CN101372701B - 一种金针菇多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种操作简便、设备投入小的金针菇多糖的制备方法，工艺步骤包括斜面菌种活化、摇瓶种子培养、液体深层发酵、连续发酵、超滤膜分离并浓缩、醇沉。采用本发明制备金针菇多糖，可在发酵罐内实现连续发酵，延长发酵时间，简化操作流程，提高多糖得率。
Description
技术领域
本发明涉及一种金针菇多糖的制备方法，尤其是一种采用发酵法生产金针菇多糖的方法。
背景技术
金针菇[Flainmulina velutipes(Fr.)Singer]又名朴菇，毛柄金钱菌，是古今中外著名的保健食用菌之一。金针菇多糖是从金针菇中提取、分离、纯化的一种多糖，能促进蛋白质、核酸的合成，提高机体生物免疫力。目前金针菇多糖可从子实体、菌丝体和深层发酵液中提取，人工栽培金针菇周期长，从中提取多糖工艺不容易控制，且成本高、产量低。与其相比，从液体深层培养液中获得多糖，具有明显的优势。
中国发明专利申请CN101143002A披露了一种采用深层液体发酵法生产富硒金针菇多糖的制备方法：将金针菇孢子接种至新鲜的固体斜面上进行培养，待斜面长好后移至液体培养基中进行种子液的培养；再通过三级发酵，最后转入3000L的发酵罐内进行深层液体发酵培养，发酵结束后对发酵液进行超滤浓缩、醇提、冷冻干燥得到胞外金针菇多糖粉。该方法选用葡萄糖作为主要的碳源影响了胞外多糖的得率，为了延长发酵时间，采用多级间歇式发酵，操作烦琐，设备投入大，且容易造成污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、设备投入小的金针菇多糖的制备方法，使其生产胞外多糖时，在发酵罐内实现连续发酵，延长发酵时间，简化操作流程，提高多糖得率。
为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案：
(1)斜面菌种活化：
将市售金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养10-14天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
培养时间优选12天。
(2)摇瓶种子培养：
三角瓶内装种子培养基，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4-6天；
种子培养基有下列常规用量的成分组成：
碳源为蔗糖、玉米粉；氮源选自蛋白胨、尿素、黄豆饼粉、蚕蛹粉、玉米浆、酵母浸出液、氨基酸、麸皮中一种或几种；维生素选自维生素B1、维生素B2的一种或两种合用；无机盐为磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰中的一种或几种。
培养基进一步优选：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5，培养液初始pH值为6.0-7.0。
(3)液体深层发酵：
将摇瓶种子接入装有培养基的发酵罐发酵，发酵温度为28-30℃，发酵时进行通气搅拌；
培养基有下列常规用量的成分组成：
碳源为蔗糖、玉米粉；氮源选自蛋白胨、尿素、黄豆饼粉、蚕蛹粉、玉米浆、酵母浸出液、氨基酸、麸皮中一种或几种；维生素选自维生素B1、维生素B2的一种或两种合用；无机盐为磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰中的一种或几种。
培养基进一步优选：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
发酵的条件为：pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至发酵结束，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
(4)连续发酵：
液体深层发酵60-75小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为1000-5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/8-1/3。
超滤膜分子量截留值优选为4000。
浓缩后浓缩液的体积降至原来的1/5。
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置12-24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得。
液体深层发酵可采用多级发酵的工艺，末级发酵后接着连续发酵。
本发明选用蔗糖作为培养基的碳源比选用葡萄糖更能提高胞外多糖的产量是通过下述试验体现的：
试验例1金针菇多糖深层发酵培养基中碳源的优选
1.1、材料与方法
1.1.1材料与仪器
材料：可溶性淀粉，蛋白胨，葡萄糖，硫酸镁，磷酸二氢钾。
仪器：刻度吸管(10mL14个)，三角烧瓶(500mL14个、250mL10个)，试管(20个)，纱布，棉花，吸耳球，药匙，电炉子，恒温震荡培养箱，蒸发皿(6个)，滤布，酒精灯，接菌针，无菌间等。
1.1.2试验方法
1.1.2.1金针菇摇瓶培养
菌种活化：用综合PDA培养基做试管斜面，活化试管保藏菌种。
培养：用500mL三角烧瓶加入200mL培养基(配方如下)培养，利用单因素实验选择最佳培养基。培养条件为：温度26℃，转数180r/min，培养6d-7d。
1.1.2.1供试培养基的配比
试验用培养基配方：
配方1：葡萄糖3％，玉米粉0.5％，黄豆汁2％，麸皮5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，维生素B10.005％。
配方2：蔗糖3％，玉米粉0.5％，黄豆汁2％，麸皮5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，维生素B10.005％。
分别按上述两种配方进行培养，除培养基碳源的组成不一致外，其余工艺条件均相同。
培养结束后，发酵液离心，取上清液，浓缩，加入3倍量95％乙醇沉淀，滤过，取滤渣干燥，称重。计算多糖得率。[得率＝多糖重(g)/发酵液体积(ml)×100％]。
1.2、结果
试验结果见表1，结果表明，选用双糖—蔗糖作为碳源，胞外多糖的产量多于采用葡萄糖作为主要碳源的产量。
表1不同碳源对胞外多糖产量的影响(n＝3)
| 试验组 | 多糖得率(％) |
| 配方1 | 0.25 |
| 配方2 | 0.38 |
在发酵后期，罐内多糖存在反馈抑制现象：当浓度升高到一定程度，生物体多糖的合成与外排将受到抑制；同时，发酵液中已经生成的多糖亦会被生物体消耗。这时，将发酵液在密闭稳态的条件下通过膜分离装置，固体菌丝体被截流在反应器内继续利用，而多糖则随着发酵液被排出，在滤过的同时补充新鲜培养液到反应器内，这样就降低了发酵液中多糖的浓度，打破反应平衡，促进生物体的发育和代谢产物的转化，实现连续发酵，延长发酵时间，同时减少反应后期生物体对多糖的消耗，提高代谢物的产率。连续发酵生产与间歇发酵生产相比的优势通过下述试验体现：
