐明蛋白质功能且用于开发新颖药物。天然产物和多样化合成(diversity-orientedsynthesis，DOS)产物和组合化学构成一池大量小分子，可从其中发现所关注的蛋白质或生物分子的特异性配体(斯克瑞伯(Schreiber)，“小分子：中心法则中缺失的环节(Small molecules:the missing link in the central dogma)”，自然化学生物学(Nat.Chem.Biol.)，2005；1(2):64-66；以引用的方式并入本文中)。具体来说，随着分离-汇集合成策略的引入(福卡(Furka)等人，国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Protein Res.)，1991，37，487；莱姆(Lam)等人，自然(Nature)，1991，354，82；其各自以引用的方式并入本文中)和适当标记技术的发展(奈斯勒(Nestler)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，1994，59，4723；以引用的方式并入本文中)，化学家如今能够制备大量固定于聚合物合成微珠上的类似于天然产物的化合物(谭(Tan)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，8565；以引用的方式并入本文中)。这些文库提供用于发现新颖配体的分子的丰富来源。

因这些化合物文库在掌握中，所以用于筛选这些化合物的有效方法的可用性变得急迫。已广泛使用的一种方法是微珠上结合分析(on-bead binding assay)(莱姆(Lam)等人，化学评论(Chem.Rev.)，1997，97，411；以引用的方式并入本文中)。将经适当标记的所关注蛋白质与文库混合且随后由基于显色或荧光的分析来鉴别显示同源配体的微珠(卡普尔(Kapoor)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，23；摩肯(Morken)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，30；圣西莱尔(St.Hilare)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，13312；其各自以引用的方式并入本文中)。尽管这种方法的效用经证实，但其限制性在于可有效筛选少量蛋白质。原则上，可将微珠剥离一个蛋白质且与另一个蛋白质再探针结合；然而，这种连续方法缓慢且仅限于数次重复。为鉴别细胞、组织或有机体中各蛋白质的特异性小分子配体，需要能够以平行方式进行各化合物相对于许多不同蛋白质筛选的高产量分析。尽管布朗(Brown)等人(美国专利5,807,522；以引用的方式并入本文中)已开发出一种在众多遗传应用(包括基因组的遗传和物理定位、基因表达的监控、DNA测序、基因诊断、有机体的基因型分析和DNA试剂在研究人员中的分布)中用于形成用于大规模杂交分析的高密度生物大分子阵列的装置和方法，但尚未开发出用于高产量筛选的类似于天然产物的化合物的高密度阵列。

近年来，已证实小分子微阵列(small-molecule microarray；SMM)适用于发现先前未知的蛋白质-配体相互作用，使得鉴别出蛋白质功能的小分子调节剂(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional group compatibility of small-molecule microarrays:discovery ofnovel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(21):2376-9；法兹奥(Fazio)等人，微量滴定板中糖阵列的合成(Synthesis of sugararrays in microtiter plate)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2002；124(48):14397-402；赫根罗德(Hergenrother)等人，小分子微阵列：含醇小分子在载玻片上的共价连接和筛选(Small molecule microarrays:covalent attachment and screening of alcohol-containingsmall molecules on glass slides)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2000；122:7849-50；豪斯曼(Houseman)等人，用于评估蛋白质结合和酶修饰的碳水化合物阵列(Carbohydratearrays for the evaluation of protein binding and enzymatic modification)，化学生物学(Chem.Biol.)，2002；9(4):443-54；卡诺(Kanoh)等人，通过使用光亲和性反应将天然产物固定在载玻片上以及蛋白质-小分子相互作用的检测(Immobilization of natural products onglass slides by using a photoaffinity reaction and the detection of protein-small-moleculeinteractions)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(45):5584-7；科恩(Kohn)等人，施陶丁格连接：用于制备小分子阵列的新颖固定策略(Staudingerligation:a new immobilization strategy for the preparation of small-molecule arrays)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(47):5830-4；麦克贝思(MacBeath)等人，以微阵列形式印渍小分子且一同检测蛋白质-小分子相互作用(Printing smallmolecules as microarrays and detecting protein-small molecule interactions en masse)，美国化学会志(J Am Chem Soc)，1999；121:7967-68；犹他坎达尼(Uttamchandani)等人，在发现人类IgG的小分子配体中经标记组合三嗪文库的微阵列(Microarrays of taggedcombinatorial triazine libraries in the discovery of small-molecule ligands of human IgG)，组合化学杂志(J.Comb.Chem.)，2004；6(6):862-8；科勒(Koehler)等人，使用小分子微阵列和多样化合成发现转录因子抑制剂(Discovery of an inhibitor of a transcription factorusing small molecule microarrays and diversity-oriented synthesis)，美国化学会志(J AmChem Soc)，2003；125(28):8420-1；库鲁维拉(Kuruvilla)等人，用多样化合成和小分子微阵列来剖析葡萄糖信号转导(Dissecting glucose signalling with diversity-orientedsynthesis and small-molecule microarrays)，自然(Nature)，2002；416(6881):653-7；其各自以引用的方式并入本文中)。为制造SMM，将化合物的储备溶液用机器人排列在官能化显微镜载玻片上，随后将其用所关注蛋白质或生物分子培养。通常使用荧光标记抗体和标准荧光载片扫描仪来显现表示蛋白质与小分子之间的推定相互作用的微阵列特征。

显然，将希望开发出产生高密度阵列的方法，所述高密度阵列将能够以高产量方式筛选日益增大且复杂的类似于天然产物的组合文库中存在的化合物以鉴别所关注生物大分子的小分子配合物。

发明内容

迄今为止，若干种温和、选择性偶合反应已用于将合成化合物共价捕获于玻璃表面上且制备小分子微阵列。例示性反应包括迈克尔加成(Michael addition)(麦克贝思(MacBeath)等人，以微阵列形式印渍小分子且一同检测蛋白质-小分子相互作用(Printingsmall molecules as microarrays and detecting protein-small molecule interactions en masse)，美国化学会志(J Am Chem Soc)，1999；121:7967-68；2004年11月30日颁予的美国专利6,824,987；2004年11月29日申请的美国专利申请案USSN 10/998,867，其在2005年5月5日以US 2005/0095639公开；其各自以引用的方式并入本文中)、伯醇与氯硅烷加成(赫根罗德(Hergenrother)等人，小分子微阵列：含醇小分子在载玻片上的共价连接和筛选(Small molecule microarrays:covalent attachment and screening ofalcohol-containing small molecules on glass slides)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2000；122:7849-50；以引用的方式并入本文中)、重氮基亚苄基介导的苯酚的捕获(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional group compatibility of small-molecule microarrays:discovery of novel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(21):2376-9；2003年2月20日申请的美国专利申请案USSN 10/370,885，其在2003年11月20日以US 2003/0215876公开；其各自以引用的方式并入本文中)、1，3-偶极环加成(法兹奥(Fazio)等人，微量滴定板中糖阵列的合成(Synthesis of sugararrays in microtiter plate)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2002；124(48):14397-402；以引用的方式并入本文中)、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应(豪斯曼(Houseman)等人，用于评估蛋白质结合和酶修饰的碳水化合物阵列(Carbohydrate arrays for theevaluation of protein binding and enzymatic modification)，化学生物学(Chem Biol)，2002；9(4):443-54；以引用的方式并入本文中)、将叠氮化物通过施陶丁格连接到膦烷(phosphane)修饰载片上(科恩(Kohn)等人，施陶丁格连接：用于制备小分子阵列的新颖固定策略(Staudinger ligation:a new immobilization strategy for the preparation ofsmall-molecule arrays)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(47):5830-4；以引用的方式并入本文中)和将酰肼键联化合物捕获于环氧化物官能化玻璃上且反之亦然(李(Lee)等人，通过将未经修饰的碳水化合物位点特异性、共价固定在涂布酰肼的载玻片上容易地制备碳水化合物微阵列(Facile preparation ofcarbohydrate microarrays by site-specific，covalent immobilization of unmodifiedcarbohydrates on hydrazide-coated glass slides)，有机快报(Org.Lett.)，2005；7(19):4269-72；李(Lee)等人，通过将酰肼键联物质有效固定在涂布环氧化物的玻璃表面上来制造化学微阵列(Fabrication of Chemical Microarrays by EfficientImmobilization of Hydrazide-Linked Substances on Epoxide-Coated Glass Surfaces)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2005；44(19):2881-2884；其各自以引用的方式并入本文中)。大多数这些表面捕获方法利用诸如醇或叠氮化物的官能团，其作为固相有机合成的部分引入且偏离小分子在表面上的方向(科恩(Kohn)等人，施陶丁格连接：用于制备小分子阵列的新颖固定策略(Staudingerligation:a new immobilizationstrategy for the preparation of small-molecule arrays)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(47):5830-4；塔拉里科(Tallarico)等人，能够实现单微珠、单储备溶液化学遗传学的多样化合成的拴系烷基硅烷基的高容量固态载体(Analkylsilyl-tethered，high-capacity solid support amenable to diversity-oriented synthesis forone-bead，one-stock solution chemical genetics)，组合化学杂志(J.Comb.Chem.)，2001；3(3):312-8；其各自以引用的方式并入本文中)。非选择性光诱发交联也已用于将一组10个复杂的天然产物固定在载玻片上(卡诺(Kanoh)等人，通过使用光亲和性反应将天然产物固定在载玻片上以及蛋白质-小分子相互作用的检测(Immobilization ofnatural products on glass slides by using a photoaffinity reaction and the detection ofprotein-small-molecule interactions)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(45):5584-7；以引用的方式并入本文中)。也已使用非共价方法，诸如肽-核酸结合物与寡核苷酸阵列杂交(温辛格(Winssinger)等人，PNA编码蛋白酶底物微阵列(PNA-encoded protease substrate microarrays)，化学生物学(Chem Biol)，2004；11(10):1351-60；温辛格(Winssinger)等人，用小分子微阵列剖析蛋白质功能(Profiling protein function with small molecule microarrays)，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci USA)，2002；99(17):11139-44；其各自以引用的方式并入本文中)。

使用选择性方法，我们已将50,000种以上多样化合成路径的产物通过经伯醇捕获而固定在氯化载片上或通过捕获苯酚而固定在重氮基亚苄基官能化载片上(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional group compatibility of small-molecule microarrays:discovery ofnovel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，2003；42(21):2376-9；赫根罗德(Hergenrother)等人，小分子微阵列：含醇小分子在载玻片上的共价连接和筛选(Small molecule microarrays:covalent attachment and screeningof alcohol-containing small molecules on glass slides)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2000；122:7849-50；科勒(Koehler)等人，使用小分子微阵列和多样化合成发现转录因子抑制剂(Discoveryof an inhibitor of a transcription factor using small moleculemicroarrays and diversity-oriented synthesis)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2003；125(28):8420-21；其各自以引用的方式并入本文中)。先前方法已保证对含有伯醇或苯酚的化合物使用单独微阵列。另外，我们希望在微阵列中包括来自天然来源的化合物(未必带有伯醇或苯酚)以及合成化合物。新颖捕获策略将允许固定合成化合物与天然化合物中存在的若干常见官能团。

本发明提供一种用于高产量筛选用于鉴别所需性质或相互作用的化合物的***。在一个优选实施例中，本发明提供一种促进鉴别能够与所关注生物大分子相互作用的化合物的***。在一个方面中，提供一种组合物，其包含使用如本文中所述的异氰酸酯化学与固态载体连接的一种以上类型化合物的阵列。在某些实施例中，化合物阵列的密度为至少500点/平方厘米、至少1000点/平方厘米、至少5000点/平方厘米或至少10,000点/平方厘米。在另一个方面中，提供一种组合物，其包含使用异氰酸酯化学与玻璃或聚合物载体连接的多个一种或一种以上类型的非寡聚物化合物，其中化合物阵列的密度包含至少1000点/平方厘米。在一个尤其优选实施例中，化合物为非肽且非寡聚物。在某些实施例中，化合物为小分子。在某些实施例中，化合物为天然产物。在某些实施例中，化合物为化合物的混合物(例如，粗天然产物萃取物、小分子的混合物等)。化合物通过与载体连接的化合物上的官能团与异氰酸酯或异硫氰酸酯官能化载体之间的反应经由共价相互作用与固态载体连接。在一个特定实施例中，化合物使用本文中所述的异氰酸酯或异硫氰酸酯化学与玻璃表面(例如载玻片)连接。一般来说，本发明的阵列由以下步骤产生：(1)提供固态载体，其中所述固态载体经能够与多种官能团相互作用以形成共价连接的异氰酸酯或异硫氰酸酯部分官能化；(2)提供待与所述固态载体连接的一种或一种以上类型的化合物的一种或一种以上溶液；(3)将所述一种或一种以上类型的化合物传递到官能化固态载体上；以及(4)使经点涂载体暴露于亲核试剂(例如吡啶蒸气)中，由此产生与载体共价连接的化合物阵列(图2)。在某些实施例中，阵列包含至少1000点/平方厘米的密度。在其它实施例中，阵列包含至少5000点/平方厘米且更优选至少10,000点/平方厘米的密度。

在一个方面中，使用如下文所示的异氰酸酯化学将化合物与固态载体连接：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。键是由化合物与具有下式的活化表面反应产生：

  

载体

其中L和载体如上文所定义。

在某些特定实施例中，化合物是通过如下文所示的键与固态载体连接：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，L为

且n为6。

在另一个方面中，化合物是使用如下文所示的异硫氰酸酯化学与固态载体连接：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。键是由化合物与具有下式的活化表面反应产生：

 

载体

其中L和载体如上文所定义。

在某些实施例中，化合物是通过如下文所示的键与固态载体连接：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，L为

且n为6。

在另一个方面中，本发明提供一种异氰酸酯官能化固态载体。在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；且

n为介于1与12之间且包括1与12的整数。在某些实施例中，L为

且n为6。

在另一个方面中，本发明提供一种异硫氰酸酯官能化固态载体。在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；且

n为介于1与12之间且包括1与12的整数。在某些实施例中，L为

且n为6。

在另一个方面中，本发明提供利用这些阵列来鉴别所关注生物大分子(例如蛋白质、肽、聚核苷酸)的小分子配合物的方法，其包含：(1)提供一种或一种以上类型的化合物(例如，更优选小分子)的阵列，其中所述阵列具有包含至少1000点/平方厘米的密度；(2)使所述阵列与一种或一种以上类型的所关注生物大分子接触；以及(3)测定特异性小分子-生物大分子配合物的相互作用。在优选实施例中，所关注生物大分子包含一组一种或一种以上蛋白质或肽。在尤其优选实施例中，所关注生物大分子包含一组一种或一种以上重组蛋白。在另一个优选实施例中，所关注生物大分子包含一组来自细胞溶解液(cell lysate)(例如，细菌细胞溶解液、酵母细胞溶解液、哺乳动物细胞溶解液、人类细胞溶解液)的大分子。在另一个优选实施例中，所关注生物大分子包含聚核苷酸。

定义

除非另外说明，否则下文定义的术语具有以下含义：

“脂肪族”：如本文中所用，术语“脂肪族”包括饱和与不饱和、直链(即未分枝)、支链、非环状、环状或多环脂肪族烃，其视情况经一个或一个以上官能团取代。如所属领域的一般技术人员将了解，“脂肪族”在本文中打算包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，如本文中所用，术语“烷基”包括直链、支链和环状烷基。类似约定适用于其它通称，例如“烯基”、“炔基”等等。此外，如本文中所用，术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等等涵盖经取代基团与未经取代基团。在某些实施例中，如本文中所用，“低级烷基”用于指示具有1-6个碳原子的那些烷基(环状、非环状、经取代、未经取代、分枝或未分枝)。

在某些实施例中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基含有1-20个脂肪族碳原子。在某些其它实施例中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基含有1-10个脂肪族碳原子。在其它实施例中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基含有1-8个脂肪族碳原子。在其它实施例中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基含有1-6个脂肪族碳原子。在其它实施例中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基含有1-4个碳原子。说明性脂肪族基团因此包括(但不限于)例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH₂-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH₂-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH₂-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-CH₂-环己基部分等等，其可再带有一个或一个以上取代基。烯基包括(但不限于)例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等等。代表性炔基包括(但不限于)乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等等。

“抗配体”：如本文中所用，术语“抗配体”指的是配体/抗配体结合对的相反成员。抗配体可为(例如)效应物/受体结合对中的蛋白质或其它大分子受体。

“化合物”：如本文中所用的术语“化合物”可包括有机金属化合物、有机化合物、金属、过渡金属络合物和小分子。在某些优选实施例中，化合物的定义中不包括聚核苷酸。在其它优选实施例中，化合物的定义中不包括聚核苷酸和肽。在一个尤其优选实施例中，术语化合物指的是小分子(例如，优选非肽和非寡聚物)且不包括肽、聚核苷酸、过渡金属络合物、金属和有机金属化合物。

