CN101374940A - 包含表达低γ-消除活性的酶的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物,其中表达具有一种或几种下述活性的酶:胱硫醚-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶,并且所述酶同时具有低-消除活性。本发明还涉及具有一种或几种下述活性的重组酶:胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶,所述重组酶同时具有低γ-消除酶活性,并用于发酵生产氨基酸、尤其是甲硫氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物,其中表达具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、并且同时具有低γ-消除活性的酶。本发明还涉及具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、同时具有低γ-消除酶活性的重组酶,其被应用于氨基酸尤其是甲硫氨酸的发酵生产。
背景技术
含硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢至关重要,并被工业化生产以用作食品或饲料添加剂以及药物。尤其是甲硫氨酸这种不能被动物合成的必需氨基酸,在许多机体功能中扮演了重要角色。除了它在蛋白质生物合成中的作用以外,甲硫氨酸也参与转甲基作用以及硒和锌的生物利用。甲硫氨酸也被直接用于治疗医学病症,如过敏和风湿热。然而,生产的大多数甲硫氨酸都被添加到动物饲料中。
在化学上,D,L-甲硫氨酸一般从丙烯醛、甲硫醇和氰化氢制得。但是,外消旋的混合物不如纯的L-甲硫氨酸效果好,比如在鸡饲料添加剂中(Saunderson,C.L.,(1985)British Journal of Nutrition 54,621-633)。纯的L-甲硫氨酸可以利用外消旋甲硫氨酸通过例如酰基转移酶处理N-乙酰基-D,L-甲硫氨酸而制备,该处理大大增加了生产成本。对纯L-甲硫氨酸的需求的增长以及对环境的考虑导致微生物生产甲硫氨酸变得极具吸引力。
只有微生物和植物能够进行甲硫氨酸生物合成。在许多微生物和植物中的L-甲硫氨酸合成途径已经很清楚了(图1)。大肠杆菌(Escherichia coli)中的甲硫氨酸来源于氨基酸天冬氨酸,但是它的合成需要两条另外的途径即半胱氨酸生物合成和C1代谢(N-甲基四氢叶酸)集中参与。天冬氨酸通过一系列三个反应被转变成高丝氨酸。高丝氨酸随后能够进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在大肠杆菌中,进入甲硫氨酸途径中需要将高丝氨酸酰化成琥珀酰-高丝氨酸。该活化步骤使得随后与半胱氨酸发生缩合,生成含硫醚的胱硫醚,其被水解产生高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最终甲基转移则通过B12依赖性或者B12非依赖性甲基转移酶来实现。
大肠杆菌(Ecoli)中甲硫氨酸的生物合成受甲硫氨酸生物合成基因经由MetJ和MetR蛋白的抑制和活化而调节。除了这种转录调节外,进入甲硫氨酸特异途径受到编码高丝氨酸转琥珀酰基酶(EC 2.3.1.46)的metA严格调控。metA除了受MetJ和MetR的转录调控外,该酶也被该途径的主要终产物甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸所反馈调控(Lee,L.-W et al.(1996)Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequentialmetabolites,JBC 241(22),5479-5780)。这两种产物介导的反馈抑制是协同的,即低浓度的每种代谢物单独作用只有轻微的抑制性,而联合起来则具有强烈的抑制作用。
在大肠杆菌中高丝氨酸被活化成琥珀酰-高丝氨酸,其随后被胱硫醚-γ-合酶转变为γ-胱硫醚,而***和螺旋体则活化高丝氨酸成为乙酰基-高丝氨酸,并能够利用乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶通过转化乙酰基-高丝氨酸而将H2S的硫直接掺入高半胱氨酸中,所述乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶在革兰氏阳性菌中被称为MetY,在螺旋体中被称为MetZ。
与真细菌中甲硫氨酸生物合成相比,植物中甲硫氨酸和苏氨酸/异亮氨酸生物合成的分支点位于磷酸高丝氨酸的层次。高丝氨酸被磷酸化生成磷酸高丝氨酸,其可以被苏氨酸合酶催化生成苏氨酸,或者利用具有胱硫醚-γ-合酶和磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的植物酶METB反应生成γ-胱硫醚和/或高半胱氨酸。最近的数据表明,有类似的途径在古生菌(archaea)中起作用(White,2003,The biosynthesis of cysteine and homocysteine inMethanococcus jannaschii,Biochim Biophys Acta.1624(1-3):46-53),但是相应的酶还没有被鉴定出来。因此,在植物中以及很可能在一些古生菌中,负责甲硫氨酸生产的步骤存在于从磷酸高丝氨酸合成γ-胱硫醚中。在植物中,甲硫氨酸生物合成通过两种关键酶的活性被调控,即胱硫醚-γ-合酶(CGS)和苏氨酸合成酶(TS)。CGS经由在该细菌酶中尚未发现的N-末端调节区而受到转录后调控(Hacham et al.2002 Plant Physiol.128,454-462)。TS被S-腺苷甲硫氨酸反馈激活,S-腺苷甲硫氨酸是一种发送高甲硫氨酸浓度信号的甲硫氨酸衍生物。这两种调节机制都将碳流从甲硫氨酸转向苏氨酸,但是在原核生物中没有此功能。
不同的胱硫醚-γ-合酶的表达已经在专利申请WO 93/17112(Genencor)中有教导。在那时还缺乏对于胱硫醚-γ-合酶的确切了解,而且其在植物中的序列也是未知的。专利申请JP2000-139471(Ajinomoto)描述了大肠杆菌胱硫醚-γ-合酶的过表达,然而还未针对使用不同生物来源的胱硫醚-γ-合酶用于任何生物中生产甲硫氨酸进行评估。
MetB酶及其对应物MetY/MetZ能接受多种不同的底物,它们列于表1中。这些酶能够催化四种不同的反应,所有反应都需要活化的高丝氨酸。活化的高丝氨酸可以是磷酸-高丝氨酸、乙酰基高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸。(i)与半胱氨酸胱硫醚-γ-合酶一起生产胱硫醚,(ii)与硫化氢硫化氢解酶一起合成高半胱氨酸,(iii)与甲基硫醇甲硫氨酸合酶一起生产甲硫氨酸以及(iiii)在缺少第二底物时γ-消除酶催化该底物解离成α-酮基丁酸、氨和活化基团(乙酸盐(酯),琥珀酸盐(酯),磷酸盐(酯))。有些酶能催化多于一种反应,但是催化效率有所不同。例如,大肠杆菌MetB在底物为半胱氨酸和琥珀酰-高丝氨酸时具有最高的催化效率,而且在缺乏半胱氨酸时具有相对较高的γ-消除酶活性(Aitken et al.2003,Biochemistry 42,11297-11306)。植物酶也能同样好地生产胱硫醚,但是具有较低的γ-消除酶活性。实际上,拟南芥(A.thaliana)METB的γ-消除酶活性的kcat只有所述大肠杆菌酶的1/1500。(Ravanel et al.1998 Biochem.J.331,639-648)。一些具有低γ-消除活性的酶被导入大肠杆菌时应该有利于高产量生产甲硫氨酸。
底物 | 胱硫醚-γ-合酶 | 硫化氢解酶 | 甲硫氨酸合酶 | γ-消除酶 |
磷酸高丝氨酸 | 植物METB古生菌绿屈挠菌(Chloroflexus) | 植物 | 植物METB | |
O-乙酰基-高丝氨酸 | 芽孢杆菌metZ | 棒杆菌met Y螺旋体metZ酵母MET25 | ||
O-琥珀酰-高丝氨酸 | 埃希氏菌metB黄单孢菌metB | α-变形菌metZ | 埃希氏菌metB | 埃希氏菌metB |
表1.不同生物来源的具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的优选底物。
对于来自不同物种或组的酶标出了活化高丝氨酸以及偏好反应的类型。详见(Hacham et al.2003,Mol.Biol.Evol.20:1513-1520)
发明内容
本发明基于下述发现,即在具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并且具有低γ-消除活性的酶表达时甲硫氨酸的生产被增强。使用这些酶减少了能转化成异亮氨酸的α-酮基丁酸的生成,其在发酵液中累积。因此,本发明涉及包含编码下述酶的基因的DNA片段,所述酶具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性,并具有低γ-消除酶活性。本发明也涉及在甲硫氨酸生产中这些酶的表达,特别是过表达。更进一步地,本发明涉及微生物,优选肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状细菌或酵母,其中表达前面提及的酶。另外,本发明描述了一种利用具有所述特性的微生物发酵生产甲硫氨酸、其前体或者衍生物的方法。
