CN101358201A - 重组人铁调素腺病毒、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人铁调素腺病毒(Ad－hepc)，包含有人铁调素(hepcidin)基因与腺病毒载体。本发明还公开了上述重组人铁调素腺病毒的制备及其应用。本发明是利用缺陷型腺病毒将人铁调素(hepcidin)基因引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达铁调素蛋白。

Description

重组人铁调素腺病毒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种利用重组腺病毒载体携带人铁调素(Hepcidin)基因、从而在生物体内能够自主表达铁调素蛋白的重组人铁调素腺病毒、其制备方法及应用。

背景技术

铁调素(Hepcidin)是一个富含半胱氨酸的抗菌多肽。2001年Park等人首次从人尿中分离到这一多肽，并将其命名为铁调素。人铁调素包含有20、22和25个氨基酸多肽等三种组成形式。25个氨基酸多肽是铁调素的主要存在形式。铁调素基因位于人的第19号染色体上，由三个外显子和两个内含子组成，转录后的mRNA长约为0.4kb。Northern Bolt的分析结果显示，铁调素的基因在肝脏特异表达，心脏、脊髓、肺表达很少，***、睪丸、卵巢、小肠、结肠、肾脏和膀胱几乎没有表达。

铁调素及其在铁调节中作用的认识是进入21世纪后铁代谢领域中最重要的突破性进展。无论对临床诊断还是治疗各类贫血及高铁负荷相关疾病，其意义均是巨大的。大量研究包括我们的结果已经证实，在外周组织参与铁代谢如小肠铁吸收以及肝脏、网织红细胞和RE***铁转运的蛋白，如载铁蛋白(Tf，Transferrin)及其受体(TfR，Transferrin Receptor)、细胞色素b(Dcytb，Duodenal Cytochrome b)、二价金属离子转运蛋白(DMT1，Divalent MetalTransporter 1)、膜铁转运蛋白1(FP1，Ferroportin 1)、铜蓝蛋白(CP，Ceruloplasmin)和膜铁转运辅助蛋白(HP，Hephaestin)在脑内均有表达。

我们最近的研究发现并在国际上首先报导了脑有能力表达铁调素。我们的实验也已初步显示脑室内注射铁调素可降低脑内铁水平，说明铁调素能调节脑铁代谢，参与脑铁平衡的维持。这些结果也显示外源性铁调素可能具有有效降低因各种原因引起的异常增高的脑铁，达到防治神经退行性疾病的目的。本项目将***研究脑室内注射铁调素对帕金森氏病动物模型脑内铁含量，以及对主要铁摄取蛋白(载铁蛋白受体和二价金属离子转运蛋白1)和铁释放蛋白(膜铁转运蛋白1，膜铁转运辅助蛋白和铜蓝蛋白)表达的影响。完成我们最近的研究发现并在国际上首先报导了脑有能力表达铁调素。我们的实验也已初步显示脑室内注射铁调素可降低脑内铁水平，说明铁调素能调节脑铁代谢，参与脑铁平衡的维持。早在1991年，我们已经发现脑铁的失调以及铁诱导的氧化应激，是促进神经退行性变的重要诱因。

实验数据显示，脑铁的失调至少是某些神经退行性疾病(例如：帕金森氏病PD以及老年性痴呆AD)的起病的始发原因之一。铁调素(Hepcidin)将成为治疗铁代谢紊乱疾病(任何类型铁过载引起的疾病)一种新的药物。然而，铁调素由于蛋白分子量小，而且具有4个二硫键，导致出现制备纯化困难以及容易降解等问题，极大限制了其作为药物的应用范围。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种在生物体内能够自主表达铁调素蛋白、从而提升体内铁调素(hepcidin)水平的重组人铁调素腺病毒。

本发明的另一目的在于提供上述重组人铁调素腺病毒的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述重组人铁调素腺病毒在制备药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)，其包含有人铁调素(hepcidin)基因与腺病毒载体。