“环状”：如本文中所用，术语“环状”指的是芳香族或非芳香族环***。环***可为单环或多环(例如，双环、三环等)。环可仅包括碳原子，或环可包括多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个等)杂原子，例如N、O、P或S。在多环环***中，环可通过脂肪族或杂脂肪族键连接，环可通过共价碳碳键或碳-杂原子键连接，环可稠合在一起，或环可螺键接。环***也可经取代。

“杂脂肪族”：如本文中所用，术语“杂脂肪族”指的是含有一个或一个以上氧、硫、氮、磷或硅原子(例如)代替碳原子的脂肪族部分。杂脂肪族部分可为分枝、未分枝、环状或非环状且包括饱和以及不饱和杂环，例如吗啉基、吡咯烷基等。在某些实施例中，杂脂肪族部分是经一个或一个以上部分独立地置换其上一个或一个以上的氢原子而经取代，所述部分包括(但不限于)脂肪族；杂脂肪族；芳基；杂芳基；芳基烷基；杂芳基烷基；烷氧基；芳氧基；杂烷氧基；杂芳氧基；烷硫基；芳硫基；杂烷硫基；杂芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO₂；-CN；-CF₃；-CH₂CF₃；-CHCl₂；-CH₂OH；-CH₂CH₂OH；-CH₂NH₂；-CH₂SO₂CH₃；-C(O)R_x；-CO₂(R_x)；-CON(R_x)₂；-OC(O)R_x；-OCO₂R_x；-OCON(R_x)₂；-N(R_x)₂；-S(O)₂R_x；-NR_x(CO)R_x，其中R_x每次出现独立地包括(但不限于)脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文和本文中所述的脂肪族、杂脂肪族、芳基烷基或杂芳基烷基取代基的任一种可经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状，且其中上文和本文中所述的芳基或杂芳基取代基的任一种可经取代或未经取代。

“配体”：如本文中所用，术语“配体”指的是配体/抗配体结合对的一个成员，且在本文中也称作“小分子”。配体或小分子可为(例如)效应物/受体结合对中的效应物分子。

“微阵列”：如本文中所用，术语“微阵列”为具有至少约每平方厘米1000个不连续区域的密度的区域、优选小分子化合物的点的规则排列。

“类似于天然产物的化合物”：如本文中所用，术语“类似于天然产物的化合物”指的是与复杂天然产物类似的化合物，其性质已通过进化选择。通常，这些化合物在一个结构中含有一个或一个以上立构中心、高密度和多样性的官能团，以及不同选择的原子。在此上下文中，多样性的官能团可定义为改变化合物中存在的一些官能团的(例如)拓扑学、电荷、大小、亲水性、疏水性和反应性。如本文中所用，术语“高密度的官能团”可优选用于定义含有优选三个或三个以上潜在或活性可变的官能部分的任何分子。这些结构特征可另外使得本发明化合物在功能上暗示复杂天然产物，原因在于本发明化合物可与特定生物受体特异性相互作用，且因此也可在功能上类似于天然产物。

“肽”：根据本发明，“肽”包含一串由肽键键联在一起的至少三个氨基酸。肽可指个别肽或一组肽。本发明的肽优选仅含有天然氨基酸，但或者可使用非天然氨基酸(即自然界中不存在、但可并入多肽链中的化合物)和/或如所属技术领域中已知的氨基酸类似物。此外，本发明的肽中的一个或一个以上氨基酸可(例如)通过增添例如糖基(carbohydrate group)、磷酸酯基(phosphate group)、法呢基(farnesyl group)、异法呢基(isofamesyl group)、脂肪酸基(fatty acid group)、用于结合、官能化或其它修饰的连接基团等的化学实体而经修饰。

“聚核苷酸”或“寡核苷酸”：聚核苷酸或寡核苷酸指的是核苷酸的聚合物。聚合物可包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)、化学修饰碱基、生物修饰碱基(例如甲基化碱基)、***碱基、经修饰糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、***糖和己糖)或经修饰磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5′-N-氨基磷酸酯(phosphoramidite)键)。

“小分子”：如本文中所用，术语“小分子”指的是在实验室中合成或在自然界中发现的非肽、非寡聚物有机化合物。如本文中所用，小分子可指“类似于天然产物的”化合物，然而，术语“小分子”并不限于“类似于天然产物的”化合物。相反，小分子的特征通常在于其含有若干个碳-碳键，且具有小于1500的分子量，但就本发明的目的来说此特征并不打算具限制性。自然界中存在的“小分子”的实例包括(但不限于)紫杉酚(taxol)、戴尼霉素(dynemicin)和雷帕霉素(rapamycin)。在实验室中合成的“小分子”的实例包括(但不限于)以下文献中所述的化合物：谭(Tan)等人(“两百万种以上具有暗示天然产物且与小型化基于细胞的分析相容的结构特征的化合物的立体选择性合成(Stereoselective Synthesis of over Two Million Compounds Having StructuralFeatures Both Reminiscent of Natural Products and Compatible with MiniaturizedCell-Based Assays)”，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，8565；以引用的方式并入本文中)和申请中申请案第08/951,930号，“暗示天然产物的化合物的组合文库的合成(Synthesis of Combinatorial Libraries of Compounds Reminiscent of NaturalProducts)”，其全部内容是以引用的方式并入本文中。在某些其它优选实施例中，利用类似于天然产物的小分子。

附图说明

图1显示含有生物活性小分子和多样化合成产物的多样性-SMM的示意性设计。反应性官能团经着色。多样性阵列中印渍的代表性生物活性小分子包括1a.尼日利亚菌素(nigericin)1b.巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)1c.阿霉素(doxorubicin)1d.染料木素(genistein)1e.乳胞素(lactacystin)1f.熊果醇(uvaol)1g.D-苏式-鞘氨醇(D-erythro-sphingosine)1h.赤霉酸(gibberellic acid)1i.巨大戟萜醇(ingenol)1j.芦荟素(aloin)。多样性阵列中印渍的DOS-小分子的代表性骨架包括2a.二氢吡喃甲酰胺2b.亚烷基-吡喃-3-酮2c.稠合吡咯烷2d.丝氨酸衍生的肽模拟物2e.莽草酸(shikimic acid)衍生的化合物2f.1，3-二噁烷2g.螺吲哚酮(spirooxindole)2h.大环内酯2i.ansa-seco类固醇衍生化合物。

图2描述蒸气催化表面固定流程。使GAPS(γ-氨基丙基硅烷)载片(S1)涂布短的经Fmoc保护聚乙二醇间隔基。在用哌啶去除Fmoc基团后，1，6-己二异氰酸酯通过形成脲键与表面偶合，产生推定的异氰酸酯官能化载玻片(S2)。随后将印渍有化合物储备溶液的载片置于干燥环境中且暴露于吡啶蒸气中，其催化将小分子共价捕获于载片表面(S3)上。

图3为官能团与异氰酸酯官能化玻璃的反应性的比较。(a)AP1497衍生物3a-3q的母体结构。(b)具有以连续两倍稀释液(10mM到20μM)印渍于异氰酸酯衍生载片上的FKBP12配体3a-3q的AP1497衍生物。将载片暴露于吡啶蒸气中以催化印渍化合物的连接。将经洗涤载片用FKBP12-GST、接着Cy5TM标记抗GST抗体进行探测。显示在635nm下荧光扫描的微阵列图象。在阵列顶部显示呈现表面捕获的官能团。(c)使用基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)微阵列分析软件在集中于各微阵列特征的300μm点内计算总荧光强度。在存在吡啶蒸气的情况下催化小分子捕获且其容忍化合物储备溶液中的水分。(d)将FKBP12配体3a、3d、3e、3r和3s(1mM)于DMF中的溶液三次重复排列于表面S2上且在N₂气氛下(底部)或在存在吡啶蒸气的情况下在N₂气氛下(顶部)培养载片。(e)将FKBP12配体3a、3d、3h和3s(1mM)于DMF(顶行)或9:1DMF:ddH₂O(底行)中的溶液三次重复排列于异氰酸酯衍生载片上。

图4显示使用抗体对选定印渍生物活性物的检测。关于(a)抗皮质酮、(b)抗洋地黄毒苷和(c)抗***(兔)抗体、接着阿历克萨氟(Alexa Fluor)647山羊抗兔相对于(d)阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647山羊抗兔IgG(A647兔)对照物的结合概况来显示各印渍生物活性物相对于背景信号的荧光强度。在635nm下的信噪比(SNR635)由(平均前景-平均背景)/(背景的标准偏差)来定义。数据表示由两个独立实验证实的个别阵列上的重复点的平均值。标记出SNR635值大于3.0的所有化合物。

图5显示用细胞溶解液筛选小分子微阵列。(a)方法的示意图。通过瞬时转染将带有所关注靶蛋白的抗原决定基标记表达构筑体引入哺乳动物细胞系中。48小时后，将重复小分子微阵列用澄清溶解液、第一抗抗原决定基抗体和最终荧光团标记第二抗体连续培养。在每次培养后用PBS进行轻微、简单洗涤。使用基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro6.0)微阵列分析软件计算荧光强度，且将各印渍小分子相对于背景信号的强度(SNR635)与用来自经模拟转染、相同细胞系的细胞溶解液培养的复制对照阵列进行比较。(b)溶解液筛选方法的最优化。用如图3b中所述以两倍稀释液(10mM到20μM)模拟为相同三次重复子阵列的FKBP12-配体阵列来选择用于如(a)中所述进行的筛选最优化实验的过度表达于HEK 293T细胞中的Flag-FKBP12和适当抗体。以逐步方式连续最优化方案条件。所呈示的数据表示三次重复子阵列的点的平均值(SNR635)。将对应于FKBP12衍生物3a-3q的数据(红色)与参照、空白DMSO点(黑色)进行比较，以实验测试总蛋白质浓度、用牛血清白蛋白(BSA)阻断的影响和聚乙二醇(PEG)连接基团长度。

图6显示使用细胞溶解液检测与不同亲和性的配体的结合。(a)获得对FKBP12具有不同亲和性的AP1497的衍生物(27，28)且用对照化合物卡托普利(captopril)和谷胱甘肽(glutathione)四次重复印渍。(b)将阵列用过度表达Flag-FKBP12的HEK-293T细胞的澄清溶解液和如图5a中所述的适当抗体培养。显示在635nm下荧光扫描的阵列的假色、代表性图象。(c)将阵列用过度表达EGFP-FKBP12的HEK-293T细胞的澄清溶解液培养。显示在488nm下荧光扫描的阵列的假色、说明性图象。(d)将阵列用未经转染HEK-293T细胞的澄清溶解液培养且用抗FKBP12的多克隆抗体进行探测。显示在635nm下荧光扫描的阵列的假色、代表性图象。

图7显示用细胞溶解液筛选的小分子微阵列的分析。(a)用一组不同的已知生物活性物、天然产物、AP1497衍生物和通过多样化合成制备的化合物来印渍10,800个特征的阵列。印渍包括DMSO溶剂(n＝158)以测定撞击临限强度。将用过度表达Flag-FKBP12的细胞溶解液进行的五个实验与用对照、模拟转染溶解液进行的五个培养进行比较。随后将各阵列用抗Flag单克隆抗体和第二Cy5标记抗小鼠抗体进行培养。显示在532nm(绿色)下和635nm(红色)下荧光扫描的FKBP12探测阵列，以及证实与AP1497衍生物结合的高亮区域。(b)FKBP12结合剂的鉴别。显示五个Flag-FKBP12和五个对照阵列的SNR635概况。各列为离散阵列上的样品(C，对照物；FK，Flag-FKBP12)，且各行为印渍小分子。色标指示DMSO溶剂点的平均(0)和最大(2.24)SNR635。呈示SNR635高于由印渍溶剂所确立的临限值且满足费舍尔精确检验(Fisher′s exact test)的显著性水平(p≤0.05)的印渍分子。

图8显示溶解液筛选方法的最优化，完整数据。用如图3b中所述以两倍稀释液(10mM到20μM)模拟为相同三次重复子阵列的FKBP12-配体阵列来选择用于如图5a中所述进行的筛选最优化实验的过度表达于HEK 293T细胞中的Flag-FKBP12和适当抗体。以逐步方式连续最优化方案条件。所呈示的数据表示三次重复子阵列的点的平均值(SNR635)。将对应于FKBP12衍生物3a-3q的数据(红色)与参照、空白DMF点(蓝色)进行比较，以实验测试总蛋白质浓度、用牛血清白蛋白(BSA)阻断的影响、以PBS洗涤的长度和聚乙二醇(PEG)连接基团长度。也呈示通过酯键(MA)进行印渍的另一种方法的比较、用于检测的经标记第一抗体的效用和用于检测的另一种抗原决定基的效用(血球凝集素：HA)。

图9为(a)发现与来自细胞溶解液的FKBP12结合的1276-M08，一种螺吲哚酮DOS化合物的结构。(b)与FKBP12-GST(左)和GST(右)结合的1276-M08的传感图(sensorgram)数据。

图10为小分子微阵列(SMM)制造和筛选过程的流程图。

图11显示小分子的异氰酸酯介导固定的流程。向γ-氨基丙基硅烷(GAPS)载片涂布短Fmoc保护聚乙二醇间隔基。在使用哌啶脱保护后，1，6-己二异氰酸酯通过形成脲键与表面偶合，得到在微阵列过程中所用的异氰酸酯涂布载片。将用小分子储备溶液印渍的载片暴露于吡啶蒸气中以催化分子与小分子微阵列(SMM)表面的共价连接。

图12显示用过度表达Flag-FKBP12的细胞溶解液探测的小分子微阵列。(a)通过伯胺印渍的AP1497类似物的识别。(b)可能通过仲醇印渍的天然产物雷帕霉素的识别。(c)从SMM上的仅溶剂特征得到的背景调节635nm荧光强度数据的柱状图。(d)从SMM上的印渍小分子特征得到的背景调节635nm荧光强度数据的柱状图。

具体实施方式

在产生具有多达一百万个成员或一百万个成员以上的类似于天然产物的化合物的复杂化学文库中的最新进展已产生随后促进有效筛选这些化合物生物活性的需要。为此，本发明提供一种能够高产量筛选极大量化合物以鉴别具有所需所关注性质的化合物的***。在某些实施例中，提供方法和组合物以使得能够高产量筛选极大量化合物以鉴别能够与生物大分子相互作用的那些化合物。在某些实施例中，将本发明的筛选***用于鉴别所关注生物大分子的小分子结合配合物。

在一个方面中，本发明提供组合物，其包含具有至少1000点/平方厘米的密度的使用异氰酸酯或异硫氰酸酯化学与固态载体连接的化合物的阵列，以及产生这些阵列的方法。在特定实施例中，本发明提供小分子、更优选类似于天然产物的化合物的阵列，其是由分离与汇集合成技术、平行合成技术和传统每次一个合成技术产生。在某些实施例中，小分子为小分子的混合物。在某些实施例中，小分子为天然产物或天然产物的萃取物。小分子可经纯化或部分经纯化。另外，在本发明中也可利用化合物的现有集合，来提供可筛选具有所需特征的化合物的高密度阵列。在另一个方面中，本发明提供基于异氰酸酯和异硫氰酸酯化学使用本发明化合物阵列来鉴别配体(小分子)-抗配体(生物大分子)结合对的方法。抗配体尤其优选为蛋白质、优选重组蛋白，且更尤其优选将重组蛋白文库用于检测方法中。

在另一个实施例中，抗配体包含来自细胞溶解液的大分子。任何细胞可用于制备溶解液。例如，细菌细胞、人类细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、鼠科动物细胞、线虫细胞、真菌细胞、植物细胞、癌细胞、肿瘤细胞、来自实验室细胞系的细胞等。在某些实施例中，将链霉菌(Streptomyces)细胞萃取物用于本发明中。在某些实施例中，将哺乳动物细胞萃取物用于本发明中。在某些实施例中，将人类细胞萃取物用于本发明中。可使用所属领域中已知的任何技术(例如，超声波处理、均质化、溶解酶(lysozyme)处理、法式压滤(French press)等)来制备溶解液。细胞溶解液可原样使用，或其可在用于本发明***中之前经部分纯化。在某些实施例中，细胞溶解液是由离心净化。在其它实施例中，在使用溶解液之前去除核酸。在某些实施例中，用溶剂萃取细胞溶解液。在某些实施例中，将细胞溶解液用于本发明筛选***中。

小分子印渍

如上所述，在一个方面中，本发明提供方法(在本文中称作“小分子印渍”)来产生高密度阵列和所得组合物，其中小分子是使用异氰酸酯化学(例如如图2中所示)或异硫氰酸酯化学与固态载体连接。