发明详述
甲硫氨酸被用于动物营养和药物应用中。常常特定的立体异构体,在此情况下则是具有生物活性的L-型,是优选的种类。因为化学合成只能提供难于拆分的外消旋混合物,所以普遍感兴趣的是利用发酵法生产L-甲硫氨酸。因此,本发明的一个目的是利用基因工程优化菌株以及改进大量生产L-甲硫氨酸、其前体或衍生物的发酵工艺。在植物和微生物中,一些酶是发酵生产甲硫氨酸所必需的。大肠杆菌中胱硫醚-γ-合酶(SEQ ID NO 1)是参与甲硫氨酸生物合成的关键酶之一。
>E.coli|EG10582|MetB:386aa-胱硫醚-γ-合酶
MTRKQATIAV RSGLNDDEQY GCVVPPIHLS STYNFTGFNE PRAHDYSRRG
NPTRDVVQRA LAELEGGAGA VLTNTGMSAI HLVTTVFLKP GDLLVAPHDC
YGGSYRLFDS LAKRGCYRVL FVDQGDEQAL RAALAEKPKL VLVESPSNPL
LRVVDIAKIC HLAREVGAVS VVDNTFLSPA LQNPLALGAD LVLHSCTKYL
NGHSDVVAGV VIAKDPDVVT ELAWWANNIG VTGGAFDSYL LLRGLRTLVP
RMELAQRNAQ AIVKYLQTQP LVKKLYHPSL PENQGHEIAA RQQKGFGAML
SFELDGDEQT LRRFLGGLSL FTLAESLGGV ESLISHAATM THAGMAPEAR
AAAGISETLL RISTGIEDGE DLIADLENGF RAANKG
除了它的主要活性胱硫醚-γ-合酶以外,其还具有不期望的副活性,即琥珀酰-高丝氨酸γ-消除酶,其可以将琥珀酰-高丝氨酸转化为α-酮基丁酸、琥珀酸和氨。该活性在仅有低量的半胱氨酸存在下尤其明显。在大肠杆菌中,它导致甲硫氨酸生成的损失,这一问题可以通过利用与大肠杆菌酶相比具有降低γ-消除酶活性的胱硫醚-γ-合酶来避免。
因此,本发明的目的是提供一种用于发酵生产氨基酸的微生物,其中表达一种或几种具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并具有低γ-消除酶活性的酶。
依据本发明,低γ-消除酶活性优选地意指与天然大肠杆菌酶中观察到的所述活性相比更低的γ-消除酶活性。另外,期望具有降低γ-消除酶活性的所述酶具有特异性的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性。所述活性可以最终低于该天然大肠杆菌酶的活性。
所述表达的具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、且具有低γ-消除酶活性的酶优选与同一生物中存在的天然酶不同。它们可以是相同物种的突变基因,或是其它物种的天然或突变基因。
依据本发明的一个优选实施方案,所述微生物被转化以引入编码具有这种低γ-消除酶活性的酶的基因。
这样的基因可以通过本领域技术人员可用的不同方式被引入:
-通过同源重组修饰天然基因,从而在所述基因所编码的酶中引入突变,以降低γ-消除酶活性和保持所述酶活性;
-将编码已知具有低γ-消除酶活性的选定酶的外源基因整合到所述微生物的基因组中;所述外源基因处于宿主微生物中有功能的调节元件的调控之下;
-导入包含外源基因的质粒,所述外源基因在该宿主微生物中有功能的调节元件的调控下编码已知具有低γ-消除酶活性的选定酶。
当所述基因被整合到微生物的基因组中时,它可以有利地引入到选用来替换天然基因的位置。
用于转化微生物的方法在本领域是众所周知的,包括同源重组。
已知植物胱硫醚-γ-合酶具有比所述大肠杆菌酶更低的γ-消除酶活性(Ravanel et al.1998,Biochem.J 331,639-648)。然而,从未显示过在甲硫氨酸的发酵生产中使用植物酶较天然大肠杆菌酶更具优势。因此本发明涉及使用植物胱硫醚-γ-合酶以提高甲硫氨酸的发酵生产。
该植物酶使用磷酸高丝氨酸作为底物,而大肠杆菌酶则接受琥珀酰-高丝氨酸,并在某些程度上接受乙酰基-高丝氨酸。最近已显示古生菌中甲硫氨酸生物合成可能通过磷酸高丝氨酸进行。至今该酶还没有被表征。因此,本发明也涉及在甲硫氨酸的发酵生产中使用具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的古生菌酶。
发现植物胱硫醚-γ-合酶在细菌中的最接近同源物存在于光合细菌绿屈挠菌(Chloroflexus)中。将该酶与植物的酶进行比对表明,结合磷酸基团所需的氨基酸在绿屈挠菌酶中是保守的(图2)(Steegborn et al.2001 J.Mol Biol 311,789-801),这些氨基酸已经由所述大肠杆菌和植物酶的结构比较确定。
因此,表达所述绿屈挠菌基因如来源于橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)的基因>gi|53798754|ref|ZP_00020132.2|COG0626的同源物的微生物也是本发明的对象。
本发明进一步的对象是具有胱硫醚-γ-合酶/磷酸高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶,并且其在所示位置处保守下列氨基酸:107E、111Y、165K、403S(参见比对图2)从而允许使用磷酸高丝氨酸作为底物,并因此表现出降低的γ-消除活性。氨基酸位置是参照烟草(Nicotiana tabacum)的序列给出的。相同的氨基酸位置可以通过简单的序列比对、无需过度实验就可以确定(参见图2)。
作为苏氨酸生物合成途径的一部分,磷酸高丝氨酸在大肠杆菌中被生成,并因此能够直接被转化成γ-胱硫醚和/或高半胱氨酸。
与植物和肠杆菌科(enterobacteriaceae)不同的是,一些***使用依赖于将乙酰基转移至高丝氨酸上而生成乙酰基-高丝氨酸的机制来活化高丝氨酸。随后,乙酰基-高丝氨酸通过利用乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶MetY经硫化氢解作用被转化成高半胱胺酸,或者利用胱硫醚-γ-合酶被转化成γ-胱硫醚。如专利申请WO2004024933和EP1313871中所述,该反应已用于在棒状细菌(coryneform baceria)中通过发酵生产甲硫氨酸。然而,相应的基因从未在大肠杆菌中被测试过,且它们的γ-消除酶活性也未被测定。
因此,本发明也涉及在大肠杆菌中使用与所述大肠杆菌酶相比具有低γ-消除酶活性、但具有相当的或增加的硫化氢解酶活性的MetY酶。
依据本发明的另一个实施方案,天然或引入酶的γ-消除酶活性降低也能通过优化该酶而得到,例如通过Sambrook等人(1989 Molecularcloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Lab.,ColdSpring Habor,New York.)所描述的定向进化或定点诱变。也可以通过使用诱变剂如NTG或EMS进行随机诱变,或者如专利申请PCT/FR04/00354中所述通过体内进化来优化该酶。优化的酶也可以是基于天然基因且具有对宿主生物来说优化的密码子偏好及GC-含量的合成基因。因此,具有降低γ-消除酶活性或增强胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的优化酶的应用是本发明的目的。
优化酶的一个具体实例是优化的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶,尤其是大肠杆菌MetB酶,其中第337位丙氨酸被在不同细菌属的酶中高度保守的脯氨酸所替代,和/或在第335位包含丙氨酸。除非另外指出,所给位置参照天然大肠杆菌酶。
本发明进一步涉及编码如上定义的根据本发明的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的核苷酸序列、DNA或RNA序列。
胱硫醚-γ-合酶和磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶有利地选自对应于PFAM参考号PF01053以及COG参考号COG0626和COG2873的酶。
PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库;http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)形成了蛋白质序列比对的大汇集。每个PFAM使得有可能显示多重比对,观察蛋白质结构域,评估在生物中的分布,获得进入其它数据库的途径,以及显示已知蛋白质结构。
COG(蛋白质直向同源组聚簇;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表30个主要***发生系的43个完全测序基因组的蛋白质序列而获得。每个COG由至少三条***发生系确定,因此使识别古老的保守结构域成为可能。
