CN101374935A - 洗涤剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含洗涤剂成分和具体脂肪酶变体的洗涤剂组合物，所述脂肪酶变体趋于产生减少的气味并且与亲本脂肪酶相比具有更好的相对性能。

Description

洗涤剂组合物

发明领域

本发明涉及衣物洗涤剂组合物，尤其是包含脂解酶的衣物洗涤剂。

发明背景

对于洗涤剂制造商来说，改善油性污垢去除效果是其不变的目标。尽管使用了许多有效的表面活性剂以及表面活性剂的组合，但是基于表面活性剂的产品仍然无法实现油脂/油性污垢的完全去除，尤其是当产品在低水温下使用时。自二十世纪八十年代后期起脂肪酶就已被用于洗涤剂中，以便通过将脂肪污垢分解成甘油三酯来去除脂肪污垢。

直至不久前，主要的市售脂肪酶如Lipolase(商品名为Novozymes)才可在洗涤过程烘干阶段的较低水分含量下产生尤其有效的作用。这些酶仅在第二洗涤步骤趋于产生显著的清洁效果，因为只有在烘干阶段洗涤过的衣物上留下的污垢才会发生显著的脂肪分解，然后在下一个洗涤步骤中移除分解的脂肪。然而最近已研发出更高效的脂肪酶，其在清洁过程的洗涤阶段也可有效地起作用。因此除了第二个洗涤步骤中的清洁作用以外，由于脂肪酶可存在于第一个洗涤循环中，因此清洁效果得到了显著的改善。US 6,939,702B1、WO00/60063和Research DisclosureIP6553D中描述了这些酶的实例。下文中将上述酶称为第一洗涤脂肪酶。

此外，消费者希望制品(诸如衣服)尽可能的洁净。这些消费者通常将清洁或处理过的制品的气味与这些制品的清洁程度相关联。因此，从消费者的观点来看，清洁和/或处理组合物的有效性通常直接与该组合物赋予用该组合物清洁或处理过的制品的气味相关联。申请人已认识到，某些物质例如酯酶和脂肪酶可产生难闻的脂肪酸气味，尤其是短链脂肪酸气味，例如丁酸的气味。然而，这些物质可以是尤其有效的清洁剂。遗憾的是，消费者通常将使用这些试剂产生的气味与不洁净相关联。具有C-末端延伸序列的、减少气味的变体实例参见WO02/062973，但是这些脂肪酶变体未表现出第一洗涤脂肪酶的强效洗涤性能，诸如那些WO00/60063中的脂肪酶，包括以商品名

销售的变体。

因此，需要一种包含脂解酶的洗涤剂组合物以获得优异的油脂/油性污垢去除效果，并且不产生任何令人讨厌的脂肪酸气味。

发明概述

本发明涉及包含洗涤剂成分和脂肪酶变体的洗涤剂组合物，所述脂肪酶变体在说明书中的给定测试条件下具有至少0.8的平均相对性能(RPavg)和至少1.1的效险(BR)。

序列列表

序列标识号:1表示编码嗜热真菌脂肪酶的DNA序列。

序列标识号:2表示嗜热真菌脂肪酶的氨基酸序列。

序列标识号:3和序列标识号:4表示用于比对实例的序列。

发明详述

定义

脂肪酶活性:本文中术语“脂肪酶活性”被定义为催化三酯酰甘油水解形成二酯酰甘油和羧酸酯的羧基酯水解酶活性。对于本发明来说，按照“材料和方法”中的“脂肪酶活性”中所述的方法测定脂肪酶活性。一单位脂肪酶活性定义为能够在30℃，pH7条件下，每分钟释放1.0微摩尔丁酸的酶量。

本发明的多肽具有至少70％，至少75％或80％或85％或90％，更优选至少95％，甚至更优选96％或97％，最优选98％或99％，甚至最优选至少100％的脂肪酶活性，脂肪酶活性以由氨基酸序列组成的多肽的相对性能进行测量，所述氨基酸序列显示为具有T231R+N233R取代的序列标识号:2的成熟多肽。

分离的多肽:在此所用的术语“分离的多肽”是指通过SDS-PAGE测定的至少20％纯化，优选至少40％纯化，更优选至少60％纯化，甚至更优选至少80％纯化，最优选至少90％纯化，甚至最优选至少95％纯化的多肽。

基本纯化的多肽:本文所用术语“基本纯化的多肽”表示这样一种多肽制品:它包含按重量计最多10％，优选最多8％，更优选最多6％，更优选最多5％，更优选最多4％，最多3％，甚至更优选最多2％，最优选最多1％，甚至最优选最多0.5％的与其天然结合的其它多肽物质。因此，基本纯化的多肽优选地按制品中存在的总多肽物质重量计为至少92％纯化，优选至少94％纯化，更优选至少95％纯化，更优选至少96％纯化，更优选至少96％纯化，更优选至少97％纯化，更优选至少98％纯化，甚至更优选至少99％，最优选至少99.5％纯化，甚至最优选至少100％纯化。

本发明的多肽优选以基本纯化形式存在。具体地讲，多肽优选以“基本纯化形式”存在，即，多肽制品基本上不含与其天然结合的其它多肽物质。这可以通过例如熟知的重组方法和经典的纯化方法制备多肽来成功完成。

本文中术语“基本纯化的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性:用参数“同一性”来描述两个氨基酸序列或两个核苷酸序列间的相关性。

对本发明来说，通过使用来自EMBOSS package(http://emboss.org)2.8.0版本的Needle程序测定两个氨基酸序列的比对。Needle程序使用全局比对算法，该算法描述于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453。使用的取代矩阵是BLOSUM62，空位开放罚分是10，空位拓展罚分是0.5。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如序列标识号:2的氨基酸1至269)和差异氨基酸序列(“外来序列”)之间的同一性程度通过以下方法计算:两个序列比对的精确匹配数目除以“发明序列”的长度或“外来序列”的长度，无论哪个序列的长度是最短的。结果表示为同一性百分比。

当“发明序列”和“外源序列”在重叠(在以下的序列比对实例中，它用“|”表示)的相同位点具有相同的氨基酸残基时，发生完全匹配。序列长度是序列中的氨基酸残基的数目(例如序列标识号:2的长度是269)。

在以下的序列比对实例中，重叠是序列A的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或者序列B的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在此实例中间隙用“-”表示。

序列比对实例

序列A:ACMSHTWGER—NL

          | |||   ||

序列B:    HGWGEDANLAMNPS

多肽片段:本文术语“多肽片段”定义为从序列标识号:2或其同源序列的氨基和/或羧基末端删除一个或多个氨基酸的多肽，其中所述片段具有脂肪酶活性。

序列:本文术语“序列”定义为从序列标识号:1或其同源序列的5′和/或3′末端删除一个和多个核苷酸的核苷酸序列，其中所述子序列编码具有脂肪酶活性的多肽片段。

等位变体:术语“等位变体”本文是指占用相同染色***点的基因的任何两个或更多个替代形式。等位变体通过突变自然产生，可导致群体内的多态现象。基因突变可以是静默突变(编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因等位变体编码的多肽。

基本纯化的多核苷酸:在此所用的术语“基本纯化的多核苷酸”是指这样的多核苷酸制品:不含其它外源的和多余的核苷酸，并且以适用于遗传工程的蛋白质生产体系的形式存在。因此，基本纯化的多核苷酸包含按重量计最多10％，优选最多8％，更优选最多6％，更优选最多5％，更优选最多4％，更优选最多3％，甚至更优选最多2％，最优选最多1％，甚至最优选最多0.5％的与其天然结合的其它多核苷酸物质。然而，基本纯化的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，诸如启动子和终止子。基本纯化的多核苷酸优选地按重量计为至少90％纯化，优选至少92％纯化，更优选至少94％纯化，更优选至少95％纯化，更优选至少96％纯化，更优选至少97％纯化，甚至更优选至少98％纯化，最优选至少99％，甚至最优选至少99.5％纯化。本发明的多核苷酸优选以基本纯化形式存在。具体地讲，本文所公开的多核苷酸优选以“基本纯化形式”存在，即，多核苷酸制品基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸物质。本文术语“基本纯化的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的、或它们的任何组合。

cDNA:本文术语“cDNA”定义为能从得自真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子通过反转录制备的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初级转录物是mRNA的前体，它通过一系列步骤被加工成熟的剪接mRNA。这些步骤包括通过所谓的剪接方法移除内含子序列。cDNA衍生自mRNA，因此缺乏任何内含子序列。

核酸构建:在此所用的术语“核酸构建”是指单链或双链核酸分子，它们分离自天然存在的基因或以某种方式被修饰以含有核酸片段，否则其不会天然存在。当核酸构建包含本发明编码序列表达所需的控制序列时，术语核酸构建与术语“表达框”同义。

控制序列:术语“控制序列”在本文中被定义为包括所有对编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的或有利的元件。对编码多肽的核苷酸序列来说，每个控制序列都可以是原有的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。控制序列最少应包括启动子和转录及翻译终止信号。对照序列可具有接头序列以引入特异的限制性酶切位点，利于对照序列与编码多肽的核苷酸序列编码区相连接。

可操作的连接:术语“可操作的连接”本文表示一种构造，其中控制序列被置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，以使得控制序列引导多肽编码序列的表达。

编码序列:本文所用术语“编码序列”是指直接为其蛋白质产物的氨基酸序列编码的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开放读框决定，开放读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子诸如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA、或重组核苷酸序列。

表达:术语“表达”包括多肽生产涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体:本文术语“表达载体”定义为包含编码本发明多肽的多核苷酸的线性或环状DNA分子，此多核苷酸可操作地与提供其表达的附加核苷酸相连。

宿主细胞:如本文所用，术语“宿主细胞”包括任何易受转化、转染、转导等影响的细胞类型，具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建。

修饰:术语“修饰”本文是指多肽的任何化学修饰，所述多肽由序列标识号:2的成熟多肽组成，以及编码多肽的DNA的基因操纵。修饰可以是氨基酸的取代、删除和/或***、以及氨基酸侧链的替代。

人造变体:本文所用术语“人造变体”是指具有脂肪酶活性的多肽，所述脂肪酶活性由表达序列标识号:1的修饰核苷酸序列的生物体产生。通过人工干预获得修饰核苷酸序列，人工干预是通过修饰本发明所公开的在序列标识号:1中的核苷酸序列。

