CN101351230A

CN101351230A - 用于投递gdnf的可植入式生物相容性免疫绝缘性媒介物

Info

Publication number: CN101351230A
Application number: CNA2006800500330A
Authority: CN
Inventors: 詹斯·托诺伊; 拉斯·U·沃尔伯格
Original assignee: NS Gene AS
Current assignee: NS Gene AS
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2009-01-21

Abstract

本发明涉及含有人类细胞组合物的装置，所述人类细胞分泌治疗有效量的GDNF(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子)，所述组合物包裹在包含核心和容许GDNF蛋白扩散的半透膜的装置中。所述人类细胞来自一种细胞系。

Description

用于投递GDNF的可植入式生物相容性免疫绝缘性媒介物

本申请涉及包含GDNF分泌细胞的装置，该装置可用于帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、亨庭顿氏病和视网膜病变的治疗。并入本文中所引用的所有参考文献作为参考。

现有技术

GDNF是一种能够促进多巴胺能神经元存活的神经营养因子。在帕金森氏病中，多巴胺能神经元变性。文献中有大量的报告显示了长期投递GDNF是治疗帕金森氏病的可行方法。因为GDNF不易穿越血脑屏障，所以将它施用到中枢神经***中需要使用侵入性程序，这可能损害血脑屏障的完整性。

在血脑屏障后面将GDNF长期投递至中枢神经***可以通过不同方式来实现：使用植入式泵或套管的连续输注、体内基因疗法、移植经遗1修饰而分泌GDNF的裸细胞、和植入含有包裹在半透膜后面的GDNF分泌细胞的导管样装置。对于在将GDNF投递至血-视网膜屏障后面的眼部也是如此。

使用植入式泵(pump)或套管(cannula)的投递需要重复输注到脑中，或是通过经由套管的注射，或是通过泵，必须在每次储药池用尽后重新装药。每次必须更换泵的储药池或再次将注射器***套管时，又多了一次可能将污染物导入脑中的机会，而脑对感染尤其易感。即使小心使用无菌程序，仍有感染的风险。已有报告，即使在重症监护病房中，用于监测颅内压的脑室内导管在大约3天后感染了细菌(Saffran，Perspectives in Biology andMedicine，35，pp.471-86(1992))。除感染风险以外，似乎还有与输注程序有关的一些风险。已有报告，脑室输注引起脑积水(Saffran et al.，Brain Research，492，pp.245-254(1989))，而且给实质连续输注溶液与脑中的细胞坏死有关。

体内基因疗法是一种将蛋白质因子投递至中枢神经***的有希望的技术。它具有原位合成活性GDNF因子的优点。然而，基因疗法需要使用病毒载体，而使用病毒载体内在地伴随着***诱变(insertional mutagenesis)、肿瘤生成、以及一旦发生不良后果时无法停止GDNF分泌等风险。

移植经遗传修饰而分泌GDNF的裸细胞也具有局部投递和在治疗部位从头合成活性因子的优点。然而，裸细胞会整合到它们所移植的组织中，使得人们几乎不可能终止治疗。此外，所移植的裸细胞一旦进入脑内即可能迁移，在脑中建立起不希望的GDNF分泌细胞群。对于干细胞和祖细胞，尤其如此。作为这种治疗类型的例子，

等人(J Neurosci2001，21：8108-18)描述了使用裸露鼠神经球(neurosphere)细胞将GDNF投递至小鼠纹状体。最近，Klein等人(Hum Gen Ther，2005，16：509-521)描述了将转导了编码GDNF的病毒载体的裸露人神经祖细胞移植至大鼠的腰脊髓，目的是开发ALS(肌萎缩侧索硬化)的疗法。

封装(encapsulate)细胞生物投递组合了基因疗法的优点又避免了缺点，即患者细胞的基因组不受影响，而且在观察到任何不良后果时能收回植入装置。

已经将不同细胞类型用于将GDNF自封装细胞投递至啮齿类和灵长类的中枢神经***。例如，Kishima等人(Neurobiol Dis，2004，16：428-39)描述了使用封装的C2C12细胞将GDNF投递至狒狒脑室。C2C12细胞是小鼠细胞。Tseng等人(J Neurosci，1997，17：325-33)描述了使用封装的GDNF分泌BHK细胞将GDNF投递至大鼠的脑。BHK是仓鼠细胞系。

尽管对于BHK和C2C12细胞，在大鼠和狒狒疾病模型中提供了PD治疗概念的证据，这些细胞尚未用于临床研究。对此的主要原因是BHK和C2C12细胞即使是封装的也都不能用于人类的治疗，因为使用异基因细胞有触发免疫应答或***互通病的潜在风险，而且BHK和C2C12细胞在封装后显示的长期生存力差(可能是因为连续增殖)。这些细胞分别固有地分泌多种小鼠和仓鼠蛋白质，它们对于人类而言可能是免疫原性的。无论如何，BHK和C2C12细胞在人造生长培养基中在应激条件下培养时不具有所要求的生存力(US 6,361,771)。