作为适于大肠杆菌的合成基因,优选的酶是拟南芥(Arabidopsisthaliana)胱硫醚-γ-合酶(登记号gi:1389725),巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcia barkeri)的推测的胱硫醚-γ-合酶和/或硫化氢解酶(登记号gi:48839517),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶(登记号YLR303W),橙色绿屈挠菌的推测的胱硫醚-γ-合酶和/或硫化氢解酶(gi:53798753)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶(gi:41324877)。将这些序列与以下代表序列进行比对:
>gi|8439541|gb|AAF74981.1|AF082891_1胱硫醚γ-合酶同工型1[马铃薯(Solanumtuberosum)]
>gi|4959932|gb|AAD34548.1|AF141602_1胱硫醚-γ-合酶前体[大豆(Glycine max)]
>gi|2198853|gb|AAB61348.1|胱硫醚γ-合酶[玉米(Zea mays)]
>gi|4322948|gb|AAD16143.1|胱硫醚γ-合酶前体[烟草(Nicitiana tabacum)]
>gi|11602834|gb||AAG38873.1|AF076495_1胱硫醚γ-合酶[水稻(Oryza sativa)]
>gi|305042|gb|AAB03071.1|胱硫醚γ-合酶[大肠杆菌]
表现出胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性、并且与上述氨基酸序列具有至少80%同源性、优选90%同源性、更优选95%同源性的这些序列的同源序列同样是本发明的目标对象。
鉴别同源序列和它们的同源性百分数的方法是本领域技术人员所熟知的,特别地包括BLAST程序,尤其是BLASTP程序,其可以从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/利用该网站指定的默认参数来使用。
为了确定哪些酶在被引入相应的菌株时对甲硫氨酸的生产有利,可以通过酶学方法评估γ-消除酶活性。例如,可以用酶学检测法,利用活化的高丝氨酸以及(i)没有其它底物、或(ii)半胱氨酸、或(iii)H2S作为底物来测定胱硫醚-γ-合酶、γ-消除酶活性和硫化氢解酶活性。该反应通过加入含有相应酶活性的蛋白质提取物而起始,并且在蛋白质沉淀和用硅烷化试剂衍生后通过GC-MS来监测高半胱氨酸和/或γ-胱硫醚的形成。
编码胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因可通过染色体方式或染色体外方式进行编码。在染色体方式中,基因组上可能有一个或几个拷贝,其可通过本领域的专家所知晓的重组方法引入基因组中。在染色体外方式中,基因可以由不同类型的质粒所携带,所述质粒在其复制起点方面有不同,因而在细胞中的拷贝数不同。它们可以1-5个拷贝、约20个拷贝或多达500个拷贝存在,各对应于紧密复制型低拷贝数质粒(pSC101,RK2)、低拷贝数质粒(pACYC,pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
metB基因可以利用不同强度、需要或不需要被诱导物分子所诱导的启动子进行表达。实例包括启动子Ptrc,Ptac,Plac,λ启动子cI或本领域专家已知的其它启动子。
靶基因的表达可以通过使相应的信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白质(如GST标签,AmershamBiosciences)稳定化或去稳定化的元件来增强或降低。
本发明还涉及含有编码本发明胱硫醚-γ-合酶和/或酰基高丝氨酸和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶的一个或几个等位基因的微生物。
这些菌株的特征在于事实上它们具有使得向甲硫氨酸的流量增加的甲硫氨酸代谢,这种流量增加是通过仅仅使用接受磷酸高丝氨酸的酶并由此降低生成的α-酮基丁酸的量,或者是通过使用接受磷酸高丝氨酸的酶以及接受酰基高丝氨酸的酶从而增加向甲硫氨酸的流动。
特别地,本发明涉及通过培养新微生物和分离所生成的含硫化合物来制备L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物。
L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的生成的增加可以通过降低下列基因之一的表达水平或将其缺失来实现。
基因 Genbank登记号 活性
ackA 1788633 醋酸激酶
pta 1788635 磷酸转乙酰基酶
acs 1790505 醋酸合酶
aceE 1786304 丙酮酸脱氢酶E1
aceF 1786305 丙酮酸脱氢酶E2
lpd 1786307 丙酮酸脱氢酶E3
sucC 1786948 琥珀酰-辅酶A合成酶,β亚基
sucD 1786949 琥珀酰-辅酶A合成酶,α亚基
pck 1789807 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶
pykA 1788160 丙酮酸激酶II
pykF 1787965 丙酮酸激酶I
poxB 1787096 丙酮酸氧化酶
ilvB 1790104 乙酰羟酸合酶I,大亚基
ilvN 1790103 乙酰羟酸合酶I,小亚基
ilvG 1790202 乙酰羟酸合酶II,大亚基
1790203
ilvM 1790204 乙酰羟酸合酶II,小亚基
ilvI 1786265 乙酰羟酸合酶III,大亚基
ilvH 1786266 乙酰羟酸合酶III,小亚基
aroF 1788953 DAHP合成酶
aroG 1786969 DAHP合成酶
aroH 1787996 DAHP合成酶
L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的额外增加可通过过表达一种或几种以下基因来实现:来自埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶(pyc,U51439),或其同源物之一,由以下基因编码的合成高丝氨酸的酶:thrA(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶,1786183),优选具有降低的反馈灵敏性,metL(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶,g1790376)或lysC(天冬氨酸激酶,1790455)和asd(天冬氨酸半醛脱氢酶,1789841)或者它们的组合。
L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的更进一步增加有可能通过过表达参与硫酸同化和半胱氨酸生成的基因来实现。含硫化合物的量增加同样会降低γ-消除酶活性。这可以通过以下来实现:过表达下列基因(见下),或如Covler和Kredich所述(1994Mol Microbiol 13 797-805)通过引入组成性cysB等位基因接触对该途径的调控,以引入编码对于其抑制剂L-半胱氨酸具有降低灵敏性的丝氨酸乙酰基转移酶的cysE等位基因(美国专利申请US 6,218,168,Denk & Bock 1987 J Gen Microbiol 133515-25)。以下的基因需要被过表达。
CysA 1788761 硫通透酶
CysU 1788764 半胱氨酸转运***
CysW 1788762 膜结合硫酸盐转运***
CysZ 1788753 cysK上游的开放读码框
cysN 1789108 ATP硫酸化酶
cysD 1789109 硫酸腺苷酰转移酶
cysC 1789107 腺苷酰硫酸激酶
cysH 1789121 腺苷酰硫酸还原酶
cysI 1789122 亚硫酸还原酶,α亚基
cysJ 1789123 亚硫酸还原酶,β亚基
cysE 1790035 丝氨酸乙酰基转移酶
cysK 1788754 半胱氨酸合酶
cysM 2367138 O-乙酰基-硫化氢解酶
cysW 1788762 硫酸转运蛋白
cysT 硫酸转运蛋白
cysZ 1788753 硫酸转运蛋白
sbp 1790351 周质硫酸结合蛋白
另外,参与C1(甲基)基团合成的基因可通过过表达下列基因而得到增强:
serA 1789279 磷酸甘油酸脱氢酶,优选反馈抗性的
serB 1790849 磷酸丝氨酸磷酸酯酶
serC 1787136 磷酸丝氨酸转氨酶
glyA 1788902 丝氨酸羟甲基转移酶
metF 1790377 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶
另外,直接参与甲硫氨酸生成的基因可以被过表达:
metB 1790375 胱硫醚-γ-合酶
metC 1789383 胱硫醚-β-裂合酶