相对性能(RP):术语相对性能反映了当用在本说明书实例2中描述的具体酶变体洗涤纺织物样本，并以其颜色亮度作测量标准时，酶变体相比参考酶的性能。

风险(R):本说明书中术语“风险”和风险因子可互换使用，它是从脂肪酶变体洗涤样品释放的丁酸与从序列标识号:2的脂肪酶成熟部分洗涤样品释放的丁酸量之间的比率，两个值都使用从无脂肪酶的洗涤样品释放的丁酸量进行校正。

效险因子(BR):效险因子描述与气味风险相比的洗涤性能，因此BR＝RPavg/R。

变体命名规则

在描述如本发明所述的脂肪酶变体时，使用以下命名法以利于参考:最初氨基酸:位点:取代氨基酸。

根据此命名法，例如将位点195处的谷氨酸取代为甘氨酸，表示为G195E。在相同的位点缺失甘氨酸的话表示为G195^*，而***附加的氨基酸残基如赖氨酸表示为G195GK。

一个与其它脂肪酶相比，包含一个在位点36的“缺失”氨基酸，同时在此位点***一个天冬氨酸的具体脂肪酶表示为^*36D。

多个突变用加号分隔，即:R170Y+G195E，表示在位点170和195处分别将酪氨酸和谷氨酸取代为精氨酸和甘氨酸。

当应用所述序列比对方法时，X231表示在亲本多肽中对应位点231的氨基酸。X231R表示此氨基酸用R置换。对序列标识号:2来说X是T，X231R因此表示在位点231处用R取代T。当一个位点(例如231)的氨基酸可以用另一个选自一组氨基酸的氨基酸取代时，例如，所述组由R和P和Y组成，用X231R/P/Y表示。

在所有情况下，使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

发明详述

具有脂肪酶活性的多肽

本发明具有脂肪酶活性的分离的多肽选自由下列脂肪酶组成的组:在本说明书给定的测试条件下具有至少0.8的RP和至少1.1的BR的脂肪酶。

在一个优选的实施例中，所述脂肪酶具有至少0.9的RP，诸如1.0或1.1。在一个甚至更优选的实施例中，所述脂肪酶具有至少1.2的RP，诸如1.3或甚至1.4。

在另一个优选的实施例中，所述脂肪酶具有至少1.2的BR，诸如1.3或甚至1.4。在一个甚至更优选的实施例中，所述脂肪酶具有至少1.5的BR，诸如1.6或甚至1.7。

在另一方面，本发明的多肽在本说明书的给定测试条件下还具有小于1，诸如小于0.95的相对LU/A280。在一个优选的实施例中，相对LU/A280小于0.90，诸如小于0.85，或甚至小于0.80。

在另一方面，本发明的分离的多肽具有如下氨基酸序列:它被包含在或包含序列标识号:2或其等位变体，并且还具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。在另一方面，本发明的分离的多肽具有如下氨基酸序列:它被包含在或包含序列标识号:2或其等位变体的成熟部分中，并且还具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。

在另一方面，本发明的分离的多肽具有如下氨基酸序列:它与序列标识号:2(即，成熟多肽)的成熟多肽有至少80％，诸如至少85％或90％，或至少95％，优选至少97％，最优选至少98％，甚至最优选至少99％的同一性，所述成熟多肽具有脂肪酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，同源多肽具有与序列标识号:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选五个氨基酸，更优选四个氨基酸，甚至更优选三个氨基酸，最优选两个氨基酸，和甚至最优选一个氨基酸的氨基酸序列。

在另一方面，本发明具有脂肪酶活性的分离的多肽由如下多核苷酸编码:所述多核苷酸在非常低的严谨性条件下，优选低严谨性条件下，更优选中严谨性条件下，更优选中-高严谨性条件下，甚至更优选高严谨性条件下，最优选非常高严谨性条件下，与以下核苷酸序列杂交:(i)核苷酸644至732，序列标识号:1，(ii)包含在核苷酸644至732的cDNA序列，序列标识号:1，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，New York)。序列标识号:1的子序列包含至少100个邻接核苷酸或优选地至少200个邻接核苷酸。此外，子序列可编码具有脂肪酶活性的多肽片段。

序列标识号:1的核苷酸序列或其子序列，以及序列标识号:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株中鉴别和克隆编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA。具体地讲，这些探针可用于与所关注的属或种的基因组或cDNA杂交，然后进行标准的Southern印迹法以鉴别和分离那里相应的基因。这些探针可以比整个序列短的多，但是其长度应为至少14，优选至少25，更优选至少35，最优选至少70个核苷酸。然而，核酸探针的长度优选为至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度为至少600个核苷酸，优选至少700个核苷酸，或更优选至少800个核苷酸的核酸探针。可以使用DNA和RNA探针。探针通常进行标记以检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或亲合素标记)。本发明涵盖了这些探针。

因此，可以从这些其它生物体制备的DNA或cDNA基因组文库中筛选与上述探针杂交并编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术从这些其它生物体中分离基因组或其它DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可以被转移到并固定在硝化纤维或其它合适的载体材料上。为了鉴定与序列标识号:1或其子序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体材料。

对于本发明来说，杂交说明核苷酸序列在非常低的至非常高的严谨条件下杂交到标记的核酸探针上，此探针对应在序列标识号:1、其互补链、或其子序列中显示的核苷酸序列。在这些条件下杂交到核酸探针上的分子可以用X射线胶片进行检测。

在另一个方面，本发明的变体可以是人造变体，它在序列标识号:2或其成熟多肽上发生一个或多个氨基酸保守取代、删除和/或***，所述变体具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。优选的是，氨基酸改变是较小的本质改变，也就是说，保守的氨基酸取代或***不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性；小的删除，通常为一至约30个氨基酸；小的氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；小的连接肽，最多约20至25个残基；或小的延伸，它通过改变净电荷或其它功能诸如聚组氨酸片段、抗原决定簇或结合域，有利于纯化。

保守取代的实例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酸盐和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的并且被描述于例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，The Proteins，AcademicPress，New York。发生的最通常的交换是丙氨酸/丝氨酸、缬氨酸/异亮氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、苏氨酸/丝氨酸、丙氨酸/甘氨酸、丙氨酸/苏氨酸、丝氨酸/天冬酰氨、丙氨酸/缬氨酸、丝氨酸/甘氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸、丙氨酸/脯氨酸、赖氨酸/精氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、亮氨酸/异亮氨酸、亮氨酸/缬氨酸、丙氨酸/谷氨酸和天冬氨酸/甘氨酸。

除了20个标准氨基酸之外，还可以用非标准氨基酸(诸如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α-甲基丝氨酸)取代野生型多肽的氨基酸残基。限制数目的非保守氨基酸、遗传密码不编码的氨基酸和非天然的氨基酸可以被氨基酸残基取代。“非天然的氨基酸”在蛋白质合成后已经被修饰，和/或其侧链具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然的氨基酸可以被化学合成，优选可商购获得，包括哌啶酸、噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。

作为另外一种选择，氨基酸改变是本质的改变，会导致多肽的物理化学特性改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等。

亲本多肽中的原发性氨基酸可以按照本领域中已知的程序进行确定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells，1989，Science 244:1081-1085)。在最近的技术中，在分子中的每个残基都引入单个的丙氨酸突变，并测试所得突变型分子的生物活性(即，脂肪酶活性)以确定氨基酸残基是否对分子活性至关重要。还可参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。也可通过对结构的物理分析来测定酶的活性位点或其它生物学交互作用，用于测定的这些技术包括诸如核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记，它们与假定的接触位点氨基酸突变结合使用。参见，例如de Vos等人，1992，Science255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.309:59-64。也可以通过分析多肽的同一性来推断原发性氨基酸的同一性，所述多肽涉及如本发明所述的多肽。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，以及随后的相应筛选程序，能够完成和测试单个或多个氨基酸取代，诸如那些在Reidhaar-Olsonand Sauer，1988，Science 241:53-57；Bowie and Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中公开的方法。其它可用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochem.30:10832-10837；美国专利5,223,409；WO92/06204)和定位诱变(Derbyshire等人，1986，Gene 46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

宿主细胞表达的克隆、诱变多肽可通过诱变/改组方法结合高通量自动筛选方法来检测活性。(使用本领域中的标准方法能从宿主细胞中重新获得编码活性多肽的诱变DNA分子并迅速测序。这些方法可以迅速测定所关注的多肽中的各个氨基酸残基的重要性，并将其施用于多肽的未知结构。

在一个方面，序列标识号:2的氨基酸1至291的氨基酸取代、删除和/或***的总数为10，优选为9，更优选为8，更优选为7，更优选为最多6，更优选为最多5，更优选为4，甚至更优选为3，最优选为2，和甚至更优选为1。

区域识别和取代。

下文提到的区域I至区域IV的位点是序列标识号:2中的氨基酸残基位点。使用“同源性和序列比对”部分所述的方法来发现不同脂肪酶中对应的(或同源的)位点。

区域I中的取代

区域I由围绕N-末端残基E1的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域I包含对应以下位点的氨基酸残基:1至11和223至239。以下位点具有特别的意义:1、2、4、8、11、223、227、229、231、233、234和236。具体地讲，已经确认了以下取代:X1N/^*、X4V、X227G、X231R和X233R。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2具有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2相同。

区域II中的取代

区域II由在酰基链的一面上和在醇部分的一面上接触底物的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸或较低疏水性的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域II包含对应以下位点的氨基酸残基:202至211和249至269。以下位点具有特别的意义:202、210、211、253、254、255、256、259。具体地讲，已经确认了以下取代:X202G、X210K/W/A、X255Y/V/A、X256K/R和X259G/M/Q/V。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2具有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2相同。

区域III中的取代

区域III由形成柔性结构，从而允许底物进入活性位点的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸或较低疏水性的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域III包含对应以下位点的氨基酸残基:82至102。以下位点具有特别的意义:83、86、87、90、91、95、96、99。具体地讲，已经确认了以下取代:X83T、X86V和X90A/R。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2具有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2相同。