所述人铁调素基因***所述腺病毒基因组中。

所述人铁调素基因为分泌型人铁调素基因。

所述人铁调素基因的表达读码框包含巨细胞病毒(CMV)启动子、分泌型人铁调素(hepcidin)基因以及下游的polyA信号。

所述人铁调素基因含有序列表中Seq ID No.1所示的序列。

所述腺病毒为缺陷型腺病毒。

所述腺病毒为1型腺病毒。

所述腺病毒为缺失了E1区的缺陷型腺病毒。

本发明还公开了上述重组人铁调素腺病毒的制备方法，所述方法包括：

a、将人铁调素(hepcidin)基因与所述腺病毒的Ad-track穿梭质粒连接构建Ad-track-hepcidin重组载体；

b、使所述Ad-track-hepcidin重组载体线性化；

c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；

d、Ad-track-hepcidin与腺病毒骨架质粒进行同源重组；

e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。

其中步骤e的细胞优选为HEK293细胞。

本发明进一步公开了上述重组人铁调素腺病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。

优选的，所述铁代谢紊乱疾病为任何类型铁过载引起的疾病，或者所述铁代谢紊乱疾病为任何类型的缺铁性贫血。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备了以下技术效果：

本发明是利用缺陷型腺病毒将人铁调素(hepcidin)基因引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达铁调素蛋白。这种方法能够克服外源蛋白质不稳定、活性低、成本高以及免疫原性等缺点，并且能够保持蛋白质二级以及高级空间结构的自然特性，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。

利用缺陷型腺病毒作为载体，具有以下优点：

1.腺病毒载体工艺流程简单，病毒滴度高；

2.腺病毒载体转染率高，可操作性好；

3.腺病毒载体宿主范围广，安全可靠，致病性低；

4.腺病毒载体免疫反应弱，外源基因表达稳定持久；

5.由CMV启动子控制铁调素(hepcidin)高效表达，调节体内血清铁水平；

6.由于在真核细胞内自主表达蛋白，其产物具有天然蛋白的构想与活性，能完全模拟天然表达情况。

附图说明

图1是腺病毒穿梭质粒的多克隆位点图；

图2是重组人铁调素(hepcidin)生产工艺流程图；

图3是Ad-hepc***蛋白表达情况图；

图4是以GFP为标记，观察Ad-hepc***感染细胞情况图；

图5是构建高血清铁动物模型并利用Ad-hepc***进行体内实验的血清铁水平结果图。

图6是构建高血清铁动物模型并利用Ad-hepc***进行体内实验的组织铁水平结果图。

图7为实施例2中Ad-hepc的***序列测定报告。

具体实施方式

本发明针对铁调素构建重组腺病毒表达体系(Ad-hepc)，提升体内铁调素(hepcidin)的水平，调节体内血清铁的浓度，降低铁对于细胞的毒性，达到治疗神经退行性疾病等铁代谢相关疾病的目的。

本发明的重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)，包括含有分泌型人铁调素基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为1型腺病毒(Adeasy-1，Ad1)。

在本发明优选的实施方式中，选择了构建铁调素的重组腺病毒，其载体***为Adeasy-1。Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过其穿梭质粒Ad-track-CMV将外源性基因与病毒骨架整合，从而包装出具有广泛感染性的重组腺病毒。包装成功的重组腺病毒在一般的细胞内不能复制，具有安全、高效、简单易行等优点。

Ad-hepc结构：重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)载体缺失了E1区，在普通细胞内不能包装为成熟病毒颗粒，为缺陷型病毒。人铁调素(hepcidin)基因为目的基因。我们将人分泌型铁调素基因***病毒的基因组中，以双CMV为其启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为其标记物，下游polyA尾为其终止信号区。

本发明的目的基因人铁调素基因含有序列表中Seq ID No.1所示的序列。

重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)生产工艺流程包括：重组载体构建、载体线性化制备、转染HEK293细胞、扩大培养、分离纯化、冷冻干燥以及包装制剂。