metH 1790450 B12-依赖性高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲
基酶
metE 2367304 四氢蝶酰三谷氨酸转甲基酶
metF 1790377 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶
metR 1790262 metE和metH的正向调节基因以及自调节
而且,可以降低降解甲硫氨酸或偏离甲硫氨酸生成途径的途径中的基因的表达,或者可以缺失所述基因。
speD 1786311 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶
speC 1789337 鸟氨酸脱羧酶
astA 1788043 精氨酸琥珀酰转移酶
dapA 1788823 二氢吡啶二羧酸合酶
可以通过表达下列基因而增强回补反应:
ppc 1790393 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
pps 1787994 磷酸烯醇式丙酮酸合酶
L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物生成的进一步增加可以通过缺失阻遏蛋白MetJ的基因来实现,该基因负责下调甲硫氨酸调节子,如JP2000157267-A/3所建议(也可参见GenBank 1790373)。
甲硫氨酸的生成可以通过使用改变的metB等位基因来更进一步提高,所述等位基因优先或仅仅使用H2S,并因此从O-琥珀酰-高丝氨酸生成高半胱氨酸,正如专利申请PCT N°PCT/FR04/00354中所描述,该申请的内容通过参考并入本文中。
在一种优选的应用中,所述生物是大肠杆菌,或谷氨酸棒杆菌,或酿酒酵母。
本发明也涉及用于生产L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的方法,通常其通过发酵所设计的细菌菌株来制备。
依据本发明,术语“培养”和“发酵”不区分地使用,指微生物在含有简单碳源的适宜培养基上的生长。
依据本发明,简单碳源即能够被那些本领域技术人员使用来获得微生物、尤其是细菌的正常生长的碳源。特别地,它可以是可同化的糖,如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜,或这些糖的副产品。尤其优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。
本领域技术人员能够确定本发明微生物的培养条件。特别地,所述细菌在20℃至55℃之间,优选地在25℃至40℃之间发酵,更具体地,对于谷氨酸棒杆菌在大约30℃发酵,对于大肠杆菌在大约37℃发酵。
发酵通常在装有适合所用细菌的已知组成确定的无机培养基的发酵罐中进行,其中含有至少一种简单碳源,如果必要的话也含有代谢物生产所必需的共底物。
特别地,用于大肠杆菌的无机培养基可以与M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)和M63培养基(Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或比如Schaefer等人定义的培养基(1999,Anal.Biochem.270:88-96)具有相同或相似的组成。
类似地,用于谷氨酸棒状杆菌的无机培养基可以与BMCG培养基(Liebl et al.,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或比如Riedel等人描述的培养基(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)具有相同或相似的组成。可以向培养基中补充成分以便补偿由突变引入的营养缺陷。
如果有必要,发酵后,可以回收并纯化L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物。在培养基中回收和纯化所生成的化合物如甲硫氨酸的方法是本领域技术人员所熟知的。
L-甲硫氨酸、其前体或由其衍生的化合物的发酵生产中应用的硫源可以是下述任何类型:硫酸盐,硫代硫酸盐,硫化氢,甲硫醇。
附图说明
图1.将草酰乙酸转变成苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的代谢途径。MetB同源物可以催化至少三个反应:γ-胱硫醚的合成,已活化高丝氨酸的硫化氢解化或γ-消除。优先接受磷酸高丝氨酸的MetB同源物用红色显示,接受琥珀酰高丝氨酸的酶用蓝色标识,转化乙酰基高丝氨酸的酶(MetB/metZ)用绿色指示。
图2.植物和细菌物种的具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的比对。灰色框内显示的残基使酶能特异性与磷酸高丝氨酸结合。高度保守的氨基酸用红色显示,保守的残基用蓝色显示。
实施例1:仅使用具有低γ-消除酶活性的接受磷酸高丝氨酸的植物METB构建用于生产甲硫氨酸的菌株
为了验证植物CGS与大肠杆菌酶相比具有更低的γ-消除酶活性,在粗提物中测定拟南芥METB酶和大肠杆菌酶的γ-消除酶活性和CGS活性之间的比例。为了这个目的,构建了这样的大肠杆菌菌株,其中缺失了metB基因的染色体拷贝,并且由质粒表达大肠杆菌或拟南芥CGS。伴随着metB的缺失,metJ基因也被消除(参见下文)。
在含5g/l葡萄糖的基本培养基上培养携带野生型或异源的接受酰基高丝氨酸或磷酸高丝氨酸的胱硫醚-γ-合酶和/或硫化氢解酶的大肠杆菌△metJB菌株,并且在晚对数期收集。细胞重悬在冷磷酸钾缓冲液中,在冰上用超声波处理(Branson sonifier,70W)。离心后,对上清中所包含的蛋白质定量(Bradford,1976)。
将10μl的提取物在30℃与或者5mM O-琥珀酰-高丝氨酸或者O-乙酰基-高丝氨酸以及或者1.5mM硫化钠或者半胱氨酸一起孵育10分钟。用丙酮沉淀蛋白质,并且在用叔丁基二甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(TBDMSTFA)衍生化之后用GC-MS对酶促反应期间生成的高半胱氨酸或γ-胱硫醚进行定量。其中包括L-丝氨酸[1-13C]作为内部标准。或者,可使用相同方案测量半胱氨酸的消失。
使用如Datsenko和Wanner(2000)所描述的同源重组策略将metB和metJ基因失活。该策略可以允许***氯霉素抗性盒,同时缺失所涉及的大多数基因。为了这个目的,应用下列的寡核苷酸:
DmetJR(SEQ ID NO 2):tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttgctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG
其具有
-与metJ基因的序列(4125596-4125675)同源的区域(小写字母)(参考序列见网址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(参考序列见Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645),
DmetJBF(SEQ ID NO 3):tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtttgcagcccgg aagccatttt CAGGCACCAG AGTAAACATT
其具有
-与metB基因的序列(4127460-4127381)同源的区域(小写字母)以及与metL的启动子同源的区域(4126116-4126197)
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
寡核苷酸DmetJBR和DmetJBF用来从质粒pKD3上扩增氯霉素抗性盒。然后将所得PCR产物通过电穿孔法导入MG1655菌株(pKD46)中,其中表达Red重组酶,允许发生同源重组。选择氯霉素抗性转化株,然后利用以下定义的寡核苷酸MetJR和MetJF使用PCR分析来验证该抗性盒的***。所得菌株被命名为MG1655(△metJB::Cm)。
MetJR(SEQ ID NO:4):ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc(与4125431至4125460的序列同源)。
MetLR(SEQ ID NO:5):aaataacact tcacatcagc cagactactgc caccaaattt(与4127500至4157460的序列同源)。
随后除去氯霉素抗性盒。通过电穿孔法将携带有作用于氯霉素抗性盒FRT位点的重组酶FLP的质粒pCP20引入重组菌株中。经过在42℃的一系列培养后,使用与先前相同的寡核苷酸通过PCR分析验证氯霉素抗性盒的丢失。
为了使用来自拟南芥的接受磷酸高丝氨酸的METB生产甲硫氨酸,构建以下的大肠杆菌菌株。如上所述缺失甲硫氨酸阻遏蛋白metJ以及大肠杆菌metB。随后缺失编码琥珀酰-高丝氨酸转移酶的metA基因和/或编码苏氨酸合酶的thrC基因。缺失策略已针对metJB缺失进行了举例说明。所有其它基因的缺失均基于相同策略并使用所指出的寡核苷酸。下面列出了用于缺失metA和thrC基因的寡核苷酸。括号中的数字指示与大肠杆菌染色体同源的区域。D开头的寡核苷酸用于实际的缺失,其它寡核苷酸用于构建体的验证或标明的特殊目的。