区域IV中的取代

区域IV由静电结合至表面的氨基酸残基组成。在此区域优选用带较多正电的氨基酸来取代亲本脂肪酶中的氨基酸。区域IV包含对应以下位点的氨基酸残基:27和54至62。以下位点具有特别的意义:27、56、57、58、60。具体地讲，已经确认了以下取代:X27R、X58N/AG/T/P和X60V/S/G/N/R/K/A/L。

在一个优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2具有至少80％，诸如85％或90％，诸如至少95％或96％或97％或98％或99％的同一性。在一个更优选的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2相同。

其它位点的氨基酸

亲本脂肪酶可任选地包含其它氨基酸的取代，尤其是少于10个和少于5个这样的取代。实施例是在对应亲本脂肪酶24、37、38、46、74、81、83、115、127、131、137、143、147、150、199、200、203、206、211、263、264、265、267和269中的一个或多个位点的取代。在一个具体实施例中，取代发生在对应81、143、147、150和249位点中的至少一个位点。在一个优选的实施例中，至少一个取代选自由下列取代组成的组:X81Q/E、X143S/C/N/D/A、X147M/Y、X150G/K和X249R/I/L。

变体可包含在限定区域I至IV之外的取代，在限定区域I至IV之外的取代数量优选地少于六个、或少于五个、或少于四个、或少于三个、或少于二个，诸如五个、或四个、或三个、或二个或一个。作为另外一种选择，变体不包含任何在限定区域I至IV之外的取代。

例如，根据本领域已知的法则，可进行更多的取代，如WO92/05249、WO 94/25577、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所述的取代。

亲本脂肪变体

在一个方面，当与所述亲本相比时，所述变体包含总计至少三个取代，所述取代选自以下组的取代中的一组或多组:

a)区域I中的至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如两个、三个、四个、五个或六个取代，

b)区域II中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个、两个、三个、四个、五个或六个取代，

c)区域III中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个、两个、三个、四个、五个或六个取代，

d)和/或区域IV中的至少一个、至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个，诸如一个、两个、三个、四个、五个或六个取代。

变体与变体的亲本相比可包含取代，所述取代对应下表1中列出的那些取代。

 

区域I	区域II	区域III	区域IV	区域外
					X4V+X227G+X231R+X233R	X210K+X256K	X83T+X86V	X58A+X60S	X150G
X227G+X231R+X233R	X256K	X86V	X58N+X60S	X150G
					X231R+X233R	X255Y
X231R+X233R	X202G
					X227G+X231R+X233R	X256K	X86V
X4V+X231R+X233R			X58N+X60S
					X231R+X233R		X90R	X58N+X60S
X231R+X233R	X255V	X90A
					X227G+X231R+X233R	X256K	X86V	X58N+X60S	X150G
X231R+X233R	X211L		X58N+X60S	X147M
					X231R+X233R				X150K

表1:一些具体的变体。

在一个更具体的实施例中，亲本脂肪酶与序列标识号:2相同，从而表1的变体将会是:

 

区域I	区域II	区域III	区域IV	区域外
					Q4V+L227G+T231R+N233R	E210K+P256K	S83T+I86V	S58A+V60S	A150G
L227G+T231R+N233R	P256K	I86V	S58N+V60S	A150G
					T231R+N233R	I255Y
T231R+N233R	I202G
					L227G+T231R+N233R	P256K	I86V
Q4V+T231R+N233R			S58N+V60S
					T231R+N233R		I90R	S58N+V60S
T231R+N233R	I255V	I90A
					L227G+T231R+N233R	P256K	I86V	S58N+V60S	A150G
T231R+N233R	F211L		S58N+V60S	L147M
					T231R+N233R				A150K

表2:序列标识号:2的一些具体变体

例如，根据本领域已知的法则可进行更多的取代，如WO92/05249、WO 94/25577、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所述的取代。

同源性和序列比对

对于本发明来说，通过本领域已知的计算机程序，如GCG程序包中所提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA5 3711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，“Journal of Molecular Biology”，48，443-45)，使用具有下列多肽序列对比设置的GAP，来适宜地测定同源性程度:GAP产生罚分为3.0，并且GAP延伸罚分为0.1。

在本发明中，犁头霉、伞枝犁头霉、米黑根毛霉、代氏根霉、黑曲霉、塔宾曲霉、尖孢镰刀菌、异孢镰刀菌、米曲霉、卡门柏青霉、臭曲霉、黑曲霉、嗜热真菌(同物异名:高温毛壳霉)、和Landerina penisapora脂肪酶序列中对应的(或同源的)位点通过图1中显示的序列比对确定。

为了找到脂肪酶序列中不显示在序列比对中的同源位点，将所关注的序列与图1中显示的序列进行比对。通过对GAP程序发现的同源性最高的序列进行GAP序列比对，将新序列与图1中的现有序列进行比对。GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)提供GAP。多肽序列比较使用以下设置:GAP产生罚分为3.0，并且GAP延伸罚分为0.1。

亲本脂肪酶与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号:2)具有至少50％，尤其是至少55％，至少60％，至少75％，至少85％，至少90％，超过95％或超过98％的氨基酸同一性。在一个具体实施例中，亲本脂肪酶与嗜热真菌脂肪酶(序列标识号:2)相同。

-效险

将描述性能与气味减少风险比的效险系数定义为:BR＝RPavg/R。本文所述的脂肪酶变体可具有大于1，大于1.1，或甚至大于1至约1000的效险系数。

-平均相对性能

计算平均相对性能(RPavg)的程序存在于本说明书的实施例5中。本文所述的脂肪酶变体可具有至少0.8，至少1.1，至少1.5，或甚至至少2至约1000的平均相对性能(RPavg)。

-相对LU/A280

通过存在于本发明实例4中的LU/A280检测分析法来测定相对LU/A280。本文所述的脂肪酶变体可具有小于1.00，小于0.9，小于0.8，或甚至小于1.00至约0.1的相对LU/A280。

具有脂肪酶活性的多肽

本发明的多肽可获取自任何微生物属。对于本发明来说，在此所用的术语“获取自”当与给定来源相联系时是指核苷酸序列编码的多肽由来源产生或由其中***了来源核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获取自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，诸如杆菌多肽，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽胞杆菌、凝固芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽胞杆菌多肽；或链霉菌多肽，例如，变铅青链霉菌或鼠链霉菌多肽；或革兰氏阴性菌多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌属多肽。

本发明的多肽也可以是真菌多肽，更优选地是酵母多肽诸如假丝酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母多肽；或更优选地丝状真菌多肽，例如顶孢霉菌、曲霉菌、短梗霉菌、隐球菌、线黑粉酵母、镰刀霉菌、腐殖霉菌、稻瘟病菌、毛霉菌、毁丝霉菌、新考玛脂霉菌、脉孢菌、拟青霉菌、青霉菌、瘤胃真菌、裂褶菌、黄丝曲霉菌、嗜热子囊菌、草根霉菌、木霉菌、或木霉菌多肽。

在一个优选的方面，多肽是卡尔斯伯酵母、啤酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺氏酵母、或具有脂肪酶活性的卵形酵母多肽。

在另一个优选的方面，多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、镰孢拟杆菌、小麦枯萎病菌、镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰刀菌、黄荆镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、念珠形镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰孢、拟枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、簇囊镰刀菌、类丝孢镰刀菌、镰孢霉、特异腐质霉、嗜热真菌(同物异名:高温毛壳霉)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、链孢霉、产紫青霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是嗜热真菌属多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是嗜热真菌多肽，例如，具有突变的序列标识号:2多肽，公开于本专利申请中。

对于上述菌种来说，应当理解本发明涵盖完全的和不完全的状态，以及其它分类学等同物，例如，无性型，尽管菌种名称是已知的。本领域内的技术人员将易于认识到适当的等同物的同一性。

公众可容易地在多个菌种保藏中心获得这些菌种的菌株，诸如American Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Centraalbureau VoorSchimmelcultures(CBS)、和Agricultural Research Service Patent CultureCollection、Northern Regional Research Center(NRRL)。

此外，使用上述探针，可以从其它来源鉴定和获得这些多肽，包括从自然界分离的微生物(例如，土壤、堆肥、水等等)。用于从自然环境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库可获得聚核苷酸。一旦使用探针检测到了编码多肽的多核苷酸序列，可利用本领域的普通技术人员熟知的技术来分离或克隆多核苷酸(参见，例如，Sambrook等人，1989，supra)。

本发明的多肽也包括融合多肽或可分开的融合多肽，其中将另一个多肽融合在多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其一部分)来生产融合多肽。生产融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括结合编码多肽的编码序列，以使得它们在框架中并且融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。

多核苷酸

本发明的脂肪酶优选地衍生自具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，更优选地衍生自编码以下多肽的核苷酸序列:所述多肽是序列标识号:2或其成熟多肽的氨基酸序列变体，它由于遗传密码的简并而与编码多核苷酸不同。多肽也可衍生自序列标识号:1的子序列，它编码具有脂肪酶活性的序列标识号:2的片段，所述片段具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA中分离的多核苷酸、从cDNA中制备多核苷酸、或它们的组合。可以从这些基因组DNA中获得的本发明多核苷酸的克隆，例如，通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共同结构特征的克隆DNA片段。参见例如Innis等人的PCR:AGuide to Methods and Application，Academic Press，New York，1990。可以使用其它核酸扩增程序诸如连接酶反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从嗜热真菌属或另一种或相关生物体菌株中克隆多核苷酸。因此，例如多核苷酸可以是多核苷酸序列的多肽编码区的等位基因或菌种变体。

多肽可以衍生自具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与序列标识号:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％的同一性，它编码具有脂肪酶活性以及至少1.1的BR和至少0.8的RP的活性多肽。

为了合成基本上类似于所述多肽的多肽，必须对编码本发明多肽的核苷酸序列进行修饰。术语“基本上类似于”所述多肽是指多肽非天然存在的形式。这些多肽可与其天然来源在某些工程学方面不同，例如，人造变体在特异活性、热稳定性、最佳pH等方面有所不同。变体序列可以在序列标识号:1的多肽编码区的核苷酸序列基础上构建，例如，其子序列，和/或通过引入核苷酸取代，所述取代不产生另一种由核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列，但是其对应趋于产生酶的宿主生物体的密码子使用，或通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。核苷酸取代的综述参见例如Ford等人的Protein Expression and Purification2:95-107，1991。

