CN101357229A - 能防治猪腹泻的免疫球蛋白复合剂的生产技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽药与饲料添加剂领域，具体是指特效防治猪腹泻免疫球蛋白复合制剂的生产方法。其特征是用特异性免疫球蛋白或含有特异性免疫球蛋白的未提取物按一定配比添加部分提取物或粉体等混匀而成。本发明综合了免疫球蛋白提取物或粉体的优点，形成了新型的抗生素替代品，达到标本兼治，可以加快腹泻动物的康复，达到防病与治病目的，同时还降低了成本。是一种安全、无激素的绿色产品，对猪腹泻有特效，治愈率达到98％以上，提高猪生长速度10％以上。本发明特别适用于猪腹泻的预防和治疗，同时也适用于各种家禽、家畜等动物腹泻疾病的防治。

Description

能防治猪腹泻的免疫球蛋白复合剂的生产技术

(一)技术领域

本发明涉及兽药与饲料添加剂领域，具体是指特效防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的生产方法。

本发明适用于猪腹泻的预防和治疗，同时也适用于各种家禽、家畜等动物腹泻疾病的防治。

(二)背景技术

仔猪腹泻是由猪致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等引起的一种常见传染病，包括猪传染性胃肠炎、流行性腹泻、猪轮状病毒病、猪繁殖呼吸综合症、猪瘟、伪狂犬病和圆环病毒性肠炎等，具有发病急、传播快、死亡率高等特点，严重危害养猪业的发展。

常见的仔猪胃肠道疾病有仔猪白痢、仔猪黄痢、仔猪副伤寒、传染性胃肠炎等。仔猪黄、白痢主要是由埃希氏大肠杆菌引起，一般吮乳仔猪发病率较高，同窝仔猪发病率可达80％，其中仔猪白痢的死亡率较低，而仔猪黄痢的死亡率很高，有时甚至会全窝死亡。产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia colt，ETEC)是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一(Yokoyam等，1992)。初生仔猪和早期断奶仔猪自身免疫功能的不成熟以及早期断奶应激引起的免疫抑制，是造成仔猪对ETEC敏感性增高、抗病力下降，并引发ETEC感染性腹泻的主要因素。

长期以来，仔猪腹泻的防治主要依赖于抗菌药物、大肠杆菌多价苗和基因工程疫苗。然而，抗生素在动物体内会导致药物残留和产生抗药性；用疫苗免疫母猪，虽可提高母乳中免疫球蛋白含量，但母源免疫球蛋白持续时间短，不足以保护仔猪整个生长阶段不致病；口服高免动物血清虽能有效防治该病，但成本较高很难在生产中推广应用。

中草药是纯天然制剂，毒副作用小，不存在耐药性及药物残留问题，加之随着人们生活水平的不断提高，动物性食品的安全性越来越引起社会的关注。中草药添加剂在改善仔猪特异性免疫功能的同时，还可以刺激仔猪非特异性免疫功能。研究表明，中草药添加剂能显著提高断奶仔猪肠道中蛋白酶的活性，从而一方画提高蛋白质吸收率，促进组织器官和免疫器官的生长发育；另一方面，促进蛋白质的消化吸收，不致被大肠段微生物过度发酵，防止了腹泻的发生。

卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin，卵黄免疫球蛋白)，卵黄免疫球蛋白具有增强机体抗菌、免疫功能，采用生物技术从产蛋鸡卵黄中制备特异性多克隆免疫球蛋白，具有成本低，产量高的特点。卵黄免疫球蛋白能够凝聚、吞噬和中和细菌及毒素成分；增强免疫***功能，预防消化道等疾病，促进营养吸收。用于动物的保健和疾病治疗等。预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄免疫球蛋白对宿主特异性菌毛抗原有强烈的亲和力，能够阻断或降低宿主特异性菌毛与仔猪小肠上皮的结合，使ETEC不能在小肠定居繁殖，从而阻断了大肠杆菌产生肠毒素，防止和减少仔猪腹泻的发生。

抗生素作为控制细菌感染的有效药物广泛应用于生产中，但抗生素的长期使用引起的耐药性问题和生产中超量使用抗生素的现象越来越突出，但控制效果却并不乐观。抗生素替代品的研究成为畜牧业发展的迫切需求。研制新型的制剂，在防治仔猪腹泻疾病方面，做到治标与治本结合，加快养猪业的发展，实现猪肉产品的绿色无害化，成为人们关注的焦点。