因此，本领域需要提供含有GDNF分泌细胞的装置，其中GDNF分泌细胞适用于人类治疗，在植入哺乳动物、特别是人类的中枢神经***或眼后分泌大量的GDNF并显示出长期稳定性。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及一种生物相容性装置，其包含：

a.含有人类细胞组合物的内部核心，该人类细胞包含编码GDNF的表达构建物；和

b.包围所述细胞组合物的半透膜，该膜允许GDNF的扩散，

其中所述人类细胞来自一种细胞系。

通过使用人类细胞，降低了***互通病和不利免疫反应的风险。

使用细胞系，确保了所述组合物中的所有细胞是相同的。在装置中具有相同的细胞该得“单元”更加稳定，因为装置内的所有细胞是相同的。意图使装置在患者的脑和眼中停留很长时间，优选超过6个月。在这么长的时间里，装置内的细胞可能有某些更新，因为有些细胞不可避免的死亡并发生坏死，而且可能通过装置内的自发细胞***而被替换。如果装入装置中的细胞组合物中的细胞最初就包括两种或更多种细胞亚群，那么装置内的自更新可能导致细胞组成的变化。这继而可导致GDNF输出的变化。

在一个特别优选的实施方案中，所述细胞能够进行吞噬。这样，可以清除来自装置内垂死细胞的残骸，而且装置内的环境可以保持“清洁”。

优选的是，转染到所述细胞中的所述表达构建物是质粒载体。对于治疗用细胞产品，不太优选使用转导了病毒载体的细胞。

在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，转染到所述细胞中的所述表达构建物在转录物中包含内含子。比较例显示，与转染了无内含子构建物的细胞系相比，在转染了含内含子表达构建物的细胞系中得到了最高水平的GDNF分泌。

在又一个方面，本发明涉及衍生自一种细胞系的人类细胞的组合物，其中所述细胞包含编码GDNF的异源表达构建物。

在另一个方面，本发明涉及治疗帕金森氏病的方法，包括将至少一个依照本发明的装置或依照本发明的细胞组合物植入有所需要的受试者的壳核和/或纹状体结构。

在另一个方面，本发明涉及治疗亨庭顿氏病的方法，包括将至少一个依照本发明的装置或依照本发明的细胞组合物植入有所需要的受试者的壳核和/或纹状体结构。

本发明还涉及治疗肌萎缩侧索硬化的方法，包括将至少一个依照本发明的装置或依照本发明的细胞组合物植入有所需要的受试者的鞘内空间和/或脊髓。植入可以在腰脊髓中进行。

此外，本发明涉及治疗视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、青光眼、眼部新血管化(ocular neovascularisation)或视网膜变性的方法，包括将至少一个依照本发明的装置或依照本发明的细胞组合物植入有所需要的受试者的眼。

图

图1显示了***表达载体pNS1n和pCIn.hNGF以产生GDNF表达载体的GDNF可读框。还显示了翻译得出的氨基酸序列。

图2A-B显示了通过GDNF ELISA测量的、选定APRE-19克隆的GDNF分泌。用固定数目的细胞铺板。在贴壁后，经过4小时温育，在内皮无血清培养基中测量GDNF分泌。误差棒显示了不同的独立测量间相对于平均值的标准偏差。图2A显示转染了pCIn.hG(有内含子)的克隆。图2B显示转染了pNS1n.hGDNF(无内含子)的克隆。

图3A-B显示了以汇合培养物形式生长的选定ARPE-19克隆在8周里的GDNF释放。下面的线显示未转染的亲本细胞系，ARPE-19。温育4小时后在培养基中通过GDNF Elisa测量GDNF释放。每条线代表一个单独的克隆。图3A显示在人类内皮无血清培养基(Invitrogen)中培养的克隆。图3B显示在DMEM/F12(Invitrogen)中培养的相同克隆。注意，纵轴的刻度不同。

图4A显示了图3各单独克隆于第4周的数据。标有C-的克隆转染了pCIn.hG，其包含内含子。标有N-的克隆转染了pNS1n.hGDNF，其不含内含子。图4B显示了两组克隆的平均值，用于更直接的比较内含子的影响。

图5显示了由NGC-0301(本发明的ARPE-19克隆)产生的GDNF的Western印迹，并与购自R&D(#212GD；哺乳动物产生的GDNF)和阿罗蒙(Alomone)(#G-240；大肠杆菌产生的GDNF)的GDNF进行比较。左边标示了分子量标志物。标有-的泳道是未脱糖基化的。标有D的泳道是在变性条件下脱糖基化的。标有N的道是在天然条件下脱糖基化的。更多细节见实施例3。

图6显示了GDNF对GFRα1-Ret的结合。x轴显示GDNF的量(ng/mL)。y轴显示三元复合物形成的程度。NGC-0301代表来自本发明细胞系的条件培养基的GDNF。R&D代表来自R&D systems(#212GD)的哺乳动物重组GDNF。阿罗蒙(Alomone)代表来自阿罗蒙实验室(Alomone labs)(#G-240)的大肠杆菌重组GDNF。