对于本领域内的技术人员来说显而易见的是，可以在分子功能的关键区域之外进行这些取代并仍获得活性多肽。对由本发明分离的多核苷酸编码的多肽活性至关重要，并因此优选不被取代的氨基酸残基可以根据本领域已知的程序进行鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如Cunningham and Wells，1989，Science244:1081-1085)。在最近的技术中在分子的每个带正电的残基中引入突变，并测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。也可以通过三维结构分析测定底物和酶的交互作用位点，三维结构通过以下技术测定:核磁共振分析、晶体学或光亲和标记(参见例如de Vos等人的Science255:306-312，1992；Smith等人的Journal of Molecular Biology224:899-904，1992；Wlodaver等人的FEBS Letters 309:59-64，1992)。

多肽可以衍生自编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低的严谨性条件下，优选低严谨性条件下，更优选中严谨性条件下，更优选中-高严谨性条件下，甚至更优选高严谨性条件下，最优选非常高严谨性条件下，与以下核苷酸序列杂交:(i)序列标识号:1，(ii)cDNA序列，包含在序列标识号:1中，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或等位变体和其子序列(Sambrook等人，1989，supra)，如本文所定义。

多肽可衍生自分离的多核苷酸，多核苷酸通过以下步骤获得:(a)在非常低、低、中、中至高、高、或非常高的严谨条件下将一组DNA与以下物质杂交:(i)序列标识号:1的核苷酸，(ii)序列标识号:1的核苷酸中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交多核苷酸，它编码具有脂肪酶活性的多肽。

核酸构建:

包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建可被可操作地连接到一个或多个控制序列上，控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中，在与控制序列相容的条件下表达。

可以用多种方法操纵编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。在多核苷酸序列***载体前对其进行操纵是可取的或必须取决于表达载体。利用重组DNA方法用于修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

对照序列可以是合适的启动子序列，启动子序列是宿主细胞可识别的、用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含转录控制序列，它调控多肽的表达。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的、杂合的启动子，并且可以从编码细胞外或细胞内多肽的基因中获得，所述多肽与宿主细胞是同源的或异源的。

用于指导本发明的核酸构建转录的合适启动子的实例，尤其在细菌宿主细胞中，是获取自以下基因的启动子:大肠杆菌乳糖操纵元、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。在“Useful proteins from recombinant bacteria”，ScientificAmerican，1980，242:74-94；和Sambrook等人，1989，supra中描述了更多的启动子。

用于指导本发明的核酸构建转录的合适启动子的实例，在丝状真菌宿主细胞中是获取自以下基因的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸盐异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镰孢霉淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镰孢霉Daria(WO 00/56900)、镰孢霉Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸盐异构酶基因的杂合启动子)；和其突变的、截短的、和杂合启动子。

在酵母细胞中，可用启动子获取自以下基因:酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸盐异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸盐激酶。酵母宿主细胞的其它可用启动子在Romanos等人，1992，Yeast 8:423-488中有所描述。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，终止子序列是宿主细胞可识别的用于终止转录的序列。终止序列被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3′末端。本发明可以使用任何在选择的宿主细胞中具有功能的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获取自以下基因:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获取自以下基因:酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸盐氢化酶。用于酵母宿主细胞的其它可用终止子在Romanos等人，1992，supra中有所描述。

控制序列也可以是合适的前导序列，前导序列是mRNA的非翻译区，它对宿主细胞的翻译是重要的。前导序列被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的5’末端。本发明可以使用任何在选择的宿主细胞中具有功能的前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列获取自以下基因:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸盐异构酶。

用于酵母宿主细胞的优选前导序列获取自以下基因:酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸盐激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶(ADH2/GAP)。

对照序列可以是聚腺苷酸序列，它是可操作地连接到核苷酸序列的3’末端的序列，并且当转录时宿主细胞认为将聚腺苷酸残基加到转录mRNA上是一种信号。本发明可以使用任何在选择的宿主细胞中具有功能的聚腺苷酸序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸序列获取自以下基因:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

用于酵母宿主细胞的可用聚腺苷酸序列在Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15:5983-5990中有所描述。

控制序列也可以是信号肽编码区，它编码连接到多肽氨基末端的氨基酸序列，并且指导编码多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’末端可固有的包含信号肽编码区，该编码区自然地连接翻译读码框与编码分泌多肽的编码区片段。作为另外一种选择，编码序列的5’末端可包含对编码序列来说外来的信号肽编码区。在编码区天然地不包含信号肽编码区的地方，需要外来信号肽编码区。作为另外一种选择，外来信号肽编码区可只是为了增加多肽分泌而置换天然信号肽编码区。然而，本发明中可以使用任何指导表达多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获取自以下基因的信号肽编码区:杆菌NCIB11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA。更多的信号肽在Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews 57:109-137中有所描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获取自以下基因的信号肽编码区:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、和嗜热真菌脂肪酶。

用于酵母宿主细胞的可用信号肽获取自以下基因:酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其它可用的信号肽编码区在Romanos等人，1992，supra中有所描述。

控制序列也可以是多肽编码区，它编码位置在于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽是已知的酶原或多肽原(或在某些情况下是酵素原)。多肽原通常是无活性的，它通过催化或自身催化裂解可转化成熟的活性多肽。多肽编码区可从以下基因中获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)。

信号肽和肽原都存在于多肽的氨基末端，肽原区域位置在紧邻着多肽的氨基末端，信号肽区域位置在紧邻着肽原区域的氨基末端。

也期望加入调控序列，调控序列允许调控多肽相对于宿主细胞生长的表达。调控体系的实例是那些响应化学或物理刺激，包括存在调控化合物而引起的基因表达开启或关闭的调控。原核体系中的调控体系包括lac、tac和trp操纵子体系。在酵母中可以使用ADH2体系或GAL1体系。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子作为调控序列。其它调控序列的实例是那些允许基因扩增的调控序列。在真核体系中，这些调控序列包括当甲氨蝶呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因，和当重金属存在时扩增的金属硫因基因。在这些实例中，编码多肽的核苷酸序列将可操作地与调控序列连接。

表达载体

重组表达载体通常包含本发明的多核苷酸、启动子、和转录及翻译终止信号。上述多种核酸和对照序列可以接合在一起以产生重组表达载体，所述载体可包括一个或多个方便的限制酶切位点以允许编码多肽的核苷酸序列在这些位点的***或取代。作为另外一种选择，本发明的核苷酸序列可以通过将核苷酸序列或包含序列的核酸构建***合适的表达载体进行表达。在表达载体制造过程中，编码序列位于载体中以使得编码序列可操作地与合适的对照序列相连用于表达。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，它们能方便地经受重组DNA程序并能表达核苷酸序列。载体的选择将通常取决于载体和引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环形的质粒。

载体可以是自主复制载体，即，载体是在染色体外存在的实体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体、或人工染色体。载体可包含用于确保自主复制的任何元件。作为另外一种选择，载体可以是这样一种形式:当引入宿主细胞时，载体整合进入基因组，与引入其的基因组一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，它们一起包含总DNA以被引入宿主细胞的基因组，或可以使用转位子。

载体优选地包含一个或多个选择性标记物，该标记物使得转化细胞容易被选择。一种选择性标记物是基因，其产物提供抗生素或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷体的原养型等。

条件性原发基因可作为非抗生素选择性标记物使用。细菌的条件性原发非抗生素选择性标记物的非限制性实例是dal基因，得自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或其它杆菌，它们仅当细菌在缺失D-丙氨酸的情况下培养时才是原发性的。当细胞在存在半乳糖的情况下生长或在导致半乳糖存在的培养基中生长，在UDP-半乳糖代谢中涉及的编码酶的基因也可用作细胞中的条件性原发标记物。这些基因的非限制性实例是那些得自菌株枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的编码UTP-依赖性磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依赖性尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.12)、或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的基因。也可以使用木糖异构酶基因诸如杆菌的xylA，在用木糖作为唯一碳源的基本培养基中作为细胞生长的选择性标记物。也可使用利用葡糖酸盐、gntK和gntP必需的基因，在用葡糖酸盐作为唯一碳源的基本培养基中作为细胞生长的选择性标记物。其它条件性原发基因的实例是本领域已知的。抗生素选择性标记物授予对以下抗生素的抗性:氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。

用于酵母宿主细胞的合适标记物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草铵膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、以及其等同物。优选用于曲霉菌细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，和吸水链霉菌的bar基因。

载体优选地包含允许载体整合进入宿主细胞基因组的元件，或允许载体在细胞中独立于基因组进行自主复制的元件。

为了整合进入宿主细胞基因组，载体可通过同源或非同源重组，依靠编码多肽的多核苷酸序列或载体的任何其它元件整合进入基因组。作为另外一种选择，载体可包含附加的核苷酸序列，该序列用于指导通过同源重组，在染色体的精确位置整合进入宿主细胞基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选地包含足够数量的核酸，诸如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，最优选800至10,000碱基对，所述核酸与对应目标序列具有高度同一性以提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合进入宿主细胞基因组。

对自主复制来说，载体可进一步包含复制起点，以使得载体能在所考虑的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的、调控自主复制的任何质粒复制基因。术语“复制起点”或“质粒复制基因”本文定义为使得质粒或载体能体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是质粒复制起点pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184，它们允许在大肠杆菌中复制，以及pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1，它们允许在杆菌中复制。

用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene 98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Research15:9163-9175；WO 00/24883)。根据WO 00/24883所公开的方法，可分离AMA1基因并构建包含基因的质粒或载体。

可在宿主细胞中***多个本发明的多核苷酸拷贝以增加基因产物的产量。通过整合至少一个附加的序列拷贝进入宿主细胞基因组，或通过在多核苷酸中包括扩增选择性标记物基因，细胞包含选择性标记物基因的扩增拷贝，因此多核苷酸的附加拷贝可通过在合适的选择性培养基中培养细胞进行选择，从而增加多核苷酸的拷贝量。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，supra)。