(三)发明内容

本发明的目的在于，提出防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，在中草药基料基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而形成的，本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，可以替代抗生素，解决了传统用抗生素治疗猪腹泻产生耐药性问题，实现畜禽产品的绿色无害化。

本发明的工艺如下：

1.卵黄免疫球蛋白的制备方法

1.1鸡蛋免疫制备：选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的大肠杆菌多价疫苗(如K88、K99、987P、F41多价疫苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋。

1.2卵黄免疫球蛋白提取方法——乙酸-乙酸钠缓冲液方法(一)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH为5.0)，二者搅拌时间为15min，混匀，4℃，静置10h。离心(1900r/min，10℃，10min)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4℃下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂→粉剂或注射剂

1.3卵黄免疫球蛋白提取方法——水稀释法(二)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳。分离蛋清与卵黄，卵黄加9倍无菌水稀释，用HCI调节pH5.2稀释液混合后，于4℃冷藏5h，在4℃1000g条件下离心1h，上清液加入饱和硫酸铵及硫酸钠盐析沉淀法进一步纯化，PBS透析，即为粗提卵黄免疫球蛋白。粗提卵黄免疫球蛋白经过DEAE-葡聚糖A50，经常规处理后，用0.015mol/Ltris～HCI PH8.0缓冲液平衡装入2×40cm玻璃柱，上样后用缓冲液进行洗脱。或经过盐析、超滤浓缩、冷冻真空干燥、测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性、制成肠溶卵黄免疫球蛋白胶囊或其他剂型。纯化的方法还可用聚乙二醇(PEG)法、硫酸葡聚糖法等。

1.4卵黄免疫球蛋白提取方法——超滤法(三)

利用方法(二)得到的粗提卵黄免疫球蛋白液，采用超滤法，分子截留量采用100kDa，操作压力差为0.12MPa、进料温度为30℃，pH5.2，截留液免疫球蛋白回收率达到91.89％，纯度为86％；最后，经DEAE离子交换层析得到高纯度的卵黄免疫球蛋白。

1.5卵黄免疫球蛋白提取工艺(以鸡蛋为例)

鲜鸡蛋→打蛋取蛋黄→制备蛋黄溶液→盐析→超滤浓缩→冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂→粉剂或注射剂

2.血清免疫球蛋白的制备方法

2.1选择健康动物(如猪、马、牛、羊等)，用市购或自制的大肠杆菌多价疫苗(如K88、K99、987P、F41多价疫苗)采用口服免疫、注射或滴鼻方法，对其进行免疫，剂量：每头0.1～3.0mL。在免疫三天后进行采血，自然凝固后于2000～10000r/min，离心20～30min，取血清。

2.2从血液中提取免疫球蛋白。常用的有盐析法(如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法)、有机溶剂沉淀法(如冷乙醇分离法)、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。用于大规模生产的方法主要有：冷乙醇分离法、盐析法、利凡诺法和柱层析法等，应用较多的为硫酸铵盐析法和冷乙醇分离法。

2.3提取工艺(以硫酸铵盐析法为例)：

猪血清→加入硫酸铵饱和溶液进行沉淀→免疫球蛋(Ig)粗品→加蒸馏水转移→超滤→透析→Ig纯品。工艺条件采用pH7.0～7.2、40～50℃、50％饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液，此工艺可以大规模生产Ig、安全无毒、操作方便。既能保证Ig的生物活性不受破坏，又能满足大量生产的需要。在我国富含Ig的原料很丰富，就全国范围内，每年可得猪血1125～115亿kg，如果这些原料能被很好地利用起来，由此所创的经济效益和社会效益将相当可观。

2.4喷雾干燥方法

将提取的动物血液IgG配制成蛋白浓度为10％～20％的溶液，分别在入风口温度120～180℃，出风口温度60～80℃条件下进行喷雾干燥，真空包装，置于冰箱保存。

3.中草药提取物制备方法

按照白头翁、金银花、马齿苋、苦参、车前草、马齿苋、鱼腥草、甘草等中草药1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

3.1供试样品提取物的制备取已经粉碎好的一定量的供试中药材样品，置于具塞三角瓶中，加入倍体积量的提取溶剂，置于超声波装置(SB3200)中，处理30min后，过滤，滤液减压浓缩后，在加入5倍体积量的提取溶剂超声波处理15min，过滤，滤液减压浓缩，如此重复2次，合并3次提取物的浓缩物，即得到该溶剂的超声波提取的粗提物，置于4℃冰箱保存备用。