根据本发明的方法，将一组化合物或一种类型的化合物“印渍”到载体上来产生高密度阵列。一般来说，这种方法包含：(1)提供固态载体，其中所述固态载体经能够与所需化合物或一组化合物相互作用以形成连接的异氰酸酯或异硫氰酸酯部分官能化；(2)提供待与所述固态载体连接的相同或不同化合物的一种或一种以上溶液；(3)将所述相同或不同化合物的一种或一种以上溶液传递到固态载体上；以及(4)使经印渍载体暴露于催化将小分子共价捕获于载体上的亲核试剂(例如吡啶蒸气)中，由此产生化合物阵列且所述阵列具有至少1000点/平方厘米的密度。

所属领域的一般技术人员将认识到：尽管可利用能够与固态载体形成连接的任何所需化合物，但尤其优选利用类似于天然产物的化合物，优选为小分子，尤其为由分离与汇集文库或平行合成产生的那些化合物。可用于本发明中的类似于天然产物的化合物的文库的实例包括(但不限于)如谭(Tan)等人(“两百万种以上具有暗示天然产物且与小型化基于细胞的分析相容的结构特征的化合物的立体选择性合成(StereoselectiveSynthesis of over Two Million Compounds Having Structural Features Both Reminiscent ofNatural Products and Compatible with Miniaturized Cell-Based Assays)”，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1998，120，8565)中所述且以引用的方式并入本文中的基于莽草酸(shikimic acid)的文库。如所属领域的一般技术人员将了解，使用分离与汇集文库能够更有效产生并筛选化合物。然而，由平行合成方法和传统方法(每次一个合成和这些结构的修饰)合成的小分子也可用于本发明的组合物和方法中，天然存在化合物或其它化合物集合、优选非寡聚物化合物也可用于本发明的组合物和方法中，其能够不经进一步合成修饰而与固态载体连接。与微阵列连接的化合物也可购自商业来源，例如阿德里奇公司(Aldrich)、西格玛公司(Sigma)等。

如所属领域的一般技术人员将认识到，在分离与汇集技术(例如参看福卡(Furka)等人，第14届国际生物化学会议文摘(Abstr.14th Int.Congr.Biochem.)，布拉格(Prague)，捷克(Czechoslovakia)，1988，5，47；福卡(Furka)等人，国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Protein Res.)，1991，37，487；依贝斯廷(ebestyen)等人，生物有机和医药化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，1993，3，413；其各自以引用的方式并入本文中)中，可在相同反应容器中制备相关化合物的混合物，因而实质上减少合成极大文库(例如含有多达一百万文库成员或一百万以上文库成员的文库)所需的容器数。作为实例，固态载体结合骨架可分成n个容器，其中n表示将与载体结合骨架反应的试剂A的种类数。在反应后，将来自n个容器的内含物合并且随后分成m个容器，其中m表示将与载体结合骨架反应的试剂B的种类数。重复这个程序，直到所需数目的试剂与骨架结构反应得到所需化合物文库为止。

如上所述，使用平行合成方法也适用。平行合成技术传统上包括将产物集合分到其各自反应容器中。举例来说，可利用含有n行m列能够固持小体积溶剂的小孔(其中可发生反应)的微量滴定板。因此，n种不同的反应物类型A可与m种不同的反应物类型B反应，得到n×m种化合物的文库。

随后，一旦已使用适当方法提供所需化合物，就可制备所需化合物的溶液。在一个优选实施例中，在固态载体上合成化合物且随后将所得合成微珠以每孔一个微珠的密度分配到聚丙烯微量滴定板中。但在一个实例中，如下文实例中所述，所连接化合物随后从其微珠上释放且溶解在小体积的适合溶剂中。由于各微珠上存在微量化合物，所以随后需要极小型化的分析。因此，在一个尤其优选实施例中，高精度转录阵列机器人(谢纳(Schena)等人，科学(Science)，1995，270，467；莎洛(Shalon)等人，基因组研究(Genome Research)，1996，6，639；其各自以引用的方式并入本文中)可用于从各孔中获取小体积的溶解化合物且将约0.1nL-10nL的溶液(例如，约0.01mM到20mM)重复传递到一系列异氰酸酯官能化显微镜载玻片上的指定位置处。可以存于有机溶剂(例如DMF、DMSO、甲醇、THF等)中的溶液形式提供化合物。优选使用如实例中所示和所述能够将溶液均匀涂覆到载片的一面上的常规载片型反应容器(slide-sized reactionvessel)来制备这些异氰酸酯或异硫氰酸酯官能化显微镜载玻片。此可导致在载片上形成微观的化合物点且在优选实施例中这些点直径为200μm-250μm。然而，所属领域的一般技术人员将了解：本发明并不限于传递1nL体积的溶液且可使用能够传递皮升(picoliter)或更小体积的替代性传递装置。因此，除高精度阵列机器人(例如，欧尼格雷德

100微阵列点样器(Microarrayer)(基因组解决方案公司(GenomicSolutions)))之外，可使用其它用于传递化合物的装置，其包括(但不限于)喷墨印刷机、压电印刷机和小体积移液机器人。

如所述，各化合物含有介导与载体表面连接的常见官能团。所形成的连接优选为稳固的且因此尤其优选形成共价酯、硫酯或酰胺连接。使用异氰酸酯或异硫氰酸酯化学来产生化合物的高密度阵列。除键的稳固性之外，其它考虑因素包括待利用的固态载体和待与载体连接的化合物的特定种类。尤其优选载体包括(但不限于)载玻片、聚合物载体或其它固态材料载体和可挠性膜载体。

在另一个实施例中，如实例1中所述，化合物是通过排列中的化合物的官能团与例如异氰酸酯或异硫氰酸酯的亲电子试剂的亲核加成来连接。发现适于与异氰酸酯或异硫氰酸酯加成的官能团包括伯醇、仲醇、苯酚、硫醇、苯胺、异羟肟酸(hydroxamic acid)、脂肪族胺、伯酰胺(primary amide)和磺酰胺。在某些实施例中，由蒸气(例如吡啶)来催化亲核加成反应。也可使用其它挥发性亲核试剂。在某些实施例中，亲核试剂包括胺。在某些实施例中，使用杂芳基试剂。举例来说，可将经点涂载片干燥且随后在不含水分的环境(例如，氮气、氩气)中暴露于吡啶蒸气中以促进化合物与异氰酸酯或异硫氰酸酯衍生的固态载体的连接。

随后将载片视情况洗涤并干燥。可在筛选之前将使用本发明方法制备的载片存储在-20℃下数月。可在干燥器中制备载片。

在一个实施例中，使用如下式中所示的异氰酸酯化学将化合物与固态载体连接：

  载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。键是由化合物与具有下式的活化表面反应产生：

  

载体

其中L和载体如上文所定义。连接基团长度为0到200个原子、长度为0到100个原子、长度为0到50个原子、长度为2到50个原子、长度为10到30个原子或长度为20到30个原子。在某些实施例中，连接基团长度为至少2个原子、长度为至少5个原子、长度为至少10个原子或长度为至少20个原子。在某些实施例中，连接基团为非环状。在其它实施例中，连接基团包含环状部分。举例来说，连接基团可包括芳基、杂芳基、碳环或杂环部分。在某些实施例中，连接基团包括苯环。在某些实施例中，连接基团为分枝的。在其它实施例中，连接基团为未分枝的。在某些实施例中，连接基团包含杂原子，包括O、N或S。在某些实施例中，连接基团不包括杂原子。在某些实施例中，连接基团包括羰基、酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酰基或脲部分。在某些实施例中，连接基团包括卤素原子。

在某些特定实施例中，化合物是通过如下式中所示的键与固态载体连接：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，L为

其中m为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，m为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，L为在某些实施例中，n为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，n为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，n为6。在某些实施例中，键具有下式：

  载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

n每次出现时为介于1与20之间且包括1与20的整数；

m为介于1与20之间且包括1与20的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，n与m每次出现时为介于1与10之间且包括1与10的整数。在某些实施例中，载体为载玻片。

在某些特定实施例中，键具有下式：

  载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。

上述化合物阵列是通过将化合物与经异氰酸酯部分(即-NCO)官能化的载体连接来制备。在某些实施例中，异氰酸酯部分是通过连接基团与固态载体连接。在某些实施例中，连接基团如上文所示。在一个方面中，本发明提供一种异氰酸酯官能化固态载体(例如异氰酸酯官能化载玻片)。

在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

  载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；且

n为介于1与12之间且包括1与12的整数。在某些实施例中，L为

其中m为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，m为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，L为

在某些实施例中，n为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，n为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

n每次出现时独立地为介于1与12之间且包括1与12的整数；且

m为介于1与12之间且包括1与12的整数。

在某些特定实施例中，键具有下式：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等。

在另一个方面中，本发明也提供一种制备官能化载体的方法，其包含以下步骤：使用1，6-己二异氰酸酯官能化与载体共价键联的氨基。在某些实施例中，向γ-氨基丙基硅烷载玻片上涂布氨基受到保护的连接基团。去除保护基，且使游离氨基与1，6-己二异氰酸酯反应。

在另一个实施例中，使用如下式中所示的异硫氰酸酯化学将化合物与固态载体连接：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，L为环状脂肪族或杂脂肪族连接基团。在某些实施例中，L为芳基连接基团。在某些特定实施例中，L为苯基部分，其可经取代或未经取代。在某些实施例中，L为对位经取代的苯基部分。键是由化合物与具有下式的活化表面反应产生：

 

载体

其中L和载体如上文所定义。连接基团长度为0到200个原子、长度为0到100个原子、长度为0到50个原子、长度为2到50个原子、长度为10到30个原子或长度为20到30个原子。在某些实施例中，连接基团长度为至少2个原子、长度为至少5个原子、长度为至少10个原子或长度为至少20个原子。在某些实施例中，连接基团为环状。在其它实施例中，连接基团包含环状部分。在某些实施例中，连接基团为分枝的。在其它实施例中，连接基团为未分枝的。在某些实施例中，连接基团包含杂原子，包括O、N或S。在某些实施例中，连接基团不包括杂原子。在某些实施例中，连接基团包括羰基、酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酰基或脲(urea)部分。在某些实施例中，连接基团包括卤素原子。

在某些实施例中，化合物是通过如下式中所示的键与固态载体连接：

    载体

其中：

X为O、S或N；且

R为所连接化合物。

在某些特定实施例中，化合物是通过如下式中所示的键与固态载体连接：

      载体

其中：

X为O、S或N；且

R为所连接化合物。

在某些特定实施例中，化合物是通过如下式中所示的键与固态载体连接：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，L为

其中m为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，m为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，L为在某些实施例中，n为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，n为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，n为6。在某些实施例中，键具有下式：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

n每次出现时为介于1与20之间且包括1与20的整数；

m为介于1与20之间且包括1与20的整数；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。在某些实施例中，n与m每次出现时为介于1与10之间且包括1与10的整数。在某些实施例中，载体为载玻片。

在某些特定实施例中，键具有下式：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

X为N、S或O；且

R为与固态载体连接的化合物。

上述化合物阵列是通过将化合物与经异硫氰酸酯部分(即-NCS)官能化的载体连接来制备。在某些实施例中，异硫氰酸酯部分是通过连接基团与固态载体连接。在某些实施例中，连接基团如上文所示。在一个方面中，本发明提供一种异硫氰酸酯官能化固态载体(例如异硫氰酸酯官能化载玻片)。

在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

    载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团(例如，聚乙二醇间隔基、聚乙烯连接基团、-CH₂-、-CH₂CH₂-；-CH₂CH₂CH₂-等)；且

n为介于1与12之间且包括1与12的整数。在某些实施例中，L为

其中m为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，m为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，L为在某些实施例中，n为介于1与100之间且包括1与100的整数。在某些实施例中，n为介于1与50、1与25、1与20或1与10之间且包括两端的整数。在某些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在某些实施例中，固态载体上的官能团具有下式：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等；

n每次出现时独立地为介于1与12之间且包括1与12的整数；且

m为介于1与12之间且包括1与12的整数。

在某些特定实施例中，键具有下式：

   载体

其中：

载体为固态载体，例如玻璃表面、载玻片、聚合物载体、塑料载体、金属载体等。

检测生物活性的方法

所属领域的一般技术人员将了解到具有极高空间密度的化合物阵列的产生有助于检测特定化学文库中的化合物与生物大分子之间发生的结合和/或活化事件。因此，在另一个方面中，本发明提供一种鉴别所关注生物大分子的小分子配合物的方法。配合物可为与特定所关注大分子结合且能够活化或抑制所关注生物大分子的化合物。一般来说，这种方法包括：(1)提供如上所述的一种或一种以上类型的化合物的阵列，其中小分子阵列具有至少1000点/平方厘米的密度；(2)使所述阵列与一种或一种以上类型的所关注生物大分子接触；以及(3)测定特异性小分子-生物大分子配合物的相互作用。

也将了解到：本发明的阵列可以多种方式利用以使得能够检测小分子与生物大分子之间的相互作用。在一个尤其优选实施例中，利用与表面连接的不同类型化合物的阵列且将其与一种或几种类型的生物大分子接触来测定哪些化合物能够与所述特异性生物大分子相互作用。如所属领域的一般技术人员将了解，如果利用一种以上类型的化合物，那么希望利用一种编码各特异性化合物的方法以使得具有特异性相互作用的化合物可经鉴别。特异性编码技术近来已经评述且这些技术以及其它等效或改良技术可用于本发明中(参看卡扎尼克(Czarnik，A.W.)，化学生物学的新视点(Current Opinion in ChemicalBiology)，1997，1，60；以引用的方式并入本文中)。或者，本发明的阵列可包含一种类型的化合物且生物大分子的文库可与此阵列接触来测定这一种类型的化合物与多种生物大分子相互作用的能力。如所属领域的一般技术人员将了解，这个实施例需要利用石蜡或其它适合材料分隔载体区域的能力，以使得分析经定位。

如所属领域的一般技术人员将了解，所关注生物大分子可包含任何生物分子。在优选实施例中，所关注生物大分子包含蛋白质，且更优选使阵列与所关注重组蛋白的文库接触。在另一个优选实施例中，所关注生物分子是以细胞溶解液(例如肿瘤相关细胞的细胞溶解液)形式提供。如所属领域的一般技术人员将了解，这些蛋白质可包含(例如)纯化蛋白、纯化蛋白池和复杂混合物(例如细胞溶解液)和其部分。用于研究的尤其优选生物大分子的实例包括(但不限于)信号转导、二聚化、基因调节、细胞周期和细胞周期检验点以及DNA损伤检验点中所涉及的生物大分子。此外，由任何所关注有机体或组织构筑表达蛋白文库的能力将产生重组蛋白的大阵列。所关注化合物可能够去活化或活化所关注特定生物分子的功能。

各生物大分子可经修饰以使得易于检测这些大分子和经固定化合物。此可通过用抗原决定基标记大分子来实现，所述抗原决定基随后由已经标记用于随后检测(例如，用放射性原子、荧光分子、有色化合物或能够形成颜色或产生光的酶标记)的不同受体(例如抗体)直接或间接识别。或者，大分子自身可使用这些方法的任一种或其它直接标记或在使用适当检测方法来检测结合蛋白(例如，质谱、表面等离子共振和光谱)时未经标记。

在一个尤其优选实施例中，本发明的阵列用于鉴别化合物以进行化学遗传研究。在经典遗传学中，使用DNA序列的去活化(例如，缺失或“剔除”)或活化(例如致癌性)突变来研究由这些基因编码的蛋白质的功能。而化学遗传学涉及使用可改变与其结合的蛋白质的功能的小分子，因而去活化或活化蛋白质功能。当然，这是最普遍批准的小分子药物作用的基础。本发明涉及开发“类芯片(chip-like)”技术以使得能够迅速检测小分子与所关注特定蛋白质之间的相互作用。下文呈示的实例证实本发明的方法和组合物如何可用于鉴别新颖小分子配体用于化学遗传研究中。所属领域的一般技术人员将认识到本发明的组合物和方法可用于需要高密度化合物形式的其它目的。

如所属领域的一般技术人员也将了解，化合物的阵列也可用于检测化合物与除生物大分子外的其它种类分子之间的相互作用。举例来说，本发明的阵列也可用于(例如)催化和材料研究领域中。