对于metA基因的缺失,使用以下寡核苷酸:
DmetAF(4211866-4211945;SEQ ID NO 6):ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcgtgaagaaaac gtctttgtga tgacaacttc tcgtgcgtct TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG
DmetAR(4212785-4212706;SEQ ID NO 7):atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtgatctggtaga cgtaatagtt gagccagttg gtaaacagta CATATGAATA TCCTCCTTAG
MetAF(4211759-4211788;SEQ ID NO 8):tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc
MetAR(4212857-4212828;SEQ ID NO 9):ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt
对于thrC基因的缺失,使用以下寡核苷酸:
DthrCF(3740-3821;SEQ ID NO 10):ctctacaatc tgaaagatca caacgagcag gtcagctttgcgcaagccgt aacccagggg ttgggcaaaa atcaggggcT GTAGGCTGGAG CTGCTTCG
DthrCR(5012-4932;SEQ ID NO 11):gattcatcat caatttacgca acgcagcaaa atcggcgggcagattatgtg aaagcaaggg taaatcagca cgttctgcCA TATGAATATC CTCCTTAG
thrCF(3490-3511;SEQ ID NO 12):cgctgaaccc taccgtgaacgg
thrCR(5284-5260;SEQ ID NO 13):gcgaccagaa ccagggaaag tgcg
为了更进一步提高高丝氨酸的生产,从质粒pCL1920(Lerner &Inouye,1990,NAR 18,15p 4631)利用启动子Ptrc表达天冬氨酸激酶/高丝氨酸,对苏氨酸具有降低反馈抗性的thrA*等位基因。为了构建质粒pME101-thrA*1,使用下列寡核苷酸通过PCR从基因组DNA扩增thrA:
BspHl thrA(SEQ ID NO 14):ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc
Smal thrA(SEQ ID NO 15):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc
将经PCR扩增的片段用限制性酶BspHI和SmaI切割,并克隆到pTRC99A载体(Stratagene)的NcoI/SmaI位点。为了从低拷贝载体进行表达,按照下述构建pME101质粒。使用寡核苷酸PME101F和PME101R通过PCR扩增pCL1920质粒,将来自pTRC99A载体带有lacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段***扩增后载体中。将所得载体和带有thrA基因的载体用ApaI和SmaI限制性酶切,并且将含thrA的片段克隆到pME101载体中。为了使ThrA解除反馈抑制,通过使用寡核苷酸ThrAFF318S和ThrAR F318S进行定点诱变(Stratagene)引入F318S突变,得到pME101-thrA*1载体,称为pSB1。
PME101F(SEQ ID NO 16):Ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(SEQ ID NO 17):Agcttagtaaagccctcgctag
ThrAF F318S(SmaI)(SEQ ID NO 18):
Ccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg
ThrAR F318S(SmaI)(SEQ ID NO 19):
Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg
为了将所生成的一部分高丝氨酸转化为磷酸高丝氨酸,将thrB基因克隆到pSB1载体中。thrB使用寡核苷酸thrA’BF和thrA’BR经PCR扩增得到:
thrA’BF(SEQ ID NO 20):tacgatgtacatggccttaa tctggaaaac tggc
thrA’BR(SEQ ID NO 21):tcccccgggT TAGTTTTCCA GTACTCGTGC GCCC
PCR片段用BsrG1和SmaI消化,并克隆到用相同限制性酶切割的pSB1载体中,得到pSB2质粒。
随后,使用寡核苷酸gapA-cgsAF和cgsAR从商品cDNA克隆(TAIR,http://arabidopsis.org/contact/)PCR扩增来自拟南芥的METB酶。寡核苷酸gapA-cgsAF由METB的核苷酸1至38(粗体)以及大肠杆菌的属于GapA启动子区域的核苷酸1860761至1960799(下划线)组成。
gapA-cgsAF(SEQ ID NO 22):ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgttg agctccgatgggagcctcac tgttcatgcc gg
cgsAR(SEQ ID NO 23):AATCGCGGAT CCGAATCCGG TCAGATGGCTTCGAGAGCTT GAAGAATGTC AGC
同时,使用寡核苷酸gapA-cgsAR和GapAF扩增大肠杆菌GapA基因的GapA启动子区域。寡核苷酸gapA-cgsAR携带MetB基因的第1至39位碱基以及大肠杆菌染色体中对应GapA启动子区域的1860799至1860761位碱基。寡核苷酸GapAF对应大肠杆菌基因组的第1860639至1860661位碱基。
gapA-cgsAR(SEQ ID NO 24):ccggcatgaa cagtgaggct cccatcggag ctcaacatat attccaccag ctatttgtta gtgaataaaag g
GapAF(SEQ ID NO 25):acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc
随后使用寡核苷酸cgsAR和GapAF将两种片段融合(Horton et al.1989 Gene 77:61-68),用限制性酶BamHI和SmaI切割,并克隆到pSB1和pSB2载体相应的限制性位点内,分别得到载体pSB3(pME101thrA*-metBAt)和pSB4(pME101thrA*-thrB-metBAt)。
随后将pSB3载体和pSB4载体引入ΔmetBJΔmetAΔthrC菌株中。
实施例2:仅使用具有低γ-消除酶活性的植物METB构建菌株用于经由0—琥珀酰高丝氨酸生产甲硫氨酸。
为了使用植物METB经由琥珀酰高丝氨酸生产甲硫氨酸,构建了△metBJ metA*菌株。该构建起始采用实施例1中描述的菌株,其中在其基因组中引入了反馈抗性高丝氨酸转琥珀酰酶metA*11(描述于专利申请PCT IB/2004/001901)。为此目的,使用下列寡核苷酸从大肠杆菌染色体扩增metA*11等位基因。
MetArcF(4211786-4211883;SEQ ID NO 26):ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaaacgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc
MetArcR(4212862-4212764;SEQ ID NO 27):cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcctgaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc
将pKD46质粒引入MG1655 ΔmetAthrC菌株以及MG1655 ΔmetA菌株中,并用携带metA*11等位基因的DNA片段转化。在改良M9平板上选择甲硫氨酸原养型的克隆。随后,如上所述加入ΔmetBJ突变。将pSB3和pSB4质粒引入这两个菌株中。
实施例3:使用具有低γ-消除酶活性的接受磷酸高丝氨酸的植物METB、并同时使用大肠杆菌MetB构建菌株。
为了进一步提高甲硫氨酸的合成,构建了同时经由O-琥珀酰高丝氨酸和磷酸高丝氨酸产生甲硫氨酸的菌株。该构建起始采用如实施例1中所描述的ΔmetA和ΔmetAΔthrC菌株,其中使用如下寡核苷酸缺失了metJ基因:
