CN101370945A

CN101370945A - 用于鉴别大量野生型dna背景中多个dna突变标记的方法

Info

Publication number: CN101370945A
Application number: CNA2006800425452A
Authority: CN
Inventors: 郭保川
Original assignee: Cleveland State University
Current assignee: Cleveland State University
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2026-10-13
Also published as: ATE548469T1; EP1951901B1; WO2007047572A2; CN101370945B; WO2007047572A3; US20120252013A1; EP1951901A4; US20090042196A1; EP1951901A2; US8076082B2

Abstract

本发明描述了用于同时测量大量DNA突变标记的状态的方法。此外，本发明还描述了用于在单个分析中同时测定一组基因的多个位点上的甲基化状态的方法。

Description

用于鉴别大量野生型DNA背景中多个DNA突变标记的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年10月14日提交的美国临时申请60/727,168的优先权。本文将美国临时申请60/727,168通过引用作为参考。

背景技术

尽管有成像技术的最新进展，癌症仍然经常在转移已经发生之后才被诊断出来。作为转移之后检出的结果，出现来自癌症的不必要的死亡。因此，在转移之前检出癌症具有急迫的社会优先性。

一种用于这种早期检出的方法是分子检测法。使用分子标记来检测癌症的分子检测法是作为一种用于癌症筛查的具有吸引力的方法而出现的，是因为它能够允许医师通过分析一滴体液或少量的粪便样品在最早的阶段检出癌症。

DNA突变和异常的基因甲基化是最常见的导致癌症发育的DNA变异现象。例如，在大约50～60％的所有癌症中，出现基因p53突变。在许多种类的癌症中发现了异常的基因甲基化。因此，DNA突变和甲基化用作癌症的指示物或标记，因此如果被鉴别出来，可以用于诊断癌症。因为这一点，努力开发基于DNA的检测方法来筛查癌症。例如，开发了基于突变分析几个基因的粪便DNA检测法用于筛查结肠直肠癌(CRC)。

尽管被用作癌症指示物，当用于筛查时突变分析仍然存在技术难题。这是因为两个原因。首先，检出临床样品的突变需要高灵敏度的方法。因为临床试样在极其大量的野生型序列中含有少量的突变序列(常常小于1％)，只有高灵敏度检测法才能够使用。此外，癌症可以由涉及不同基因中的突变累积的不同途径引起，因此没有单个突变现象可以用作可靠的癌症指示物。因此，必须使用一组或一系列基因来检出癌症。例如，粪便DNA检测法应用k-ras、p53、APC和BAT26的突变作为标记来检测结肠直肠癌。此外，基因突变常常发生在不同的碱基。例如，APC突变可以发生在其前1600个密码子内的任意位置。因此，临床检测必须能够在极其大量的野生型DNA中检测出大量标记的突变状态。

其次，癌症筛查必须是费用低廉的，因为该因素最终决定了该方法用于医疗治疗的程度。粪便隐血试验(fecal occult testing)是一个很好的例子。粪便隐血试验不是特别灵敏的，但是比其他方法更有成本效益。结果，粪便隐血试验成为美国预防服务特别小组推荐用于CRC筛查的方法。事实上，对于医疗政策制定者和/或保险公司来说，不可能接受成本高昂的筛查方法。因此，除了提供合理的灵敏度之外，好的临床筛查试验必须是费用低廉的。

已经有许多方法用来检测突变。通常，这些方法可以分为两组。在一组方法中，聚合酶链式反应(PCR)是检测***的组成部分。这些方法依赖于突变体等位基因的选择性扩增，允许灵敏检测极其大量的野生型等位基因中的突变体等位基因。等位基因特异性扩增法(ASA)和突变体富集PCR法(ME-PCR)是用于该用途的两个广泛使用的方法，这两个方法都能够检测出极其大量的野生型DNA中的突变体DNA，该野生型DNA具有比突变体DNA高100,000倍的量。不过，这些方法通过PCR富集突变体DNA，每一个PCR反应一般检测一个突变。如前所述，必须使用大量突变来获得高的筛查灵敏度。因此，如果使用这组方法进行癌症筛查，将需要许多PCR反应，从而增加了筛查成本。因此，采用这组方法的检测法不是费用低廉的，因此不适合用于临床筛查。

在第二组方法中，在通过PCR将靶序列扩增之后来分析突变。可以使用例如序列测定法、DHPLC、DNA微阵列、DGGE和SSCP的技术来分析突变。与第一组方法不同，第二组方法可以在长的序列跨度内检测突变。不过，这些方法不是足够灵敏的以检出大量野生型DNA背景中的突变。因此，虽然这组方法常常被用于检测来自于突变体DNA的丰度相对高的切除肿瘤样品的DNA突变，这组方法低的灵敏度已经阻碍了它们用于检测来自突变体DNA的丰度较低的临床试样例如体液和粪便的DNA突变。因此，由于它们低的灵敏度，第二组方法也不适合用于临床筛查。

近来，已经提出了用于突变分析的PCR/连接酶检测反应(LDR)法，该方法用DNA微阵列组合了聚合酶链式反应/连接酶检测反应。该方法的特征是它能够测量许多标记的突变状态，并且已经被用于检测来自临床试样的DNA突变。不过，这种方法具有局限性。虽然对于单个突变***，报道了高的灵敏度，但是当使用PCR/LDR来测量许许多多的突变时，仍然存在有获得高灵敏度的难题。这是因为对于所有的序列来说，LDR不是同等灵敏的，因为它依赖于连接酶识别不同序列的能力。更重要的是，序列之间通过PCR的扩增变化很大，因此在复合设置(multiplexed setting)中一些突变可能不是可检测出的。因此，如果突变的序列在多重PCR中被低效地被扩增，将难于检测它们。

很清楚地，对于以灵敏的和费用低廉的方式分析大量野生型DNA背景中的DNA突变标记的状态，在本领域有迫切的需求。

如前所述，异常的基因甲基化是一种常常导致癌症的DNA变异现象。甲基化是指将甲基(-CH₃)生化添加到生物分子中。在基因的5’调节区上的CpG二核苷酸的异常甲基化是常见的导致基因沉默的现象。作为CpG岛超甲基化的结果，启动子的染色质结构可以被改变，从而阻止了正常的与转录机制之间的相互作用。现在人们清楚，在癌症中异常的甲基化是普遍的现象。如果这发生在对生长抑制关键的基因中，所产生的转录沉默可以促进肿瘤发育。因此，与突变一样，启动子CpG岛超甲基化是使肿瘤抑制基因转录失活的常见机理。甲基化分析具有相当大的重要性，因为甲基化分析不仅获得了对癌症的了解，而且这种分析还导致发现治疗和诊断生物标记。近来，监测DNA甲基化的整体变化已经被用于癌症的分子分类。最近，人们发现，甲基化与癌症治疗相关。因此，还可以使用甲基化标记来分类和预测癌症的类型和阶段，癌症的治疗结果和成活率。

甲基化分析对于表征DNA甲基化是关键的。不过，尽管其非常重要，甲基化分析仍然存在技术难题，尤其是分析生物样品时。这是由于两个原因。第一个原因是灵敏度。用于分析临床样品的方法必须是灵敏的，因为生物样品是异质的，常常在大量未甲基化序列中含有少量的甲基化序列。例如，组织带检物例如植入石蜡的样品含有低达1％的变异DNA，而且在其它临床生物样品例如体液、血液、尿和粪便中它们的丰度甚至更低。因此，只有高灵敏度的分析法能够显示出大量未甲基化DNA中的甲基化。

涉及甲基化分析是技术难题的第二个原因是倍增能力(multiplexingcapability)。癌症由涉及许多基因的甲基化累积的不同途径产生，并且没有单个甲基化现象可以提供用于癌症分析的准确的指示物。因此，必须描述大量基因的分布图来表征与癌症相关的甲基化。因此，用于甲基化分析的技术还应该具有高阶倍增能力。此外，在临床样品中变异的DNA分子的数量是有限的。对于甲基化分析来说这尤其是一个问题，因为在亚硫酸氢盐处理之后仅仅能够回收10-20％DNA分子。因此，对于甲基化分析来说倍增能力是必需的，因为在临床生物样品中没有足够量的变异DNA分子来允许一次分析一个基因。

甲基化分析能够从整体上描绘出甲基化分布图，鉴定一组CpG位点或基因上的甲基化模式，以及测定单个CpG位点上的甲基化水平。甲基化限制性酶消化法是一种用于甲基化分析的好方法，但是大多数目前使用的方法是基于亚硫酸氢盐处理，该亚硫酸氢盐处理能够将胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶残基保持不变。然后用特异性引物通过PCR扩增处理过的DNA以获得所有尿嘧啶残基都被转变为胸腺嘧啶的片段。作为由亚硫酸氢盐处理所产生的甲基化和未甲基化DNA序列中的差别的结果，可以使用常规的突变分析法来测定CpG位点上的甲基化状态。因此，在亚硫酸氢盐处理之后通过突变分析法可以测定CpG位点的甲基化状态。

可以将现行的用于甲基化分析的基于亚硫酸氢盐的方法分为三种方法。第一种方法是基于亚硫酸氢盐的序列测定法，该方法能够描绘出基因启动子内部的甲基化胞嘧啶残基。其优点是它鉴定出基因启动子内部的每一个甲基化胞嘧啶残基，但是其缺点是灵敏度低以及缺乏倍增能力。第二种方法用DNA微阵列组合了亚硫酸氢盐法-PCR以在靶序列内部使甲基化等位基因和未甲基化等位基因区别。这种方法允许平行测定在许多目标基因内部的许多CpG位点上的甲基化状态。但是，它不是足够灵敏的，以使测定大量未甲基化DNA背景中的少量甲基化DNA。第三种方法是甲基化特异性PCR(MSP)以及它的许多变化例如MethyLight。这种方法是高度灵敏的，能够检出10,000个拷贝的未甲基化等位基因中的一个甲基化等位基因。此外，基于实时的MSP可以定量甲基化DNA的丰度。但是，这种方法通常一次分析一个基因的甲基化状态，具有有限的倍增能力。此外，这种方法测定仅在几个临近CpG位点上的甲基化状态。很清楚地，这些方法或者是不足够灵敏的，或者不具有倍增能力，或者同时具有两个缺点。

最近，开发出了两种基于连接作用的方法用于甲基化分析。在第一种方法中，PCR/LDR法被用于甲基化分析。这种方法与先前提到的为突变分析而开发的技术类似。简言之，它首先利用多重PCR来扩增多个靶DNA序列，接着进行连接反应。然后使用微阵列分析连接产物来测定每一个靶CpG位点上的甲基化状态。在第二种方法中，使用基因分型体系来进行甲基化检测。与第一种方法不同，第二种方法应用连接作用来生产甲基化和未甲基化的等位基因，然后接着进行多重PCR以扩增含有每一个靶CpG位点的序列。使用微阵列分析每一个CgG位点上的甲基化状态。基于连接作用的方法可以检测许多目标基因的多个CgG位点上的甲基化状态。但是，它们的检出灵敏度仍然相对较低，因此通常被用于分析含有大于等于10％的变异DNA的样品。这种灵敏度无疑不是足够高，以使检出许多类型的临床生物样品中低丰度的甲基化DNA，尤其是变异DNA的丰度小于1％的样品。