宿主细胞

重组宿主细胞通常包含本发明的多核苷酸，在多肽的重组生产中有利地使用这些多核苷酸。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞以使得载体保持成为染色体的部分或成为如前所述的自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，因为复制期间发生了突变，后代细胞并不与亲本细胞相同。亲本细胞的选择很大程度上取决于编码多肽和其来源的基因。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物或非单细胞微生物，例如，真核生物。

可用的单细胞微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性菌，包括但不限于杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽胞杆菌；或链霉菌多肽，例如，变铅青链霉菌和鼠链霉菌，或革兰氏阴性菌诸如大肠杆菌和假单胞菌属。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，杆菌细胞是嗜碱杆菌。

载体引入细菌宿主细胞可受到以下因素影响:例如，原生质体转化(参见例如，Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115)、使用感受态细胞(参见例如，Young和Spizizin，1961，Journalof Bacteriology 81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)、或结合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169:5771-5278)。

宿主细胞也可以是真核细胞，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。在此所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、瓶菌门和接合菌门(由Hawksworth等人定义，In，Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌门(由Hawksworth等人引用，1995，supra，第171页)和所有有丝***孢子真菌(Hawksworth等人，1995，supra)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、孔生担孢子酵母、和属于不完全菌纲(芽孢纲)的酵母。因为酵母分类将来可能发生改变，对于本发明来说，酵母应按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980)中描述的方法进行定义。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母菌、裂殖酵母、或耶氏酵母细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔斯伯酵母、啤酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺氏酵母、或具有脂肪酶活性的卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门和卵菌亚门所有的丝状形式(由Hawksworth等人定义，1995，supra)。丝状真菌通常特征在于菌丝体壁由甲壳质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖、和其它复合多糖组成。菌体生长通过菌丝伸长完成，碳分解代谢必须在有氧条件下进行。相反，酵母诸如酿酒酵母，其菌体生长通过单细胞菌体出芽完成，碳分解代谢可以是发酵性的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是顶孢霉菌、曲霉菌、短梗霉菌、烟管菌、拟蜡菌、鬼伞菌、采绒革盖菌、隐球菌、线黑粉酵母、镰刀霉菌、腐殖霉菌、稻瘟病菌、毛霉菌、毁丝霉菌、新考玛脂霉菌、脉孢菌、拟青霉菌、青霉菌、白腐菌、射脉菌、瘤胃真菌、侧耳菌、裂褶菌、黄丝曲霉菌、嗜热子囊菌、草根霉菌、木霉菌、毛栓菌、或木霉菌细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是镰孢拟杆菌、小麦枯萎病菌、镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰刀菌、黄荆镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、念珠形镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰孢、拟枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、簇囊镰刀菌、类丝孢镰刀菌、或镰孢霉细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是烟管菌、干拟蜡菌、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa，Ceriporiopsis subrufa、或虫拟蜡菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、特异腐质霉、高温毛壳霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、链孢霉、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、云芝、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉菌株细胞。

真菌细胞可通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的过程进行转化，就其本身而言是已知的方式。用于转化曲霉菌和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等人，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474中有所描述。用于转化镰刀霉菌种的合适方法在Malardier等人，1989，Gene78:147-156，和WO 96/00787中有所描述。酵母可以用以下文献中描述的方法进行转化:Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。

生产方法

本发明的多肽可以通过包括以下步骤的方法进行生产:(a)培养细胞，所述细胞是能够生产多肽的野生型细胞，在有益于多肽生产的条件下进行培养；和(b)重新获得多肽。细胞优选是曲霉菌，更优选是米曲霉。

用于生产本发明的多肽的方法也可包括(a)在有益于多肽生产的条件下培养宿主细胞；和(b)重新获得多肽。

用于生产本发明的多肽的方法也可包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，此序列在序列标识号:1的成熟多肽编码区具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码脂肪酶多肽，所述脂肪酶被包含在或包含序列标识号:2的多肽，和(b)重新获得多肽。在一个优选的实施例中，所述核苷酸序列编码脂肪酶多肽，所述脂肪酶被包含在或包含序列标识号:2的多肽成熟部分，和(b)重新获得多肽。

在此生产方法中，细胞使用本领域熟知的方法在适于多肽生产的营养培养基中进行培养。例如，在合适的培养基中以及在允许多肽表达和/或分离的条件下，细胞可通过摇瓶培养法进行培养，和在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、加料分批的或固态发酵)。使用本领域已知的方法，培养在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行。合适的培养基可得自商业供应商或根据公布的组合(例如，在American Type Culture Collection目录中的那些组合)制备。如果多肽被分泌进入营养培养基，它可从培养基中直接重新获得。如果多肽不被分泌，它能从细胞溶解产物中重新获得。

可以使用本领域已知的，专用于多肽的方法来检测多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、酶产物形成、或底物消耗。例如，可以使用酶检测分析法来测定如本文所述的多肽活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法重新获得。例如，多肽可以通过以下常规方法从培养基中重新获得:包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过多种本领域已知的方法纯化多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提纯(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

组合物

优选地，组合物富集本发明所述的多肽。术语“富集的”表示已经强化了组合物的脂肪酶活性，例如，使用富集系数1.1。

组合物可包含本发明的多肽作为主要的酶组分，例如，单组分组合物。作为另外一种选择，组合物可包含多种酶活性，诸如氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、甲壳质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳醣苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、缩氨酸谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。附加的酶可由以下微生物生产，例如:属于曲霉菌属的微生物，优选的是棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉，臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；镰刀菌，优选的是镰孢拟杆菌、小麦枯萎病菌、镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰刀菌、黄荆镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红色镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰孢、硫色镰刀菌、簇囊镰刀菌、类丝孢镰刀菌、或镰孢霉；腐殖霉菌，优选的是特异腐质霉或嗜热真菌；或木霉属，优选的是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉。

多肽组合物可以根据本领域已知的方法制备，并能够以液体或干燥组合物的形式存在。例如，多肽组合物能够以颗粒或微粒的形式存在。组合物中包含的多肽可根据本领域已知的方法稳定。

洗涤剂成分

在此所用的洗涤剂组合物包括制品和清洁及处理组合物。除非另外指明，如本文所用，术语“清洁和/或处理组合物”包括片剂、颗粒状或粉状多功能洗涤剂或“重垢型”洗涤剂，尤其是衣物洗涤剂；液体状、凝胶状或糊状多功能洗涤剂，尤其是通常所说的重垢型液体类；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢型餐具洗涤剂，尤其是高泡型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括各种在家庭和公共场所使用的片状、颗粒状、液体状和漂洗助剂型洗涤剂。所述组合物也可在单位剂量包装中，包括本领域已知的那些单位剂量包装，以及那些水溶性的、水不溶性的和/或水可渗透的单位剂量包装。

本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种本发明的脂肪酶变体。除了脂肪酶变体之外，洗涤剂组合物还包含洗涤剂成分。下文说明的洗涤剂成分的非限制性列表适用于本发明的组合物，并且适合将其加入到本发明的某些实施例中，例如以促进或提高清洁性能，处理待清洁的底物，或通常用着色剂、染料等等改进清洁组合物的美观性。这些附加组分的明确性质及其掺入量将取决于组合物的物理形式以及其应用的清洁操作的性质。合适的洗涤剂成分质包括但不限于:表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶和酶稳定剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形过酸、聚合分散剂、增白剂、抑泡剂、染料、抗腐蚀剂、晦暗抑制剂、香料、结构弹性剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。

典型的洗涤剂将包含按以下成分的任何组合重量计5％至30％表面活性剂，优选阴离子表面活性剂诸如直链烷基苯磺酸盐和羟基环氧硫酸盐；0.005％至0.1％蛋白酶活性蛋白，其中所述蛋白酶优选选自Coronase^TM，、FNA、FN4或Savinase^TM，0.001％至0.1％淀粉酶活性蛋白，其中所述淀粉酶优选选自Termamyl^TM Natalase^TM、Stainzyme^TM和Purastar^TM和0.1％至3％的螯合剂，优选二亚乙基三胺五醋酸。对于颗粒型和片剂产品来说，这些典型的洗涤剂将另外包含按重量计5％至20％漂白剂，优选过碳酸钠；1％至4％的漂白活化剂，优选TAED和/或0％至30％，优选5％至30％，更优选少于10％的助洗剂，诸如硅铝酸盐沸石A和/或三聚磷酸盐。

漂白剂-本发明洗涤剂组合物可包含一种或多种漂白剂。

通常，当使用漂白剂时，本发明的组合物可包括按本主题清洁组合物的重量计约0.1％至约50％，或者甚至约0.1％至约25％的漂白剂。合适漂白剂的示例包括:

(1)过氧化氢源，例如无机过氢化合物盐，包括以下碱金属盐如钠盐:过硼酸盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐、以及它们的混合物。在本发明的一个方面，无机过氢化合物盐选自由下列物质组成的组:过硼酸钠盐、过碳酸钠盐、以及它们的混合物，皂；和

(2)具有R-(C＝O)-L的漂白活化剂，其中R为烷基，任选支链烷基。当漂白活化剂为疏水时，其具有6至14个碳原子或者8至12个碳原子。当漂白活化剂为亲水时，其具有小于6个碳原子或者甚至小于4个碳原子；并且L为离去基团。合适的离去基团的实例为苯甲酸及其衍生物，尤其是苯磺酸盐。合适的漂白活化剂包括十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸及其盐、3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)。合适的漂白活化剂还公开于WO 98/17767中。尽管可采用任何适宜的漂白活化剂，在本发明的一个方面中，本主题的清洁组合物可包含NOBS、TAED或它们的混合物。

(3)预成形的过酸。

如果存在，过酸和/或漂白活化剂通常以基于所述组合物约0.1至约10％重量，约0.5至约60％重量或者甚至约0.6至约40％重量的含量存在于所述组合物中。其一种或多种疏水前体可与一种或多种亲水过酸或其前体联合使用。

可选择过氧化氢源与过酸或漂白活化剂的量，使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比为1:1至35:1，或者甚至2:1至10:1。

表面活性剂-如本发明所述的洗涤剂组合物可包含表面活性剂或表面活性剂体系，其中所述表面活性剂可选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、以及它们的混合物。如果存在的话，表面活性剂通常以按本主题组合物的重量计约0.1％至约60％，约0.1％至约40％，约0.1％至约12％，约1％至约50％，或者甚至约5％至约40％的含量存在。