在考虑以下实例后，将进一步理解本发明的这些和其它方面，以下实例打算说明本发明的某些特定实施例，但并不打算限制其范围，所述范围由权利要求书界定。

实例

实例1-用于筛选细胞溶解液的稳固小分子微阵列平台

此处描述异氰酸酯官能化载玻片的制备和使用以捕获来自各种固相有机合成途径的DOS化合物和生物活性化合物，包括天然产物。异氰酸酯与多种亲核官能团反应而不会留下酸性副产物(凡德纳比利-曲姆波兹(Vandenabeele-Trambouze)等人，有机异氰酸酯与亲核化合物胺、醇、硫醇、肟和苯酚在稀有机溶液中的反应性(Reactivity oforganic isocyanates with nucleophilic compounds:amines，alcohols，thiols，oximes，andphenols in dilute organic solutions)，前沿环境研究(Advanced Environmental Research)，2001；6:45-55；以引用的方式并入本文中)且异氰酸酯表面从而增加可固定在单一小分子微阵列(SMM)上的天然或合成来源的小分子的多样性。异氰酸酯玻璃基板已经制备且用于以微阵列形式固定寡核苷酸(阿莫林格(Ameringer)等人，用于DNA微阵列的超薄官能星形PEG涂层(Ultrathin functional star PEG coatings for DNA microarrays)，生物大分子(Biomacromolecules)，2005；6(4):1819-23；春(Chun)等人，作为玻璃上沸石晶体的单层集合的新颖分子结合剂的二异氰酸酯(Diisocyanates as novel molecularbinders for monolayer assembly of zeolite crystals on glass)，化学通讯(Chem Commun)(剑桥(Camb))，2002(17):1846-7；郭(Guo)等人，通过在玻璃载体上与寡核苷酸阵列杂交对遗传多态性的直接荧光分析(Direct fluorescence analysis of geneticpolymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports)，核酸研究(Nucleic Acids Res)，1994；22(24):5456-65；索普拉姆(Sompuram)等人，水稳定性保护异氰酸酯玻璃阵列基板(A water-stable protected isocyanate glass array substrate)，分析生物化学(Anal.Biochem)，2004；326(1):55-68；其各自以引用的方式并入本文中)。

我们先前已报道SMM用于发现钙调蛋白配体(calmoduphilin)(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional group compatibility of small-molecule microarrays:discovery ofnovel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2003；42(21):2376-9；以引用的方式并入本文中)、酵母转录辅阻遏子Ure2p(uretupamine)(库鲁维拉(Kuruvilla)等人，用多样化合成和小分子微阵列来剖析葡萄糖信号转导(Dissecting glucose signalling with diversity-oriented synthesis and small-moleculemicroarrays)，自然(Nature)，2002；416(6881):653-7；以引用的方式并入本文中)和酵母HAP转录因子复合物的Hap3p亚单位(haptamide)(科勒(Koehler)等人，使用小分子微阵列和多样化合成发现转录因子抑制剂(Discovery of an inhibitor of atranscription factor using small molecule microarrays and diversity-oriented synthesis)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2003；125(28):8420-1；以引用的方式并入本文中)的用途。这些筛选的每一者涉及在特定载片上仅含有一个DOS文库的SMM。最近，我们探索由一个阵列中的各种DOS合成途径来制备含有子文库的SMM。制备此SMM的目的在于允许研究人员对一个阵列中的各种子文库取样且随后根据不同子集的初始筛选结果来优先筛选完全DOS文库。在这个实例中我们报道异氰酸酯官能化载玻片用于制备在相同载片上含有来自各种固相有机合成途径(布克(Burke)等人，组合产生小分子的不同骨架(Generating diverse skeletons of small molecules combinatorially)，科学(Science)，2003；302(5645):613-8；布克(Burke)等人，组合产生骨架不同小分子的合成策略(A synthesis strategy yielding skeletally diverse small molecules combinatorially)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2004；126(43):14095-104；陈(Chen)等人，小分子杂合物的会聚性多样化合成(Convergent diversity-oriented synthesis of small-moleculehybrids)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2005；44(15):2249-52；库马(Kumar)等人，使用骨架转化策略的小分子多样性(Small-molecule diversity using askeletal transformation strategy)，有机快报(Org Lett)，2005；7(13):2535-8；罗(Lo)等人，基于立体选择性三组分偶合反应的螺吲哚酮文库(A library of spirooxindoles based ona stereoselective three-component coupling reaction)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2004；126(49):16077-86；斯塔万格(Stavenger)等人，定向多样性有机合成的不对称催化：4320编码和空间隔离二氢吡喃甲酰胺的对映选择性合成(Asymmetric Catalysis inDiversity-Oriented Organic Synthesis:Enantioselective Synthesis of 4320 Encoded andSpatially Segregated Dihydropyrancarboxamides)，德国应用化学国际版(Angew Chem IntEd Engl)，2001；40(18):3417-3421；王(Wong)等人，立体化学不同1，3-二噁烷的模合成和初步生物评估(Modular synthesis and preliminary biological evaluation ofstereochemically diverse 1，3-dioxanes)，化学生物学(Chem Biol)，2004；11(9):1279-91；其各自以引用的方式并入本文中)的DOS化合物与市售生物活性化合物(包括天然产物)的若干集合的小分子“多样性微阵列”的用途(图1)。

目的在于使用SMM发现配体的先前策略依赖于用所关注纯化蛋白进行培养。这些方案的潜在应用已受到蛋白质生物化学中难题(包括大蛋白质的表达、溶解性、翻译后修饰状态、活性和产率)的限制。此外，在不能购得所关注蛋白标靶的情况下，可能会限制不具有蛋白质生物化学专业知识的研究人员筛选SMM的能力。此外，我们描述稳固、有效SMM筛选方法的最优化，其允许使用直接来自细胞溶解液而未经纯化的抗原决定基标记靶蛋白来检测特异性蛋白质-小分子相互作用。我们证实新颖连接化学可与检测各种小分子与直接获自细胞溶解液的FKBP12(哈丁(Harding)等人，免疫抑制剂FK506的受体为顺-反肽基-脯氨酰基异构酶(A receptor for the immunosuppressant FK506 is acis-trans peptidyl-prolyl isomerase)，自然(Nature)，1989；341(6244):758-60；斯可卡(Siekierka)等人，免疫抑制剂FK506的胞液结合蛋白具有肽基-脯氨酰基异构酶活性，但与亲环素不同(A cytosolic binding protein for the immunosuppressant FK506 haspeptidyl-prolyl isomerase activity but is distinct from cyclophilin)，自然(Nature)，1989；341(6244):755-7；其各自以引用的方式并入本文中)之间的已知相互作用相容。报道使用复杂溶解液检测特异性相互作用的先前研究通常涉及加入已知纯化蛋白(雷迪(Reddy)等人，用类肽微阵列在复杂混合物中进行蛋白质“指纹印渍”(Protein“fingerprinting”in complex mixtures with peptoid microarrays)，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci USA)，2005；102(36):12672-7；以引用的方式并入本文中)或需要在空间排列于寡核苷酸阵列上之前用与核酸结合的共价探针的集中文库在溶液中培养(温辛格(Winssinger)等人，PNA编码蛋白酶底物微阵列(PNA-encoded protease substratemicroarrays)，化学生物学(Chem Biol)，2004；11(10):1351-60；温辛格(Winssinger)等人，用小分子微阵列剖析蛋白质功能(Profiling protein function with small moleculemicroarrays)，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，2002；99(17):11139-44；其各自以引用的方式并入本文中)。对于配体发现、标靶识别、抗体和蛋白质特异性概述以及例如细胞状态的特征发现(signature discovery)和诊断工具开发的未来应用来说，在蛋白质未经纯化的细胞溶解液中检测选择性相互作用的能力具有吸引力。

结果

将含有具有多种反应性的亲核试剂的小分子排列于弱亲电子性表面上，其与小分子或周围水分缓慢反应且不产生潜在有害的副产物(例如酸)。如图2中所示，将γ-氨基丙基硅烷载片(S1)涂布短聚乙二醇(PEG)间隔基且通过脲键与1，6-己二异氰酸酯偶合，产生推定异氰酸酯官能化载玻片(S2)。随后将印渍有化合物储备溶液的载片置于干燥环境中且暴露于吡啶蒸气中，其催化将小分子共价捕获于载片表面(S3)上。

为评估此方法，使用机器人微阵列点样器来印渍一系列合成FKBP12配体(霍尔特(Holt)等人，高亲和性FKBP配体的设计、合成和动力学评估以及其与FKBP12的复合物的X射线晶体结构(Design，synthesis and kinetic evaluation of high-affinity FKBPligands and the X-Ray crystal structures of their complexes with FKBP12)，美国化学会志(JAm Chem Soc)，1993；115:9925-9938；以引用的方式并入本文中)，其经衍生以使伯醇(3a、3o、3p、3q)、仲醇(3b)、叔醇(3c)、苯酚(3d)、甲醚(3e)、羧酸(3f)、异羟肟酸(3g)、甲基(3h)、硫醇(3i)、伯胺(3j、3n)、仲胺(3k)、吲哚(3l)、或芳胺(3m)存在于异氰酸酯衍生载片上(图3a、图3b)。先前已显示各FKBP12配体的修饰位点容许取代，因为3是二聚化的化学诱导物的母体结构(基南(Keenan)等人，用于蛋白质的调节二聚作用的二价FKBP12配体的合成和活性(Synthesis and activity of bivalentFKBP12 ligands for the regulated dimerization of proteins)，生物有机医药化学(Bioorg MedChem)，1998；6(8):1309-35；以引用的方式并入本文中)。使用DMF作为溶剂以连续两倍稀释液(10mM到20μM)来印渍配体。将经印渍载片暴露于吡啶蒸气中，用乙二醇中止，并用DMF、THF和甲醇充分洗涤。将干燥载片用FKBP12-GST(哈丁(Harding)等人，免疫抑制剂FK506的受体为顺-反肽基-脯氨酰基异构酶(A receptor for theimmunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase)，自然(Nature)，1989；341(6244):758-60；斯可卡(Siekierka)等人，免疫抑制剂FK506的胞内结合蛋白具有肽基-脯氨酰基异构酶活性，但与亲环素不同(A cytosolic binding protein for theimmunosuppressant FK506 has peptidyl-prolyl isomerase activity but is distinct fromcyclophilin)，自然(Nature)，1989；341(6244):755-7；其各自以引用的方式并入本文中)和Cy5^TM标记抗GST抗体依次探测，且使用基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)软件(加利福尼亚州联盟城分子装置公司(Molecular Devices，Union City，CA))在635nm进行荧光扫描。如图3中所示，对应于FKBP12-GST的荧光信号强度根据连接所呈示的官能团与配体浓度而改变。特征直径依赖于配体浓度且在较高浓度下平均直径为250μm。伯胺、芳胺和硫醇似乎具有最高固定水平。伯醇、苯酚、异羟肟酸、仲胺和吲哚的荧光强度也与显著固定一致。仲醇、羧酸和叔醇是以较低量固定。在1.25mM，我们的化合物储备溶液的典型浓度下，检测到痕量伯酰胺3e和3h，而未检测到N，N-取代酰胺3r(图3d)。当用纯化蛋白探测时，将不同长度的聚乙二醇间隔基加成到配体(3n-3q)上未对特征形态或荧光强度造成显著影响。另外，将不同长度的聚乙二醇间隔基(n＝0、2、4、8、70)加成到表面S2上且进行比较(数据未显示)。具有较短PEG链(n＝2、4、8)的表面等效且显示优于不具有PEG的表面的改良信躁比。具有较长PEG链的表面在结合分析中显示最低荧光级别且得到不一致的点形态。

当从程序中省略吡啶蒸气时，荧光级别显著降低(图3d)。当在37℃下将载片暴露于吡啶中时，固定量略增强(数据未显示)。为测试这种捕获方法对用于印渍的化合物储备溶液中存在的水分的灵敏度，将FKBP12配体3a、3b、3c和3e于9:1DMF:ddH₂O中的1mM溶液三次重复排列于异氰酸酯衍生载片上(图3e)。荧光强度与直接从DMF印渍的化合物的荧光强度等效。对于SMM制备来说对水的耐受性是重要的考虑因素，因为存于DMF和DMSO中的化合物储备溶液随时间过去随着其进出冷藏而吸收水(程(Cheng)等人，在各种条件下贮藏化合物在DMSO中稳定性的研究(Studies on repositorycompound stability in DMSO under various conditions)，生物分子筛选杂志(J.Biomol.Screen)，2003；8(3):292-304；以引用的方式并入本文中)。从DMSO中印渍的小分子也是使用这种方法捕获，其具有比从DMF中印渍的化合物(约250μm-300μm)更小的特征直径(约100μm-150μm)。

为研究我们的方法对于印渍并非有意通过共价捕获附件合成的化合物的适用性，将300种以上市售生物活性化合物印渍于异氰酸酯官能化载片上。我们依次使用抗皮质酮、洋地黄毒苷和17β-***的兔第一抗体和荧光染料标记山羊抗兔第二抗体来筛选这些生物活性微阵列。通过计算635nm下的强度且调节复制阵列上各特征的局部背景来测定信躁比(SNR)，且将数据与用单独经标记第二抗体培养的复制对照阵列进行比较(图4)。发现信躁比>3.0的六种生物活性物在复制阵列中与单独经标记多克隆第二抗体结合。如由用单独PBS缓冲液探测的阵列所判断，无化合物在635nm下自发荧光(数据未显示)。潮霉素B(Hygromycin B)，一种氨基糖苷抗生素得到最高调节信躁比(平均SNR为47.6)。三种喹诺酮抗生素、诺氟沙星(norfloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和吡哌酸(pipemidic acid)在至少一个实验中显示大于3.0的平均调节荧光强度。在抗皮质酮抗体结合概况中，氢化可的松(hydrocortisone)(平均SNR为68.9)、倍氯米松(beclomethasone)(63.3)和皮质酮(59.2)，皮质类固醇在结构上相关，记录为阳性物。羟基洋地黄毒苷元(Gitoxigenin)(平均SNR为62.5)、铃兰毒苷(convallatoxin)(52.7)、毛花洋地黄苷C(lanatoside C)(24.0)、地高辛(digoxin)(17.8)和洋地黄毒苷(15.1)，所有作用于心脏的类固醇糖苷在复制抗洋地黄毒苷抗体实验中同样记录为阳性物。17β-***(平均SNR为9.0)、雌三醇(8.7)和雌酮(7.3)，用于捕获的反应性基团的数目改变的原发性***在抗17β-***结合概况中记录为阳性物。抗体结合概况证实可使用异氰酸酯介导的捕获来印渍和检测具有多种亲核官能团的小分子。另外，这些数据证实一种概述免疫球蛋白对小分子的特异性的容易方法。

我们目的在于扩展这种方法的范围以包括检测小分子与先前未经纯化的哺乳动物细胞中表达的靶蛋白之间的相互作用。为此，开发出筛选方案，由此将用带有所关注的过度表达抗原决定基标记蛋白的细胞溶解液培养的SMM与用模拟转染细胞溶解液培养的对照SMM进行比较(图5a)。在适度溶解并通过离心净化后，将细胞溶解液培养在SMM上。随后，将阵列用第一抗抗原决定基抗体和Cy5^TM结合第二抗体连续培养。在每次培养后用PBST简单洗涤并轻微搅拌。对复制阵列上的相应特征检测荧光强度且计算、比较并平均化SNR。

我们通过筛选抗HEK-293T溶解液的API497衍生物(如图3b中)的阵列来研究这种方法，所述HEK-293T溶解液是由经设计来过度表达FLAG-FKBP12的构筑体瞬时转染的哺乳动物细胞制备。通过逐步引入变化以鉴别最大化方案稳定性的参数来进行最优化实验。阵列来源于相同印渍系列，且使用相同激光功率和光电倍增管增益来进行荧光扫描。如图5b中所述，使用以1.25mM的均一、标准浓度排列的配体的平均SNR来比较实验变量。为测定总蛋白质浓度是否影响配体检测，用浓度在0.1μg/μL到1.0μg/μL之间改变的溶解液来培养SMM。各特征的最大荧光强度和SNR证实在0.3μg/μL下最佳。在涉及SMM的方案中通常使用阻断培养。考虑到细胞溶解液的复杂环境，我们有兴趣探究在样品培养之前是否需要阻断。当用细胞溶解液培养SMM时，发现用BSA阻断会使最大信号强度与背景调节信号(SNR)减小。印渍配体与大分子之间的相互作用可通过引入聚合物聚乙二醇(PEG)间隔基而得以增强。也可用经PEG涂布的载片表面降低非特异性背景相互作用。为研究间隔基长度对荧光检测和SNR的影响，在印渍API497衍生物SMM中改变PEG间隔基长度。对于各印渍特征来说，长(n为约70)PEG间隔基与实质上较短间隔基(n＝2)相比观测到SNR的显著降低。其它最优化实验和使用细胞溶解液对SMM的详细、最优化筛选方案呈示于下文。