很清楚地，对于以灵敏的和费用低廉的方式分析大量野生型DNA背景中许多目标基因的大量CpG位点上的甲基化状态，在本领域有迫切的需求。

发明内容

本示例性实施方式涉及通过DNA分析收集自患者的临床样品进行癌症筛查。具体地，本发明涉及同时测定大量野生型DNA背景中多个DNA标记的变异状态。

在第一方面，本发明提供了一种用于测量大量野生型DNA背景中多个突变标记的方法。该方法包括：提供含有突变体DNA和野生型DNA的样品。所述突变体DNA含有突变。所述方法还包括通过第一PCR扩增样品以生产含有突变位点的DNA片段。所述方法还包括通过进行一个或多个突变体特异性富集循环富集含有突变的突变体DNA片段，从而形成富集体系。所述方法还包括通过第二PCR扩增该富集体系以生产足够量的突变体DNA用于检测。以及，所述方法包括测量靶DNA样品中突变位点的状态。

在另一方面，本发明提供了一种用于生产足够纯的突变体DNA片段的方法，所述突变体DNA片段用于测定大量野生型DNA背景中多个DNA突变位点的突变状态。所述方法包括：提供含有突变体DNA和野生型DNA的DNA样品。所述方法还包括通过多重PCR扩增含有突变位点的DNA序列，从而生产扩增子。以及，所述方法包括从PCR的扩增子中富集具有突变的突变体DNA片段。

在另一方面，本发明提供了一种用于测量大量未甲基化DNA背景中大量CpG位点的甲基化状态的方法。所述方法包括提供含有甲基化DNA和未甲基化DNA的样品。所述方法还包括处理样品以将未甲基化DNA的胞嘧啶基团转变为尿嘧啶基团，而不改变CpG位点上的甲基化胞嘧啶。所述方法还包括用引物通过第一PCR扩增该处理过的样品，从而获得所有的尿嘧啶基团都转变为胸腺嘧啶基团的DNA片段。所述方法还包括通过进行一个或多个甲基化特异性富集循环富集甲基化DNA，从而形成富集体系。所述方法还包括通过第二PCR扩增所述富集体系以生产足够量的甲基化DNA用于检测。以及，所述方法还包括测量CpG位点的甲基化状态。

在另一方面，本发明提供了一种用于生产足够纯的甲基化DNA片段的方法，所述甲基化DNA片段用于测定大量未甲基化DNA背景中多个DNA CpG位点上的甲基化状态。所述方法包括提供含有甲基化DNA和未甲基化DNA的DNA样品。所述方法还包括将DNA样品进行亚硫酸氢盐处理。所述方法还包括通过多重PCR扩增处理后的DNA，从而生产扩增子。以及，所述方法包括从PCR的扩增子中富集含有甲基化CpG位点的甲基化DNA片段。

在另一方面，本发明提供了一种用于除去由多重PCR产生的引物-引物相互作用产物的方法。所述方法包括通过多重PCR扩增靶DNA序列，以及通过序列特异性俘获除去引物-引物相互作用产物来纯化多重PCR的扩增靶序列。

在另一方面，本发明提供了一种用于使多级多重PCR更强大的方法。所述方法包括提供含有靶序列的样品。所述方法还包括通过第一多重PCR扩增样品来形成含有引物-引物相互作用产物的第一扩增样品。所述方法还包括除去至少一部分引物-引物相互作用产物。以及，所述方法在除去引物-引物相互作用产物之后，通过第二PCR形成第二扩增样品。

在另一方面，本发明提供了一种用于平衡多个PCR产物产率的方法，其包括提供含有将要进行扩增的靶序列的DNA样品。所述方法还包括通过第一PCR扩增靶DNA序列。所述方法还包括平衡由第一PCR扩增出的靶序列的量。以及，所述方法包括通过第二PCR扩增平衡过的靶DNA序列。

在另一方面，本发明提供了一种用于平衡由多级多重PCR生产的PCR产物产率的方法。所述方法包括提供含有第一靶序列和第二靶序列得样品。所述方法还包括鉴别第一靶序列和第二靶序列的相对扩增效率。以及，所述方法包括将适合于以第一靶序列为靶点的第一探针和适合于以第二靶序列为靶点的第二探针加入到样品中。第一探针与第二探针的摩尔比基于第一和第二靶序列的相对扩增效率。

附图说明

图1是说明根据本发明优选实施方式的方法的示意图；

图2是说明涉及使用两轮PCR的多重PCR方法的示意图；

图3显示了用不同比例的正常竞争探针与突变体探针富集序列的结果，该序列含有在k-ras的第12位密码子的第一个碱基处的G→T突变：(A)无正常竞争探针；(B)突变体探针超过正常竞争探针2.5倍；(C)突变体探针超过正常竞争探针7.5倍；(D)突变体探针超过正常竞争探针15倍。样品含有1％的突变体DNA，被富集一次。将突变体探针固定为2.5pmol；

图4显示了使用以下用量的突变体探针富集序列的结果，该序列含有在k-ras的第12位密码子的第一个碱基处的G→T突变：(A)1pmol；(B)0.2pmol和(C)0.1pmol。样品含有1％的突变体DNA，仅被富集一次。将正常探针与突变体探针的比例固定为7.5；

图5显示了分别使用一个(A)、两个(B)和三个(C)富集循环富集序列的结果，该序列含有在APC的第1450位密码子的第一个碱基处的C→T突变。该样品分别含有1％(A)、0.1％(B)和0.01％(C)突变DNA；

图6分别显示了富集98bp(A)、278bp(B)和575bp(C)的PCR产物的结果，所有的PCR产物含有相同的在APC的第1450位密码子的第一个碱基处的C→T突变。样品含有1％的突变体DNA，仅被富集一次；

图7显示了测量6个DNA样品中突变状态的结果。每一样品含有0.1％的突变体DNA并通过两个循环的杂交得到富集。样品(A)含有在k-ras的第12位密码子的第一个碱基处的G→T突变；样品(B)含有在p53的第190位密码子的第二个碱基处的C→T突变；样品(C)含有在p53的第248位密码子的第一个碱基处的C→T突变；样品(D)含有在p53的第267位密码子的第二个碱基处的G→C突变；样品(E)含有在p53的第274位密码子的第一个碱基处的G→T突变；样品(F)含有在APC的第1450位密码子的第二个碱基处的C→T突变。结果发现，从每一个样品都鉴定出正确的突变，并且没有观察到假阳性鉴定；

图8是显示根据本发明的另一优选实施方式方法的示意图；

图9是用于MMPA分析法的竞争性杂交策略的原理的示意图；

图10显示了在不同的条件下用MMPA法检测甲基化DNA的结果：(a)不使用甲基化特异性富集检测含有0.1％甲基化DNA的样品；(b)使用甲基化特异性富集检测含有0.1％甲基化DNA的样品；(c)使用甲基化特异性富集检测含有0.01％甲基化DNA的样品；以及(d)使用甲基化特异性富集检测不含有甲基化DNA的样品；

图11显示了由以下方法生产的PCR产物的DNA片段分析谱图：(a)在两轮PCR之间没有序列特异性提取步骤；以及(b)有序列特异性提取步骤。发明详述

在本文中所用的术语“野生型”是指当从天然源分离时具有该基因特征的基因。野生型基因是在人群中最常见的，从而被指定为基因的“正常型”或“野生型”的基因。与之相反，术语“修饰的”或“突变体”是指当与野生型基因相比时，显示出序列修饰(即，改变的特征)的基因。

在本文中所用的术语“等位基因”是指仅仅一个或几个碱基不同的两个序列。

术语“延伸引物”或“引物”是指与靶序列互补的多核苷酸。延伸引物能够使靶序列退火，并且可以作为用于多核苷酸合成的引物，使用野生型或突变体多核苷酸或者两者作为模板。

术语“探针”是指与靶序列互补并且能够优先结合到靶序列的多核苷酸。

如本文中所用的，“杂交”是指由于互补的碱基配对，通过核酸链如单链形成复合结构，尤其是二重结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间，或者在含有少量不匹配区域的核酸链之间。杂交条件应该是足够严格的，以使具有在等位基因之间的杂交强度上的差异性。探针优先与完全互补的靶序列杂交的杂交条件在本领域是公知的，例如如Sambrook等人，分子克隆实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，第三版(Third Edition)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，N.Y.，2001所记载的，通过引用并入本文。严格条件是序列依赖型的，在不同的环境下是不同的。

“PCR扩增”或者简单的“PCR”通常涉及使用核酸序列作为模板用于生产大量的该序列的互补链。可以使该模板与具有与该模板序列的一部分互补的序列的引物杂交，并使之与含有dNTP和聚合酶的适当的反应混合物接触。引物被聚合酶延长，产生与该初始模板互补的核酸。为了扩增双链核酸分子的两条链，可以使用两个引物，每一个引物具有与一条核酸链的一部分互补的序列。例如通过加热使核酸分子链变性，重复该操作，此时前面步骤新合成出的链作为后续步骤的模板。聚合酶链式反应(PCR)扩增程序可以涉及几个到很多个变性、杂交和延长反应循环，以生产足够量的所需要的核酸。

“多重聚合酶链式反应(PCR)”是PCR的变形，在该PCR中，在相同的反应中同时扩增两个或两个以上的序列或基因座(loci)。

“DNA微阵列”(也常常被称为DNA芯片或DNA阵列)是将多个微观DNA点粘附于固体表面例如玻璃、塑料或硅片上，形成分析多个核酸靶的阵列。

部分人基因组被称为“CpG岛”，因为当与它们的周边区域比较时，这些区域富含CpG二核苷酸(即紧接着胞嘧啶脱氧核糖磷酸的是鸟嘌呤脱氧核糖磷酸)。CpG位点上的甲基化胞嘧啶通过亚硫酸氢盐处理时保持不变，而未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。然后可以使用聚合酶链式反应(PCR)扩增该DNA，使得甲基化胞嘧啶被复制为胞嘧啶，而尿嘧啶被复制为胸腺嘧啶。因此，在特定CpG位点上检测出胞嘧啶显示了甲基化，而在正常地含有胞嘧啶的CpG位点上出现胸腺嘧啶显示了在该CpG位点上存在未甲基化的胞嘧啶。结果，在使样品进行亚硫酸氢盐处理之后使用突变分析方法可以实现测定CpG位点上的甲基化状态。

本发明提供了一种在本文中被称为PEPD(PCR-富集-PCR-检测)的方法，该方法以灵敏的和费用低廉的方式同时测定大量DNA突变标记的状态。图1显示了PEPD的原理，其一般包括四个主要步骤。第一步，通过第一多重PCR扩增含有突变体和野生型DNA的DNA样品以产生足够量的DNA片段，该DNA片段含有用于富集标靶的所有突变位点。第二步，通过一个或多个突变体特异性富集循环使突变体DNA富集。这可以通过减少野生型DNA或选择性俘获突变体DNA或者两者的结合来进行。例如，PCR可以与生物素标记的突变体特异性探针杂交以选择性俘获突变体序列，接着减少野生型序列。在从探针中分离之后，可以使富集的DNA再富集，直到得到满意的富集。第三步，然后通过第二多重PCR扩增富集的DNA分子，以产生足够量的突变体DNA用于检测。第四步，使用例如DNA微阵列的方法来测定每一个DNA标记的突变状态。