如果存在的话，所述洗涤剂通常将包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐、α烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、羟基环氧硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基丁二酸或皂。

所述洗涤剂可任选地包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，诸如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基氧化胺、乙氧基化脂肪酶一乙醇酰胺、脂肪酸一乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

助洗剂-本发明的洗涤剂组合物可包括一种或多种洗涤剂助剂或助洗剂体系。当使用助洗剂时，本主题组合物将通常包含按本主题组合物的重量计至少约1％，约5％至约60％，或者甚至约10％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于:碱金属、铵和链烷醇铵的聚磷酸盐、碱金属硅酸盐或层状硅酸盐、碱土和碱金属碳酸盐、硅铝酸盐助洗剂和各种碱金属、多元乙酸(如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)的各种铵盐和取代铵盐，以及聚羧酸酯(如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧联二琥珀酸、多元马来酸、苯-1，3，5-三羧酸、羧甲基氧代琥珀酸)以及它们的可溶性盐。

螯合剂-本文的洗涤剂组合物可包含螯合剂。合适的螯合剂包括铜、铁和/或锰螯合剂、以及它们的混合物。当使用螯合剂时，本主题组合物可包含按本主题组合物的重量计约0.005％至约15％，或者甚至约3.0％至约10％的螯合剂。

增白剂-本发明的洗涤剂组合物也可包含能改变待清洁制品外观的附加组分，诸如荧光增白剂。这些增白剂吸收紫外光并发出可见光。合适的荧光增白剂含量包括从约0.01％重量，约0.05％重量，约0.1％重量，或甚至约0.2％重量的较低含量至0.5％重量或甚至0.75％重量的较高含量。

分散剂-本发明的组合物还可包含分散剂。合适的水溶性有机物包括均聚或共聚酸或其盐，其中多元羧酸包含至少两个相隔不超过两个碳原子的羧基。

酶-除了本发明的脂肪酶变体外，洗涤剂组合物还可再包含一种或多种酶以提供清洁性能和/或织物护理有益效果，诸如蛋白酶、另一种脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。

通常选择的酶的特性应与选择的洗涤剂相容，(即，最佳pH与其它酶和非酶成分相容等等)，并且酶应为有效量。

合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。包括化学改性的或蛋白质工程的突变型。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选微生物碱性蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是那些衍生自杆菌的蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草菌溶素、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)、序列标识号4和序列标识号7，描述于WO 05/103244中。其它合适的丝氨酸蛋白酶包括那些获取自微球菌亚目某些种，尤其是公开于Cellulonas种的丝氨酸蛋白酶及其变体，公开于WO2005052146中。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和镰刀霉蛋白酶，描述于WO 89/06270和WO 94/25583中。

可用蛋白酶的实例是WO 92/19729，WO 98/20115、WO 98/20116、和WO98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位点具有取代的变体:27、36、57、68、76、87、97、101、104、106、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、245、252和274，以及具有以下突变的其它变体:(K27R、V104Y、N123S、T124A)，(N76D、S103A、V104I)，或(S101G、S103A、V104I、G159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K)。其它可用蛋白酶的实例是WO 05/052146中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位点具有取代的变体:14、16、35、65、75、76、79、123、127、159和179

优选的可商购获得的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、Coronase^TM、Polarzyme^TM and Kannase^TM(NovozymesA/S)、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、PurafectPrime^TM、Purafect OxP^TM、FNA、FN2、FN3和FN4(Genencor InternationalInc.)。

脂肪酶包括那些细菌或真菌来源的脂肪酶。包括化学改性的或蛋白质工程的突变型。可用脂肪酶的实例包括获取自腐殖霉菌(同物异名:嗜热真菌)的脂肪酶，例如获取自高温毛壳霉(同物异名:嗜热真菌)的脂肪酶，描述于EP 258 068和EP 305 216中，或获取自特异腐质霉的脂肪酶，描述于WO 96/13580中，假单胞菌属脂肪酶，例如获取自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、司氏假单胞菌(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002))、威州齿盘假单胞菌(WO 96/12012)的脂肪酶，杆菌脂肪酶，例如获取自菌株枯草芽孢杆菌(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽胞杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例是诸如那些在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶变体。

其它可商购获得的脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM(NovozymesA/S)。

合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌来源的淀粉酶。包括化学改性的或蛋白质工程的突变型。淀粉酶包括例如α-得自杆菌的淀粉酶，例如一种特殊的地衣芽孢杆菌菌株，该菌株在GB1,296,839中有更详细的描述。

可用淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位点具有取代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

可商购获得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Stainzyme^TM、Stainzyme Ultra^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(得自Genencor International Inc.)。

合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌来源的纤维素酶。包括化学改性的或蛋白质工程的突变型。合适的纤维素酶包括获取自杆菌属、假单胞菌属、腐殖霉属、镰刀霉属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如产自特异腐质霉、嗜热黄毁丝霉和尖孢镰刀菌的真菌纤维素酶，它们公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO89/09259中。

尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是诸如那些在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、U S5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的纤维素酶变体。

可商购获得的纤维素酶包括Renozyme^TM、Celluclean^TM、Endolase^TM、Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(Novozymes A/S)、Clazinase^TM、和PuradaxHA^TM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶:

合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌来源的酶。包括化学改性的或蛋白质工程的突变型。可用的过氧化物酶实例包括获取自鬼伞菌的过氧化物酶，例如获取自灰盖鬼伞的过氧化物酶，其变体描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中。

可商购获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

当存在于清洁组合物中时，上述酶可以按所述组合物的重量计约0.00001％至约2％，约0.0001％至约1％或者甚至约0.001％至约0.5％酶蛋白的含量存在。

酶稳定剂-用于洗涤剂中的酶可使用多种技术来稳定。本发明使用的酶可由最终组合物中存在的钙和/或镁离子水溶性源来稳定，最终产物将这种离子提供给酶。也可使用其它常规稳定剂，例如多元醇，诸如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物诸如4-苯甲酰硼酸，所述组合物可以按照例如WO92/19709和WO 92/19708描述的方法配制。

溶剂-合适的溶剂包括水与其它溶剂如亲脂性流体。合适的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其它硅氧烷、烃、二元醇醚、甘油衍生物如甘油醚、全氟胺、全氟化和氢氟醚溶剂、低挥发性无氟有机溶剂、二醇溶剂、其它对环境友好的溶剂、以及它们的混合物。

洗涤方法

本发明包括一种清洁和/或处理某一部位，特别是表面或织物的方法，上述方法包括以下步骤:将申请人的清洁组合物实施例(以纯物质形式或稀释在洗涤液体中)与至少部分表面或织物接触，然后任选地漂洗上述表面或织物。可在上述漂洗步骤之前对所述表面或织物进行洗涤步骤。对本发明而言，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。正如本领域的技术人员所了解，本发明的清洁组合物可理想地用于洗衣用途。因此，本发明包括一种用于洗涤织物的方法，所述方法包括以下步骤:将待洗涤的织物与所述清洁洗涤溶液接触，所述洗涤溶液包含申请人的清洁组合物、清洁助剂或它们的混合物的至少一个实施例。织物可包括任何能够在正常消费者使用条件下洗涤的大部分任何织物。所述溶液优选具有约8至约10.5的pH。所述组合物采用的溶液浓度为约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温通常为约5℃至约90℃。本发明在低水温如30℃以下或25℃或20℃以下是尤其有益的。水与织物的比率通常为约1:1至约30:1。

脂肪酶变体实例

用作缓冲剂和底物的化学物质是至少试剂级的商业产品。

-培养基和溶液:LAS(Surfac PS^TM)和沸石A(Wessalith P^TM)。所用的其它成分是标准实验室试剂。

-材料:EMPA221，来自EMPA St.Gallen，Lerchfeldstrasse 5，CH-9014 St.Gallen，Switzerland

实施例1:酶生产

使用本领域的标准方法，构建一个包含编码脂肪酶的基因的质粒并将其转染进入合适的宿主细胞。

使用恒温34℃，起始体积1.2升的培养基进行补料分批发酵。培养基的最初pH设为6.5。一旦pH升至7.0，通过加入10％H3PO4来保持此值恒定。培养基中的溶解氧水平通过改变搅拌速率以及使用每升培养基每分钟1.0升空气的固定通风速率进行控制。在整个补料分批发酵阶段进料速率维持在一个恒定的水平。分批培养基包含麦芽糖浆作为碳源，尿素和酵母提取物作为氮源，以及痕量金属和盐的混合物。在补料分批发酵阶段连续加入的进料包含麦芽糖浆作为碳源，然而加入尿素和酵母提取物是为了确保充足的氮源供应。

使用本领域已知的标准方法进行脂肪酶的纯化，例如通过过滤发酵上清液和后续的疏水色谱和阴离子交换液，例如实例3中EP0851913EP所述的方法。

实例2:AMSA-自动机械应力检测分析法-用于计算相对性能(RP)。

使用自动机械应力检测分析法(AMSA)测试本专利申请的酶变体。通过AMSA测试，能检测大量小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的狭槽，以及一个牢固挤住织物样品以使其在所有狭槽开口处被洗涤的封盖。在洗涤期间，剧烈摇动所述板、测试溶液、织物和封盖以使得测试溶液接触织物，并施加机械应力。更详细的描述可参见WO 02/42740，尤其是第23至24页的段落“Special method embodiments”。包含洗涤剂测试溶液的容器由在一个金属板中的圆柱形孔洞(直径6mm，深10mm)组成。脏污的织物(测试物质)位于金属板的顶部，用作在容器上的封盖和密封件。另一个金属板位于脏污织物的顶部以避免从任何一个容器溢出任何液体。两个金属板连同脏污织物一起以30Hz的频率和2mm的振幅上下振动。

所述检测分析法在下文指定的试验条件下进行:

 

测试溶液	0.5g/L LAS0.52g/L Na2CO31.07g/L沸石A0.52g/l柠檬酸三钠
		测试溶液体积	160微升
PH值	按原样(≈9.9)
		洗涤时间	20分钟
温度	30℃
		水的硬度	15°dHCa2+/Mg2+/NaHCO3的比率为4:1:7.5
测试溶液中的酶浓度	0.125，0.25，0.50，1.0mg酶蛋白/升(mg ep/l)
		干燥	洗涤性能:织物片在洗涤后立即在自来水中漂洗，并在85℃下风干5分钟气味:织物片在洗涤后立即在自来水中漂洗，并在室温(20℃)下干燥2小时
测试物质	如下所述的霜膏姜黄样品(用作棉纺织物的EMPA221)