识别AP1497对FKBP12的高亲和性(K_D＝8.8nM)，我们有兴趣评估这种技术鉴别如筛选实验中可检测到的较低亲和性相互作用的能力。使用异氰酸酯捕获方法，用对照生物活性物印渍对FKBP12具有完全不同亲和性的两种配体的聚焦阵列(focused array)(图6A)。最优化筛选方案允许特异性鉴别K_D高达2.6μM的配体(图6B)(麦克贝思(MacBeath)等人，以微阵列形式印渍蛋白质以进行高产率功能测定(Printing proteins asmicroarrays for high-throughput function determination)，科学(Science)，2000；289(5485):1760-3；以引用的方式并入本文中)。为测定这种方法是否将允许检测小分子与嵌合荧光蛋白之间的低亲和性相互作用，用来自经编码EGFP-FKBP12融合蛋白的载体瞬时转染的哺乳动物细胞的溶解液培养SMM。将经培养载片用PBST简单洗涤并在488nm下进行荧光扫描。在不需要第一抗体和荧光标记第二抗体的情况下观测具有低结合亲和性的配体的鉴别(图6C)。在组织培养物中用蛋白质表达构筑体将细胞瞬时转染通常使得蛋白质过度表达，如上文实验中一样。在配体发现的上下文中，此可证实为可取的；然而，SMM的其它应用(例如细胞状态的仿形)涉及通过使用靶蛋白特异性抗体来检测与内源性表达蛋白的特异性相互作用。为探索此可能性，将SMM用来自未经转染293T细胞的溶解液培养。随后用抗FKBP12的N末端区域的市售多克隆抗体和第二荧光团结合抗体培养使得可检测内源性FKBP12与K_D高达2.6μM的配体之间的特异性相互作用(图6D)。

为研究我们的最优化溶解液方案作为筛选方法的稳定性，印渍含有10,000种生物活性小分子、天然产物和来源于多样化合成的小分子的不同SMM。微阵列也包括对应于FKBP12的合成配体(3-5)的27种特征，和免疫抑制剂和抗癌天然产物雷帕霉素(FKBP12的已知配体)。独立地制备十种细胞溶解液(五种对照物和五种Flag-FKBP12)且用多样性SMM将其培养。在用第一抗体和Cy5标记第二抗体培养后，在635nm下对载片进行荧光扫描且计算局部背景校正(SNR)。在五种具有表达Flag-FKBP12的溶解液的复制SMM中，检测FKBP12的所有27种印渍配体(包括雷帕霉素和低亲和性合成配体5)。代表性阵列呈示于图7a中。

为统计学询问我们的技术在不同阵列上鉴别所关注蛋白的配体的能力，由排列溶剂的最大SNR强度确立的临限强度2.24将局部校正特征强度(SNR635)分成两部分。将SNR强度大于2.24的特征分类为阳性物。使用费舍尔精确检验来比较对照物培养阵列或Flag-FKBP12培养阵列的特征，且产生104种仅溶剂特征的列联表，其在至少一个实验中表现为撞击。在0.05的显著性水平下，发现24种细胞具有显著p值(图7b)。一种DOS化合物1276-M08也记录为分析阳性物。通过表面等离子体共振证实结合，但通过表面等离子体共振发现自孔再合成的主要产物与GST和GST-FKBP12结合，指示所述分子可能不是FKBP12的选择性配体。

讨论

我们使用小分子的共价捕获策略，其利用充分确定的化学反应(凡德纳比利-曲姆波兹(Vandenabeele-Trambouze)等人，有机异氰酸酯与亲核化合物胺、醇、硫醇、肟和苯酚在稀有机溶液中的反应性(Reactivity of organic isocyanates with nucleophiliccompounds:amines，alcohols，thiols，oximes，and phenols in dilute organic solutions)，前沿环境研究(Advanced Environmental Research)，2001；6:45-55；阿莫林格(Ameringer)等人，用于DNA微阵列的超薄官能星形PEG涂层(Ultrathin functional star PEG coatings forDNA microarrays)，生物大分子(Biomacromolecules)，2005；6(4):1819-23；春(Chun)等人，作为玻璃上沸石晶体的单层集合的新颖分子结合剂的二异氰酸酯(Diisocyanates asnovel molecular binders for monolayer assembly of zeolite crystals on glass)，化学通讯(Chem Commun)(剑桥(Camb))，2002(17):1846-7；郭(Guo)等人，通过在玻璃载体上与寡核苷酸阵列杂交对遗传多态性的直接荧光分析(Direct fluorescence analysis ofgenetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports)，核酸研究(Nucleic Acids Res)，1994；22(24):5456-65；索普拉姆(Sompuram)等人，水稳定性保护异氰酸酯玻璃阵列基板(A water-stable protected isocyanate glass array substrate)，分析生物化学(Anal.Biochem)，2004；326(1):55-68；其各自以引用的方式并入本文中)且允许第一次制备含有来自天然来源与合成来源的小分子的微阵列。异氰酸酯介导的捕获可应用于含有多种亲核官能团的化合物且不需要在合成期间引入含有特殊反应性附加物的化合物(例如醇或叠氮化物)(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional groupcompatibility of small-molecule microarrays:discovery of novel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2003；42(21):2376-9；赫根罗德(Hergenrother)等人，小分子微阵列：含醇小分子在载玻片上的共价连接和筛选(Small moleculemicroarrays:covalent attachment and screening of alcohol-containing small molecules onglass slides)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2000；122:7849-50；科恩(Kohn)等人，施陶丁格连接：用于制备小分子阵列的新颖固定策略(Staudinger ligation:a newimmobilization strategy for the preparation of small-molecule arrays)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2003；42(47):5830-4；其各自以引用的方式并入本文中)以在阵列中共价捕获。异氰酸酯官能团不会产生副产物；与若干种先前捕获剂相比，其包括使用正电性氯部分的那些捕获剂。后者导致酸性残余物在小分子附近沉积和浓缩，其可使得小分子部分降解且筛选结果混乱。含有多个亲核官能团的化合物也具有在特定点以不同方向显示的可能性。多种显示模式可允许蛋白质以特定微阵列特征尝试不同结合方向。然而，异氰酸酯载片可与需要蛋白质结合的亲核试剂反应且因此可在筛选种产生一些假阴性物。由于印渍特征内的潜在异质性，我们更喜欢使用来自基于表面等离子体共振的次级结合分析的数据而非微阵列荧光强度来优先对阳性物进行跟踪。这种方法允许我们使用高产量微阵列筛选平台和表面等离子体共振平台来迅速鉴别候选配体以表征实时和定量分析中的阳性物。

捕获方法允许我们制备含有除天然产物和生物活性化合物以外来源于多种固相合成的化合物(例如FDA批准药物)的微阵列。这些阵列含有更大化学多样性且因此更希望用于对更大蛋白质组进行筛选。在我们的经验中，关于一种所关注蛋白质的研究人员通常更喜欢筛选多个含有来自个别合成的化合物的微阵列，但通过筛选多样性阵列开始以辅助指导其关于进一步筛选那些文库的选择。

在努力检验印渍具有可变官能团的小分子的复杂集合的过程中，我们用一系列对生物活性小分子具有已知特异性的抗体探测不同SMM。这些抗体的已知标靶的结构类似物也经鉴别，指示已印渍分子的大的不同集合可产生对免疫球蛋白的结构结合性质的了解。这种方法已暗示如先前已报道使用聚焦碳水化合物阵列将免疫球蛋白仿形(王(Wang)D，刘(Liu)S，楚默(Trummer)BJ，邓(Deng)C，王(Wang)A，用于识别微生物和宿主细胞的交叉反应性分子标记物的碳水化合物微阵列(Carbohydratemicroarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microbes and hostcells)，自然生物技术(Nat Biotechnol)，2002；20(3):275-81；以引用的方式并入本文中)。重要的是，对如本文中呈示的小分子的大的不同文库中的抗体特异性仿型可对迅速诊断、治疗、中和和催化抗体发现提供独特机会。

由异氰酸酯介导的捕获产生的SMM也可与涉及在细胞溶解液中含有经过度表达、抗原决定基标记蛋白的总细胞溶解液的结合筛选相容。直接从溶解液中筛选的能力通过避免蛋白质纯化而节省大量时间和努力。这种溶解液方法对在纯化时回避广泛方法的蛋白质提供配体发现的可能性。溶解液筛选更具生物相关性，因为一些所关注蛋白可留在蛋白质复合物中或需要蛋白质配合物来保持活性。直接获自哺乳动物细胞溶解液的蛋白质也更易于适当折叠且具有与活性或所需三级结构相关的翻译后修饰。来自溶解液的蛋白质也可用于阻断表面，从而产生竞争性分析。小分子与使用异氰酸酯捕获制备的表面的键联也似乎在溶解液筛选条件下对细胞酯酶和蛋白酶稳定，因为载片可在变性条件下剥离且再探测(数据未显示)。使用异氰酸酯捕获的溶解液实验中的信躁比与我们所制备的包括通过酯键与表面键联的表面相比得以改良。因此，我们相信这种新颖能力构成了SMM方法的主要进展且应将其用途扩展为发现所关注蛋白质的小分子配合物的方法。印渍特征的多样性和SMM表面与这种溶解液筛选方案的相容性也允许将先前未经纯化的来源于细胞溶解液的蛋白质的复杂混合物仿形。关于SMM的溶解液应用的详细研究在我们实验室正在进行中。

迄今为止已印渍一千种以上复制多样性SMM。通过包括若干个实验室的协作，50种以上蛋白质(包括单一纯化蛋白、纯化蛋白复合物和来自澄清细胞溶解液的蛋白质)已相对这些微阵列进行筛选。在所测试的100种以上相互作用中，86％经再测试为结合剂，其在第二基于表面等离子体共振的分析中具有0.5μM-20μM的估计解离常数，所述分析包括将靶蛋白固定在葡聚糖涂布传感器表面上且注射不同浓度的化合物(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functional group compatibility of small-molecule microarrays:discovery of novel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2003；42(21):2376-9；以引用的方式并入本文中)。未再测试的化合物通常归类为葡聚糖的不溶性、非特异性结合剂或假阳性物。

总之，我们已开发出一种用于制备小分子微阵列的新颖方法，其可应用到天然或合成来源的含有多种亲核官能团的化合物中从而增加化合物的多样性和数量，其可经固定以进行基于微阵列的结合筛选。我们能够使用抗体检测并证实选定的印渍小分子和结构相关化合物的存在。最后，我们使用这种化学来制备含有接近10,000种小分子的多样性SMM且使用微阵列来证实表面可与使用未经任何纯化的来自细胞溶解液的总蛋白检测相互作用相容。未来努力将使用小分子结合作为特征利用抗体和与溶解液相容的多样性SMM来仿形结合选择性和细胞状态的变化。

实验程序

材料。生物活性小分子和天然产物购自商业来源。DOS分子获自布罗德化学生物程序(Broad Chemical Biology Program)。化合物3s由约翰塔拉里科博士(Dr.John Tallarico)赠与。化合物27、28获自阿瑞德制药公司(Ariad Pharmaceuticals)的蒂莫西克拉克森博士(Dr.Timothy Clackson)。Flag-FKBP12哺乳动物表达构筑体由保罗克莱蒙博士(Dr.Paul Clemons)赠与。EGFP-FKBP12哺乳动物表达构筑体是使用购自克隆技术实验室(Clontech Laboratories)的创造者(Creator)^TM克隆***和获自哈佛大学蛋白质研究学院(Harvard Institute of Proteomics)的FKBP12文库载体来构筑。抗皮质酮、***和洋地黄毒苷的抗体购自西格玛公司(Sigma)。小鼠抗Flag^TM单克隆抗体购自西格玛公司(Sigma)。阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647山羊抗兔抗体购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)。Cy5^TM标记山羊抗GST抗体和兔抗小鼠抗体购自安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)。使用爱克森(Axon)4000B扫描仪在5μm解析度下使用635nm和532nm激光器或使用爱克森(Axon)4200A扫描仪在5μm解析度下使用488nm和532nm激光器来扫描载片。使用购自分子装置(Molecular Devices)的基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)软件来分析阵列。

一般方法。所有购得材料都在未经进一步纯化的情况下使用。将除DMF外的所有反应溶剂从溶剂纯化***中去除，其中使溶剂穿过经填充活性氧化铝柱。DMF为阿德里奇公司(Aldrich)无水级。用于其它用途的溶剂为购自飞世尔公司(Fisher)的市售HPLC级。所有反应是在正氩气压力下在经烘箱干燥的标准实验室玻璃容器中进行。使用默克(Merck)硅胶60F254板通过薄层色谱来监控反应。通过UV(254nm)或磷钼酸来呈现化合物。使用默克(Merck)硅胶60(230-400目)来进行快速柱色谱。所有NMR谱都记录在瓦里安公司(Varian)依诺瓦(Inova)AS500光谱仪上。化学位移以相对于残余溶剂信号的ppm来表示。在使用沃特斯公司(Waters)对称(Symmetry)C18柱的沃特斯公司(Waters)联合(Alliance)2690 HPLC***上进行LC-MS。用沃特斯公司(Waters)996光二极管阵列检测器和麦克罗麦斯公司(Micromass)LCZ(ESI)光谱仪来检测化合物。CH₃CN和0.1％甲酸水溶液用作溶剂。在0分钟时比率为15％CH₃CN/85％水且以线性梯度在5分钟时变为100％ CH₃CN，接着为1分钟的100％ CH₃CN。使用对称(Symmetry)C18半制备型柱和乙腈(0.1％三氟乙酸)/水(0.1％三氟乙酸)作为流动相用具有2487双重波长(Dual Wavelength)检测器的沃特斯公司(Waters)Delta 600来进行制备型HPLC。

异氰酸酯载片制备的一般方案。将如先前所述制备的氨基官能化载玻片(麦克贝思(MacBeath)G，科勒(Koehler)AN，斯克瑞伯(Schreiber)SL，以微阵列形式印渍小分子且一同检测蛋白质-小分子相互作用(Printing small molecules as microarrays anddetecting protein-small molecule interactions en masse)，美国化学会志(J Am Chem Soc)，1999；121:7967-68；以引用的方式并入本文中)或市售γ-氨基丙基硅烷GAPS^TM载片(柯宁(Corning))在Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(10mM，新***(Neosystem))、PyBOP(10mM)和iPr₂NEt(20mM)于DMF中的溶液中培养至少4小时。将所述载片用DMF洗涤来去除过量偶合溶液并在10％(v/v)哌啶于DMF中的溶液中培养30分钟(室温)以去除表面上的Fmoc基团。在用DMF冲洗后，在室温下将载片在10％(v/v)1，6-己二异氰酸酯(阿德里奇公司(Aldrich))于DMF中的溶液中活化30分钟。用THF简单冲洗三次以使得完全去除活化溶液且将载片迅速干燥，随后置于机器人微阵列点样器平台上。视印渍过程的时间长短而定，使印渍载片干燥至少10分钟(印渍操作大于2小时)且至多2小时(短印渍操作)，随后将其置于玻璃真空干燥器中的金属支架中。将三通转接器与干燥器连接，其中管道通向真空管线和含有约1mL吡啶的圆底烧瓶。一旦干燥器和烧瓶完全排空，就将真空管线关闭且催化吡啶蒸气标准化压力达至少4小时。随后将载片浸渍于乙二醇(1M，于DMF中)和1％(v/v)吡啶的溶液中达10分钟以使表面中止反应。将载片用DMF洗涤两次达30分钟，用乙醇洗涤一次达30分钟，通过离心干燥，并在筛选之前存储在-20℃下。使用这些条件可将载片存储长达6个月。

多样性小分子微阵列制备。如先前所述(巴恩斯-塞曼(Barnes-Seeman)等人，扩展小分子微阵列的官能团相容性：新颖钙调蛋白配体的发现(Expanding the functionalgroup compatibility of small-molecule microarrays:discovery of novel calmodulin ligands)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2003；42(21):2376-9；以引用的方式并入本文中)使用配备有ArrayIt^TM秘密(Stealth)48针打印头和SMP3点样针(特里克姆国际公司(TeleChem International，Inc.))的欧尼格雷德(OmniGrid)