有几个方面有助于提高PEPD的能力来测定大量野生型DNA中许许多多DNA突变标记的状态。

第一，可以在PEPD中进行多个富集循环，直到获得满意的富集，从而使通过单个阵列检测各种各样的突变成为可能。例如，为了在具有比目的突变体DNA的量高1000倍的正常DNA中检出突变体DNA，如果一个循环富集一些突变体等位基因1000倍，而对其他突变体等位基因只有10倍，那么一个富集循环将会遗漏一些突变。相反地，如果进行三个富集循环，通过使用相同的阵列可以检出所有的突变。

根据PEPD的优选方法，突变体特异性富集技术或循环的循环数可以根据特定的应用和***参数进行改变。不过，一般来说，循环数范围为1至5。优选地，循环数范围为1至3。

第二，在PEPD中在两轮PCR之间进行富集。这对于PEPD的成功来说是关键的。在多个富集循环之后回收的DNA的量可能较低，因为需要严格条件来获得所要求的富集。例如，如果对于每一个循环DNA回收率为1％，在三个循环之后，总回收率将是0.0001％。因此，如果在PCR之前进行富集，将不能够从突变体DNA的量较低的临床样品中回收甚至一个突变体DNA拷贝。这就是不能使用多个富集循环直接从初始临床样品中富集突变体DNA的原因。相反地，在PCR之后，可以回收足够量的突变体DNA。此外，如果没有第二PCR就进行检测，在富集之后，将没有剩余足够量的突变体DNA用于检测。相反地，在富集之后进行另一扩增可以确保有足够量的突变体DNA用于检测。如接下来所描述的，在多重设置中，在两轮PCR之间的富集还使突变体的扩增与检测更强大和特异。

第三，癌症筛查采用大量的DNA标记，因此强大的多重PCR对于多重分析法来说是必须的。进行两轮PCR的多重PCR策略是已知的。第一轮PCR引物具有靶特异性部分和通用尾部。靶特异性部分允许扩增靶序列，而尾部导入用于第二PCR的序列，该第二PCR使用与在第一PCR中所导入的尾部互补的引物。PEPD还可以使用该策略来扩增多个序列。伴随该策略的主要问题是由于在第一PCR过程中形成引物-引物相互作用产物，在该多重设置中第二PCR经常不能充分地扩增一些序列。不过，根据本发明，在PEPD中可以使该问题最小化，因为作为富集的结果，也除去了引物-引物相互作用产物，这使第二PCR更强大。实际上，可以将该富集方法延伸以提供提高多重PCR的扩增的一般方法。

第四，多重PCR的扩增随着序列的变化而变化。也就是说，在多重PCR中一些序列会被低效地扩增。这已经是伴随现有方法的问题，因为被这些低效扩增的序列所含有的突变将会被遗漏，这导致假阴性。不过，该问题被PEPD最小化了。如图1和2所示，在富集之后突变体DNA成为主要部分。第二PCR的扩增依赖于每一序列的拷贝数。结果，在第二PCR之后，突变体序列将是占优势的，即使当它们在第一PCR被低效地扩增。因此，富集确保了足够的突变体DNA扩增。因为突变分析要求仅仅检出突变体DNA，PEPD使突变分析在多重设置中更强大(robust)。

PEPD法是简单的，但是也是强大的，因此可以成为通用的突变检测技术平台。上皮衍生癌构成大多数癌症，可以取出例如血和其他体液的样品，技术人员可以寻找突变体DNA来检测癌症。例如，基于PEPD平台，技术人员可以容易地开发出分析法以在取自支气管肺泡灌洗液(BAL)的DNA中检测与肺癌相关的突变的状态，用来筛查肺癌。

可以以几种不同程序来进行PEPD策略中的富集。可以例如通过突变特异性杂交和提取程序来进行富集，在该突变特异性杂交和提取程序中，在杂交条件下，使多个突变体特异性探针与PCR产物接触，该PCR产物即通常是目标DNA片段的扩增子。每一个突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂交物。优选使突变体特异性探针连接到能够与第二分子结合的第一结合分子上，该第二分子又优选连接到固体载体上。杂交之后，杂交物可以被含有第二结合分子的固体载体俘获。

也可以通过竞争性突变特异性杂交和提取程序来进行PEPD策略中的富集。在杂交条件下，使多个突变体特异性探针和正常竞争探针与PCR产物接触，或者相反暴露于PCR产物中，PCR产物即扩增子例如目标DNA片段。每一个突变体特异性探针优先与突变体序列(例如含于DNA片段中的)形成杂交物，而其对应的正常竞争探针优先与对应的野生型序列形成杂交物。还将所述突变体特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合。杂交之后，杂交物可以被含有第二结合分子的固体载体所俘获。优选地，每一种突变体特异性探针与其对应的正常竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

合适的结合分子的例子包括，但不限于生物素、链霉亲和素以及它们的组合。

在突变特异性杂交和提取富集策略，以及竞争性突变特异性杂交和提取富集策略两者中，可以通过以下步骤来富集目标DNA片段：在固体载体上提取，从该固体载体上释放所述片段，然后使该***和剩余DNA片段进行另外的富集循环。

先前提到的突变体特异性探针和对应的正常竞争探针可以是适宜特定应用的任意探针。这些探针的优选实例包括但不限于：寡核苷酸、肽核酸、锁核酸(LNA)以及它们的组合。LNA是一类双环核酸，其中用亚甲基单元将核糖核苷连接在2’-氧和4’-碳原子之间。锁核酸(LNA)作为一类新的构型严格的寡核苷酸类似物最先为Wengel及其同事于1998年报道。

如上所述，在某些应用中，第一或初始PCR可以是多元的(multiplex)或多重(multiplexed)PCR。在该策略中，使用两对或两对以上的引物。每一对引物包括一个正向引物和反向引物。每一对引物用于扩增含有一个或多个突变位点的序列。每一个引物优选含有靶特异部分和通用尾部。该靶特异部分侧接于目标序列，或相反使其与目标序列连接以允许扩增该序列。对于所有的正向和反向引物，通用尾部的序列优选是相同的。优选地，该通用尾不能够与人基因组序列相结合。优选地，正向引物和反向引物的通用尾的序列可以相同或不相同。

此外，在应用第二PCR的程序中，优选的是，当第一PCR的正向和反向引物的通用尾相同时，第二PCR使用一个通用引物。以及，优选的是，当正向和反向引物的通用尾不相同时，一个通用引物与正向引物的通用尾配对，另一个通用引物与反向引物的通用尾配对。通常，在使用第二PCR的程序中，使含有突变的富集突变体DNA片段与通用引物接触，或相反使其暴露于通用引物中。使通用引物与正向和反向引物的通用尾杂交以扩增富集的DNA片段。

本发明也提供了一种用于生产足够纯的突变体DNA片段的方法，所述突变体DNA片段是用于测定大量野生型DNA背景中多个DNA突变位点的突变状态。该方法包括提供含有突变体DNA和野生型DNA的DNA样品。所述方法还包括扩增含有突变位点的DNA序列，从而生产扩增子。优选地，通过多重PCR进行该扩增操作。所述方法还包括从PCR的扩增子中富集具有突变的突变体DNA片段。如前所述，多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中使每一对引物与含有一个或多个突变位点的序列杂交用于扩增该序列。以及，从扩增产物即扩增子中富集含有突变的突变体DNA片段，可以通过突变特异性杂交和提取技术，或者竞争性突变特异性杂交和提取技术来进行。

本发明也提供了一种在本文被称为MMPA(多重甲基化剖析阵列)的用于甲基化分析的方法。具体地，该方法允许使用单阵列来同时测定在非常大量的未甲基化DNA背景中多个CpG位点上的甲基化状态。图9显示了MMPA的原理，其一般包括5个步骤。第一步，使用亚硫酸氢盐反应来对同时含有甲基化和未甲基化DNA的样品进行处理，该亚硫酸氢盐反应将胞嘧啶转变为尿嘧啶而甲基化胞嘧啶残基抵抗这种转变。第二步，用特异性引物通过第一PCR扩增处理后的DNA以获得片段，在该片段中所有的尿嘧啶残基都被转变为胸腺嘧啶，而CpG位点上的甲基化胞嘧啶残基保持不变。该PCR将生产出足够量的DNA用于富集。第三步，使用一个或多个甲基化特异性富集技术的循环来富集甲基化DNA。这些技术的实例包括减少未甲基化DNA，选择性俘获甲基化DNA，或者它们的组合。第四步，然后通过第二PCR来扩增富集的DNA分子以生产出足够量的DNA用于检测。以及，第五步，接着测定在每一个靶CpG位点上的甲基化状态。

有几个方面与MMPA相关，从而使其可以同时研究在大量过量的未甲基化DNA中多个CpG位点上的甲基化状态。

第一，MMPA采用竞争性杂交来提高杂交的特异性，其中由第一轮PCR生产的DNA片段同时与针对所选的甲基化等位基因的甲基化特异性探针和与对应的未甲基化等位基因互补的竞争探针进行杂交。因为甲基化特异性探针是生物素化的，而竞争探针则没有被生物素化，因此只有甲基化特异性探针/靶杂交物可以被例如链霉亲和素包被珠所俘获。然后将所俘获的杂交物洗脱，得到用于甲基化等位基因富集的单链靶。可以将所富集的DNA再次富集直到所有的甲基化等位基因比对应的未甲基化等位基因含量更高。图9显示了用于MMPA实施方式中的竞争性杂交的原理。

第二，杂交特异性可以随着序列而极大地变化，从而导致富集的极大的改变。但是，杂交是一种物理过程，因此不会人为地产生甲基化DNA。因此，在MMPA中使用多个杂交循环以能够获得每一个靶序列的令人满意的富集。例如，为了检测在过量未甲基化DNA中的甲基化，其中所述未甲基化DNA具有比目标甲基化物质高1,000倍的量，并且一个杂交循环富集一些序列1,000倍，而对于其他序列只有20倍，可以使用三个杂交循环以确保所有的甲基化等位基因都被充分地富集。这就是一次分析能够同时在大量未甲基化DNA背景中显示出很多CpG位点上的甲基化状态的原因。

根据MMPA的优选方法，甲基化特异性富集技术或循环的数量可以随着特定应用和***参数而变化。不过，一般来说，循环数范围可以为1至5。优选地，循环数为1至3。

第三，在MMPA中在两轮PCR之间进行甲基化特异性富集。这对于MMPA的成功来说是关键的。在多个富集循环之后回收的DNA的量可能较低，因为使用严格的杂交和洗涤条件用于富集。例如，如果对于一个循环DNA回收率为1％，那么在三个循环之后，总回收率为0.0001％。因此，如果在PCR之前进行富集，将不能够从甲基化DNA的量较低的生物样品中回收甚至一个拷贝的甲基化DNA。在富集之前的PCR可以生产足够量的甲基化DNA用于富集。此外，如果在富集之后没有另外的扩增即进行检测，将没有剩余足够量的甲基化DNA用于检测。因此，富集之后的扩增确保有足够量的甲基化DNA用于检测。如下所述，在多重设置中，在两轮PCR之间的富集还使甲基化的扩增与检测更强大和特异。

