CN101352580A - 一种抗菌型表皮修复材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，涉及一种人体表皮修复材料。提供一种具有抗菌性能的抗菌型表皮修复材料的制备方法。在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，按质量百分比分别配制胶原溶液和壳聚糖溶液；在壳聚糖溶液中加入载银无机抗菌剂，搅拌，超声；将加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；将胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干；以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜；将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂中进行交联，清洗，烘干，即得抗菌型表皮修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体表皮修复材料，尤其是涉及一种抗菌型表皮修复材料的制备方法。
背景技术
表皮修复材料是一类用于各种创伤和创口表面进行临时覆盖的医用敷料，它可以使创口免遭细菌感染及其他外来因素的影响，具有保护创口和创面的作用。因此，寻找理想的创面覆盖物已成为国内外对各类皮肤创伤治疗的主要研究方向之一。胶原是细胞外基质的主要成分，比白蛋白和明胶等天然生物材料具有更好的生物相容性，并且有利于细胞的粘附、增殖和分化。壳聚糖的结构与人体内的糖胺聚糖极其相似，具有优良的血液相容性、降解性和抗血栓性。能促进生长因子及胶原的合成，从而加速成纤维细胞的生长。壳聚糖还能提高巨噬细胞的活性，激活宿主抵御病毒和细菌感染的免疫途径。此外，壳聚糖的加入还能减缓胶原的降解速度。因此利用胶原-壳聚糖制备的复合膜是解决伤口覆盖问题的有效途径。
虽然壳聚糖具有抑制细菌生长的作用，但研究表明，壳聚糖只有在酸性条件下才具有抗菌性。另外，壳聚糖与胶原的共混也限制了壳聚糖抗菌功能的发挥，因胶原中的羧基易与壳聚糖的氨基阳离子生成聚电解质或形成氢键，降低了氨基阳离子的抗菌活性。因此，胶原-壳聚糖敷料覆盖的创面易于被细菌侵染，其抗菌功能有待进一步提高。
能造成伤口感染的细菌种类繁多，这些细菌对伤口及其周围组织都有潜在的危险，减少伤口感染最可行的途径就是应用抗菌剂。传统的抗菌剂主要是指有机类抗菌剂，主要包括醇类、醛类、酚类、羧酸类、咪唑类以及有机金属类等。虽然有机抗菌剂对真菌有较好的抗菌效果，但其抗细菌效果较差，而且热稳定性低，一般只能在较低温度下使用，并且其分解或挥发物对人体与环境也可能造成一定的危害。另外，由于近年来耐药性极强的病原性细菌的出现，使得有机类抗菌剂的使用在很大程度上受到了限制。因此，应用无机抗菌剂来代替有机抗菌剂势在必行。银不但可以杀灭需氧菌、厌氧菌、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、真菌和病毒([14]Michael AA，George JV，Anthony EB.Antimicrobial properties of silver-containingwound dressings：a microcalorimetric study[J].International Journal of Pharmaceutics，2003，263：61-68：[15]Wright JB，Lam K，Hanson D，et al.Efficacy of topical silver against fungal bum wound pathogens[J].Am JInf Cont，1999，27：344-350；[16]lan AH，Paula D，Andrew PS.Assessment ofa silver-coated barrier dressing forpotential use with skin grafts on excised burns[J].Burns，2003，29：445-448.)，而且还有消炎的作用([17]Demling RH，DeSanti L.Effects of silver on wound management[J].Wounds，2001，13：4-9.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌性能的抗菌型表皮修复材料的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1)在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.2％～0.8％的胶原溶液和0.2％～0.8％的壳聚糖溶液；
2)在壳聚糖溶液中按质量百分比加入0.5％～7.5％的载银无机抗菌剂，搅拌，超声；
3)将步骤2)制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；
4)将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按1～10cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干；
5)以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜；