试验例2连续发酵与间歇式发酵多糖产量的比较
2.1试验方法
2.1.1单级发酵工艺
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养12天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。
(3)单级发酵培养：
5L发酵罐培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至放罐前，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
放罐标准：发酵时间70小时，菌丝球上浮1/3，镜检有锁状联合，无杂菌。
发酵结束后，将发酵液离心，收集上清液。
(4)超滤膜分离并浓缩：
将上述发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/5。
(5)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，称重。
2.1.2多级间歇式发酵工艺
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养12天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。
(3)二级发酵培养：
5L种子罐发酵培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至转罐前，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
转罐标准：发酵时间70小时，菌丝球上浮1/3，镜检有锁状联合，无杂菌。
50L发酵罐发酵培养：
将种子接入装有20L培养基的发酵罐发酵，接种量为10％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至转罐前，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
放罐标准：发酵时间40小时，菌丝球上浮1/2，镜检有锁状联合，无杂菌。
发酵结束后，将发酵液离心，收集上清液。
(4)超滤膜分离并浓缩：
将上述发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/5。
(5)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，称重。
2.1.3连续发酵工艺
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养12天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50m1三角瓶内装种子培养基20m1，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.0-7.0。
(3)液体深层培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为1％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至结束，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
(4)连续发酵：
液体深层发酵70小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/5。
(5)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，称重。
2.2试验结果
试验结果见表2
表2三种发酵方式发酵时间和产量的比较
试验结果表明，采用连续发酵生产金针菇多糖，可延长在单级发酵罐内的发酵时间，产量约是同等条件下单级发酵的10倍；在总发酵时间少于间歇式发酵时间的情况下，产量高于后者，可以减少设备投入，简化工艺流程，降低生产成本。
下面将结合具体实施方式对本发明做进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养12天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.5。
(3)液体深层培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为1-10％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至结束，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
(4)连续发酵：
液体深层发酵70小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/5。
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置18小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得196.3g金针菇多糖。
实施例2
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养10天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.0。
(3)液体深层培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为10％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至结束，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
(4)连续发酵：
液体深层发酵60小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为1000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/8。
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置12小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得142.1g金针菇多糖。
实施例3
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养14天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养6天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，氨基酸0.5％，酵母浸出液2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为7.0。