第四，在MMPA中优选使用两轮PCR策略。第一PCR引物具有靶特异性部分和通用尾部。该靶特异性部分允许扩增靶序列，而尾部导入用于第二PCR的通用序列，该第二PCR使用与被第一PCR所导入的尾部互补的引物。与两轮PCR策略相关的一个问题是：由于在第一PCR过程中形成引物-引物相互作用产物，在该多重设置中第二轮PCR经常不能充分地扩增某些序列。不过，该问题被MMPA显著地最小化。这是因为，作为富集的结果，除去了引物-引物相互作用产物，使第二轮PCR更强大。实际上，该方法可以成为改进高阶(high-order)多重PCR的通用方法。

第五，多重PCR的另一问题是PCR扩增效率随着序列的变化而变化。对于甲基化分析来说这尤其是一个问题，因为低效扩增的甲基化序列可能是不可检测出的。不过，在MMPA中该问题也被最小化了，因为在富集之后甲基化特异性富集使甲基化DNA比未甲基化DNA含量更高。因为第二PCR的扩增主要依赖于每一序列的拷贝数，在第二轮PCR之后，甲基化序列将是占优势的，即使当它们被第一PCR低效地扩增。此外，探针提取工艺可以平衡多重PCR扩增出的PCR产物的产率。这可以通过以下方法来实现：优化杂交探针的摩尔比例使得在杂交过程中，低效扩增的序列能够被更有效地俘获，而高效扩增的序列被较低效地俘获。例如，如果被第一PCR进行的序列A的扩增比序列B更有效，使用较低量的以序列A为标靶的探针来俘获序列A，从而使富集之后的所回收的序列A和序列B的量平衡，使检测两个序列成为可能。

MMPA提供了优于现有甲基化分析方法的几个优点。第一，一个MMPA分析能够显示出很多目标基因的多个CpG位点上的甲基化状态，因此允许使用少量原材料的分析。第二，MMPA极大地提高了检测灵敏度，同时保持其高阶倍增能力。根据本发明，已经证实，MMPA能够在过量的具有比甲基化等位基因高1,000倍的量的未甲基化等位基因中检测出一个甲基化等位基因。实际上，该灵敏度与甲基化特异性PCR(MSP)的灵敏度相当，其中MSP是最灵敏的方法，但是具有有限的倍增能力。第三，通过杂交实现MMPA的富集，其中与PCR和络合不同，杂交是物理过程，不会人为地产生甲基化DNA，从而使MMPA高度特异。相反地，对于扩增法，以增加假阳性为代价，可以获得更高的灵敏度。第四，MMPA费用低廉，因为一次分析能够同时显示出很多目标基因的多个CpG位点上的甲基化状态。第五，用于MMPA的富集程序是简单的，在相当短的时间内即可以完成三个杂交循环。此外，可以使用液态处理***进行MMPA的样品制备，因此MMPA检测是高处理量的方法，并且适合于自动化控制。

可以通过几种不同的方法来进行MMPA策略的富集。可以例如通过甲基化特异性杂交和提取程序来进行富集，在该突变特异性杂交和提取程序中，在杂交条件下，使多个甲基化特异性探针与PCR产物，即扩增子接触，该扩增子通常是目标DNA片段。每一个甲基化特异性探针优先与甲基化序列形成杂交物。优选地，使甲基化特异性探针连接到能够与第二分子结合的第一结合分子上，该第二分子又优选连接到固体载体上。杂交之后，杂交物可以被含有第二结合分子的固体载体俘获。

也可以通过竞争性甲基化特异性杂交和提取程序进行MMPA策略的富集。在杂交条件下，使多个甲基化特异性探针和未甲基化竞争探针与PCR产物接触，或相反使其暴露于PCR产物中，PCR产物即扩增子例如目标DNA片段。每一个甲基化特异性探针优先与甲基化序列(例如DNA片段中所含有的)形成杂交物，而未甲基化竞争探针优先与对应的未甲基化序列形成杂交物。还将所述甲基化特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合。杂交之后，杂交物可以被含有第二结合分子的固体载体所俘获。优选地，每一种甲基化特异性探针与其对应的未甲基化竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

在甲基化特异性杂交和提取富集策略，以及竞争性甲基化特异性杂交和提取富集策略两者中，可以通过以下步骤来富集目标DNA片段：在固体载体上提取，从该固体载体上释放所述片段，然后使该体系和剩余DNA片段进行另外的富集循环。

先前提到的甲基化特异性探针和对应的未甲基化竞争探针可以是适宜特定应用的任意探针。这些探针的优选实例包括但不限于：寡核苷酸、肽核酸、锁核酸(LNA)以及它们的组合。

如上所述，在某些应用中，第一或初始PCR可以是多元的或多重PCR。在该策略中，使用两对或两对以上的引物。每一对引物包括一个正向引物和反向引物。每一对引物用于扩增含有一个或多个甲基化位点的序列。每一个引物优选含有靶特异部分和通用尾部。该靶特异部分侧接于(flank)所述目标序列，或相反使其与目标序列连接(align)以允许扩增该序列。对于所有的正向和反向引物，通用尾部的序列优选是相同的。优选地，该通用尾不能够与人基因组序列结合。并且，优选地，正向引物和反向引物的通用尾的序列可以相同或不同。

此外，在应用第二PCR的程序中，优选的是，当第一PCR的正向和反向引物的通用尾相同时，第二PCR使用一个通用引物。以及，优选的是，当正向和反向引物的通用尾不同时，一个通用引物与正向引物的通用尾配对，另一个通用引物与反向引物的通用尾配对。通常，在使用第二PCR的程序中，使含有甲基化位点的富集DNA片段与通用引物接触，或相反使其暴露于通用引物中。使通用引物与正向和反向引物的通用尾杂交以扩增富集的DNA片段。

本发明还提供了一种用于生产足够纯的甲基化DNA片段的方法，该DNA片段是用于检测大量未甲基化DNA背景中多个DNA CpG位点上的甲基化状态。该方法包括提供含有甲基化DNA和未甲基化DNA的DNA样品。所述方法还包括扩增含有甲基化位点的DNA序列从而生产扩增子。优选地，通过多重PCR进行该扩增操作。所述方法还包括从PCR的扩增子中富集含有甲基化CpG位点的甲基化DNA片段。如前所述，该多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中使每一对引物与含有一个或多个甲基化位点的序列杂交用于扩增该序列。以及，从扩增产物即扩增子中富集含有甲基化的甲基化DNA片段，可以通过甲基化特异性杂交和提取技术，或者竞争性甲基化特异性杂交和提取技术来进行。

所有前述方法都特别针对来源于收集自患者的临床生物试样的样品，包括：人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合。疑似生物样本的样品或DNA样品通常含有DNA变异位点，该DNA变异位点处于一个或多个单碱基取代、一个或多个单碱基***、一个或多个单碱基缺失、在一个或多个CpG位点上的甲基化以及它们的组合的形式。在这些样品中野生型DNA与变异DNA的典型摩尔比在约2:1至约100,000:1的范围内。

如前所述，本发明还提供了一种用于除去由多重PCR产生的引物-引物相互作用产物的方法。一般地，所述方法包括：通过多重PCR扩增靶DNA序列；接着，通过序列特异性俘获除去引物-引物相互作用产物来纯化多重PCR的扩增的靶序列。如将要被评价的，所述多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中每一对引物适合于扩增特定的靶序列。

优选通过以下方法进行序列特异性俘获：在杂交条件下，使多个序列特异性探针接触或相反使其暴露于多重PCR的产物或扩增子中。每一个序列特异性探针优先与靶序列形成杂交物。还将所述序列特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合。在杂交之后，所述杂交物可以被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。可以重复序列特异性俘获程序，使得被固体载体所提取的DNA片段从该固体载体中释放出来，接着进行另外的序列特异性俘获循环。各种结合分子如前所述，可以包括生物素、链霉亲和素以及它们的组合。

许多探针都可以用于序列特异性俘获法。非限制的实例包括寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合。优选地，序列特异性探针不与用于多重PCR的引物的序列相结合。

本发明还可以适用于使多级多重PCR更强大。该方法包括：提供含有靶序列的样品，接着通过第一多重PCR来扩增样品以形成含有引物-引物相互作用产物的第一扩增样品。接着，除去至少一部分引物-引物相互作用产物。然后，可以使用第二多重PCR以形成第二扩增样品。

本发明还提供了一种用于平衡多个PCR产物的产率的方法。所述方法包括提供含有将要被扩增的靶序列的DNA样品。所述方法涉及接着通过第一PCR扩增靶DNA序列。接着可以平衡或相反调节靶序列的量。以及，接着通过第二PCR扩增平衡过的靶DNA序列。在该程序中，第一PCR优选是使用两对或两对以上PCR引物的多重PCR。每一对引物包括正向引物和反向引物。每一对引物适合于扩增目标靶序列。每一个引物包括靶特异性部分和通用尾部。所述靶特异性部分侧接于所述靶序列以允许扩增所述序列，并且对于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列相同。优选地，所述通用尾不能够与样品中的任何DNA序列相结合。优选地，正向和反向引物的通用尾的序列可以相同或不同。

优选通过序列特异性俘获使由第一PCR扩增出的靶序列的量平衡。在杂交条件下使多个序列特异性杂交探针与第一PCR的扩增子接触，其中每一个序列特异性探针优先与靶序列形成杂交物。还将所述序列特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合。在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。优选地，优化序列特异性探针的摩尔比，使得通过加入更大量的对应于所述低效扩增序列的序列特异性探针，使低效扩增序列能够被更有效地俘获，以及通过加入较少量的对应于所述高效扩增序列的序列特异性探针，使高效扩增序列在杂交过程中被较低效地俘获。

序列特异性探针几乎可以是任意种探针，例如寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合。

在上述使用序列特异性俘获的平衡策略中，第一结合分子可以是例如生物素、链霉亲和素以及它们的组合；第二结合分子可以选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

可以重复进行序列特异性俘获，其中将被固体载体所提取的DNA片段从该固体载体中释放出来，接着进行另外的序列特异性俘获循环以得到靶序列量的最优平衡。

本发明还提供了一种用于平衡由多级多重PCR生产的PCR产物的产率的方法。该方法包括提供含有第一靶序列和第二靶序列的样品。接着，该方法涉及鉴别第一靶序列和第二靶序列的相对扩增效率。然后，该方法包括将适合于以第一靶序列为靶点的第一探针和适合于以第二靶序列为靶点的第二探针加入到样品中。第一探针与第二探针的摩尔比基于第一和第二靶序列的相对扩增效率。如果第一靶序列具有比第二靶序列更高的扩增效率，那么增加第一探针与第二探针的摩尔比。