6)将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂中进行交联，清洗，烘干，即得抗菌型表皮修复材料。
载银无机抗菌剂可以是载银磷酸锆、载银磷酸复盐、载银氢氧化钠锆、载银二氧化硅等中的一种。
按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶(0.1～9)。
交联剂可采用戊二醛或丙三醇等，按质量百分比，交联剂的浓度最好为0.01％～10％，交联的时间最好为1～24h，清洗最好用去离子水清洗，烘干的温度最好为37℃。
与现有的表皮修复材料的制备方法相比，由于本发明采用的抗菌杀菌剂与以往的有机系杀菌剂相比，载银无机抗菌剂是将具有高效抗菌能力的银离子加载在各种无机天然或人工合成的载体上，从而使产品具有抗菌效果。载银无机抗菌剂具有安全性高、抗菌谱广、作用时间长、耐热性好、不易挥发和分解等特点，能克服传统有机抗菌剂常见的一些缺点。因而使用理化性质稳定的材料制成，故其功能不会因加工而受损，且解决了以往进口银系无机抗菌剂迁移速度快的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1的抗菌剂浓度对材料抗菌性的影响(胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜的抗菌性评估)。在图1中，对同一块平板中，中心的1为灭菌滤纸为空白对照；顶端的两个样品表示HN-300占复合膜的10％(wt％)；右边的样品表示HN-300占复合膜的7.5％(wt％)；下边的样品表示HN-300占复合膜的5％(wt％)；左边的样品表示HN-300占复合膜的2.5％(wt％)；12h、36h、60h、144h为培养时间。
图2为本发明实施例1不同HN-300含量的胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜在PBS液中的银元素释放率。在图2中，横坐标为时间(day)，纵坐标为释放率(％)；2.5％、5％、7.5％、10％分别为复合膜中HN-300含量。
图3为本发明实施例2不同浓度的戊二醛交联含10％(wt)FUMAT T200-4的胶原∶壳聚糖＝7∶3的复合膜的降解性能。在图3中，横坐标为时间(h)，纵坐标为降解率(％)；0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2.5％分别为戊二醛交联液的浓度。
图4为本发明实施例3中L292细胞在不同含量HN-300的抗菌复合膜表面培养4天时的扫描电子显微镜照片。在图4中，0％～10％是复合膜中添加的HN-300的质量百分比；左：×200；右：×1000。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：抗菌剂浓度对材料抗菌性的影响
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.05M的乙酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.6％(wt)的胶原溶液和浓度为0.6％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入以磷酸镐钠晶体为载体的载银无机抗菌剂粉末HN-300，经搅拌、超声、再搅拌后与壳聚糖溶液以9∶1的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/HN-300分散液，其中HN-300的含量依次为10％、7.5％、5％、2.5％(wt)，将制得的分散液按3cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于37℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于37℃烘箱中烘干即得胶原/壳聚糖/HN-300复合膜。用抑菌圈实验法评价不同含量抗菌剂对复合膜抗菌性的影响，如图1所示，除空白对照外所有的样品周围具有明显的抑菌圈出现。各样品抑菌圈直径统计(参见表1：实施例1胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜的抑菌圈直径检测结果)表明，HN-300含量为2.5％～10％的复合膜周围的抑菌圈直径与空白对照相比具有显著性，并且样品的抑菌圈直径随样品中HN-300浓度降低而减小，即材料的抑菌性随HN-300浓度降低而减弱；将HN-300含量2.5％～10％的复合膜浸入PBS液中制取浸提液，1～7天银元素的释放率如图2所示，该图显示：经过24h，HN-300含量为2.5％的复合膜中银元素的释放率达到45％，表现出典型的突释效应，而HN-300含量为10％的复合膜中银元素的释放率仅达12％，这些现象表明，释放过程初期的突释效应随复合膜中HN-300含量的增加而减弱，而含2.5％HN-300的复合膜经过7天，银元素的释放率仅达80％，所以HN-300含量为2.5％的复合膜中银元素的释放是一个长期的过程，但60h以后释放的银，浓度不足以杀死细菌。结合对复合膜浸出液细胞毒性评估可知，在144h时间内具有持续的抑菌性和较好的生物安全性的HN-300添加量应在5％左右。
表1
单位：毫米
*：与空白对照相比具有显著性的样品(P＜0.05)。mean±S.D.