(3)液体深层培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的5L发酵罐发酵，接种量为5％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至结束，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，蚕蛹粉1％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1。
(4)连续发酵：
液体深层发酵75小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3。
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得132.5g金针菇多糖。
实施例4
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养12天。
所选马铃薯综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
(2)摇瓶种子培养：
50ml三角瓶内装种子培养基20ml，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养5天；
种子培养基配方：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，培养液初始pH值为6.5。
(3)液体深层培养：
5L种子罐发酵培养：
将摇瓶种子接入装有2L培养基的发酵罐发酵，接种量为1％，发酵的条件为：发酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至转罐前，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
转罐标准：发酵时间70小时，菌丝球上浮1/3，镜检有锁状联合，无杂菌。
50L发酵罐发酵培养：
将种子接入装有20L培养基的发酵罐发酵，接种量为10％，发酵的条件为：酵温度为28-30℃；pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，通气量为1：1，v/v/m，搅拌速度为180r/m；24h至发酵结束前，通气量控制在1.2：1，v/v/m，搅拌速度为210r/m。
培养基配比：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
(4)连续发酵：
50L发酵罐发酵60小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，母液回流至发酵罐重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为1000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/5。
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置12小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得3421.6g金针菇多糖。
Claims (8)
1.一种金针菇多糖的制备方法，其特征在于所述的方法包含下列步骤：
(1)斜面菌种活化：
将金针菇菌种移接至马铃薯汁综合培养基斜面上，24℃恒温培养10-14天；
(2)摇瓶种子培养：
三角瓶内装种子培养基，灭菌，冷却后接斜面母种，振荡培养，共培养4-6天；
(3)液体深层发酵：
将摇瓶种子接入装有培养基发酵罐发酵，接种量1-10％，发酵温度为28-30℃，发酵时进行通气搅拌；
(4)连续发酵：
液体深层发酵60-75小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态下连续排放滤液，固体菌丝体被截流在发酵罐内重复使用，同时以泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，维持罐内的发酵条件，整个过程维持30小时，结束发酵，收集所有滤液，发酵罐内残余的发酵液离心后收集上清液与上述滤液合并，即得总发酵液；
(5)超滤膜分离并浓缩：
将上述总发酵液通过分子量截留值为1000-5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/8-1/3；
(6)醇沉：
加入3倍体积量的95％乙醇至上述浓缩液，0-4℃静置12-24小时，收集沉淀，洗涤干燥，即得；
所述的摇瓶种子培养基和液体深层培养基含有下列重量体积百分比的物质：玉米粉3％，蔗糖1％，麸皮1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，维生素B1和维生素B2各0.005％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的马铃薯汁综合培养基含有下列重量体积百分比的物质：葡萄糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，马铃薯汁20％，琼脂2.0％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种活化恒温培养的时间为12天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的摇瓶种子培养的条件为：25℃下，摇床转速200r/min，摇瓶装液量为三角烧瓶总容量的2/5，培养液初始pH值为6.0-7.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的液体深层发酵的条件为：pH变化范围在5.5-7.0；培养前期24h，每分钟内每1L发酵液通入的空气量为1L，搅拌速度为180r/m；24h至发酵结束，每分钟内每1.2L发酵液通入的空气量为1L，搅拌速度为210r/m。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述超滤膜分子量截留值为4000。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述超滤膜浓缩后浓缩液的体积降至原来的1/5。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的液体深层发酵可采用多级发酵的形式。
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