3.2中草药提取物微胶囊生产技术

按照大豆白与麦芽糊精的比例1∶2，中草药提取物添加量为2.2％，均质压力为30MPa，喷雾干燥塔进风口风温100℃，出风风温70～80℃。经喷雾干燥制得中草药提取物微胶囊。

4.中草药粉碎

采用微粉碎机或超微粉碎机对中草药进行粉碎。

5.中草药与卵黄免疫球蛋白饲料添加剂制备方法

5.1中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂

按照中草药提取粉剂、卵黄免疫球蛋白粉剂干粉与载体1∶0.5∶2的比例，先将中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂加入到混合机混合1min，再加入载体混合4min，即得复合饲料添加剂。

5.2利用超声波提取中草药有效成分，合并滤液，浓缩至原液浓度为1g/mL，采用间歇法灭菌。经过低温冷冻干燥机进行制成粉剂；卵黄免疫球蛋白粉剂由疫苗经过蛋鸡免疫制备。中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂复合制备了中草药与卵黄免疫球蛋白复合饲料添加剂。

本发明的优点是：

1.通过应用猪致病性大肠杆菌K88、K99、9879、F41疫苗免疫蛋鸡，制备了鸡抗猪大肠杆菌特异性高免卵黄免疫球蛋白或特异性血清免疫球蛋白。应用平板式膜超滤技术对卵黄中的免疫球蛋白进行分离，采用真空冷冻干燥工艺，制备了卵黄免疫球蛋白粉剂。

2.确定了中草药处方组成，利用超声波技术对中草药进行了提取，采用真空冷冻干燥工艺，制备了中草药粉剂。利用中草药粉剂小鼠腹泻模型进行了治疗性试验；对不同配比的中草药卵黄免疫球蛋白饲料添加剂进行了体外抑菌试验，确定了最佳配比，研制了中草药卵黄免疫球蛋白饲料添加剂(仔猪腹泻康)产品，对早期断奶仔猪腹泻进行了治疗性试验研究。

3.本研究创新之处：一是研制了中草药卵黄免疫球蛋白复合饲料添加剂新型产品；二是建立了中草药与卵黄免疫球蛋白提取工艺。

4.在卵黄免疫球蛋白的提取方法、卵黄免疫球蛋白与中草药组合形成的添加剂配方两方面具有创新，研究成果达到了国内领先水平。

5.原料来源广泛，可再生；工艺流程简单，条件温和；整个制备工艺无任何废水、废气废液产生，无环境污染。

6.本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，具有增强机体抗菌、免疫功能，可抑制致病性大肠杆菌等肠道致病菌的生长，是维持仔猪健康所必需。具有创新性，可以替代抗生素，有广阔的市场前景。

(四)具体实施方式

具体实施方式一：

原料：中草药提取物、卵黄免疫球蛋白、载体

1.中草药提取物制备：

按照白头翁、金银花、马齿苋、苦参、车前草、马齿苋、鱼腥草、甘草等中草药1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备：

2.1鸡蛋免疫制备：选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的大肠杆菌多价疫苗(如K88、K99、987P、F41多价疫苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0.5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋。

2.2卵黄免疫球蛋白提取方法(以乙酸-乙酸钠缓冲液方法为例)

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH为5.0)，二者搅拌时间为15min，混匀，4℃，静置10h。离心(1900r/min，10℃，10min)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4℃下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分-WSF)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→制成卵黄免疫球蛋白制剂

3.中草药免疫球蛋白制剂制备：

3.1按照中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂干粉1∶1的比例先将中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂加入到混合机混合1min，再加入，添加30～80％玉米芯混合4min，即得复合饲料添加剂。

3.2利用超声波提取中草药有效成分，合并滤液，浓缩至原液浓度为1g/mL。将制得的中草药液体提取物与液体卵黄免疫球蛋白按照1∶1混合→中草药免疫球蛋白液体→间歇灭菌→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→进行调配→装瓶处理后→成品(或制成肠溶卵黄免疫球蛋白胶囊或其他剂型)