实施例2：交联剂浓度对材料降解性能的影响
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.5M的乙酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.8％(wt)的胶原溶液和浓度为0.8％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入以磷酸锆为载体的载银无机抗菌剂粉末FUMAT T200-4，使FUMATT200-4的含量均为10％(wt)。经搅拌、超声、再搅拌后与壳聚糖溶液分别以7∶3的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/FUMAT T200-4分散液，经烘干后得到含10％(wt)FUMATT200-4的胶原∶壳聚糖＝7∶3的复合膜，分别在0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％(w/w)的戊二醛水溶液中交联12h获得交联度不同的胶原/壳聚糖/FUMAT T200-4复合膜。如图3所示，交联后复合膜的耐降解性能得到显著提高，在戊二醛浓度为0.1％～1％范围之内，随戊二醛浓度的增大该复合膜在各时相的降解率相应降低，即复合膜的稳定性越好，因此可以根据具体需要，通过改变戊二醛的浓度来控制该复合膜的稳定性。
实施例3：含不同浓度抗菌剂复合膜体外生物安全性评价
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.05M的乙酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.6％(wt)的胶原溶液和浓度为0.6％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入以磷酸镐钠晶体为载体的载银无机抗菌剂粉末HN-300，经搅拌、超声、再搅拌后与壳聚糖溶液以9∶1的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/HN-300分散液，其中HN-300的含量依次为10％、7.5％、5％、2.5％(wt)，将制得的分散液按3cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于37℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于37℃烘箱中烘干即得胶原/壳聚糖/HN-300复合膜。在各组复合膜上种植1mL的小鼠成纤维细胞L929(1×104/mL)，37℃下5％CO2培养箱中培养，每2天换液一次，连续培养4天后，用扫描电子显微镜(SEM)对复合膜表面的细胞进行观察，可见HN-300添加量为10％的复合膜表面未发现有细胞生长，而HN-300添加量在0％～7.5％(wt)的复合膜表面均有大量细胞生长，细胞生长状态良好，见图4。
实施例4
在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.2％的胶原溶液和0.8％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中按质量百分比加入1％的载银磷酸锆，搅拌，超声。将制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶1.5。将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按3cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂戊二醛中进行交联10h，用离子水清洗，在37℃下烘干，即得抗菌型表皮修复材料。按质量百分比，交联剂的浓度为0.1％。
实施例5
在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.4％的胶原溶液和0.20％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中按质量百分比加入3％的载银磷酸复盐，搅拌，超声。将制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶3。将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按1cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂戊二醛中进行交联15h，用离子水清洗，在37℃下烘干，即得抗菌型表皮修复材料。按质量百分比，交联剂的浓度为2％。
实施例6
在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.6％的胶原溶液和0.4％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中按质量百分比加入6％的载银氢氧化钠锆，搅拌，超声。将制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶5。将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按5cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂戊二醛中进行交联20h，用离子水清洗，在37℃下烘干，即得抗菌型表皮修复材料。按质量百分比，交联剂的浓度为6％。
实施例7
在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.5％的胶原溶液和0.6％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中按质量百分比加入0.5％的载银二氧化硅，搅拌，超声。将制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶0.1。将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按10cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂戊二醛中进行交联1h，用离子水清洗，在37℃下烘干，即得抗菌型表皮修复材料。按质量百分比，交联剂的浓度为0.01％。
实施例8
在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.8％的胶原溶液和0.5％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中按质量百分比加入7.5％的载银磷酸锆，搅拌，超声。将制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶9。将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按7cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂戊二醛中进行交联24h，用离子水清洗，在37℃下烘干，即得抗菌型表皮修复材料。按质量百分比，交联剂的浓度为10％。