具体地，重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)生产工艺流程包括：

a、将人铁调素(hepcidin)基因与所述腺病毒的Ad-track穿梭质粒连接构建Ad-track-hepcidin重组载体；

b、使所述Ad-track-hepcidin重组载体线性化；

c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；

d、Ad-track-hepcidin与腺病毒骨架质粒进行同源重组；

e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。

其中步骤e的细胞优选为HEK293细胞。

本发明的重组人铁调素腺病毒可用于制备药物组合物，该药物组合物可用于治疗铁代谢紊乱疾病，包括任何类型铁过载引起的疾病与任何类型缺铁性贫血。

可用于制备药物组合物时，本发明的重组人铁调素腺病毒可以制备成液体制剂，偏碱性，PH 8.0，冻干后为白色粉末，可跟水与任何比例混合，无味，可作为针剂、喷剂。

本发明是利用缺陷型腺病毒将人铁调素(hepcidin)基因引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达铁调素蛋白。这种方法能够克服外源蛋白质不稳定、活性低、成本高以及免疫原性等缺点，并且能够保持蛋白质二级以及高级空间结构的自然特性，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。

利用缺陷型腺病毒作为载体，具有以下优点：

1、腺病毒载体工艺流程简单，病毒滴度高；

2、腺病毒载体转染率高，可操作性好；

3、腺病毒载体宿主范围广，安全可靠，致病性低；

4、腺病毒载体免疫反应弱，外源基因表达稳定持久；

5、由CMV启动子控制铁调素(hepcidin)高效表达，调节体内血清铁水平；

6、由于在真核细胞内自主表达蛋白，其产物具有天然蛋白的构想与活性，能完全模拟天然表达情况。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

铁调素基因***重组

如图1所示，pTrack-CMV为重组腺病毒的穿梭质粒。我们将铁调素基因两端接上Bgl II与Sal I酶切位点，并加上polyA尾作为终止信号区。酶切铁调素基因与穿梭质粒，并将两者用T4连接酶进行连接转化，经筛选后，得到正确克隆，送测序公司测序鉴定。

Ad-hepc结构：重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)载体缺失了E1区，在普通细胞内不能包装为成熟病毒颗粒，为缺陷型病毒。人铁调素(hepcidin)基因为目的基因。我们将人分泌型铁调素基因***病毒的基因组中，以双CMV为其启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为其标记物，下游polyA尾为其终止信号区。

实施例2

重组人铁调素腺病毒制备

重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)生产工艺流程包括：重组载体构建、载体线性化制备、转染HEK293细胞、扩大培养、分离纯化、冷冻干燥以及包装制剂。具体见以下详述及其生产工艺流程图(见图2)。

1、目的基因hepcidin的获取

以含人基因组cDNA的作为模板，Pfu高保真酶PCR扩增。PCR热扩增条件为95℃变性5min，95℃80s，58℃100s，72℃120s，30个循环，最后72℃保温5min。产物约450bp。

其引物序列为：

上游引物(Seq ID No.2)：

CTCAC AGATCT GACAGAAGGCAAGATGGCACTAAG

下游引物(Seq ID No.3)：

TCAAT GTCGAC GCTGGGGTAGGACAGGAATAAATA

PCR反应条件如下：

无菌水                38μl

10x PCR Buffer        5μl

4x dNTP               4μl

引物1                 1μl

引物2                 1μl

模板                  0.5μl

Pfu聚合酶             0.5μl

                                          

总体积：              50μ

2、Ad-track-hepcidin穿梭质粒的构建

A.双酶切PCR产物与Ad-track质粒，37℃酶切过夜。酶切体系构建如下：

PCR产物               20μl

10x buffer            10μl

ddH2O                 60μl

Bgl-II                5μl

Sal-I                 5μl

                                         

总体积                100μl

Ad-track质粒          20μl

10x buffer            10μl

ddH2O                 60μl

Bgl-II                5μl

Sal-I                 5μl

                                   