具体实施方式二：

原料：中草药提取物、卵黄、载体

1.中草药提取物制备：将中草药以党参、白头翁、黄芪、板蓝根、败酱草1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药与卵黄复合制剂制备：

按照中草药提取物与卵黄重量比1∶1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→中草药免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式三：

原料：中草药提取物、卵黄卵清、载体

1.1.中草药提取物制备：将中草药以苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、败酱草、甘草1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药卵黄卵清制剂制备：

将制得的中草药提取物与卵黄蛋清按照1∶1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→中草药免疫球蛋白粉剂→测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性→真空包装→成品

具体实施方式四：

原料：中草药微(超微)粉碎、卵黄免疫球蛋白、载体

1.中草药微(超微)粉碎：

按照苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、败酱草、鱼腥草、甘草等中草药1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，制备中草药粉剂。

2.卵黄免疫球蛋白制备(采用水稀释法)：

高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5％新洁尔灭溶液中，浸泡10分钟，再用75％的酒精冲洗，无菌打破蛋壳。分离蛋清与卵黄，卵黄加9倍无菌水稀释，用HCI调节pH5.2稀释液混合后，于4℃冷藏5h，在4℃1000g条件下离心1h，上清液加入饱和硫酸铵及硫酸钠盐析沉淀，离心后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥，即得粗提卵黄免疫球蛋白。

3.中草药免疫球蛋白制剂制备：

将制得的中草药提取物与卵黄免疫球蛋白按照1∶1的比例进行配比→添加20～60％白碳黑，通过混合机混匀→灭菌→中草药免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品

具体实施方式五：

原料：中草药微(超微)粉碎、卵黄、载体

1.中草药提取物制备：

按照白头翁、金银花、白头翁、苦参、车前草、黄芪、鱼腥草、甘草等中草药1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用微粉碎粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60～90min。超声波频率采用20～40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。

2.卵黄制备：

取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药与卵黄复合制剂制备：

按照中草药提取物与卵黄重量比1∶1的比例进行混合后→添加20～80％脱脂米糠与0.5％抗氧化剂→通过混合机混匀→灭菌→真空包装→中草药免疫球蛋白粉剂产品。

具体实施方式六：

原料：中草药微(超微)粉碎、卵黄卵清、载体

按照苦参、白头翁、黄连、车前草、大青叶等中草药1∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，利用超微粉碎或微粉碎机粉碎后混合，制得中草药粉剂。

2.卵黄卵清制备：

取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。

3.中草药卵黄卵清制剂制备：

将制得的中草药粉剂与卵黄蛋清按照1∶1的比例进行配比→添加20～60％粉碎的大豆皮，通过混合机混匀→灭菌4～5分钟→中草药免疫球蛋白粉剂→真空包装→成品。

Claims (7)

1、防治猪腹泻复合制剂是在中草药基料基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而形成的，其特征在于，所谓的中草药基料是以党参、苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、连翘、败酱草、茯苓、金银花、马齿苋、车前草、鱼腥草、甘草等中的2～14种原料调配混匀而成的；所谓的特异性免疫球蛋白是利用猪腹泻致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等制备的单价或多加灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋再经过消毒、分离纯化工艺制备而成的，或由上述疫苗免疫哺乳动物如猪、兔等制备的血清免疫球蛋白；经过粉碎(或提取)的中草药与特异性免疫球蛋白(或卵黄、卵黄卵清)按照一定配比与载体复合混匀而成的固体或液体制剂。采用口服、注射或伴饲料等方法给药，对猪腹泻有特效，治愈率达到98％以上，提高猪生长速度10％以上。

2、根据权利要求1所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，复合制剂为粉剂、水剂、颗粒或其他剂型，可以做饲料添加剂和各种药剂。

3、根据权利要求1所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，中草药基料采用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的提取物，在复合制剂中加入的比例为1～99％。

4、根据权利要求1所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，特异性卵黄免疫球蛋白为提取，或特异免疫鸡蛋经过消毒后直接打蛋，利用蛋清蛋黄或只用蛋黄，再与权利3中的中草药混合，在复合制剂中加入的比例为0.1～99％。

5、根据权利要求1所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，利用猪腹泻致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等制备的单价或多加灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋采用分离纯化工艺制备而成的。

6、根据权利要求1所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，其特征在于，采用口服、注射、伴料等方法给药，对猪腹泻有特效。

7、根据权利要求1所述的载体，其特征在于，载体包括有机载体与无机载体。