100微阵列点样器(基因组解决方案公司(Genomic Solutions))将来自不同组的小分子排列在异氰酸酯官能化载玻片上。微阵列含有10,800个印渍特征，其中15×15个特征的48个子阵列具有320μm中心-中心间隔。从384孔聚丙烯板(阿博金公司(Abgene))来印渍小分子溶液(约1mM，于DMF中)。印渍含有9,152种DOS化合物(布克(Burke)等人，组合产生小分子的不同骨架(Generating diverse skeletons of small moleculescombinatorially)，科学(Science)，2003；302(5645):613-8；布克(Burke)等人，组合产生骨架不同小分子的合成策略(A synthesis strategy yielding skeletally diverse smallmolecules combinatorially)，美国化学会志(J Am Chem Soc)，2004；126(43):14095-104；陈(Chen)等人，小分子杂合物的会聚性多样化合成(Convergent diversity-orientedsynthesis of small-molecule hybrids)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2005；44(15):2249-52；库马(Kumar)等人，使用骨架转化策略的小分子多样性(Small-molecule diversity using a skeletal transformation strategy)，有机快报(Org Lett)，2005；7(13):2535-8；罗(Lo)等人，基于立体选择性三组分偶合反应的螺吲哚酮文库(Alibrary of spirooxindoles based on a stereoselective three-component coupling reaction)，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，2004；126(49):16077-86；斯塔万格(Stavenger)等人，定向多样性有机合成的不对称催化：4320编码和空间隔离二氢吡喃甲酰胺的对映选择性合成(Asymmetric Catalysis in Diversity-Oriented Organic Synthesis:EnantioselectiveSynthesis of 4320 Encoded and Spatially Segregated Dihydropyrancarboxamides)，德国应用化学国际版(Angew Chem Int Ed Engl)，2001；40(18):3417-3421；王(Wong)等人，立体化学不同1，3-二噁烷的模合成和初步生物评估(Modular synthesis and preliminarybiological evaluation of stereochemically diverse 1，3-dioxanes)，化学生物学(Chem Biol)，2004；11(9):1279-91；其各自以引用的方式并入本文中)、336种生物活性物、72种对照化合物和1,192个含有DMF的空白孔的28个板。将含有各种浓度的若丹明(rhodamine)衍生物(约1mM，DMF)(麦克贝思(MacBeath)等人，以微阵列形式印渍小分子且一同检测蛋白质-小分子相互作用(Printing small molecules as microarrays and detectingprotein-small molecule interactions en masse)，美国化学会志(J Am Chem Soc)，1999；121:7967-68；以引用的方式并入本文中)的29个板的48个孔在最后浸渍中印渍以充当构成子阵列的阵列上的荧光标记物。将各针在从孔中提取样品之间用乙腈洗涤三次达5秒并真空干燥3秒以试图最小化样品的转移污染(carryover contamination)。在特定印渍操作中印渍一百个阵列且迄今为止已印渍1000个以上复本的多样性微阵列。各印渍操作的质量控制包括在筛选之前扫描阵列和寻找各种荧光染料对照特征以及筛选存在与否以检测选定已知蛋白质-配体相互作用。

用纯化FKBP12-GST进行微阵列筛选。在室温下用300μL的纯化FKBP12-GST(哈丁(Harding)等人，免疫抑制剂FK506的受体为顺-反肽基-脯氨酰基异构酶(A receptorfor the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase)，自然(Nature)，1989；341(6244):758-60；斯可卡(Siekierka)等人，免疫抑制剂FK506的胞内结合蛋白具有肽基-脯氨酰基异构酶活性，但与亲环素不同(A cytosolic binding protein for theimmunosuppressant FK506 has peptidyl-prolyl isomerase activity but is distinct fromcyclophilin)，自然(Nature)，1989；341(6244):755-7；其各自以引用的方式并入本文中)于PBST缓冲液中的1μg/mL溶液将微阵列培养30分钟。将阵列用PBST简单冲洗并随后在轨道平台振荡器上用PBST洗涤两次(每次洗涤1分钟)。随后在室温下将阵列用300μL的Cy5^TM标记山羊抗GST抗体于PBST中的0.5μg/mL溶液培养30分钟。将探测阵列用PBST冲洗，用PBST洗涤三次(每次洗涤2分钟)并用PBS洗涤一次(2分钟)。将阵列通过离心干燥并用基恩匹克斯(Genepix)4000B微阵列扫描仪在635nm下进行荧光扫描。用第二标记抗体、依次用第一抗体和标记第二抗体以及依次用GST和第一抗体与第二抗体来探测对照阵列以确保荧光信号是由于FKBP12与印渍配体的结合。为分析含有配体3a-3q的阵列特征(图3b)，使用基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)软件来计算各特征上居中的一组300μm直径的总荧光强度值。在不同浓度下各配体的强度以图形显示(图3c)。

用抗天然产物的抗体进行小分子微阵列仿形。将用天然产物和生物活性物印渍的微阵列用各种抗体培养以检测特异性化合物。在第一个培养步骤中，在室温下用300μL的以下物质中的一种将阵列培养30分钟：PBST缓冲液(对照物)、兔抗皮质酮全抗血清于PBST中的1:500溶液、兔抗17β-***全抗血清于PBST中的1:500溶液。将阵列用PBST简单冲洗并随后用PBST洗涤两次。随后在室温下将所有阵列用300μL的阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647山羊抗小鼠多克隆第二抗体于PBST中的1:1000溶液培养30分钟。将探测阵列用PBST冲洗，用PBST洗涤三次并用PBS洗涤一次。将阵列通过离心干燥并在635nm下进行荧光扫描。使用调整参数计算各特征的信躁比。

用来自溶解液的Flag-FKBP12进行多样性微阵列筛选。在补充有青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM中进行HEK-293T细胞的常规培养。由FuGENE6脂质转染(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))用带有Flag^TM抗原决定基标记FKBP12编码序列的哺乳动物过度表达载体进行HEK-293T细胞的转染。在48小时后收集细胞，且通过用MIPP溶解缓冲液(20mM NaH₂PO₄(pH7.2)、1mM Na₃VO₄、5mM NaF、25mM β-甘油磷酸盐、2mM EGTA、2mM EDTA、1mM DTT、0.5％(v/v)Triton X-100)培养并离心来制备澄清溶解液。添加其它溶解缓冲液直到总蛋白质浓度为0.3mg/mL，且通过免疫印迹(Western blot)来检验Flag^TM-FKBP12的过度表达(数据未显示)。将小分子微阵列用澄清溶解液、抗Flag^TM M5鼠科动物单克隆第一抗体和阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647山羊抗小鼠多克隆第二抗体连续培养。用补充有1.0％牛血清白蛋白的PBST将抗体稀释到0.5μg/mL。所有培养都是在4℃下进行一小时。在培养后用PBST简单洗涤载片。在用蒸馏水简单冲洗后，将载片通过离心干燥，扫描并如上所述进行分析。

用细胞溶解液筛选SMM的方案

HEK 293T细胞的转染

1.使细胞在DMEM/10％ FBS+P/S+Glut中生长，直到70％-90％长满

2.将6孔板24的每个孔涂5×10⁵个细胞(1孔＝1SMM)

3.在37℃下培养24小时

4.用2mL温DMEM/10％FBS置换培养基

5.用以下次序来制备脂质转染反应物：

a.OptiMEM(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen))  100mL

b.Fugene 6(罗氏诊断学(Roche Diagnostics))  3μL

c.质粒DNA                                 2μg

6.轻拍以混合并在室温下培养15分钟

7.在孔周围逐滴轻轻吸取100μL转染反应物

8.在37℃下培养36-48小时

9.用EGFP监控并记录转染效率

转染细胞的收集

10.当EGFP效率>70％且强烈时收集细胞

11.抽吸培养基并丢弃

12.吸取500μL冷却的PBS到各孔中

13.通过重复吸取PBS使细胞层轻轻脱离

14.将普通细胞汇集于15mL猎鹰(Falcon)管中

15.以1,000g的速率在4℃下旋转3分钟

16.丢弃上清液

17.轻轻再悬浮于PBS中

18.重复洗涤步骤15-17共三次

19.将经洗涤细胞悬浮液在艾本多夫(Eppendorf)管中等分

20.以1,000g的速率在4℃下旋转3分钟

21.小心地最大限度地丢弃上清液

22.将细胞小球急速冷冻在EtOH/干冰中

23.存储在-80℃下直到使用为止

细胞溶解液的制备

24.在湿冰上解冻细胞小球

25.用蛋白酶抑制剂和DTT(新鲜)来制备MIPP溶解缓冲液

26.将小球再悬浮于100μL-200μL溶解缓冲液中

27.在冰上培养15分钟

28.以14,000g的速率在4℃下旋转10分钟

29.将澄清上清液倾析到新的冷艾本多夫(Eppendorf)管中

30.进行布拉福德(Bradford)分析以评估蛋白质浓度

31.用溶解缓冲液调节以达到0.3μg/μL-1μg/μL

筛选印渍小分子微阵列

32.将细胞溶解液涂覆到载片表面(根据方法测定的体积)：

a.赫比腔(Hybe Chamber)  1.4mL

b.帕拉封口膜(Parafilm)  0.3mL

c.盖片(Coverslip)       0.15mL

33.在4℃下培养1小时

34.在4℃下用冷却的PBST洗涤3次，每次1分钟

35.涂覆第一抗体(用PBST+1％BSA进行1:1000稀释)

36.在4℃下培养1小时

37.在4℃下用冷却的PBST洗涤3次，每次1分钟

38.涂覆第二Cy5标记抗体(用PBST+1％BSA进行1:1000稀释)

39.在4℃下培养1小时

40.在4℃下用冷却的PBST洗涤3次，每次3分钟

41.用ddH₂O简单冲洗

42.以1000rpm将载片离心干燥1分钟

43.用PMT电压(500)和100％功率在635下扫描

MIPP溶解缓冲液                 1.00L

NaH₂PO₄·2H₂O        20mM       3.12g

Na₃VO₄              1mM         0.184g

NaF                5mM         0.08g(80mg)

B-甘油磷酸盐       25mM        5.48g

EGTA               2mM         0.78g

EDTA               2mM         0.72g

Triton X-100       0.5％       2.5mL

DTT                1mM         新鲜

pH                 7.2

PBST＝PBS+0.1％ Tween 20

统计学方法

使用10个微阵列(5个处理物和5个对照物)来测定印渍小分子与含有FKBP12的细胞溶解液之间的相互作用。各微阵列含有总共10,800个印渍特征。在各微阵列上的10,800个特征中，158个特征仅含有溶剂且用作阴性对照物以确立强度临限值。发现所有溶剂细胞(158×10＝1,580)上的最大荧光强度值(即临限值)为2.243。使用此临限值将数据分成两部分，使用费舍尔精确检验(Fisher′s Exact test)来评估处理细胞具有比对照特征更大的强度的假设。产生104种仅溶剂特征的列联表和p值，其中至少一个细胞显示高于临限值的荧光强度。使用SAS中的精确选择进行计算(卡里(Cary.N.C))。

通过表面等离子体共振来评估1276-M08的结合

用柏考(Biacore)S51仪器(新泽西州皮斯卡特维镇柏考公司(Biacore，Inc.Piscataway，NJ))进行SPR测量。柏考(Biacore)CM5研究级传感器芯片上的各流动单元含有三个可寻址点：两个样品点和一个参照点。以13,000响应单位(RU)的量将将抗GST固定在点1和2上。使用EDC/NHS连接化学应用范例将用10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)稀释的抗GST固定。用乙醇胺中止固定化学。以1,600RU的量将GST标记FKBP12捕获在点1上且将重组GST捕获在点2上。

以30μl/min的流动速率在运行缓冲液(24mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、137mMNaCl、3mM KCl、0.005％(v/v)P20表面活性剂和5％(v/v)DMSO)中进行动力学实验。起始于2.5μM，在六种不同浓度下在1:2稀释液中双重复测试化合物。使用Scrubber和ClampXP软件(犹他大学生物分子相互作用中心(Center for Biomolecular Interaction，University of Utah))来计算动力学和平衡常数。将结合数据双参考减去并使用1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型全拟合，其中用FKBP12的合成配体实验测定最大结合位点数。将传感图(sensorgram)标准化以使得最大反应将对应于y轴上的100RU。

FKBP12配体3a-3r的合成

根据以下公开案中的方案来合成羧酸官能化FKBP12-配体3f：泰伦斯基南(TerenceKeenan)，戴维R.耶格尔(David R.Yaeger)，南希L.卡瑞杰(Nancy L.Courage)，卡尔T.罗林斯(Carl T.Rollins)，玛丽艾伦帕瓦内(Mary Ellen Pavone)，维克多M.里维拉(VictorM.Rivera)，杨武(Wu Yang)，郭涛(Tao Guoy)，简F.阿玛拉(Jane F.Amara)，蒂姆克拉克森(Tim Clackson)，迈克尔吉尔曼(Michael Gilman)和丹尼斯A.霍尔特(DennisA.Holt)；生物有机和医药化学6(Bioorganic & Medicinal Chemistry 6)(1998)1309-1335。3f充当其它所报道的合成FKBP12-配体(3a-e和3g-q)的常用中间体。

一般方法A(酰胺偶合)：将292mg(0.5mmol)羧酸3f和4当量(在未经保护二胺的情况下为20当量)的相应胺溶解于5mL二氯甲烷中。将反应混合物冷却到0℃且添加1mL二氯甲烷中的286mg(0.55mmol，1.1当量)PyBop。在此温度下搅拌反应混合物，直到所有羧酸经消耗为止(通常在1小时内)。对于处理来说，添加二氯甲烷且用半饱和碳酸氢钠溶液和水来洗涤有机层。将有机层经硫酸钠干燥且在过滤后在减压下去除溶剂。通过制备型HPLC来纯化粗产物。

一般方法B(酯形成)：将146mg(0.25mmol)羧酸3f和40mg(0.3mmol，1.2当量)N，N二甲基氨基吡啶溶解于3mL二氯甲烷中。将反应混合物冷却到0℃且缓慢添加1mL二氯甲烷中的62mg(0.3mmol)二环己基碳化二亚胺，接着添加10当量(2.5mmol)的相应二醇。随后将反应混合物升温到室温并搅拌1小时。将沉淀物滤出并用二氯甲烷洗涤。将有机层合并且在减压下去除溶剂。首先用ISCO CombiFlash***(己烷-乙酸乙酯，梯度为10％到100％乙酸乙酯，检测278nm)经二氧化硅纯化粗产物，接着用制备型HPLC来纯化。

伯醇3a：方法A

仲醇3b：方法A

叔醇3c：方法B

苯酚3d：方法A

甲醚3e：方法A

异羟肟酸3g：方法A

烷基3h：方法A

硫醇3i：方法A

伯胺3j：方法A

仲胺3k：方法A

吲哚3l：方法A

苯胺3m：方法A

3-PEG伯胺3n：方法A

2-PEG伯醇3o：方法B

3-PEG伯醇3p：方法B

5-PEG伯醇3q：方法B

N，N-二甲基酰胺AP1497衍生物3r：向10mL圆底烧瓶中馈入3f(10mg，17.2μmol)，并在高真空下干燥，随后加入偶合试剂。在氩气下，将偶合试剂(1.4当量N，N-二甲胺，1.6当量PyBOP，2.8当量DIPEA，在3mL无水DMF中)加入烧瓶中。将混合物在氩气下在周围温度下搅拌14小时且通过TLC来监控反应结果。在完成后，用乙酸乙酯(10mL)稀释反应混合物。将有机层用2％ KHSO₄(水溶液)、ddH₂O、盐水洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。在减压下浓缩滤液，且快速柱色谱(CHCl₃:MeOH＝20:1)得到呈透明油状的所需产物(11mg，92.3％分离产率)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ ppm 7.27(t，J＝7.5Hz，1H)，6.96(d，J＝8Hz，1H)，6.95(s，1H)，6.89(m，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H)，6.68(m，2H)，5.78(t，J＝6Hz)，5.31(d，J＝6Hz，1H)，4.70(m，2H)，3.86(s，3H)，3.85(s，3H)，3.65(d，J＝9.5Hz，1H)，3.16(td，J＝12.5，2.5Hz，1H)，3.09(s，3H)，2.98(s，3H)，2.62-2.51(m，2H)，2.37(d，J＝12.5Hz，1H)，2.25(m，1H)，2.05(m，1H)，1.79-1.61(m，6H)，1.50(qt，J＝13，4Hz，1H)，1.35(qt，J＝13，4Hz，1H)，1.25-1.19(m，6H)，1.11(d，J＝6Hz，1H)，0.88(t，J＝8Hz，3H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ ppm 193.2，186.3，178.9，170.0，158.2，141.4，133.4，130.0，125.0，120.1，119.8，114.3，113.1，111.7，111.2，67.4，55.8，51.3，46.7，44.1，38.0，35.7，32.5，31.2，26.4，24.9，23.5，23.1，21.6，21.2，8.7；HRMS(TOF-ES+)C₃₄H₄₇N₂O₈Na(M+H)⁺的计算值，611.3332(1.6ppm误差)。