总体积                100μl

B.QIAquick Gel extraction kit试剂盒法凝胶回收酶切片断；

C.0.8％琼脂糖凝胶电泳，利用定量Marker初步估计核酸浓度；

D.T4连接酶4℃过夜，连接凝胶回收PCR产物与酶切质粒，连接体系如下：

Ad-track质粒酶切片断  5μl

PCR产物酶切片断       7μl

10x buffer            2μl

ddH2O                 4.5μl

T4连接酶              1.5μl

                                        

总体积                20μl

注：先加入DNA片断与ddH2O，45℃温浴5min，且所有试剂加入前于0℃预冷。

E.将连接产物转化入DH-5α感受态细菌中，涂板37℃过夜16h；

F.次日每个平板挑取较小的克隆10个，小量法提取质粒；

G.双酶切重组质粒；

H.酶切产物5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色；

I.挑选切出相应小片断的克隆扩增，提取质粒；

J.保存菌种与质粒，送样品测序鉴定，结果与预期一致，如图7所示。

3、Pme-I线性化重组质粒

利用Pme-I内切酶线性化穿梭质粒，凝胶回收线形化片断。

酶切***构建如下：

10x buffer            5μl

100x BSA              0.5μl

质粒DNA               25μl

Pme-I                 1μl

ddH2O                 18.5μl

                                        

总体积                50μl

4、Adeasy-1质粒转化BJ5183，构建Ad-BJ5183细菌株

A.用冷却的无菌吸头，吸取BJ5183感受态细胞200μl至无菌离心管中；

B.按照比例稀释Adeasy-1质粒；

C.每组取10μl加入感受态细胞中；

D.混匀内容物，冰浴30min；

E.将管置42℃循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动；

F.迅速转至冰浴中，冷却2min；

G.每管加800μl无抗生素LB培养基；37℃缓慢(45rpm)振荡45min；

H.取200μl至含氨苄青霉素的LB琼脂平板，均匀涂布菌液；

I.倒置平板，37℃，16h。

J.次日观察结果，看生长菌落多寡是否与浓度梯度一致。

5、Ad-track-hepcidin穿梭质粒与Adeasy-1同源重组

A.将目的基因***穿梭载体的多克隆位点，转化E.coli-DH5α，铺卡那霉素抗性LB平板，挑取克隆，接种于5ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃震摇过夜，次晨提取质粒，PCR或酶切鉴定。

B.提取的穿梭质粒经Pme-I酶切过夜，充分线性化(不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率，将线性化质粒去磷酸化有助于降低背景信号)，凝胶纯化。

C.将回收的线性化载体转入Ad-BJ5183感受态细胞内，铺卡那霉素抗性LB平板，置于37℃孵箱内培养14-16小时。

D.挑取较小的克隆15-20个，接种于卡那抗性液体LB培养基5ml中，37℃震摇过夜。次晨收菌，立即提取质粒，酶切鉴定，选择成功重组的克隆，大量扩增，命名为Ad-hepcidin。

6、病毒骨架Pac-I线性化

利用Pac-I内切酶线性化上述病毒骨架质粒，37℃酶切过夜，以便在293A细胞中包装病毒。酶切体系构建如下：

10x buffer            5μl

100xBSA               0.5μl

Pac-I                 1μl

Ad-hepcidin DNA       40μl

ddH2O                 3.5μl

                                     