具有100碱基的DmetJR(SEQ ID NO:28):
caggcaccag agtaaacatt gtgttaatgg acgtcaatac
atctggacat ctaaacttct ttgcgtatag attgagcaaa CATATGAATA TCCTCCTTAG
具有100碱基的DmetJR(SEQ ID NO:29):
tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca
ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG
MetJR(SEQ ID NO:30):ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc(与4125431至4125460的序列同源)。
MetBR(SEQ ID NO:31):ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc(与4126305至4126276的序列同源)。
随后,将具有反馈抗性的高丝氨酸转琥珀酰酶metA*11(描述于专利申请PCT IB2004/001901中)引入基因组中。为此目的,使用下列寡核苷酸从大肠杆菌染色体中扩增metA*11等位基因。
MetArcF(4211786-4211883;SEQ ID NO 32):ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaaacgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc
MetArcR(4212862-4212764;SEQ ID NO 33):cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcctgaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc
将pKD46质粒引入用携带metA*11等位基因的DNA片段转化的MG1655 ΔmetJ ΔmetA ΔthrC和MG1655 ΔmetJ ΔmetA菌株。在改良M9平板(必要时补充苏氨酸)上选择甲硫氨酸原养型的克隆。
与实施例1中使用metBAt构建pSB3和pSB4类似,通过使用寡核苷酸MetBF和MetBR进行扩增,并将PCR扩增产物克隆到限制性位点PstI和HindIII中,将带有适当启动子的大肠杆菌metB基因克隆到pSB1和pSB2载体中。
MetBF(4125957-4125982)(SEQ ID NO 34):ttagacagaa ctgcagcgcc gctccattca gccatgagatac
MetBR(4127500-4127469)(SEQ ID NO 35):cgtaacgccc aagcttaaat aacacttcacatcagccaga ctactgcc
所得载体被命名为pSB5(pME101thrA*-metBEc)以及pSB6(pME101thrA*-thrB-metBEc)。
随后,将质粒pSB3、pSB4、pSB5和pSB6引入MG1655 ΔmetJ metA*11ΔthrC和MG1655 ΔmetJ metA*11菌株中。
实施例4:以硫酸盐或硫化氢作为硫源经由磷酸高丝氨酸和/或O-琥珀酰高丝氨酸生成甲硫氨酸。
使用补充5g/l MOPS、5g/l葡萄糖并且可能还有2mM苏氨酸的改良M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)在小烧瓶培养物中对实施例1至3中所构建菌株的氨基酸生产进行分析。如果使用硫化氢作为硫源,所有的含硫酸根的盐都被替换成等摩尔量的含氯盐。硫化物以硫化铵(10mM)形式来提供。如果有必要,以浓度为100mg/l加入壮观霉素。用过夜培养物接种30ml培养物至OD600为0.2。在培养物的OD600到达4.5至5之后,加入1.25ml 50%葡萄糖溶液和0.75ml 2MMOPS(pH6.9),振荡培养物1小时。随后,如果必要加入IPTG。
在分批培养阶段分析细胞外代谢物。在OPA/Fmoc衍生化之后通过HPLC对氨基酸定量,在硅烷化之后使用GC-MS分析其它相关的代谢物。
菌株 | 甲硫氨酸(mmol/gDw) | 异亮氨酸(mmol/gDw) | 胱硫醚-γ-合酶(mU/mg蛋白) | γ-消除(mU/mg蛋白) |
DmetBJmetA*11 pSB5 | 0.48 | 0.67 | 2468 | 307 |
DmetBJmetA*11 pSB3 | 0.26 | 0.13 | 6 | <0.05 |
表2携带大肠杆菌(pSB5)和拟南芥(pSB3)MetB的菌株的特异性甲硫氨酸生产,以及它们相应的胱硫醚-γ-合酶(CGS)和γ-消除活性。
使用来自拟南芥的具有低γ-消除酶活性的METB生产甲硫氨酸通过γ-消除酶反应显著减少异亮氨酸的生成,而甲硫氨酸的合成则没有被显著影响。这与仅使用大肠杆菌途径的试验形成对比,其中经由γ-消除作用产生了大量副产物异亮氨酸。
实施例5:使用接受乙酰基-高丝氨酸和H2S作为底物的酵母MetB酶生产甲硫氨酸的菌株的构建和评价
为了测试酵母体内的γ-消除酶活性以及评价它用于生产甲硫氨酸的潜力,构建了以下菌株。使用下列寡核苷酸,通过PCR从基因组DNA中扩增编码酿酒酵母中高丝氨酸乙酰基转移酶的MET2基因:
Ptac-metAlevF(SEQ ID NO 36):tgctacagct ggagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtggaaggaggac agaccatgtc gcatacttta aaatcgaaaa cgctccaaga gc
Ptac-metAlevR(SEQ ID NO 37):CGTACTGACG ACCGGGTCCT ACCAGTTGGTAACTTCTTCG GCCTCACC
随后将PCR片段克隆到pACYC184载体的PvuII和DrdI限制性位点,得到pSB7载体。寡核苷酸Ptac-metAlevF携带驱动pACYC184载体表达酵母MET2基因的pTAC启动子。
使用寡核苷酸metBlev和gapA-metBlevF扩增酵母乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶(MET17)。同时,使用寡核苷酸gapA-metBlevR和GapAF扩增大肠杆菌gapA启动子。随后,通过只使用寡核苷酸metBlev和GapAF(详见上面)采用融合PCR法将MET17基因与gapA启动子融合。
gapA-metBlevR(38-75:1860797-1860761;SEQ ID NO 38):GGCCGGCGTGTAGTTGAACA GTATCGAAAT GAGATGGCAT ATATTCCACC AGCTATTTGTTAGTGAATAA AAGG
gapA-metBlevF(1-38:1860761-1860797;(SEQ ID NO 39):ccttttattc actaacaaatagctggtgga atatatgcca tctcatttcg atactgttca actacacgcc ggcc
metBlev(SEQ ID NO 40):TAATCGCGGAT CCGCGTCATG GTTTTTGGCC AGCG
GapAF(1860639-1860661;SEQ ID NO 41):acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc
将融合片段克隆到实施例1中所述pSB1载体的SmaI和BamHI位点,得到pSB8载体。
将pSB7和pSB8载体均转化到ΔmetJ ΔmetB ΔmetA菌株中,得到DmetBJ DmetC DmetA pSB7 pSB8。该菌株在迟滞期后以0.21/h的生长速率生长。验证质粒和突变,并对甲硫氨酸进行定量。
菌株 | 甲硫氨酸(mmol/gDw) | 异亮氨酸(mmol/gDw) | OSHS或OAHS(mU/mg蛋白) | γ-消除(mU/mg蛋白) |
ΔmetBJ ΔmetC metA*11pSB5 | 0.23 | 0.62 | 17041 | 3071 |
ΔmetBJ ΔmetA ΔmetC pSB7 pSB8 | 0.57 | 0.14 | 194 | <0.05 |
表3携带大肠杆菌(pSB5)和酵母(pSB8)MetB的菌株的特异性甲硫氨酸生产以及它们相应的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶(OSHS)、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(OAHS)和γ-消除活性。1数值是在ΔmetBJmetA*11 pSB5菌株中获得的。
表3显示,甲硫氨酸的生成量在有酵母MET2和MET17基因存在下被显著提高。同时,所生成的异亮氨酸的量降低。这可以由MET17酶的低γ-消除酶活性(如实施例1所述体外测定酵母乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶的γ-消除酶活性)来解释。