实施例

本文所包含的以下实施例用来说明本发明，并不是用来限制本发明。

实施例1

本实施例将说明使用竞争性突变特异性杂交和提取以提高富集的特异性。在本方法中，对每一突变位点使用两个寡探针，其中一个寡探针(突变体探针)与突变体DNA互补，另一个寡探针(正常竞争探针)与野生型DNA互补。但是，只将突变体探针生物素化，因此只有它们以及被它们所负载的突变体DNA可以被俘获，从而富集突变体DNA。使用两个寡探针是基于以下考虑：寡探针的Tm变化可能不是足够大到能够区分被一个碱基所区别的两个等位基因，以及加入正常竞争探针可以提高杂交的竞争性，从而提高富集。

在本实施例中，我们检测出在K-ras的第12位密码子的第一碱基上的G→T突变。野生型DNA购自普洛麦格(Promega)(麦迪逊(Madison)，WI)。突变体DNA提取自肺癌患者的支气管肺泡灌洗(BAL)样品。通过用野生型DNA稀释突变体来生产含有低丰度的突变体DNA的样品。基于原始样品中突变体DNA的拷贝数和所加入的野生型DNA的量估算在该生产出的样品中突变体DNA的丰度和量。在本实施例中，使用和研究含有1％的突变体DNA(在5ng正常DNA中有0.05ng突变体DNA)的样品。

第一PCR：首先使该DNA样品进行第一PCR，其中正向和反向PCR引物具有T7或T3的尾部，它们的序列分别为：5′-GTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATATTCGTCCACAA-3′(SEQ ID NO：2)。在该PCR中使用以下用量的物质：正向和反向引物各10pmol，每一种dNTP各0.2mM，具有2mM MgCl₂的1×PCR缓冲液，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

竞争性突变特异性杂交和提取：将第一PCR的产物与突变体和正常竞争探针的混合物温育用于进行竞争性突变特异性富集。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及突变体和正常竞争探针以总体积为20μL的量加入到反应管中。突变体和正常竞争探针的序列分别为：5′-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-TTGGAGCTGGTGGC GTAG-3′(SEQ ID NO：4)。改变正常竞争探针与突变体探针的摩尔比以测定该比例对富集的影响。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(戴诺生物技术，奥斯陆，挪威(Dynal Biotech，Oslo，Norway))的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。

第二PCR：使用约1μL富集DNA作为用于第二PCR扩增的模板，该第二PCR扩增分别使用T7的5′-GTAATACGACTCACTATAGG-3′(SEQ ID NO：5)和T3的5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ ID NO：6)作为正向和反向引物。在该PCR使用以下用量的物质：10pmol的正向和反向引物，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

突变分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶(USB，Cleveland，OH)和DNA外切核酸酶I(exonecularse I)(USB，Cleveland，OH)在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，含有1.5mM MgCl₂的2x热测序酶(ThermoSequenase)缓冲液，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃ 20秒，72℃ 20秒)。微测序的延伸引物是：5′-CAAGGCACTCTTGCCTACGCCAC-3′(SEQ ID NO：7)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。

图3显示了用不同比例的正常竞争探针与突变体探针富集序列的结果，该序列含有在k-ras的第12位密码子的第一个碱基处的G→T突变。图3中标有引物、突变体和正常的峰分别对应于引物、突变体序列的延伸产物和正常序列的延伸产物。对试验样品富集一次。可以看出，在不存在正常竞争探针的情形下没有发现对应于突变体DNA的峰(图3A)。但是，在加入2.5或7.5或15倍更过量的正常探针之后，出现突变体峰(图3B至3D)，这表明在加入正常竞争探针之后极大地提高了富集。

实施例2

本实施例说明了所用的探针的量对富集的影响。

在本实施例中，我们检测在K-ras的第12位密码子的第一碱基上的G→T突变。野生型DNA购自Promega(Madison，WI)。突变体DNA提取自肺癌患者的BAL样品。通过用野生型DNA稀释突变体来生产含有低丰度的突变体DNA的样品。基于原始样品中突变体DNA的拷贝数和所加入的野生型DNA的量估算在该生产出的样品中突变体DNA的丰度和量。在本实施例中，使用含有1％的突变体DNA(在5ng正常DNA中有0.05ng突变体DNA)的样品进行研究。

第一PCR：首先使该DNA样品进行第一PCR，其中正向和反向PCR引物具有T7或T3的尾，正向引物的序列为：5′-GTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′(SEQ ID NO：1)，反向引物的序列为：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATATTCGTCCACAA-3′(SEQ ID NO：2)。在该PCR使用以下用量的物质：正向和反向引物各10pmol，每一种dNTP各0.2mM，具有2mM MgCl₂的1×PCR缓冲液，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

竞争性突变特异性杂交和提取：将第一PCR的产物与突变体和正常竞争探针的混合物温育用于进行竞争性突变特异性富集。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA以及突变体和正常竞争探针以总体积为20μL的量加入到反应管中。将正常竞争探针与突变体探针的摩尔比固定为7.5，突变体探针的量在0.1至1pmol的范围内。突变体和正常竞争探针的序列分别为：5′-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-TTGGAGCTGGTGGCGTAG-3′(SEQ ID NO：4)。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA 5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1xTE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。

突变分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，含有1.5mM MgCl₂的2x热测序酶缓冲液，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃20秒，72℃ 20秒)。微测序的延伸引物是：5′-CAAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3′(SEQ ID NO：7)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。

图4显示了使用不同量的突变体探针富集序列，该序列含有在k-ras的第12位密码子的第一个碱基处的G→T突变。样品含有1％的突变体DNA，并且富集1次。结果发现，当突变体探针的量在0.1至1pmol的范围内时，得到相似的富集。

实施例3

本实施例说明了使用多个杂交和提取的循环来提高富集。在本实施例中，我们使用含有在APC的第1450位密码子的第一碱基上的C→T突变的序列。野生型DNA购自Promega(Madison，WI)。突变体DNA提取自结肠癌细胞系。通过用野生型DNA稀释突变体来生产含有低丰度的突变体DNA的样品。基于原始样品中突变体DNA的拷贝数和所加入的野生型DNA的量估算在该生产出的样品中突变体DNA的丰度和量。在本实施例中，分别对含有1％、或0.1％或0.01％的突变体DNA的样品进行研究。

第一PCR的正向和反向引物具有T7或T3的尾，它们的序列分别为：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3′(SEQ IDNO：8)和5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTGCAGCTTG-3′(SEQ ID NO：9)。微测序延伸引物是：5′-CCTCAAACAGCTCAAACCAAG-3′(SEQ ID NO：10)。突变体探针和正常竞争探针分别是：5′-生物素-TCAAACCAAGTGAGAAGTA(SEQ ID NO：11)和5′-TCAAACCAAGCGAGAAGTA-3′(SEQ ID NO：12)。

第一PCR：在该PCR使用以下用量的物质：正向和反向引物各10pmol，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

富集：将第一PCR的产物与突变体和正常竞争探针的混合物温育用于进行竞争性突变特异性杂交和提取。将总体积为20μL的、含有以下物质的液体加入到试管中：2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA以及0.01pmol/μL突变体探针和0.075pmol/μL正常竞争探针。正常竞争探针与突变体探针的摩尔比为7.5。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)的20μL 2xB&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。

突变分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，含有1.5mM MgCl₂的2x热测序酶缓冲液，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃20秒，72℃ 20秒)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。

图5显示了使用一个(5A)、两个(5B)和三个(5C)富集循环富集序列，该序列含有在APC的第1450位密码子的第一个碱基处的C→T突变，其中该样品分别含有1％(5A)、0.1％(5B)和0.01％(5C)突变体DNA。清楚地，在图5C中突变体DNA的峰与野生型DNA的峰相当，这表明用三个富集循环成功富集了该序列约10,000倍。

实施例4

本实施例说明了DNA的大小对富集的影响。在本实施例中，我们研究了三种不同大小的序列，它们都含有在APC的第1450位密码子的第一碱基上的C→T突变。分别地，第一序列的长度为158bp长，第二序列的长度为439bp长，第三序列的长度为829bp长。野生型DNA购自Promega(Madison，WI)。突变体DNA提取自结肠癌细胞系。通过用野生型DNA稀释突变体来生产含有低含量的突变体DNA的样品。基于原始样品中突变体DNA的拷贝数和所加入的野生型DNA的量估算在该生产出的样品中突变体DNA的丰度和量。在本实施例中，对含有1％的突变体DNA的样品进行研究并且只富集一次。

我们设计三对引物来产生这些三种大小的PCR产物。所有的正向引物具有T7尾的5′-GTAATACGACTCACTATAGG-3′(SEQ ID NO：5)，所有的反向引物具有T3尾的5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ ID NO：6)。三对正向和反向引物的序列是：

正向引物(158bp)：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3′(SEQ ID NO：8)；

反向引物(158bp)：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTGCAGCTTG-3′(SEQ ID NO：9)；

正向引物(439bp)：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3′(SEQ ID NO：13)；

反向引物(439bp)：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCATCTGAATCATCTAATAGGTCC-3′(SEQ ID NO：14)；

正向引物(829bp)：5′-GTAATACGACTCACTATAGGACACAGGAAGCAGATTCTGC-3′(SEQ ID NO：15)；

反向引物(829bp)：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCATCTGAATCATCTAATAGGTCC-3′(SEQ ID NO：16)。

微测序延伸引物是5′-CCTCAAACAGCTCAAACCAAG-3′(SEQ ID NO：10).突变体探针和正常竞争探针分别是：5′-生物素-TCAAACCAAGTGAGAAGTA-3′(SEQ ID NO：11)和5′-TCAAACCAAGCGAGAAGTA-3′(SEQ IDNO：12)。

富集：将第一PCR的产物与突变体和正常竞争探针的混合物温育用于进行竞争性突变特异性杂交和提取。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA，以及0.01pmol/μL的突变体探针和0.075pmol/μL正常竞争探针以总体积为20μL的量加入到反应管中。正常竞争探针与突变体探针的摩尔比为7.5。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。

突变分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，2x热测序酶缓冲液，1.5mMMgCl₂，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃ 20秒，72℃ 20秒)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。

图6分别显示了富集158bp(图6A)、439bp(图6B)和829bp(图6C)的PCR产物，所有的PCR产物含有在APC的第1450位密码子的第一个碱基处的相同的C→T突变。所有样品含有1％的突变体DNA，并且仅被富集一次。该结果清楚地显示，至少在158至829bp的区域内，富集程度不会随DNA大小而显著变化，这表明该富集程序能够对不同大小的各种PCR产物良好地起作用。

实施例5

本实施例说明了同时富集多个靶序列。我们通过在相同的条件下富集6个不同的突变体序列来说明这个问题，其中四个是p53突变(第190、248、267和274位密码子)，第五个是k-ras突变(第12位密码子)，第六个是APC突变(第1450位密码子)。含有k-ras和p53突变的突变体DNA提取自肺癌患者的BAL样品，含有APC突变的突变体DNA提取自结肠癌细胞系。测定突变体DNA的量。通过用野生型DNA(Promega，Madison，W1)稀释突变体DNA来生产含有低含量的突变体DNA的样品。基于原始样品中突变体DNA的拷贝数和所加入的野生型DNA的量估算在该生产出的样品中突变体DNA的丰度和量。在本实施例中，对含有1％或0.1％或0.01％的突变体DNA的样品进行研究。