总体积                50μl

7、病毒骨架鉴定与纯化灭菌

取10μl线形化病毒骨架双酶切鉴定，体系同前所述。

鉴定后纯化酶切产物：

A.收集多管酶切产物，等体积酚-氯仿抽提2次；

B.等体积氯仿单独抽提1次；

C.加1/10体积3M NaAC(PH5.2)以及2.5倍体积冰的无水乙醇，至于-80℃1小时；

D.4℃，16000r/min，离心10min；

E.冰冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃放置过夜；

F.4℃，12000r/min，离心5min，移至超净台上操作；

G.弃上清，无菌环境下干燥15min；

H.50μl无菌ddH2O溶解沉淀；

I.取2μl电泳，测定核酸浓度。

8、病毒包装

A.将线性化质粒转染入HEK292细胞；

B.放置15天左右，每隔3天换液一次。待细胞出现彗星状荧光收毒；

C.大量扩增病毒，约培养100个9cm培养皿的细胞量后，进行超速梯度离心纯化；

D.透析后测定滴度，分装后保存于-80度。

实施例3

Ad-hepc***感染以及表达实验

1、接种C6细胞1.5X10⁷个细胞于9cm培养(Corning)中，37℃，5％CO₂培养过夜；

2、感染前换5ml无血清培养基；

3、每个培养皿加0.5ul实施例2中制备得到的纯化病毒；

4、分别培养0h，6h，12h，24h，48h

5、按照时间点收集细胞；

6、Real-time PCR定量检测不同时间点铁调素表达情况；

7、统计结果。

结果如图3、4所示，12小时左右铁调素表达已经达到空白对照组的8.1倍，并且持续表达。

实施例4

Ad-hepc体内实验(血清铁与组织铁测定)

1.选择3月龄SD大鼠雄雌各10只，按性别随机分为两组；

2.两组实验鼠均以高铁饲料(购自SIGMA)喂养3个月，构建高血清铁大鼠模型，并测定血清铁浓度；

3.实验组注射Ad-hepc病毒稀释液，每次剂量为约1X10¹²个病毒颗粒，每3天注射一次，3次为一疗程；对照组注射PBS等渗盐水；

4.一疗程结束后，分别于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常规方法利用生化仪器测定血清铁浓度。

5.最后处死大鼠，分别取心脏、大脑组织标本，冻干后利用测铁试剂盒测定组织铁含量。

结果发现，从第6天开始，实验组血清铁浓度开始下降，12天达到正常血清铁水平。组织铁测定显示实验组的组织含铁量显著降低。结果如图5、图6所示。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>钱忠明

     葛啸虎

     柯亚

     汪程远

<120>重组人铁调素腺病毒、其制备方法及应用

<130>0710198PJE

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>255

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atggcactga gctcccagat ctgggccgct tgcctcctgc tcctcctcct cctcgccagc    60

ctgaccagtg gctctgtttt cccacaacag acgggacaac ttgcagagct gcaaccccag    120

gacagagctg gagccagggc cagctggatg cccatgttcc agaggcgaag gaggcgagac    180

acccacttcc ccatctgcat tttctgctgc ggctgctgtc atcgatcaaa gtgtgggatg    240

tgctgcaaga cgtag                                                     255

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctcacagatc tgacagaagg caagatggca ctaag                               35

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcaatgtcga cgctggggta ggacaggaat aaata                               35

Claims (10)

1、一种重组人铁调素腺病毒(Ad-hepc)，其特征在于：包含有人铁调素(hepcidin)基因与腺病毒载体。

2、根据权利要求1所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述人铁调素基因***所述腺病毒基因组中。

3、根据权利要求1或2所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述人铁调素基因为分泌型人铁调素基因。

4、根据权利要求3所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述人铁调素基因的表达读码框包含巨细胞病毒(CMV)启动子、分泌型人铁调素(hepcidin)基因以及下游的polyA信号。

5、根据权利要求1或2所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述腺病毒为缺陷型腺病毒。

6、根据权利要求5所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述腺病毒为1型腺病毒。

7、根据权利要求5所述的一种重组人铁调素腺病毒，其特征在于：所述腺病毒为缺失了E1区的缺陷型腺病毒。

8、权利要求1～7中任意一项所述的重组人铁调素腺病毒的制备方法，所述方法包括：

a、将人铁调素(hepcidin)基因与所述腺病毒的Ad-track穿梭质粒连接构建Ad-track-hepcidin重组载体；

b、使所述Ad-track-hepcidin重组载体线性化；

c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；

d、Ad-track-hepcidin与腺病毒骨架质粒进行同源重组；

e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。

9、权利要求1～7中任意一项所述的重组人铁调素腺病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述铁代谢紊乱疾病为铁过载引起的疾病。

Images