实施例6:构建和评价表达来自于巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)(Fusaro株)的古生菌metB的甲硫氨酸生产菌株
与植物中一样,在古生菌中甲硫氨酸生物合成被认为是经由磷酸高丝氨酸进行的。为此,我们假设与所述植物酶类似,来自甲烷八叠球菌(Methanosarcina)的MetB也可能具有低γ-消除酶活性。因此,使用寡核苷酸metBmethano和gapA-metBmethanoR通过PCR扩增甲烷八叠球菌metB。如先前所述,随后将大肠杆菌gapA启动子与metB基因融合在一起,其中对于该启动子的扩增使用寡核苷酸gapA-metBmethanoF和GapAF,对于实际的融合使用metBmethano和GapAF。将得到的片段克隆到pJB137载体的SmaI限制性位点内,得到pSB9质粒。
MetBmethano(SEQ IDNO 42):GTCCCCCGGG AATCTAGTCT AGATTAAATTACTTCAAGG GCCTGTTTGA GG
gapA-metBmethanoR(32-69:1860797-1860761)(SEQ ID NO 43):cacattttgt tgcaaacttcacttctcttt ccatatattc caccagctat ttgttagtga ataaaagg
gapA-metBmethanoF(1-3g:1860761-1860797)(SEQ ID NO 44):ccttttattc actaacaaatagctggtgga atatatggaaa gagaagtgaa gtttgcaaca aaatgtg
GapAF(1860639-1860661)(SEQ ID NO 45):acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc
将pSB9质粒引入ΔmetJ metA*11、ΔmetJ ΔmetA ΔmetB和ΔmetJΔmetA ΔmetB ΔthrC菌株中,所得菌株如实施例2中所述进行发酵。与携带具有大肠杆菌metB基因的pSB5质粒的ΔmetJ metA*11菌株相比,甲硫氨酸的合成被提高,而异亮氨酸的合成被降低。这最可能是由于古生菌metB酶的低γ-消除酶活性所致。
实施例7:表达橙色绿屈挠菌metB基因的菌株的构建和评价
图2的比对显示橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的MetB酶在识别磷酸高丝氨酸作为底物所需的位置处携带有一些氨基酸。为此,我们推测该酶像植物METB一样可能具有比该大肠杆菌酶更低的γ-消除酶活性。为了验证使用metB酶对合成甲硫氨酸是否有利,使用寡核苷酸metBchloro和gapA-metBchloroR经PCR扩增绿屈挠菌metB。如前所述,随后将大肠杆菌的gapA启动子与metB基因融合在一起,对于扩增启动子使用寡核苷酸gapA-metBchloroF和GapAF,对于实际的融合使用metBchloro和GapAF。将所得片段克隆到pACYC177(Biolabs)载体的限制性位点BamHI和SmaI中,得到pSB10载体。
metBchloro(SEQ ID NO 46):ACGTGGATCC GAATTCCTTA TTCGTCGGCAAGAGCCTGTT GC
gapA-metBchloroR(33-70:1860797-1860761)(SEQ ID NO 47):ggccgtacgg gtccggtaaactgatcgata gccatatatt ccaccagcta tttgttagtg aataaaagg
gapA-metBchloroF(1-38:1860761-1860797)(SEQ ID NO 48):ccttttattc actaacaaatagctggtgga atatatggct atcgatcagtttaccggacc cgtacggcc
GapAF(1860639-1860661)(SEQ ID NO 49):acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc
为了在甲硫氨酸生物合成中评价该酶,将pSB10质粒引入ΔmetJmetA*11、ΔmetJ ΔmetA ΔmetB和ΔmetJ ΔmetA ΔmetB ΔthrC菌株中,所得菌株如实施例2所述进行发酵。与携带具有大肠杆菌metB基因的pSB6质粒的ΔmetJ metA*11菌株相比,其中的甲硫氨酸生产显著提高。
实施例8:表达酵母高丝氨酸乙酰基转移酶和来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶metY的菌株的构建
为了体内测试谷氨酸棒状杆菌的γ-消除酶活性并评价它用于生产甲硫氨酸的潜力,构建了以下菌株。
使谷氨酸棒状杆菌乙酰基-高丝氨酸硫化氢解酶基因metY的密码子偏好改造为适于大肠杆菌,并在体外进行合成。同时添加大肠杆菌gapA启动子。
随后将融合片段克隆到实施例1描述的pSB1载体的SmaI和BamHI位点,得到pSB11载体。
将pSB11载体以及携带酵母高丝氨酸乙酰基转移酶的pSB7载体都转化入MG1655 ΔmetJ metA*11菌株和ΔmetJ ΔmetB ΔmetA菌株中,测定所生成的甲硫氨酸的量。可以显示,当以硫化氢或硫酸盐作为硫源生长时,在酵母高丝氨酸乙酰基转移酶以及经密码子改造的棒状杆菌乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶metY存在下所生成的甲硫氨酸的量显著提高。同时,异亮氨酸的生成量显著降低。作为替代,可以使用经密码子改造的棒状杆菌高丝氨酸转乙酰酶来代替所述酵母酶。
实施例9:构建表达具有降低γ-消除活性的大肠杆菌高丝氨酸琥珀酰转移酶的菌株
为了确保不经由其经典生物合成途径生成异亮氨酸,缺失了ilvA基因和携带第二苏氨酸脱氨酶的tdcABCDEFG操纵子。
使用如前所述的缺失策略以及以下寡核苷酸缺失ilvA基因:
DilvAF(SEQ ID NO 50)
GgctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttaagagcagtgctgcgcgcgccggtttacgaggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其具有
-与ilvA基因的序列(3952954-3953033)同源的区域(小写字母)(参考序列在网址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)(参考序列在Datsenko,K.A.& Wanner B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645),
DilvAR(SEQ ID NO 51)
cctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggcaatcgtagcccagctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggCATATGAATATCCTCCTTAG
其具有
-与ilvA基因的序列(3954478-3954400)同源的区域(小写字母)
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写字母)。
利用寡核苷酸DilvAR和DilvAF从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。随后将得到的PCR产物通过电穿孔法引入MG1655 ΔmetBJ metA11(pKD46)和ΔmetJ metA11(pKD46)菌株中,其中表达的Red重组酶允许同源重组。然后,选择氯霉素抗性转化株,使用以下定义的寡核苷酸ilvAR和ilvAF通过PCR分析验证抗性盒的***。得到的菌株是ΔmetBJmetA*11 ΔilvA。
ilvAR(3954693-3954670)(SEQ ID NO 52):gccccgaaccggtgcgtaaccgcg
ilvAF(3952775-3952795)(SEQ ID NO 53):ggtaagcgatgccgaactggc
除了IlvA之外,已知苏氨酸脱水酶(TdcB)可在厌氧或微氧条件下催化苏氨酸脱氨生成α-酮基丁酸。为了排除由该酶生成α-酮基丁酸的可能性,从ΔmetBJ metA*11 ΔilvA菌株的基因组中缺失该基因。TdcB是tdcABCDEFG操纵子的一部分,该操纵子如针对前述突变体所述以相似方式使用下述四种寡核苷酸而被缺失。利用DtdcGR和DtdcAF扩增所述盒,利用tdcGR和tdcGF进行验证。
DtdcGR(3255915-3255993)(SEQ ID NO 54)
gctgacagcaatgtcagccgcagaccactttaatggccagtcctccgcgtgatgtttcgcggtatttatcgttcatatcCATATGAATATCCTCCTTAG
DtdcAF(3264726-3264648)(SEQ ID NO 55)
GgtaattaacgtaggtcgttatgagcactattcttcttccgaaaacgcagcacctggtagtctttcaggaagtcattagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
tdcGR(3255616-3255640)(SEQ ID NO 56)
gcgtctgcaatgacgcctttattcg
tdcAF(3264922-3264899)(SEQ ID NO 57)
Cgccataaaatatggttatccccg
所得菌株被称作ΔmetBJ metA*11 ΔilvA ΔtdcABCDEFG。
为了降低大肠杆菌胱硫醚-γ-合酶/硫化氢解酶(MetB)的γ-消除酶活性,在参与底物半胱氨酸结合的区域内引入突变。为此目的,使用寡核苷酸MetBF和MetBR(括号中的数字对应于大肠杆菌基因组的位置)从基因组DNA中PCR扩增大肠杆菌metB。用PstI和HindIII限制性酶切消化该PCR片段,将其克隆到pUC18中相同的限制性位点内。
MetBF(4125957-4125982)(SEQ ID NO 58):ttagacagaactgcagcgcc gctccattca gccatgagatac
MetBR(4127500-4127469)(SEQ ID NO 59):cgtaacgccca agcttaaataacacttcacatcagccagac tactgcc
随后,向大肠杆菌胱硫醚-γ-合酶/硫化氢解酶中引入突变,导致氨基酸变化T335A/A337P、R49L和D45V。
按照Stratagene的Quick changeTM定点突变试剂盒,采用定点诱变方法,利用下述寡核苷酸对引入每种突变。引入限制性位点(粗体)以便于验证。
metBT335A/A337PF(SEQ ID NO 60):cgcgcttctg gtgccatgcc cggatgtgcc atggttgcgg cg
metBT335A/A337PR(SEQ ID NO 61):cgccgcaacc atggcacatc cgggcatggc accagaagcg cg
metBR49LF(SEQ ID NO 62):gaacctcgagcgcatgattactcgcgtctgggcaacccaacgcgcg
metBR49LR(SEQ ID NO 63):cgcgcgttgggttgcccagacgcgagtaatcatgcgctcgaggttc
metBD45VF(SEQ ID NO 64):gaacctcgagcgcatgtgtactcgcgtcgcggcaacccaacgcgcgat
metBD45VR(SEQ ID NO 65):atcgcgcgttgggttgccgcgacgcgagtacacatgcgctcgaggttc
通过测序验证所得到的修饰metB序列,用PstI和HndIII限制性酶切,并克隆到pSB1载体的相同位点。将所得质粒转化到ΔmetBJ metA*11ΔilvA ΔtdcABCDEFG菌株中。如前所述在小烧瓶培养物中评价菌株。通过γ-消除作用生成的异亮氨酸的量显著降低,而甲硫氨酸的合成只有轻微影响。这与低γ-消除活性以及保留显著的胱硫醚-γ-合酶活性有关。
菌株 | 甲硫氨酸(mmol/gDw) | 异亮氨酸(mmol/gDw) | 胱硫醚-γ-合酶(mU/mg蛋白) | γ-消除(mU/mg蛋白) |
DmetBJ metA*11 DilvA DtdcABCDEFGpSB5 | 0.96 | 0.88 | 3790 | 101 |
DmetBJ metA*11 DilvA DtdcABCDEFGpSB1-metB**T335A/A337P | 0.24 | 0 | 425 | 1 |
DmetBJ metA*11 DilvA DtdcABCDEFGpSB1-metB**D45V | 0.69 | 0.33 | 891 | 34 |
DmetBJ metA*11 DilvA DtdcABCDEFGpSB1-metB**R49L | 0.99 | 0.48 | 445 | 22 |
Claims (26)
1.一种微生物,其中表达具有胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶中一种或几种活性、并且同时具有低γ-消除活性的酶。
2.权利要求1的微生物,其中胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的γ-消除活性与大肠杆菌胱硫醚-γ-合酶相比至少低两倍,优选至少低10倍。
3.权利要求1或2的微生物,其中表达接受磷酸高丝氨酸的胱硫醚-γ-合酶/磷酸高丝氨酸硫化氢解酶。
4.权利要求3的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶是植物的METB基因,优选拟南芥(Aratbidopsisthaliana)的METB基因。
5.权利要求1或2中任一项的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的METB基因。
6.权利要求1或2中任一项的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶来源于古生菌,优选巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)。
7.权利要求1或2中任一项的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶来源于绿屈挠菌科(Chloroflexaceae),优选橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)。
8.权利要求1或2中任一项的微生物,其中所述的酶具有以下位置氨基酸中的至少两个:107E、111Y、165K、403S。
9.权利要求1或2中任一项的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶是***的metY和/或metB基因。
10.权利要求1至9中任一项的微生物,其中所述的天然或异源胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶被优化,并因而具有较低的γ-消除酶活性,从而允许以异亮氨酸为代价增强甲硫氨酸的选择性。
11.权利要求1的微生物,其中表达在337位具有脯氨酸的被优化的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
12.权利要求1的微生物,其中表达在335位具有丙氨酸的被优化的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
13.权利要求1的微生物,其中表达在335位具有丙氨酸、在337位具有脯氨酸的被优化的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
14.权利要求1至13中任一项的微生物,其中编码所述胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的多核苷酸被过表达。
15.权利要求1至13中任一项的微生物,其中所述的胱硫醚-γ-合酶和/或磷酸高丝氨酸硫化氢解酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶的催化性质被提高。
16.权利要求1至15中任一项的微生物,其中引入异源高丝氨酸酰基转移酶,其允许利用相应的接受酰基高丝氨酸的胱硫醚-γ-合酶和/或酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
17.权利要求1至16中任一项的微生物,其中数种不同的杂合途径从高丝氨酸活跃地生产高半胱氨酸和/或胱硫醚。
18.权利要求1至17中任一项的微生物,其中待生产的期望氨基酸的生物合成途径中的其它基因也额外得到增强。
19.权利要求1至17中任一项的微生物,其中减少期望氨基酸产生的代谢途径至少被部分降低。
20.利用如权利要求1至19中任一项所述的微生物发酵制备氨基酸、特别是甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法,包括如下步骤:
a)对生产所述期望氨基酸的微生物进行发酵,
b)浓缩细菌细胞或培养基中的期望产物,和
c)分离发酵液和/或生物质中的期望氨基酸/组分,任选地部分或全部(0-100%)保留在终产物中。
21.权利要求20的方法,其中将硫分子/化合物从半胱氨酸转移至任何活化的高丝氨酸。
22.权利要求20的方法,其中将硫分子/化合物直接从H2S转移至任何活化的高丝氨酸。
23.权利要求20的方法,其中培养基中的硫源是硫酸盐或衍生物。
24.权利要求20的方法,其中培养基中的硫源是硫代硫酸盐。
25.权利要求20的方法,其中培养基中的硫源是H2S。
26.权利要求20的方法,其中培养基中的硫源是甲基硫醇。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090225 |