在本研究中，我们使用多重PCR来扩增覆盖这6个位点的5个序列(请注意，一个序列具有在第267和274位密码子上的两个p53突变位点)。第一PCR采用5对引物，每一个引物具有靶特异部分和通用尾部。靶特异部分扩增靶序列，而尾部导入用于第二PCR的序列。使用T7序列作为正向引物的尾部，使用T3序列作为反向引物的尾部。这些引物的序列是：

K-ras的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′(SEQ ID NO：1)；

K-ras的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATATTCGTCCACAA-3′(SEQ ID NO：2)；

APC的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3′(SEQ ID NO：8)；

APC的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTGCAGCTTG-3′(SEQ ID NO：9)；

p53(第190位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCAGTTGCAAACCAGACCTCA-3′(SEQ ID NO：17)；

p53(第190位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCAGATAGCGATGGTGA GCAG-3′(SEQ ID NO：18)；

p53(第248位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGGGTCAGAGGCAAGCA GAG-3′(SEQ ID NO：19)；

p53(第248位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGCTCTGACTGTACC ACCA-3′(SEQ ID NO：20)；

p53(第267和274位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGTCTTGCGGAGATTCTCTTCC-3′(SEQ ID NO：21)；

p53(第267和274位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGACAAGGGTG GTTGGGAGTA-3′(SEQ ID NO：22)；

第一PCR：在该PCR使用以下用量的物质：正向和反向引物各10pmol，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA 10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

富集：将第一PCR的产物与突变体和正常竞争探针的混合物温育用于进行竞争性突变特异性杂交和提取。在本实施例中，使用6对探针来富集PCR产物，其中每一个探针以一个突变位点为靶点。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA，以及0.01pmol/μL的每一种突变体和0.075pmol/μL每一种正常竞争探针，以总体积为20μL的量加入到反应管中。正常竞争探针与其对应的突变体探针的摩尔比为7.5。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA 5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。所用的6对突变体和正常竞争探针的序列是：

K-ras的突变体探针：5′-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG-3′(SEQ IDNO：3)；

K-ras的正常竞争探针：5′-TTGGAGCTGGTGGCGTAG-3′(SEQ ID NO：4)；

APC的突变体探针：5′-生物素-TCAAACCAAGTGAGAAGTA-3′(SEQID NO：11)；

APC的正常竞争探针：5′-TCAAACCAAGCGAGAAGTA-3′(SEQ ID NO：12)；

p53(第190位密码子)的突变体探针：5′-生物素-CTGAGGAAGGGCCAGA-3′(SEQ ID NO：23)；

p53(第190位密码子)的正常竞争探针：5′-CTGAGGAGGGGCCAGA-3′(SEQ ID NO：24)；

p53(第248位密码子)的突变体探针：5′-生物素-GGCCTCCAGTTCATGC-3′(SEQ ID NO：25)；

(第248位密码子)的正常竞争探针：5′-GGCCTCCGGTTCATGC-3′(SEQID NO：26)；

p53(第267位密码子)的突变体探针：5′-生物素-CTGTTCGGTCCCAGTA-3′(SEQ ID NO：27)；

p53(第267位密码子)的正常竞争探针：5′-CTGTTCCGTCCCAGTA-3′(SEQ ID NO：28)；

p53(第274位密码子)的突变体探针：5′-生物素-GCACAAAAACGCACCTC-3’(SEQ ID NO：29)；

p53(第274位密码子)的正常竞争探针：5′-GCACAAACACGCACCTC-3′(SEQ ID NO：30)；

突变分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，含1.5mM MgCl₂的2x热测序酶缓冲液，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃ 20秒，72℃ 20秒)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。在本实施例中，我们使用6个微测序引物，其中每一种引物以6个突变位点中的一个为靶点。所述微测序延伸引物的序列是：

k-ras的微测序延伸引物：5′-CAAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3′(SEQID NO：7)；

APC的微测序延伸引物：5′-CCTCAAACAGCTCAAACCAAG-3′(SEQ IDNO：10)；

p53(第190位密码子)的微测序延伸引物：5′-TGCTCTTAGGTCTGGCCC-3′(SEQ ID NO：31)；

p53(第248位密码子)的微测序延伸引物：5′-TGCATGGGCGGCATGAAC-3′(SEQ ID NO：32)；

p53(第267位密码子)的微测序延伸引物：5′-CGCACCTCAAAGCTGTTC-3′(SEQ ID NO：33)；

p53(第274位密码子)的微测序延伸引物：5′-TCCCAGGACAGGCACAAA-3′(SEQ ID NO：34)；

图7显示了检测6个样品中突变的结果，每一个样品具有0.1％的突变体DNA，并且被富集两次。可以发现，对于每一个样品都检测出正确的突变，并且没有检测出假阳性。使用3个杂交循环也可以从含有0.01％的突变体DNA的样品中检测出正确的突变(数据没有显示)。

实施例6

本实施例是说明甲基化特异性富集。通过富集ER基因的甲基化序列来研究甲基化特异性富集。采用以下方法来制备阳性对照甲基化DNA：通过使用建议的程序用Sssl甲基化酶(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)，MA)处理正常DNA，将每一个CpG位点上的胞嘧啶转变为甲基化胞嘧啶。通过将甲基化DNA掺入正常DNA来制备含有甲基化和未甲基化DNA的样品，其中基于原始样品中甲基化DNA的拷贝数和所加入的未甲基化DNA的量来估算甲基化DNA的丰度和量。对含有0.1％和0.01％的甲基化DNA的样品进行研究，在每一个样品中使用20拷贝的甲基化DNA。

亚硫酸氢盐处理：我们使用标准的亚硫酸氢盐处理方法来处理样品DNA。首先将1μg鲑鱼***DNA加入到DNA样品中作为载体，接着在NaOH存在的情形下在42℃变性DNA 20min。将新制的亚硫酸氢盐溶液加入到变性的DNA样品中，接着在黑暗条件下在55℃温育混合溶液。其后，对处理后的样品进行脱硫、中和和纯化。将处理后的DNA储存在-20℃。

第一PCR：在亚硫酸氢盐处理之后，使每一个样品进行第一PCR。该PCR的引物具有靶特异性部分和T7(正向)或T3(反向)的通用尾。该靶特异性部分扩增ER的甲基化序列，而该尾部导入用于第二PCR的序列。正向和反向引物的序列分别是：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATTTGGATAGTAGTAAGTTTGT-3′(SEQ ID NO：35)和5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCTATTAAATAAAAAAAAACCCCCCAAACC-3′(SEQ ID NO：36)。在该PCR使用以下用量的物质：正向和反向引物各10pmol，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA 10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

富集：将第一PCR的产物与甲基化和未甲基化竞争探针的混合物温育用于进行竞争性甲基化特异性杂交和提取。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA，以及0.01pmol/μL甲基化探针和0.075pmol/μL未甲基化竞争探针，以总体积为20μL的量加入到反应管中。所用的未甲基化竞争探针与甲基化探针的摩尔比为7.5。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA 5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(Dynal Biotech，Oslo，Norway)的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到干净的管中。甲基化探针和未甲基化竞争探针的序列分别是：5′-生物素-ACGAGTTTAACGTCGCGG-3′(SEQ ID NO：37)和5′-ATGAGTTTAATGTTGTGG-3′(SEQ IDNO：38)。

第二PCR：使用约1μL富集的DNA作为用于第二PCR扩增的模板，该第二PCR扩增分别使用T7的5′-GTAATACGACTCACTATAGG-3′(SEQ IDNO：5)和T3的5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ ID NO：6)作为正向和反向引物。在该PCR使用以下用量的物质：10pmol的正向和反向引物，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。

甲基化分析：通过基于MALDI-TOF的微测序法来检测富集程度。首先将第二PCR的产物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37℃处理30min，接着在80℃处理10min。将2.5μL处理过的PCR产物与2.5μL以下混合物混合：ddATP、ddGTP和ddTTP每一种0.025mM，0.1mM dCTP，含1.5mM MgCl₂的2x热测序酶缓冲液，1pmol/μL微测序引物，0.2u/μL热测序酶。在以下条件下进行微测序：在94℃预热2min，接着进行60个以下循环(94℃ 20秒，50℃ 20秒，72℃ 30秒)。微测序延伸引物是：5′-CCCTCRAAATAATTATACAC-3′(SEQ ID NO：39)。将10μL NH₄OH处理过的离子交换珠与该微测序产物温育用于脱盐。通过将延伸产物与3-HPA基质混合来制备MALDI样品。将该样品干燥，然后通过MALDI-TOF进行分析。通过比较对应于突变体和正常等位基因的峰的强度，来确定富集程度。

图10显示了本研究的结果，其中标有P、M和UM的峰分别对应于引物、甲基化等位基因的延伸产物和未甲基化等位基因的延伸产物。图10a和图10b分别显示了不使用和使用甲基化特异性富集来检测1,000倍过量未甲基化DNA中ER的甲基化序列的结果。不使用甲基化特异性富集没有检测出甲基化DNA(图10a)，而使用甲基化特异性富集清楚地检测出甲基化DNA(图10b)，这表明了通过甲基化特异性杂交富集甲基化DNA的效率。图10c显示了成功检出0.01％的甲基化ER的结果，这表明MMPA可以检测出0.01％的甲基化DNA。请注意，MMPA的特异性是极好的，如通过使用相同的程序分析只含有未甲基化DNA(图10d)的样品所证实的，其中没有观察到对应于甲基化DNA的峰。

实施例7

本实施例是说明使用序列特异性提取策略来平衡不同PCR产物的产率。在本实施例中，通过第一轮PCR来扩增BRAF、K-ras、p53和APC的10个序列，该第一轮PCR使用10对引物，每一对引物具有靶特异性部分和通用尾部。该靶特异性部分扩增靶序列，而该尾部导入用于第二PCR的序列。分别使用T7和T3序列作为正向和反向引物的尾部。使用50ng人基因组DNA作为模板。在该PCR使用以下用量的物质：正向和反向引物各2.5pmol，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA10min，接着进行38个以下循环(95℃ 60秒，58℃ 60秒，72℃ 60秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。这10对引物的序列是：

BRAF的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGTGCTTGCTCTGATAGGAAAATGA-3′(SEQ ID NO：40)；

BRAF的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCCACAAAATGGATCCAGA CAAC-3′(SEQ ID NO：41)；

p53(第248位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGGGTCAGAGGCAAGCAGAG-3′(SEQ ID NO：19)；

p53(第248位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGCTCTGACTGTACCACCA-3′(SEQ ID NO：20)；

p53(第267和274位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGACAAGGGTGGTTGGGAGTA-3′(SEQ ID NO：22)；

APC(第876位密码子)的正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGTCTAGGCAACTACCATCAG-3′(SEQ ID NO：42)；

APC(第876位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGAGGTATGAATGGC TGACAC-3′(SEQ ID NO：43)；

APC(第1114位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCCAACCACATTTTGGACAGC-3′(SEQ ID NO：44)；

APC(第1114位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGTCTTCTTGACACAAA GACTGGC-3′(SEQ ID NO：45)；

APC(第1306位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGACACAGGAAGCAGATTCTGC-3′(SEQ ID NO：46)；

APC(第1306位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCTATCAAGTGAACT GACAGAAG-3′(SEQ ID NO：47)；

APC(第1450位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3′(SEQ ID NO：8)；

APC(第1450位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTGCAGCTTG-3′(SEQ ID NO：9)；

APC(第1554位密码子)的正向引物：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGGGAATGAAACAGAATCAGAGC-3′(SEQ ID NO：48)；

APC(第1554位密码子)的反向引物：5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGCATCTGAATCATCT AATAGGTCC-3′(SEQ ID NO49).