LCMS数据：

羧酸AP1497衍生物3f，用于偶合反应的母体物质：

C₃₂H₄₁NO₉ M.W.＝583.67

伯醇AP1497衍生物3a：

C₃₅H₄₈N₂O₉ M.W.＝640.76

仲醇AP1497衍生物3b：

C₃₆H₅₀N₂O₉ M.W.＝654.79

叔醇AP1497衍生物3c：

C₃₇H₅₁NO₁₀ M.W.＝669.80

苯酚AP1497衍生物3d：

C₄₀H₅₀N₂O₉ M.W.＝702.83

甲醚AP1497衍生物3e：

C₃₆H₅₀N₂O₉ M.W.＝654.79

异羟肟酸AP1497衍生物3g：

C₃₂H₄₂N₂O₉ M.W.＝598.68

丙酰胺AP1497衍生物3h：

C₃₅H₄₈N₂O₈ M.W.＝624.76

硫醇AP1497衍生物3i：

C₃₄H₃₆N₂O₈S M.W.＝642.80

伯胺AP1497衍生物3j：

C₃₅H₄₉N₃O₈ M.W.＝639.78

仲胺AP1497衍生物3k：

C₃₆H₄₉N₃O₈ M.W.＝651.79

吲哚AP1497衍生物31：

C₄₂H₅₁N₃O₈ M.W.＝725.87

芳胺AP1497衍生物3m：

C₃₈H₄₇N₃O₈ M.W.＝673.80

PEG伯胺AP1497衍生物3n：

C₃₈H₅₅N₃O₁₀ M.W.＝713.86

PEG伯醇(2O)AP1497衍生物3o：

C₃₆H₄₉NO₁₁ M.W.＝671.77

PEG伯醇(3O)AP1497衍生物3p：

C₃₈H₅₃NO₁₂ M.W.＝715.83

PEG伯醇(5O)AP1497衍生物3q：

C₄₂H₆₁NO₁₄ M.W.＝803.93

实例2-用于共价捕获和筛选呈微阵列形式的不同小分子的方法

这个实例描述用于共价捕获呈微阵列形式的具有不同反应性官能团的小分子的稳固方法且概述用所关注蛋白质来探测小分子微阵列的程序。使用蒸气催化、异氰酸酯介导的表面固定流程来连接源自多样化合成路径的生物活性小分子、天然产物和小分子。另外，描述用纯化蛋白和细胞溶解液来筛选小分子微阵列的最优化方法。最后，提供可与市售软件相容的用于数据分析的建议模型。这些程序使得有可能发现新颖相互作用的平台潜在应用于免疫球蛋白仿形、细胞状态的比较性分析与配体发现。

本文中，我们呈示使用蒸气催化、异氰酸酯介导的技术来共价捕获不同集合的小分子的这种方法的详细、逐步描述。这种方法的示意图提供于图10中。小分子的储备溶液是以384孔板形式排列。在显微镜载玻片上制备经保护聚乙二醇(PEG)表面(图11)。在脱保护后，1，6-己二异氰酸酯偶合建立反应性异氰酸酯表面。小分子经机器人印渍且随后由吡啶蒸气来催化与表面的共价连接。随后将中止反应并经洗涤的载片在干燥情况下存储以用于其它实验中。与复杂天然产物、多样化合成产物和生物活性小分子(例如医药剂)的相容性极大地预示着改良印渍小分子特征的数量和结构多样性。

这个表面在实验上可与涉及澄清细胞溶解液的分析相容，其通常可避免对标靶进行生物化学纯化的需要。也描述用纯化蛋白和细胞溶解液来筛选小分子微阵列的最优化方案。在用少量体积的蛋白质或溶解液培养后，将载片洗涤并随后用第一抗体和经标记第二抗体连续培养。使用用于分析印渍寡核苷酸阵列而形成的标准、市售软件由三次重复收集到的数据来定量测定对结合相互作用的检测。尽管本文中未描述，但使用这种方案发现的候选蛋白质-配体相互作用通常是使用涉及基于荧光的热移位和表面等离子体共振的次级结合分析来表征。

原稿中所述的印渍和检测方法存在限制性。首先，许多学术环境对筛选化学文库的使用权可能有限。建立功能性机器人微阵列印渍平台所需的资源和培训的投资也可造成惯例难题。在初始对设备投资$150,000后，印渍和筛选SMM的估计成本小于每阵列$20。关于SMM筛选，许多研究环境通过目的在于研究基因组学的微阵列工具可以使用必要的所有试剂和设备。

本文中所述的方案包括使用若干种有机溶剂和物质，其需要使用适当安全设备，例如安全玻璃或手套，和适当通风的通风橱。对选定试剂规定来自物质安全数据表(materialsafety data sheet；MSDS)的注意。所有反应和洗涤都是在通风橱中进行。关于适当有机实验室技术的更多指导，请参照参考文献17。设备和软件是以实例形式提供。可使用替代性设备和软件。可在装备有适当封闭且通风的微阵列点样器以及邻近通风橱的微阵列工具中预备微阵列。可用任何标准微阵列工具筛选并扫描小分子微阵列。在表1中，我们已提出印渍若干种市售染料和小分子(包括免疫抑制剂天然产物和蛋白质FKBP12的已知配体)作为测试实例。将本发明的方案应用到这些配体-蛋白质对上将有助于理解本文中所述的程序。

本文中所述的SMM印渍和筛选方法为用于发现新颖蛋白质-配体相互作用的便携式、稳固、平行平台的构建提供蓝图。对靶向酵母转录因子的小分子的先前发现暗示未来应用于介导疾病表型(例如致瘤性转化)的基因调节元件将使得能够鉴别工具化合物并引导未来医药发展。载片表面与细胞溶解液的相容性创造另一个机会来仿形细胞状态或复杂混合物(例如血清免疫球蛋白)。

材料

试剂

柯宁(Corning)GAPS II涂布载玻片(飞世尔公司(Fisher)07-200-006)

Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(NeoMPS，FA03202)。这个方案已成功地使用不同长度的聚乙二醇间隔基(n＝2-10个乙二醇单元)。较长长度(n>30)的间隔基提供较低荧光强度值和不一致点形态。

六氟磷酸(苯并***-1-基氧基)三吡咯烷基鏻，

(美国诺维生物化学公司(Novabiochem)，01-62-0016)

哌啶，经再蒸馏(西格玛公司(Sigma)-阿德里奇公司(Aldrich)，411027)

1，6-己二异氰酸酯(阿德里奇公司(Aldrich)，D124702)

吡啶(阿德里奇公司(Aldrich)，270970)

乙二醇(比利时艾可斯有机物公司(Acros Organics)，295530010)

N，N-二甲基甲酰胺，DMF(飞世尔化学品公司(Fisher Chemical)，D131-4)

N，N-二异丙基乙基胺，DIPEA(西格玛公司(Sigma)-阿德里奇公司(Aldrich)，550043)

二甲亚砜(比利时艾可斯有机物公司(Acros Organics)，414880010)

乙腈(飞世尔化学品公司(Fisher Chemical)，A998-4)

四氢呋喃，THF，经稳定(比利时艾可斯有机物公司(Acros Organics)，164240025)

德克萨斯红(Texas Red)

尸胺(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，T-2425)

俄勒冈绿(Oregon Green)

488尸胺(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，O-10465)

阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647尸胺(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，A-30679)

雷帕霉素(LC实验室(LC Laboratories)，R-5000)

FK506(LC实验室(LC Laboratories)，F-4900)

API497是如参考文献18中所述进行制备

FKBP12-6xHis是如参考文献8中所述进行制备

阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647结合物抗5xHis抗体(德国快而精公司(Qiagen)，35370)

Cy5单反应性抗体标记染料包(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，PA25001)

293T细胞(ATCC，CRL-11268)

脂质体转染胺(Lipofectamine)2000转染试剂(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，11668-019))

OptiMEM无低血清组份培养基(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，11058)

Flag-FKBP12哺乳动物过度表达构筑体，如参考文献15中所述

Anti-FLAG

 M5单克隆小鼠抗体(西格玛公司(Sigma)，F4042)

抗小鼠山羊第二抗体，阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647结合物(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，A-21237)

抗兔山羊第二抗体，阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647结合物(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，A-21246)

生物素(西格玛公司(Sigma)，B4501)

生物素-PEG胺(西格玛公司(Sigma)，B9931)

生物素尸胺(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，A-1594)

链霉亲和素(Streptavidin)，阿历克萨氟(Alexa Fluor)

647结合物(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，S-32357)

地高辛(西格玛公司(Sigma)，D6003)

抗地高辛小鼠单克隆抗体，克隆DI-22，腹水(西格玛公司(Sigma)，D8156)

皮质酮(富路卡(Fluka)，27840)

抗皮质酮兔抗体，全抗血清(西格玛公司(Sigma)，C8784)

蛋白酶抑制剂混合液片剂(罗氏公司(Roche)，11836170001)

Tris缓冲盐水(TBS，0.025M Tris-HCl、0.137M NaCl、0.003M KCl(pH7.4))

具有Tween-20的Tris缓冲盐水(TBST，0.025M Tris-HCl、0.137M NaCl、0.003MKCl(pH7.4)、0.01％(v/v)Tween-20)

磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.012M NaH₂PO₄、0.137M NaCl、0.003M KCl(pH7.4))

具有Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST，0.012M NaH₂PO₄、0.137M NaCl、0.003M KCl(pH7.4)、0.01％(v/v)Tween-20)

MIPP溶解和培养缓冲液(0.02M NaH₂PO₄、0.001M Na₃VO₄、0.005M NaF、0.025Mβ-甘油磷酸盐、0.002M EGTA、0.001M DTT、0.5％(v/v)Triton X-100(pH7.2))。使用RIPA溶解和萃取缓冲液(0.025M Tris-HCl、0.15M NaCl、1％(v/v)NP-40、1％(v/v)脱氧胆酸钠、0.1％(v/v)SDS(pH7.6))使得在载片表面上形成自发荧光膜，其显著降低分析中的信躁比且应加以避免。

设备

欧尼格雷德(OmniGrid)100微阵列点样器(基因组解决方案公司(GenomicSolutions))

946打印头(特里克姆国际公司(Telechem International)，946PH48)

946微点样针(特里克姆国际公司(Telechem International)，946MP3)

384孔聚丙烯天然微阵列板，圆柱状孔(阿博金公司(Abgene)，AB-1055)

可热剥离板封条(美国速度11公司(Velocity11)，06643001)

干燥器干燥存储箱，丙烯酸树脂(VWR，24987-053)

具有微板载体的台式离心机

低粒子丁腈手套(VWR，40101-222)(使用一些粉末状手套可在微阵列上产生自发荧光残余物。)

吸水纸(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，11-998)

不锈钢50载片支架(美国惠顿科技公司(Wheaton Scientific)，900404)

具有不锈钢盖的大玻璃槽，500mL(雷蒙A兰姆公司(Raymond A Lamb)，E102-6)

具有o环末端的三通玻璃真空阀(阿德里奇公司(Aldrich)，Z271330)

曲金(Tygon)R-3603真空管

玻璃真空干燥器(阿德里奇公司(Aldrich)，Z114340)

4孔矩形聚苯乙烯盘(丹麦努克公司(Nunc)，267061)

正方形皮氏培养皿(petri dish)，100×100×15mm(丹麦努克公司(Nunc)，4021)

帕拉封口膜(Parafilm)M(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，13-374-10)

海布斯利普(Hybrislip)^TM杂交盖，60×22mm(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，H-18202)

艾本多夫(Eppendorf)管

轨道平台振荡器(VWR，82004-958)

用于微阵列干燥的2载片离心机(苏尼佳医药公司(Sunergia Medical)，MSC-T)

基恩匹克斯(Genepix)4200A 4激光载片扫描仪(美国分子装置公司(MolecularDevices))

基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)软件(美国分子装置公司(Molecular Devices))

试剂准备：

小分子：提出将含有异氰酸酯反应性官能团的若干种小分子作为测试分子来评估所述方法(表1)。

表1.用于测试方案的荧光染料和提出的蛋白质-小分子对

nd＝未测定

关于化合物的定购信息提供于试剂部分中。应如步骤1中所述用DMSO稀释小分子来制备用于印渍的10mM储备溶液。

蛋白质：可用已知蛋白质或抗体配合物来检测提出的测试分子(表1)。可如步骤21(方法A)和步骤22(方法A)中所述使用市售链霉亲和素-荧光染料结合物来检测印渍生物素衍生物。可如步骤21(方法A)和步骤22(方法B)中所述依次使用抗所述化合物的市售抗体和经标记第二抗体来检测皮质酮和地高辛。可如步骤21(方法A)和步骤22(方法B)中所述通过与抗原决定基标记的FKBP12和针对抗原决定基标记的经标记抗体培养来检测AP1497、FK506和雷帕霉素。最后，使用第一抗体和经标记第二抗体、使用来自细胞溶解液的抗原决定基标记的FKBP12来检测这种相互作用的方案描述于步骤24-29中。所提出的用于各测试情况的筛选浓度和抗体稀释度提供于表1中。例如TBST或PBST等标准缓冲液可用于所有实验。

设备准备

专用微阵列点样器洗涤台。标准欧尼格雷德(OmniGrid)100装置包括用于水性洗涤印渍针的超声波仪。对于小分子微阵列来说，使用例如乙腈等有机溶剂洗出针中的化合物。超声波处理台已经被搅拌板和含有乙腈的重结晶盘代替。在每次洗涤步骤期间，将印渍头浸入搅拌乙腈盘中5秒，接着在真空干燥台上3秒。对于各针浸渍来说，将洗涤干燥循环重复三次以最小化样品的滞留。确保搅拌棒不产生深旋涡以使得针不与溶剂接触。不时监控溶剂量以确保针经有效洗涤。

典型基恩匹克斯(Genepix)扫描仪设定。像素大小：10μm；每个激光器的PMT电压：635nm激发(ex.)(红)＝500-600，594nm激发(黄)＝600，532nm激发(绿)＝500-550，488nm激发(蓝)＝400-500。

程序

制备用于印渍的小分子储备溶液

1.将所关注小分子溶解于DMSO中。通常，印渍储备液浓度在1mM到10mM之间。DMF为用于制备储备溶液的适合替代性溶剂。将储备溶液存储在-20℃下。

2.将5μL各储备溶液转移到384孔聚丙烯微阵列板的个别孔中。对于大的样品数目来说，希望使用液体转移机器人。将密封原料板存储在-20℃下且经历长达10个冷冻-解冻周期，随后进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析来监控化合物储备液的稳定性。可接受的冷冻-解冻周期数通常视印渍的小分子的性质而定。一组典型印渍原料板在12个冷冻-解冻周期后报废。

制备异氰酸酯涂布的显微镜载玻片

3.将一百个氨基官能化GAPS II载片(柯宁(Corning))置于两个不锈钢50载片支架上。将各支架浸没于含有新鲜PEG溶液(1L DMF中的Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(1mM)、PyBOP(2mM)和DIPEA(0.5mM))中的大玻璃槽中。溶液应完全覆盖载片。在室温下在通风橱中在搅拌下将载片在PEG溶液中培养至少4小时。培养通常进行整夜。

4.从PEG溶液中移出支架，并使其滴水，随后用DMF简单冲洗。将支架再次滴干，且将其置于在1L DMF中含有1％(v/v)哌啶的清洁槽中以从表面上去除Fmoc基团。脱保护反应在室温下10分钟后完成。可将载片置于脱保护溶液中整夜。

5.从哌啶溶液中移去支架，滴干，且在搅拌下用DMF洗涤一分钟。为将异氰酸酯基安置于载片表面上，将脱保护载片置于在DMF中含有1％(v/v)1，6-己二异氰酸酯的槽中。在室温下在搅拌下将完全浸没的载片在此溶液中培养30分钟。

6.在搅拌下将经活化载片浸渍于DMF中并洗涤3分钟。用新鲜DMF重复。在搅拌下将载片浸渍于THF中并洗涤2分钟。这种洗涤次序可有效地从载片上去除过量异氰酸酯试剂且将提供清洁并干燥的载片。通常在印渍之前将载片干燥，以使得过量溶剂和试剂不会暴露于微阵列点样器平台中。可在最后THF冲洗后在和缓空气流下将载片干燥一分钟或两分钟。否则，仅使THF蒸发数分钟。

印渍小分子微阵列

7.从冷冻器中去除化合物原料板且使其在干燥器干燥存储箱中解冻。

8.将经干燥且活化的载片小心地置于微阵列点样器平台上。确保载片全部处于相对于条形码贴纸的共同方向中。

9.将清洁的打印针小心地装载入打印头中，避免接触针尖。

10.使用欧尼格雷德(OmniGrid)100软件来设计印渍构型。由DMSO进行印渍通常提供点直径为约150μm的特征。使用300μm的中心-中心间隔轻松地允许使用48个针在15×15子阵列中印渍10,800个特征。

11.使用基恩瓦克(Genevac)HT-24或具有微板转接器(microplate adapter)的标准台式离心机将所有化合物原料板以400g离心1分钟。应将板离心以确保所有储备溶液存在于孔的底部。

12.将清洁的玻璃印迹衬垫***三个微板位置的一个中。将前两个化合物原料板***其余微板固持器中。确保所有原料板以相对于孔A01的适当方向置于微板固持器上以避免实际印渍次序与理论印渍次序或GAL文件之间的不一致。

13.以所需阵列形式印渍化合物。对于每次样品获取来说，指示阵列点样器以400μm中心-中心间隔在印迹衬垫上预点涂30个特征。在印渍每两个板之后用吸水纸和甲醇来清洁印迹衬垫。在经活化载片上点涂之前在印迹衬垫上印渍溶液可避免过量溶液在印渍操作的前几个载片上产生大点。