表3

通过在50℃下混合5g(Santa Maria，Denmark)姜黄和100g(38％脂肪，Arla，Denmark)霜膏来制备霜膏姜黄样品，混合物在此温度下保留约20分钟并过滤(50℃)移除任何不溶解的颗粒。混合物冷却至20℃，将棉纺样品，EMPA221，浸入此霜膏姜黄混合物，然后在室温下干燥过夜并冷冻直至使用。在2005年5月27日提交的专利申请PA200500775中公开了霜膏姜黄样品的制备方法。

酶变体的性能可通过用具体酶变体洗涤的织物样品的颜色亮度进行测量。亮度也可用白光照明时从织物样品反射的光强度表示。当织物脏污时，其反射光的强度比清洁织物的反射光强度低。因此反射光的强度可用于测量酶变体的洗涤性能。

使用一种专业的平面扫描器(PFU DL2400pro)进行颜色测量，此扫描器用于获取洗涤织物样品的图象。扫描分辨率为200dpi，输出色深24位。为了获得精确的结果，用Kodak反射IT8色卡频繁校准扫描仪。

使用一个特别设计的应用软件(Novozymes Color Vector Analyzer)来从扫描图象中提取光强度值。所述程序从图象中检索24位像素值并将其转化成红、绿和蓝(RGB)值。通过将RGB值相加作为载体，然后提取所得载体的长度来计算强度值(Int):

$\mathrm{Int}=\sqrt{r^2+g^2+b^2}$

变体的洗涤性能(P)根据以下公式计算:

P＝Int(v)-Int(r)其中

Int(v)是用测试酶洗涤的织物表面的光强度值，和

Int(r)是不用测试酶洗涤的织物表面的光强度值。

根据定义，规定相对性能得分是AMSA洗涤的结果:相对性能得分(RP)是测试酶变体的性能(P)之和与参考酶性能的比值:

RP＝P(测试酶)/P(参考酶)

RPavg是指在所有四种酶浓度下(0.125，0.25，0.5，1.0mg ep/l)与参考酶相比较的平均相对性能

RPavg＝avg(RP(0.125)，RP(0.25)RP(0.5)，RP(1.0))

如果变体性能优于参考酶，则认为它表现出改善的洗涤性能。

在本发明的情况下，参考酶是序列标识号:2的脂肪酶，它具有T231R+N233R的取代。

实施例3:用于计算效险的GC-气相色谱-。

通过固相微萃取气相色谱法(SPME-GC)，使用以下方法测量脂肪酶洗涤样品中的丁酸释放。将在包含1mg/L脂肪酶的表1指定溶液中洗涤的四个织物片(直径5mm)转移至气相色谱(GC)瓶。在一个配有一个Stabilwax-DA w/Integra-Guard柱(30m，0.32mm内径和0.25micro-m df)和一个Carboxen PDMS SPME纤维(75micro-m)的Varian3800GC上分析样品。每个样品在40℃预培养10分钟，然后用SPME纤维在织物片上的顶部空间中取样20分钟。随后将样品注入色谱柱(进样口温度＝250℃)。柱流量＝2mL氦/分钟。柱温箱温度梯度:0分钟＝40℃，2分钟＝40℃，22分钟＝240℃，32分钟＝240℃。用FID检测器检测丁酸，并基于丁酸标准曲线计算丁酸的量。

脂肪酶变体的风险性能气味(R)是从脂肪酶变体洗涤样品释放的丁酸与从序列标识号:2的脂肪酶成熟部分洗涤样品释放的丁酸量之间的比率，两个值都使用从无脂肪酶的洗涤样品释放的丁酸量进行校正。根据以下公式计算变体的风险(R):

气味＝1mg酶蛋白测得的微克丁酸/l空白校正

α_测试酶＝气味_测试酶-空白

α_参考酶＝气味_参考酶-空白

R＝α_测试酶/α_参考酶

如果一个变体的R系数小于1，即认为它表现出比参考减少的气味。

实施例4:相对于在280nm的吸光度的活性(LU)

通过以下检测分析法LU/A280测定脂肪酶相对于在280nm的吸光度的活性:

使用***树胶作为乳化剂，乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)来制备脂肪酶底物。然后在pH-恒定滴定试验中，在30℃，pH7或pH9条件下水解三丁酸甘油酯。一单位脂肪酶活性(1LU)相当于能够在pH7条件下，每分钟释放1微摩尔丁酸的酶量。

测量纯化脂肪酶在280nm的吸光度(A280)并计算LU/A280比率。变体的LU/A280除以参考酶的LU/A280来计算相对LU/A280。在本发明的情况下，参考酶是序列标识号:2的成熟部分，它具有T231R和N233R的突变。

实施例5:BR-效险

将描述性能与气味减少风险比的效险系数因此定义为:BR＝RP_avg/R

如果一个变体的BR系数高于1，即认为它表现出改善的洗涤性能和减少的气味。

应用以上方法获得的结果如下:

 

变体	在序列标识号:2的成熟部分的突变	RP	BR	LU/A280
					1	I202G+T231R+N233R	0.84	1.41	未确定的
2	I86V+L227G+T231R+N233R+P256K	1.08	1.52	1700
					3	Q4V+S58N+V60S+T231R+N233R	0.87	1.73	1950
4	S58N+V60S+I90R+T231R，N233R	1.06	1.27	2250
					5	I255Y+T231R+N233R	1.19	1.17	3600
6	I90A+T231R+N233R+I255V	1.13	1.14	2700
					参考文献	T231R+N233R	1.00	1.00	3650
7	G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270H+271T+272P+273S+274S+275G+276R+277G+278G+279H+280R	0.43	未确定的	850
					8	G91A+E99K+T231R，N233R+Q249R+270H+271T+272P+273S+274S+275G+276R+277G+278G	0.13	未确定的	500

表4

WO 2000/060063描述了表4中的参考脂肪酶和变体7和8。

实施例6

BR-效险

测量表5中列出的变体的效险。用与实施例5中所述方法相同的方法测量效险系数，所有列出的变体其效险系数都大于1。

 

变体	在序列标识号:2
		参考文献	T231R+N233R
9	L97V+T231R+N233R
		10	A150G+T231R+N233R
11	I90R+T231R+N233R
		12	I202V+T231R+N233R
13	L227G+T231R+N233R+P256K
		14	I90A+T231R+N233R
15	T231R+N233R+I255P
		16	I90V+I255V+T231R+N233R
17	F211L+L227G+T231R+N233R+I255L+P256K
		18	S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L
19	S58N+V60S+T231R+N233R+Q249I
		20	A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
21	K46L+S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L+D254I
		22	Q4L+E43T+K46I+S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L+D254I
23	Q4L+S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L+D254I
		24	K46I+S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L+D254L
25	K46L+S58N+V60S+K223I+T231R+N233R+D254I
		26	E43T+K46I+S58N+V60S+T231R+N233R+Q249L+D254I
27	S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		28	K24R+K46R+K74R+I86V+K98R+K127R+D137K+A150G+K223R+T231R+N233R
29	S58A+V60A+I86V+T231R+N233R

 

30	K24R+K46R+S58N+V60S+K74R+I86V+K98R+K127R+D137K+K223R+T231R+N233R
		31	S58A+V60A+I86V+A150G+T231R+N233R
32	S58N+V60V+D62G+T231R+N233R
		33	Q4V+S58N+V60S+I86V+T231R+N233R+Q249L
34	Q4V+S58N+V60S+I86V+A150G+T231R+N233R+I255V
		35	Q4V+S58N+V60S+I90A+A150G+T231R+N233R+I255V
36	Y53A+S58N+V60S+T231R+N233R+P256L
		37	I202L+T231R+N233R+I255A
38	S58A+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		39	D27R+S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
40	V60K+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		41	Q4V+S58A+V60S+S83T+I86V+A150G+E210K+L227G+T231R+N233R+P256K
42	Q4V+V60K+S83T+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		43	D27R+V60K+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
44	Q4N+L6S+S58N+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		45	E1N+V60K+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
46	V60K+I86V+A150G+K223N+G225S+T231R+N233R+P256K
		47	E210V+T231R+N233R+Q249R
48	S58N+V60S+E210V+T231R+N233R+Q249R
		49	Q4V+V60K+I90R+T231R+N233R+I255V
50	Q4V+V60K+A150G+T231R+N233R
		51	V60K+S83T+T231R+N233R
52	V60K+A150G+T231R+N233R+I255V
		53	T231R+N233G+D234G
54	S58N+V60S+I86V+A150G+E210K+L227G+T231R+N233R+Q249R+P256K

 

55	S58N+V60S+I86V+A150G+E210K+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K
		56	S58N+V60S+I86V+A150G+G156R+E210K+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K
57	S58T+V60K+I86V+N94K+A150G+E210V+L227G+T231R+N233R+P256K
		58	S58T+V60K+I86V+D102A+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
59	S58T+V60K+I86V+D102A+A150G+E210V+L227G+T231R+N233R+P256K
		60	S58T+V60K+S83T+I86V+N94K+A150G+E210V+L227G+T231R+N233R+P256K
61	S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K
		62	G91S+D96V+D254R
63	V60L+G91M+T231W+Q249L
		64	T37A+D96A+T231R+N233R+Q249G
65	E56G+E87D+T231R+N233R+D254A
		66	E210K+T231R+N233R
67	D27H+E87Q+D96N+T231R+N233R+D254V
		68	F181L+E210V+T231R+N233R
69	D27N+D96G+T231R+N233R
		70	D96N+T231R+N233R
71	T231R+N233I+D234G
		72	S58K+V60L+E210V+Q249R
73	S58H+V60L+E210V+Q249R
		74	Q4V+F55V+I86V+T231R+N233R+I255V
75	Q4V+S58T+V60K+T199L+N200A+E210K+T231R+N233R+I255A+P256K
		76	Q4V+D27N+V60K+T231R+N233R
77	I90F+I202P+T231R+N233R+I255L