序列特异性提取：将第一PCR的产物与10种序列特异性探针混合用于提取，其中每一种序列特异性探针与一种扩增序列杂交并提取该序列。将2μL上面扩增的PCR产物、1×PCR缓冲液、5mM EDTA，以及0.01pmol/μL每一种序列特异性探针，以总体积为20μL的量加入到反应管中。在以下条件进行探针与PCR产物的杂交：首先在95℃变性DNA 5min，接着以0.04℃/秒的速率将温度缓慢降低到25℃。在杂交之后，将含5μL链霉亲和素包被磁珠(DynalBiotech，Oslo，Norway)的20μL 2x B&W缓冲液加入到杂交管中，接着将该杂交管在室温下温育45min。用180μL 1x TE缓冲液洗涤该磁珠3次。其后，接着加入5μL 1x TE缓冲液以重悬浮该磁珠。将该磁珠在95℃加热5min，接着将上清液转移到清洁管中。这些序列特异性探针的序列是：

K-ras：5′-生物素-TTGGAGCTGGTGGCGTAG-3′(SEQ ID NO：50)；

p53(第190位密码子)：5′-生物素-ATCTTATCCGAGTGGAAGG-3′(SEQID NO：51)；

p53(第248位密码子)：5′-生物素-CCTGCATGGGCGGCATGA-3′(SEQ IDNO：52)；

p53(第267位密码子)：5′-生物素-CTCTCCCAGGACAGGCAC-3′(SEQ IDNO：53)；

APC(第876位密码子)：5′-生物素-CTTCAAAGCGAGGTTTGC-3′(SEQ IDNO：54)；

APC(第1114位密码子)：5′-生物素-GAAACAAATCGAGTGGGT-3′(SEQID NO：55)；

APC(第1306位密码子)：5′-生物素-CAGTGTCACAGCACCCTA-3′(SEQID NO：56)；

APC(第1450位密码子)：5′-生物素-CCACCACCTCCTCAAACAG-3′(SEQID NO：57)；

APC(第1554位密码子)：5′-生物素-GAGGCAGAAAAAACTATTGA-3′(SEQ ID NO：58)；

BRAF：5′-生物素-CGAGATTTCACTGTAGCT-3′(SEQ ID NO：59)；

第二PCR：使用0.5μL的第一轮PCR产物或约1μL富集DNA作为用于第二PCR扩增的模板，该第二PCR扩增分别使用T7的5′-D4-GTAATACGACTCACTATAGG-3′(SEQ ID NO：60)和T3的5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ ID NO：6)作为正向和反向引物。在该PCR使用以下用量的物质：10pmol的正向和反向引物，每一种dNTP各0.2mM，1×PCR缓冲液，2mM MgCl₂，0.05u/μL TaqGold DNA聚合酶，总反应体积为20μL；在以下条件进行该PCR：首先在95℃变性DNA 10min，接着进行38个以下循环(95℃30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后在72℃保持5min用于延伸。该T7引物具有荧光标记，允许用DNA测序仪进行最终PCR产物的片段分析。

图11显示本研究的结果，其中标有1、2...10的峰分别对应于所扩增的10个序列。图11a是在两轮PCR之间没有使用探针提取步骤所扩增的PCR产物的片段分析谱图。清楚地，PCR产物的产率变化很大，几个序列甚至是检测不出的。图11b显示了在两轮PCR之间增加探针提取步骤以及优化10个探针的摩尔比之后的结果，其中每一种PCR产物的产率是相似的，这显示了使用探针提取程序来平衡多重PCR的产物产率的效果。值得注意的是，该探针提取可以成为改进多重PCR的一般方法。

根据优选的实施方式已经描述了示例性实施方式。明显地，通过阅读和理解上述详细说明，可以产生其他的修饰和改变。可以理解的是，示例性实施方式应该理解为包括所有的这些修饰和改进，只要它们出现在后附权利要求或其等同方式的范围内。

序列表

Claims

1.一种用于测量大量野生型DNA背景中多个突变标记的状态的方法，所述方法包括：

提供含有突变体DNA和野生型DNA的样品，所述突变体DNA包含突变；

通过第一PCR扩增样品以生产含有突变位点的DNA片段；

通过进行一个或多个突变体特异性富集循环富集含有突变的突变体DNA片段，从而形成富集体系；

通过第二PCR扩增该富集体系以生产足够量的突变体DNA用于检测；以及，

测量靶突变位点的状态。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变位点包括一个或多个单碱基的(i)取代、(ii)***、(iii)缺失和(iv)它们的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品来源于收集自患者的临床生物样品，所述生物样品选自由人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合所组成的组中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述DNA样品中所述野生型DNA与突变体DNA的摩尔比为约2:1至约100,000:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一PCR是使用两对或两对以上PCR引物的多重PCR，其中每一对引物包括正向引物和反向引物，其中每一对引物适合于扩增含有一个或多个突变位点的序列，并且其中每一个引物包括靶特异性部分和通用尾部，其中所述靶特异性部分侧接于所述序列以允许扩增所述序列，并且对于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列是相同的，其中所述通用尾部不能够与人基因组序列相结合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变体特异性富集循环选自由以下所组成的组中：(i)减少野生型DNA，(ii)选择性俘获突变体DNA，以及(iii)(i)和(ii)的组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从多重PCR的扩增子中富集含有突变的突变体DNA片段通过以下(i)和(ii)的至少之一进行：(i)突变特异性杂交和提取，以及(ii)竞争性突变特异性杂交和提取。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，富集含有突变的突变体DNA片段是通过突变特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个突变体特异性探针与第一PCR的DNA片段接触，其中每一个突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂交物，其中还将所述突变体特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，其中在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所进行的突变体特异性富集循环的循环数范围为1至5个循环。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述循环数为1个。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，重复所述突变特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的突变特异性富集和提取的循环。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述突变体特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

15.根据权利要求7所述的方法，其中，富集含有突变位点的DNA片段是通过竞争性突变特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个突变体特异性探针和正常竞争探针与第一PCR的DNA片段接触，其中每一个突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂交物，而其对应的正常竞争探针优先与对应的野生型序列形成杂交物，其中还将所述突变体特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所进行的竞争性突变特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述循环数为1个。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，重复所述竞争性突变特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的竞争性突变特异性富集和提取的循环。

20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述突变体特异性探针和正常竞争探针都选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

21.根据权利要求15所述的方法，其中，每一种突变体特异性探针与其对应的正常竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一PCR使用两对或两对以上的PCR引物，每一对引物包括正向引物和反向引物，每一对引物包括通用尾；第二PCR是通过使含有突变的富集DNA片段与通用引物接触来进行的，其中所述通用引物与正向引物和反向引物的通用尾杂交以扩增所有富集的DNA片段。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，当第一PCR的正向和反向引物的通用尾相同时，第二PCR使用一个通用引物；当第一PCR的正向和反向引物的通用尾不同时，第二PCR使用两个通用引物，其中一个通用引物与第一PCR的正向引物的通用尾配对，而另一个通用引物与第一PCR的反向引物的通用尾配对。

25.一种用于生产足够纯的突变体DNA片段的方法，所述突变体DNA片段是用于测定大量野生型DNA背景中多个DNA突变位点的突变状态，所述方法包括：提供含有突变体DNA和野生型DNA的DNA样品；通过多重PCR扩增包含突变位点的DNA序列，从而生产扩增子；以及，从PCR的扩增子中富集具有突变的突变体DNA片段。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述DNA突变选自由一个或多个单碱基(i)取代、(ii)***、(iii)缺失和(iv)它们的组合所组成的组中。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述DNA样品来源于收集自患者的临床生物样品，所述生物样品选自由人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合所组成的组中。

28.根据权利要求25所述的方法，其中，在所述DNA样品中野生型DNA与突变体DNA的摩尔比为约2:1至约100,000:1。

29.根据权利要求25所述的方法，其中，所述多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中每一对引物与含有一个或多个突变位点的序列杂交用于扩增所述序列。

30.根据权利要求25所述的方法，其中，富集突变体DNA片段是通过选自由以下所组成的组中的操作进行的：(i)减少野生型DNA，(ii)选择性俘获突变体DNA，以及(iii)(i)和(ii)的组合。

31.根据权利要求25所述的方法，其中，所述从多重PCR的扩增子中富集含有突变的突变体DNA片段通过以下(i)和(ii)的至少之一进行：(i)突变特异性杂交和提取，以及(ii)竞争性突变特异性杂交和提取。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，富集是通过突变特异性杂交和提取进行的，这是通过以下过程进行的：在杂交条件下使多个突变体特异性探针与多重PCR的扩增子接触，其中突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂交物，其中还将所述突变特异性杂交探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所进行的突变体特异性富集循环的循环数范围为1至5个循环。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述循环数为1个。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，重复所述突变特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的突变特异性富集和提取的循环。

37.根据权利要求32所述的方法，其中，所述突变体特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

38.根据权利要求32所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

39.根据权利要求31所述的方法，其中，富集是通过竞争性突变特异性杂交和提取进行的，这是通过以下过程进行的：在杂交条件下使多个突变体特异性探针和正常竞争探针与多重PCR的扩增子接触，其中每一个突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂交物，而其对应的正常竞争探针优先与对应的野生型序列形成杂交物，其中还将所述突变体特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，所进行的竞争性突变特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述循环数为1个。

42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，重复所述竞争性突变特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的竞争性突变特异性富集和提取的循环。

44.根据权利要求39所述的方法，其中，所述突变体特异性探针和正常竞争探针都选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

45.根据权利要求39所述的方法，其中，每一种突变体特异性探针与其对应的正常竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

46.根据权利要求39所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

47.一种用于测量大量未甲基化DNA背景中大量CpG位点的甲基化状态的方法，所述方法包括：

提供含有甲基化DNA和未甲基化DNA的样品；

处理所述样品以将未甲基化DNA中的胞嘧啶基团转变为尿嘧啶基团；

用引物通过第一PCR扩增该处理过的样品，从而获得所有的尿嘧啶基团都被转变为胸腺嘧啶基团的DNA片段；

通过进行一个或多个甲基化特异性富集循环富集甲基化DNA，从而形成富集体系；

通过第二PCR扩增所述富集体系以生产足够量的甲基化DNA用于检测；以及

测量CpG位点的甲基化状态。

48.根据权利要求49所述的方法，其中，所述样品来源于收集自患者的临床生物样品，所述生物样品选自由人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合所组成的组中。