14.在印渍操作完成后，将载片留在微阵列点样器平台上至少10分钟以使得印渍样品干燥。

15.将印渍载片移到不锈钢载片支架中。将支架置于通风的化学通风橱中通过曲金(Tygon)管与3通玻璃阀连接的真空干燥器中。主要出口应通过管指向干燥器，其中一个阀也通过管指向真空管线。另一个(关闭)阀应通过管指向具有2mL无水吡啶的烧瓶。抽空含有载片的干燥器。将载片在真空下保持5分钟以辅助去除任何过量印渍溶剂。关闭真空管线并打开通向含有吡啶的***阀。随后使干燥器中的印渍载片暴露于吡啶蒸气中至少2小时。吡啶催化对异氰酸酯反应性较小的官能团的共价连接。最终，关闭吡啶管线并将干燥器抽空以干燥载片。在整夜培养期间通常将载片暴露于吡啶蒸气中。

16.从干燥器中移出支架且在搅拌下将经干燥载片浸没在5％(v/v)乙二醇和0.1％(v/v)吡啶于DMF中的溶液中达30分钟以使异氰酸酯表面中止反应。

17.在乙二醇中止反应后，用DMF冲洗载片。在搅拌下用DMF将载片洗涤1小时，接着用THF进行两次简单洗涤(每次3分钟)。通过离心干燥载片。

18.将经干燥载片包装于用帕拉封口膜(parafilm)密封的5载片盒中。微阵列可在-20℃下存储长达6个月。所述阵列可在4℃下保持若干天。

质量控制：检测已知蛋白质-小分子相互作用

19.预扫描以观察已知荧光团(列于表1中)并鉴别自发荧光化合物。

20.在已在4℃下保持冷却的TBST缓冲液中制备用于检测已知印渍配体(列于表1中)的蛋白质或抗体溶液。通常在0.1μg mL^-1到5.0μg mL^-1的范围内筛选纯化蛋白和抗体。使用对所关注蛋白适当的缓冲液为重要的。缓冲液应含有活性或稳定性所需的特异性辅因子或试剂。最好避免自发荧光添加剂。通常使用TBST和PBST且其是以实例形式提供。

21.在4℃下用微阵列将经稀释蛋白质培养1小时。将两种培养方法描述于下。当蛋白质并非有限供应或如果需要搅拌时，使用方法A(使用相同的可遵循的抗体培养方案)。廉价的方法B是用于最小化结合分析中所用的蛋白质的量。这种方法用作盖玻片的替代方法，其提供不一致的结果和围绕盖玻片边缘的高背景面积：

A)盘式法

(i)将微阵列印渍面朝上置于4孔矩形盘的孔中，

(ii)将3mL蛋白质溶液轻轻地吸移到载片条形码贴纸上并使溶液展开以覆盖载片的表面。或者，可将三个载片印渍面朝上置于正方形皮氏培养皿中。

(iii)用盖子将盘盖住并置于摆动平台上以使得轻轻搅拌载片表面上的溶液。或者，将6mL蛋白质溶液轻轻地吸移到盘中并搅拌。

B)帕拉封口膜(Parafilm)法

(i)切割一条帕拉封口膜(Parafilm)并置于冷藏室中的光滑且平坦的表面(例如清洁实验台)上或冷却的平坦表面上以转移到实验室冰箱或冷藏室中。

(ii)将300μL蛋白质溶液吸移到帕拉封口膜(Parafilm)上。

(iii)将微阵列印渍面朝下小心地置于滴剂上以使得蛋白质溶液展开以覆盖整个载片。避免在载片的印渍表面与帕拉封口膜(Parafilm)之间引入气泡。

22.小心地从微阵列中去除蛋白质溶液。使用冷却的TBST缓冲液(4℃)简单地冲洗来自载片的过量蛋白质溶液。对于使用直接标记荧光蛋白质的分析，遵循方法A。对于涉及用经标记抗体进行检测的分析，遵循方法B。

A)荧光染料标记蛋白的直接检测

对于经荧光部分(例如，阿历克萨(Alexa)647、荧光素、GFP等)直接标记的蛋白质来说，在平台振荡器或摇移器上在搅拌下用3mL缓冲液将各载片洗涤2分钟。重复两次。用冷却的TBS缓冲液(4℃)洗涤一次达1分钟且转到步骤23。

B)基于抗体的检测

当使用基于荧光染料标记抗体的检测(例如，抗His、抗GST、抗FLAG等)时，立即将所关注的稀释抗体施用于TBST或另一适合缓冲液中且将载片在4℃下置放1小时。小心地从微阵列中去除荧光染料标记抗体溶液。使用冷却的TBST缓冲液简单地冲洗来自载片的过量蛋白质溶液。在搅拌下用3mL缓冲液洗涤载片达2分钟。重复两次。用冷却的TBS缓冲液洗涤一次达2分钟。

23.使用载片离心机通过离心来干燥载片。探测微阵列即将用于分析。理想地在用蛋白质探测后立即扫描载片。可将经干燥载片存储在室温下黑暗中长达两天，随后在荧光信号无显著衰退的情况下进行扫描。

使用细胞溶解液的蛋白质结合筛选

24.用编码所关注抗原决定基标记蛋白质的哺乳动物过度表达构筑体转染HEK-293T细胞。将细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，预计每个SMM培养将需要一个孔。根据所提供的技术方案，用最易购得的脂质转染试剂在此细胞系中已达到可靠的高水平的表达。通常在转染后48-72小时之间收集细胞，此时经EGFP载体转染的孔达到稳定的高程度的表达。可通过免疫印迹法(immunoblot)来证实蛋白质表达及检测。如果可行，那么可在适当生物化学分析中评估免疫沉淀蛋白质的活性。

25.收集细胞以进行存储或溶解。将粘着细胞在6孔板中用冷却PBS洗涤两次，再悬浮于每孔500μL冷却PBS中并转移到经标记艾本多夫(Eppendorf)管中。通过简单离心将细胞粒化且丢弃上清液。通常将粒化细胞速冻在液氮中并存储在-80℃下直到使用时为止。

26.制备细胞溶解液以用小分子阵列培养。将细胞小球在湿冰上解冻并迅速且轻轻地再悬浮于补充有蛋白酶抑制剂和新鲜DTT的MIPP溶解缓冲液(每个源孔300μL体积)中。在冰上培养15分钟。随后通过在4℃下以14,000g离心10分钟来净化溶解液。在离心后立即将上清液倾析到新的冷却艾本多夫(Eppendorf)管中。进行蛋白质量化分析且用溶解缓冲液调节以达到0.3μgmL^-1。已确定MIPP溶解缓冲液以最小化如上文所制备的阵列的自发荧光。TGN和RIPA溶解缓冲液在受控实验中会干扰信躁比。

27.使用步骤21中所述的方法在4℃下用溶解液将SMM培养1小时。在轻轻旋转下用冷却PBST洗涤1分钟，重复三次。

28.在4℃下立即用第一抗体将SMM培养1小时。对于针对抗原决定基的抗体(例如抗FLAG或抗His)来说，推荐用补充有0.1％ BSA的PBST进行1:1000稀释。在轻轻旋转下用冷却PBST(4℃)洗涤3分钟，重复三次。

29.在4℃下立即用第二抗体将SMM培养1小时。1:1000稀释适于大多数商业荧光染料标记抗体溶液。在轻轻旋转下用冷却PBST洗涤3分钟，重复三次。用蒸馏水简单冲洗且通过离心将载片干燥1分钟。探测载片即将用于分析。

数据分析

30.使用基恩匹克斯(Genepix)4200A载片扫描仪使用推荐的设定扫描载片。

31.比对相应GAL文件，使用基恩匹克斯普拉6.0(Genepix Pro 6.0)软件将各扫描图象的微阵列位置翻译为微板位置。使用印渍荧光染料标记物来辅助比对各子阵列。适当将各GAL文件特征的尺寸恢复到实际印渍微阵列特征的直径且产生各微阵列的基恩匹克斯(Genepix)结果(GPR)文件。

32.分析结果文件以评估a)是否存在荧光染料标记物，b)是否存在已知配体，c)是否有标记物化合物转移到下个样品而导致相邻特征受到污染，d)在实验波长下哪种化合物自发荧光，以及e)是否存在与施用于微阵列的蛋白质或抗体结合的新颖小分子。

33.根据与在各SMM上仅含有溶剂的特征所限定的模拟物处理分布的偏差，对来自三次重复实验数据的分析阳性物进行评价。在基恩匹克斯(Genepix)软件中基于每点关于背景信号来调节荧光强度，且在分析中主要使用此度量标准。

34.随后将分析阳性物与适当时从对照实验中收集到的三次重复实验数据进行比较。因为此平台能够检测小分子与免疫球蛋白之间的相互作用，所以与仅缓冲液或对照溶解液实验进行比较，接着进行抗体培养为必要的。

结果

这个方案中概述的各实验步骤的性能、产率和再现性已经最优化以供众多有兴趣的研究人员制造用于筛选的阵列。通常，研究人员可预计在显微镜载玻片上以微阵列形式成功固定接近11,000种不同化合物。为达到此结果，我们推荐用荧光配体作为印渍过程对照物的“研发分析”筛选和已知高亲和性配体来证实筛选范围中的平台。

筛选重组和转染蛋白的最优化方案已如所述经证实可靠且稳固。然而关于新蛋白质的测试，适当蛋白质折叠和溶解缓冲液的稳定性和用于检测的抗原决定基和抗体的选择的影响相当大。为说明由筛选小分子微阵列预期产生的结果，我们在图12中呈示由来自表达Flag-FKBP12的HEK-293T细胞的澄清细胞溶解液进行筛选产生的数据。在这个实验中，使用如上所述的第一抗体和第二抗体检测流程。在532nm和635nm下对阵列进行荧光扫描，在此合并图象中分别为假色绿和红。分析阳性物表现为红色。这些数据说明通过伯胺印渍的小分子配体AP1497(图12a)和通过仲醇印渍的天然产物雷帕霉素(图12b)的预期检测。描述关于仅含有溶剂的孔的局部背景作修正的635nm荧光强度分布的柱状图呈示于图12c中，其说明这个实验的低噪音。描述来自阵列上印渍小分子的相同测量的柱状图呈示于图12d中。这个图说明来自非活性化合物和溶剂的信号的预期、相当、低强度分布。另外，如用箭头突出的数据说明，AP1497衍生物和雷帕霉素通过此分析表现为不同的分析阳性物。

总之，这个方案详述以微阵列形式印渍不同小分子且筛选纯化蛋白与复杂混合物的最优化策略。使用这个平台，我们已检测出由表面等离子体共振所证实具有一定范围的亲和性(2nM到50μM)的用于蛋白质标靶的小分子结合剂。

其它实施例

所属领域的一般技术人员将易于了解到前述仅表示本发明的某些优选实施例。可在不偏离如以下权利要求书中提出的本发明的精神或范围的情况下，对上述程序和组合物作出各种改变和更改。

Claims (51)

1.一种阵列，其包含：

通过异氰酸酯衍生连接基团或异硫氰酸酯衍生连接基团与固态载体连接的多个一种以上类型的化合物，其中所述化合物阵列的密度包含至少100点/平方厘米。

2.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含小分子阵列。

3.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含非寡聚物化合物阵列。

4.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含非肽且非寡聚物化合物阵列。

5.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含分子量小于2000g/mol的化合物阵列。

6.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含其中化合物不是聚核苷酸、肽或蛋白质的化合物阵列。

7.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物阵列包含，其中化合物是来自细胞溶解液的生物分子的化合物阵列。

8.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物包括选自由伯醇、仲醇、苯酚、硫醇、苯胺、异羟肟酸、伯酰胺、脂肪族胺和磺酰胺组成的群组的连接官能团。

9.根据权利要求1所述的阵列，其中所述化合物包括选自由伯醇、仲醇、苯酚、羧酸、异羟肟酸、硫醇和胺组成的群组的连接官能团。

10.根据权利要求1所述的阵列，其中所述连接的特征在于所得键足够稳固以使得所述化合物(1)在随后操作步骤期间不会意外地断裂且(2)呈惰性以使得所用官能团不会干扰随后操作步骤。

11.根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列中的所述化合物各自通过由亲核试剂与异氰酸酯或异硫氰酸酯部分加成产生的键与所述固态载体连接。

12.根据权利要求11所述的阵列，其中所述加成是由蒸气催化。

13.根据权利要求11所述的阵列，其中所述加成是由亲核试剂催化。

14.根据权利要求12所述的阵列，其中所述蒸气为吡啶。

15.根据权利要求12所述的阵列，其中所述蒸气为挥发性杂环胺。

16.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述载体连接的所述异氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团；

X为N、S或O；且

R为与所述固态载体连接的所述化合物。

17.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述载体连接的所述异硫氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团；

X为N、S或O；且

R为与所述固态载体连接的所述化合物。

18.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述载体连接的所述异氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为O、S或N；且

R为所连接化合物。

19.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述载体连接的所述异氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团；

n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

X为N、S或O；且

R为与所述固态载体连接的所述化合物。

20.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述载体连接的所述异氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

n每次出现时独立地为介于1与20之间且包括1与20的整数；

m为介于1与20之间且包括1与20的整数；

X为N、S或O；且

R为与所述固态载体连接的所述化合物。

21.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与载玻片连接的所述异硫氰酸酯衍生连接基团具有下式：

载体

其中：

X为O、S或N；且

R为所连接化合物。

22.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述固态载体连接的所述连接基团显示于下：

载体

其中n为介于1与12之间且包括1与12的整数；

m为介于1与200之间且包括1与200的整数；

X为O、S或N；且

R为所连接化合物。

23.根据权利要求1所述的阵列，其中将化合物与所述固态载体连接的所述连接基团具有下式：

载体

其中n为介于1与200之间且包括1与200的整数；且

R为所连接化合物。

24.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为玻璃。

25.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为衍生玻璃。

26.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为甲硅烷化玻璃。

27.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为γ-氨基丙基甲硅烷化玻璃。

28.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为聚合物。

29.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为金属。

30.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为金属涂布表面。

31.根据权利要求1所述的阵列，其中所述固态载体为金涂布表面。

32.根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列的密度为至少1000点/平方厘米。

33.根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列的密度为至少2500点/平方厘米。

34.根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列的密度为至少5000点/平方厘米。

35.一种阵列，其包含：

通过异氰酸酯衍生连接基团或异硫氰酸酯衍生连接基团与固态载体连接的多个一种或一种以上类型的化合物，其中所述化合物阵列的密度包含至少100点/平方厘米。

36.一种形成化合物阵列的方法，所述方法包含以下步骤：

提供固态载体，其中所述固态载体经能够与一种以上类型的化合物相互作用以形成共价连接的弱亲电子性部分官能化；

提供待与所述固态载体连接的一种以上类型的化合物的一种或一种以上溶液；

将所述一种以上类型的化合物的所述一种或一种以上溶液传递到所述固态载体上，由此使所述化合物各自通过共价相互作用与所述固态载体连接，且由此所述化合物阵列具有至少100点/平方厘米的密度；以及

使所述固态载体在足以催化所述化合物与所述载体的共价连接的条件下暴露于呈蒸气形式的碱中。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述弱亲电子性部分为异氰酸酯部分。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述弱亲电子性部分为异硫氰酸酯部分。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述碱为吡啶。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述足以催化所述化合物与所述载体的共价连接的条件包含在无水环境中进行所述连接。

41.根据权利要求36所述的方法，其中所述足以催化所述化合物与所述载体的共价连接的条件包含在惰性气氛中进行所述连接。

42.根据权利要求36所述的方法，其中所述惰性气氛为氩气或氮气气氛。

43.一种鉴别所关注生物大分子的小分子配合物的方法，其包含以下步骤：

提供根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列包含通过异氰酸酯衍生连接基团或异硫氰酸酯衍生连接基团与载体连接的小分子的阵列，且其中所述小分子阵列具有至少100点/平方厘米的密度；

使所述阵列与一种或一种以上类型的所关注生物大分子接触；以及

测定特异性小分子-生物大分子配合物的结合。

44.一种鉴别基因产物的小分子配合物的方法，其包含：

提供根据权利要求1所述的阵列，其中所述阵列包含通过异氰酸酯衍生连接基团或异硫氰酸酯衍生连接基团与载体连接的小分子的阵列，且其中所述小分子阵列具有至少100点/平方厘米的密度；

使所述阵列与生物分子文库接触；以及

测定特异性重组蛋白与小分子配合物的结合。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物分子文库为蛋白质文库。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物分子文库为重组蛋白文库。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物分子文库为细胞溶解液。

48.一种固态载体，其包含经异氰酸酯部分衍生的固态载体。

49.根据权利要求48所述的固态载体，其中所述异氰酸酯部分具有下式：

载体

其中L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团。

50.一种固态载体，其包含经异硫氰酸酯部分衍生的固态载体。

51.根据权利要求50所述的固态载体，其中所述异硫氰酸酯部分具有下式：

载体

其中L为经取代或未经取代、分枝或未分枝、环状或非环状脂肪族或杂脂肪族连接基团。

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