 

78	S58N+V60S+D158N+T231R+N233R
		79	S58N+V60S+S115K+T231R+N233R
80	S58N+V60S+L147M+A150G+F211L+T231R+N233R
		81	V60K+A150G+T231R+N233R
82	I90V+L227G+T231R+N233R+P256K
		83	T231R+N233R+I255S
84	I86G+T231R+N233R
		85	V60K+I202V+E210K+T231R+N233R+I255A+P256K
86	I90G+I202L+T231R+N233R+I255S
		87	S58G+V60G+T231R+N233R

表5

在WO 2000/060063中描述了参考脂肪酶。

洗涤剂实例

用于实例的缩写组分的确认如下所示:

LAS                         直链C_11-13烷基苯磺酸钠。

CxyAS                       C_1x-C_1y烷基硫酸钠

CxyEzS                      与平均z摩尔环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基硫酸钠

CxyEy                       C_1x-C_1y醇，具有平均乙氧基化度z

QAS                         R₂.N+(CH₃)₂(C₂H₄OH)，其中R₂＝C₁₀-C₁₂

硅酸盐                      无定形硅酸钠(SiO₂:Na₂O的比率为1.6:1至3.2:1)。

沸石A                       分子式为Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂.27H₂O的水合硅铝酸钠，具有0.1

                            至10微米范围内的原生粒度(重量基于无水表述)。

(Na-)SKS-6                  结晶层状硅酸盐，分子式为δ-Na₂Si₂O₅。

柠檬酸盐                    二水合柠檬酸三钠

柠檬酸                      无水柠檬酸。

碳酸盐                      无水碳酸钠。

硫酸盐                      无水硫酸钠。

MA/AA                       4:1丙烯酸酯/马来酸酯的无规共聚物，平均分子量为约70,000

                            至80,000。

AA聚合物             聚丙烯酸钠聚合物，平均分子量为约4,500。

PB1/PB4              无水过硼酸钠一水合物/四水合物。

PC3                  无水过碳酸钠[2.74Na₂CO₃.3H₂O₂]

TAED                 四乙酰基乙二胺。

NOBS                 壬酰羟苯磺酸钠。

DTPA                 亚乙基三胺五醋酸。

HEDP                 羟乙烷二膦酸盐

EDDS                 1，2-乙二胺-N，N′-二琥珀酸的钠盐，(S，S)异构体

STPP                 三聚磷酸钠

蛋白酶               蛋白分解酶，以商品名

             售自Novozymes A/S，以商品名

               Purafect 

和Purafect 

售自Genencor，以及

                     在专利WO 91/06637和/或WO 95/10591和/或EP 0 251 446

                     中描述的蛋白酶诸如FNA、FN3和/或FN4。

淀粉酶               以商品名

Purafect 

售自Genencor；

                     

和

售自Novozymes

                     A/S的淀粉分解酶。

脂肪酶               在表2的实例5中描述了脂肪酶变体1至5中的任何一种、

                     以及它们的组合。

甘露聚糖酶           售自Novozymes的

CMC或HEC             羧甲基或羟基乙基或酯改性的纤维素

或EMC

SS附聚物             抑泡剂附聚物:12％硅氧烷/二氧化硅，18％硬脂醇，70％淀粉，

                     为颗粒形式。

TEPAE                四亚乙基五胺乙氧基化物

PH值                 20℃时在1％的蒸馏水溶液中测定。

实施例A

由下列制剂举例说明具有颗粒状衣物洗涤剂形式的漂白洗涤剂组合物。

 

	A	B	C	D	E	F
							LAS	20	22	20	15	20	20
QAS	0.7	1	1	0.6	0.0	0.7
							C25E3S	0.9	0.0	0.9	0.0	0.0	0.9
C25E7	0.0	0.5	0.0	1	3	1
							STPP	23	30	23	17	12	23
沸石A	0.0	0.0	0.0	0.0	10	0.0
							硅酸盐	7	7	7	7	7	7
碳酸盐	15	14	15	18	15	15
							AA聚合物	1	0.0	1	1	1.5	1
CMC	1	1	1	1	1	1
							蛋白酶32.89mg/g	0.1	0.07	0.1	0.1	0.1	0.1
淀粉酶8.65mg/g	0.1	0.1	01	0.0	0.1	0.1
							脂肪酶18mg/g	0.03	0.07	0.3	0.1	0.07	0.1
增白剂-Tinopal AMS(Ciba)	0.06	0.0	0.06	0.18	0.06	0.06
							增白剂-Tinopal CBS-X(Ciba)	0.1	0.06	0.1	00	0.1	0.1
DTPA	0.6	0.3	06	0.25	0.6	0.6
							MgSO4	1	1	1	0.5	1	1
PC3	0.0	5.2	0.1	0.0	0.0	00
							PB1	4.4	0.0	3.85	2.09	0.78	3.63
NOBS	1.9	0.0	1.66	1.77	0.33	0.75
							TAED	0.58	1.2	0.51	0.0	0.015	0.28
硫酸盐/水分	余量至100％	余量至100％	余量至100％	余量至100％	余量至100％	余量至100％

在25℃下，实例A中用于洗涤织物的任何组合物在水中的浓度为600ppm至10000ppm，典型的中间条件为2500ppm，并且水与织物的比率为25:1。典型的pH为约10，但可通过改变酸与烷基苯磺酸的钠盐形式的比例来调节pH。

实施例B

由下列制剂举例说明具有颗粒状衣物洗涤剂形式的漂白洗涤剂组合物。

在20℃至90℃下，实例B中用于洗涤织物的任何上述组合物在水中的浓度为10,000ppm，并且水与织物的比率为5:1。典型的pH为约10，但可通过改变酸与烷基苯磺酸的钠盐形式的比例来调节pH。

实施例C

 

	A(重量百分比)	B(重量百分比)	C(重量百分比)	D(重量百分比)	E(重量百分比)	F(重量百分比)
							C25E1.8S	11	10	4	6.32	6.0	8.2
LAS	4	51	8	33	4.0	3.0
							甲酸钠	1.6	0.09	1.2	0.04	1.6	1.2
氢氧化钠	2.3	3.8	1.7	1.9	2.3	1.7
							单乙醇胺	1.4	1.490	1.0	0.7	1.35	1.0
二甘醇	5.5	0.0	4.1	0.0	5.500	4.1
							C23E9	0.4	0.6	0.3	0.3	2	0.3
DTPA	0.15	0.15	0.11	0.07	0.15	0.11
							柠檬酸	2.5	396	1.88	1.98	2.5	1.88
C12-14二甲基氧化胺	0.3	0.73	0.23	0.37	0.3	0.225
							C12-18脂肪酸	0.8	1.9	0.6	0.99	0.8	0.6
硼砂	1.43	I.5	1.1	0.75	1.43	1.07
							乙醇	1.54	1.77	1.15	0.89	1.54	1.15
TEPAE1	0.3	0.33	0.23	0.17	0.0	0.0
							乙氧基化的六亚甲基二胺2	0.8	081	0.6	0.4	0.0	0.0
1，2-丙二醇	0.0	6.6	0.0	3.3	0.0	0.0
							蛋白酶*	36.4	36.4	27.3	18.2	36.4	27.3
甘露聚糖酶*	1.1	1.1	0.8	0.6	1.1	0.8
							淀粉酶*	7.3	7.3	5.5	3.7	7.3	5.5
脂肪酶*	10	32	0.5	3.2	2.4	3.2
							水、香料、染料和其它	余量	余量	余量	余量	余量	余量

^*以mg酶/100g计的数值

¹如US 4,597,898中所述。

²以商品名

购自BASF，以及如WO 01/05874中所述的那些

在发明详述中引用的所有文件都在相关部分中引入以供参考；对于任何文件的引用不应当解释为承认其是有关本发明的现有技术。当本发明中术语的任何含义或定义与引入以供参考的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明实质和范围的情况下可以做出多个其他改变和变型。因此，权利要求书意欲包括在本发明范围内的所有这样的改变和变型。

序列表

Claims (21)

1.一种洗涤剂组合物，所述组合物包含洗涤剂成分和多肽，所述多肽具有脂肪酶活性，并且在所述说明书中给定的测试条件下还具有至少0.8的平均相对性能和至少1.1的效险。

2.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽在所述说明书的给定测试条件下具有小于1.00的相对LU/A280。

3.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是细菌多肽。

4.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是真菌多肽。

5.如权利要求4所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是嗜热真菌属多肽。

6.如权利要求5所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是嗜热真菌多肽。

7.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是包含在序列标识号：2中的脂肪酶的变体。

8.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是包含在序列标识号：2的多肽的成熟部分中的脂肪酶的变体。

9.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是包含序列标识号：2的脂肪酶的变体。

10.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是包含序列标识号：2的多肽的成熟部分的脂肪酶的变体。

11.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严谨条件下与序列标识号：1的644至732核苷酸或其互补链杂交。

12.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂成分是0.1％至40％，优选0.1％至12％的阴离子表面活性剂。

13.如权利要求12所述的洗涤剂组合物，其中所述阴离子表面活性剂是烷氧基化的烷基硫酸盐。

14.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂成分是5％至30％的硅铝酸盐和/或磷酸盐助洗剂。

15.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂成分是过氧化物源和漂白活化剂，优选地四乙酰基乙二胺。

16.如权利要求1所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是液体洗涤剂组合物或固体洗涤剂组合物。

17.如权利要求16所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是颗粒状洗涤剂组合物。

18.如权利要求1所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是固体片剂或用可溶性膜包封的液体的单位剂量组合物。

19.一种洗涤方法，所述方法包括在包含如权利要求1所述的洗涤剂组合物的水溶液中洗涤纺织品。

20.如权利要求19所述的洗涤方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)任选地用权利要求1的组合物预处理所述污垢和污渍以形成被任选地预处理过的表面；

(b)将有效量的权利要求1的组合物加入到水中，以形成包含约500至约10000ppm的所述组合物的洗涤水溶液；

(c)使所述洗涤水溶液与被任选地预处理过的表面接触，和

(d)任选地向所述洗涤水溶液和被任选地预处理过的表面提供搅拌。

21.如权利要求19所述的洗涤方法，其中所述水溶液的温度低于30℃。