49.根据权利要求47所述的方法，其中，在所述样品中未甲基化DNA与甲基化DNA的摩尔比为约2:1至约100,000:1。

50.根据权利要求47所述的方法，其中，所述CpG位点在一个或多个基因上。

51.根据权利要求47所述的方法，其中，所述处理是通过使用亚硫酸氢盐反应进行的。

52.根据权利要求47所述的方法，其中，所述第一PCR是使用两对或两对以上PCR引物的多重PCR，其中每一对引物包括正向引物和反向引物，其中每一对引物适合于扩增含有一个或多个CpG位点的序列，并且其中每一个引物包括靶特异性部分和通用尾部，其中所述靶特异性部分侧接于所述序列以允许扩增所述序列，并且对于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列相同，其中所述通用尾不与由处理操作生产的任何DNA片段相结合。

53.根据权利要求47所述的方法，其中，所述甲基化特异性富集循环选自由以下所组成的组中：(i)减少未甲基化DNA，(ii)选择性俘获甲基化DNA，以及(iii)(i)和(ii)的组合。

54.根据权利要求47所述的方法，其中，所述从多重PCR的扩增子中富集含有在CpG位点上的甲基化胞嘧啶的甲基化DNA片段是通过以下(i)和(ii)的至少之一进行的：(i)甲基化特异性杂交和提取，和(ii)竞争性突变特异性杂交和提取。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，富集是通过甲基化特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个甲基化特异性探针与第一PCR的DNA片段接触，其中每一个甲基化特异性探针优先与甲基化序列形成杂交物，其中还将所述甲基化特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所进行的甲基化特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述循环数为1个。

58.根据权利要求56所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

59.根据权利要求58所述的方法，其中，重复所述甲基化特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体俘获的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的甲基化特异性杂交和提取的循环。

60.根据权利要求55所述的方法，其中，所述甲基化特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

61.根据权利要求55所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

62.根据权利要求54所述的方法，其中，富集甲基化DNA片段是通过竞争性甲基化特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个甲基化特异性探针和未甲基化竞争探针与第一PCR的DNA片段接触，其中所述甲基化特异性探针优先与甲基化序列形成杂交物，而对应的未甲基化竞争探针优先与对应的未甲基化DNA片段形成杂交物，其中还将所述甲基化特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

63.根据权利要求62所述的方法，其中，所进行的竞争性甲基化特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述循环数为1个。

65.根据权利要求63所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

66.根据权利要求65所述的方法，其中，重复所述竞争性甲基化特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体俘获的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的竞争性甲基化特异性杂交和提取的循环。

67.根据权利要求62所述的方法，其中，所述甲基化特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

68.根据权利要求62所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

69.根据权利要求62所述的方法，其中，甲基化特异性探针与相应的未甲基化竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

70.根据权利要求47所述的方法，其中，所述第一PCR使用两对或两对以上引物，每一对引物包括正向引物和反向引物，每一对引物包括通用尾；第二PCR是通过使富集的甲基化DNA片段与通用引物接触来进行的，其中所述通用引物与正向和反向引物的通用尾杂交以扩增所有富集的DNA片段。

71.根据权利要求70所述的方法，其中，当第一PCR的正向和反向引物的通用尾相同时，第二PCR使用一个通用引物；当第一PCR的正向和反向引物的通用尾不同时，第二PCR使用两个通用引物，其中一个通用引物与第一PCR的正向引物的通用尾配对，而另一个通用引物与第一PCR的反向引物的通用尾配对。

72.一种用于生产足够纯的甲基化DNA片段的方法，所述甲基化DNA片段是用于测定大量未甲基化DNA背景中多个DNA CpG位点的甲基化状态，所述方法包括：提供含有甲基化DNA和未甲基化DNA的DNA样品；使DNA样品进行亚硫酸氢盐处理；通过多重PCR扩增含有甲基化CpG位点的DNA序列，从而生产扩增子；以及，从PCR的扩增子中富集含有甲基化CpG位点的甲基化DNA片段。

73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述DNA样品来源于收集自患者的临床生物样品，所述生物样品选自由人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合所组成的组中。

74.根据权利要求72所述的方法，其中，在所述DNA样品中未甲基化DNA与甲基化DNA的摩尔比为约2:1至约100,000:1。

75.根据权利要求72所述的方法，其中，所述CpG位点在一个或多个基因上。

76.根据权利要求72所述的方法，其中，所述亚硫酸氢盐处理将CpG位点上的未甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，而CpG位点上的甲基化胞嘧啶保持不变。

77.根据权利要求76所述的方法，其中，所述多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中使每一对引物与含有一个或多个CpG位点的序列杂交用于扩增所述序列。

78.根据权利要求77所述的方法，其中，多重PCR将尿嘧啶转变为胸腺嘧啶。

79.根据权利要求72所述的方法，其中，所述从多重PCR的扩增子中富集含有甲基化CpG位点的甲基化DNA片段是通过以下(i)和(ii)的至少之一进行的：(i)甲基化特异性杂交和提取，以及(ii)竞争性甲基化特异性杂交和提取。

80.根据权利要求79所述的方法，其中，富集是通过甲基化特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个甲基化特异性探针与第一PCR的DNA片段接触，其中每一个甲基化特异性探针优先与甲基化序列形成杂交物，其中还将所述甲基化特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

81.根据权利要求80所述的方法，其中，所进行的竞争性甲基化特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述循环数为1个。

83.根据权利要求81所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

84.根据权利要求83所述的方法，其中，重复所述甲基化特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体俘获的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的甲基化特异性杂交和提取的循环。

85.根据权利要求80所述的方法，其中，所述甲基化特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

86.根据权利要求80所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

87.根据权利要求79所述的方法，其中，富集甲基化DNA片段是通过竞争性甲基化特异性杂交和提取进行的，其中在杂交条件下使多个甲基化特异性探针和未甲基化竞争探针与第一PCR的DNA片段接触，其中甲基化特异性探针优先与甲基化序列形成杂交物，而对应的未甲基化竞争探针优先与对应的未甲基化DNA片段形成杂交物，其中还将所述甲基化特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

88.根据权利要求87所述的方法，其中，所进行的竞争性甲基化特异性杂交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

89.根据权利要求88所述的方法，其中，所述循环数为1个。

90.根据权利要求88所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

91.根据权利要求90所述的方法，其中，重复所述竞争性甲基化特异性杂交和提取，其中将被所述固体载体俘获的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的竞争性甲基化特异性杂交和提取的循环。

92.根据权利要求87所述的方法，其中，所述甲基化特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

93.根据权利要求87所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

94.根据权利要求87所述的方法，其中，甲基化特异性探针与对应的未甲基化竞争探针的摩尔比为约0.02:1至约10:1。

95.一种用于除去由多重PCR产生的引物-引物相互作用产物的方法，所述方法包括：通过多重PCR扩增靶DNA序列；以及，通过序列特异性俘获除去引物-引物相互作用产物来纯化多重PCR的扩增靶序列。

96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述多重PCR使用两对或两对以上的PCR引物，其中每一对引物适合于扩增一个靶序列。

97.根据权利要求95所述的方法，其中，所述序列特异性俘获是通过在杂交条件下使多个序列特异性探针与多重PCR的扩增子接触来进行的，其中所述序列特异性探针优先与靶序列形成杂交物，其中还将所述序列特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及，在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

98.根据权利要求97所述的方法，其中，所进行的序列特异性俘获循环的循环数范围为1至5个循环。

99.根据权利要求98所述的方法，其中，所述循环数为1个。

100.根据权利要求98所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

101.根据权利要求100所述的方法，其中，重复所述序列特异性俘获，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的序列特异性俘获循环。

102.根据权利要求97所述的方法，其中，所述序列特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中，并且其中所述序列特异性探针不与多重PCR的引物序列相结合。

103.根据权利要求97所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

104.一种用于使多级多重PCR更强大的方法，所述方法包括：

提供含有靶序列的样品；

通过第一多重PCR扩增所述样品来形成含有引物-引物相互作用产物的第一扩增样品；

除去至少一部分引物-引物相互作用产物；以及，

在除去引物-引物相互作用产物之后，通过第二多重PCR形成第二扩增样品。

105.根据权利要求104所述的方法，其中，所述第一多重PCR使用具有靶特异性部分和通用尾部的PCR引物。

106.一种用于平衡多个PCR产物的产率的方法，其包括：提供含有将要被扩增的靶序列的DNA样品；通过第一PCR扩增靶DNA序列；平衡被第一PCR扩增出的靶序列的量；以及，通过第二PCR扩增该平衡的靶DNA序列。

107.根据权利要求106所述的方法，其中，所述第一PCR是使用两对或两对以上PCR引物的多重PCR，其中每一对引物包括正向引物和反向引物，其中每一对引物适合于扩增靶序列，并且其中每一个引物包括靶特异性部分和通用尾部，其中所述靶特异性部分侧接于所述靶序列以允许扩增所述序列并且对于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列相同，其中所述通用尾不能够与样品中的任何DNA序列相结合。

108.根据权利要求106所述的方法，其中，通过序列特异性俘获使被第一PCR扩增出的靶序列的量平衡，其中在杂交条件下使多个序列特异性杂交探针与第一PCR的扩增子接触，其中所述序列特异性探针优先与靶序列形成杂交物，其中还将所述序列特异性探针连接到第一结合分子上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；以及在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获；以及，调整序列特异性探针的摩尔比，使得通过加入较大量的对应于所述低效扩增序列的序列特异性探针，使所述低效扩增序列能够被更有效地俘获，以及通过加入较少量的对应于所述高效扩增序列的序列特异性探针，使所述高效扩增序列在杂交过程中被较低效地俘获。

109.根据权利要求108所述的方法，其中，所述序列特异性探针选自由寡核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

110.根据权利要求108所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

111.根据权利要求108所述的方法，其中，重复所述序列特异性俘获，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进行另外的序列特异性俘获循环以获得所需要的靶序列的平衡量。

112.根据权利要求106所述的方法，其中，所述第一PCR使用两对或两对以上的引物，每一对引物包括正向引物和反向引物，每一对引物包括通用尾；第二PCR是通过使平衡的靶序列与通用引物接触来进行的，其中使所述通用引物与正向和反向引物的通用尾杂交以扩增所有的靶序列。

113.根据权利要求112所述的方法，其中，当第一PCR的正向和反向引物的通用尾相同时，第二PCR使用一个通用引物；当第一PCR的正向和反向引物的通用尾不同时，第二PCR使用两个通用引物，其中一个通用引物与第一PCR的正向引物的通用尾配对，而另一个通用引物与第一PCR的反向引物的通用尾配对。

114.一种用于平衡由多级多重PCR生产的PCR产物的产率的方法，所述方法包括：

提供含有第一靶序列和第二靶序列的样品；

鉴别第一靶序列和第二靶序列的相对扩增效率；

将适合于以第一靶序列为靶点的第一探针和适合于以第二靶序列为靶点的第二探针加入到所述样品中，其中第一探针与第二探针的摩尔比基于第一和第二靶序列的相对扩增效率。

115.根据权利要求114所述的方法，其中，第一靶序列具有比第二靶序列低的扩增效率，因此增加第一探针与第二探针的摩尔比。