实施例9：含不同种类载银无机抗菌剂的复合膜的生物安全性评价
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.5M的乙酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.8％(wt)的胶原溶液和浓度为0.8％(wt)的壳聚糖溶液，然后分别在壳聚糖溶液中加入以磷酸镐钠晶体为载体的载银无机抗菌剂粉末HN-300、以磷酸锆为载体的载银无机抗菌剂SR1000、以磷酸锆为载体的载银无极抗菌剂FUMAT T200-4、以氢氧化钠锆为载体的载银无机抗菌剂Novaron及以二氧化硅为载体的载银无机抗菌剂MOD，各种抗菌剂在壳聚糖溶液中的浓度均为5％。经搅拌、超声、再搅拌后壳聚糖溶液与胶原溶液以1∶9的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/HN-300分散液、胶原/壳聚糖/SR1000分散液、胶原/壳聚糖/FUMAT T200-4分散液、胶原/壳聚糖/Novaron分散液及胶原/壳聚糖/MOD分散液，将制得的上述几种分散液按10cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于65℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于65℃烘箱中烘干即得含上述不同种类抗菌剂的胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜。在各组复合膜上种植1mL的小鼠成纤维细胞L929(1×104/mL)，37℃下5％CO2培养箱中培养，每2天换液一次，连续培养4天后，用扫描电子显微镜(SEM)对复合膜表面的细胞进行观察，可见各组复合膜表面均有大量细胞生长，细胞生长状态良好。
实施例10
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.01M的盐酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.2％(wt)的胶原溶液和浓度为0.2％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入0.5％的以磷酸锆为载体的载银无机抗菌剂SR1000，经搅拌、超声、再搅拌后与胶原溶液以1∶1的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/SR1000分散液，将制得的分散液按5cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于45℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于45℃烘箱中烘干即得胶原/壳聚糖/SR1000复合膜。
实施例11
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.02M的乙酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.5％(wt)的胶原溶液和浓度为0.5％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入1％的以磷酸锆为载体的载银无机抗菌剂SR1000，经搅拌、超声、再搅拌后与胶原溶液以2∶8的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/SR1000分散液，将制得的分散液按18cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于37℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于37℃烘箱中烘干即得胶原/壳聚糖/SR1000复合膜。
实施例12
经酶消化法去除末端肽得到无抗原性的不全胶原，用0.01M的盐酸分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，配制成浓度为0.5％(wt)的胶原溶液和浓度为0.5％(wt)的壳聚糖溶液，然后在壳聚糖溶液中加入2％的以氢氧化钠锆为载体的载银无机抗菌剂Novaron，经搅拌、超声、再搅拌后与胶原溶液以3∶7的质量比充分搅拌混合得到胶原/壳聚糖/Novaron分散液，将制得的分散液按10cm2/g在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，置于37℃烘箱中烘干。以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将复合膜铺于板表面置于37℃烘箱中烘干即得胶原/壳聚糖/Novaron复合膜。
Claims (8)
1.一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酸性条件下分别溶解胶原溶胀液和壳聚糖，搅拌使其充分溶解，按质量百分比分别配制成浓度为0.2％～0.8％的胶原溶液和0.2％～0.8％的壳聚糖溶液；
2)在壳聚糖溶液中按质量百分比加入0.5％～7.5％的载银无机抗菌剂，搅拌，超声；
3)将步骤2)制得的加有抗菌剂的壳聚糖溶液与胶原溶液混合搅拌，即得胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液；
4)将制得的胶原/壳聚糖/抗菌剂分散液按1～10cm2/g的用量在聚四氟乙烯板上均匀铺膜，烘干；
5)以蒸馏水浸泡使膜与聚四氟乙烯板分离，再次将膜铺于聚四氟乙烯板表面，烘干即得胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜；
6)将胶原/壳聚糖/抗菌剂复合膜浸于交联剂中进行交联，清洗，烘干，即得抗菌型表皮修复材料。
2.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于载银无机抗菌剂为载银磷酸锆、载银磷酸复盐、载银氢氧化钠锆、载银二氧化硅中的一种。
3.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于按质量比加有抗菌剂的壳聚糖溶液∶胶原溶液为1∶0.1～9。
4.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于交联剂为戊二醛或丙三醇。
5.如权利要求1或4所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于按质量百分比，交联剂的浓度为0.01％～10％。
6.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于交联的时间为1～24h。
7.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于清洗用去离子水清洗。
8.如权利要求1所述的一种抗菌型表皮修复材料的制备方法，其特征在于在步骤6)中，烘干的温度为37℃。
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