图7显示了PC12在无血清培养基中的存活。x轴显示GDNF的量(nM)。y轴显示相对MTS降低+/-SEM。NGC-0301代表来自本发明细胞系的条件培养基的GDNF。R&D代表来自R&D systems(#212GD)的哺乳动物重组GDNF。阿罗蒙(Alomone)代表来自阿罗蒙实验室(Alomone labs)(#G-240)的大肠杆菌重组GDNF。

图8显示了在HE-SFM中温育4小时后测量的含有GDNF分泌细胞的装置的GDNF释放。结果来自体外培养了2周的装置。这些装置是实施例6中所描述的PS装置(聚砜膜，截留值90kDa，长5mm，内部直径700μm，含有50,000个细胞)。Y轴显示GDNF释放，以ng GDNF/装置/24小时计。柱代表5个装置的平均值。棒代表平均值的标准偏差。

图9A-B显示了在大鼠脑中植入8周后含有GDNF分泌细胞的装置的GDNF释放。在HE-SFM中温育4小时后测量GDNF释放，表述为ng GDNF/装置/24小时。柱形代表5个装置的平均值。图6A显示用PES装置(聚醚砜膜，截留值280kDa，长7mm，内部直径500μm，含有50,000个细胞)得到的结果。图6B显示用PS装置(聚砜膜，截留值90kDa，长5mm，内部直径700μm，含有50,000个细胞)得到的结果。

图10A-B显示了一个代表性PES装置的组织学切片，在植入大鼠脑中8周后体内切片，随后测量GDNF输出。图10A显示完整装置的一个切片，有膜、泡沫支持物和活的细胞。图10B是装置中一个显示优异的细胞存活的小部分的特写。

定义

“内含子”在本文中指DNA序列中那些与编码序列(外显子)一起转录但在形成成熟mRNA时被去除的区域。内含子可出现在被转录序列内的任何位置：基因的编码序列之间、基因的编码序列之内、和5’非翻译区(5’UTR)(包括启动子区)内。初级转录物中的内含子被切除，外显子序列被同时地且精确地连接以形成成熟mRNA。内含子与外显子的连接点形成剪接位点。在许多高等真核生物中，内含子的碱基序列保守地以GT开始，以AG结束。

在用于本文时，“生物相容性胶囊”或“生物相容性装置”意味着该装置在植入宿主哺乳动物后不会引起足以导致对装置的排斥或使之无法工作(例如通过降解)的有害宿主应答。

在用于本文时，“免疫绝缘性(immunoisolatory)胶囊或装置”意味着该装置或胶囊在植入哺乳动物宿主后使得宿主免疫***对该装置或胶囊核心内的细胞造成的有害效果最小化。

生物学活性是指分子对特定细胞的生物学上有用的效果。在用于本文时，“生物学活性GDNF”指由合成GDNF的细胞释放或分泌的，并对靶细胞发挥其效果的GDNF。分泌型GDNF的生物学活性可以在如实施例中所描述的PC-12测定法和RET-L1(或RET-L2)Elisa测定法中检验。

“哺乳动物启动子”指能够在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子。

启动子的下调指转基因产物的表达降低至可能导致转基因产物在体内植入后缺乏显著生物学活性的水平。在用于本文时，“不受下调的启动子”指在哺乳动物宿主中体内植入后驱动或继续驱动转基因在有生物学活性的水平表达的启动子。

在用于本文时，“生物学活性GDNF的长期、稳定表达”指在足以维持其有用生物学活性的水平持续产生生物学活性GDNF，时间长于1个月、优选长于3个月、最优选长于6个月。

高水平的序列同一性指示第一种序列衍生自第二种序列的可能性。氨基酸序列同一性要求被比对的两种序列之间有相同的氨基酸序列。如此，与参比序列具有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对后，候选序列中70％的氨基酸与参比序列中的对应氨基酸相同。同一性可以借助计算机分析来测定，诸如但不限于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.，Thompson J.，Gibson T.，Thompson J.D.，Higgins D.G.，Gibson T.J.，1994.CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res.22：4673-4680)，参数设定为其中推荐的缺省值。ClustalW软件可以从欧洲生物信息学学会(European Bioinformatics Institute)http://www.ebi.ac.uk/clustalw的ClustalW WWW Service获得。以其缺省设置使用此程序，将查询和参比多肽的成熟(生物活性)部分加以比对。对完全保守的残基计数，并除以参比多肽的长度。

ClustalW算法可类似地用于比对核苷酸序列。核苷酸序列同一性可以以与氨基酸序列类似的方式来计算。

详述

GDNF(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子)

GDNF首次记载于WO 93/06116。它通过与GFRα1或GFRα2共同受体形成复合物的RET受体酪氨酸激酶来发信号。人GDNF的“前-原”(pre-pro)形式的氨基酸序列见SEQ ID NO：2，4和17。小鼠GDNF的“前-原”形式的氨基酸序列见SEQ ID NO：6。大鼠GDNF的“前-原”形式的氨基酸序列见SEQID NO：8。

人、小鼠和大鼠GDNF的转录物的核苷酸序列可见于Genbank，编号分别为NM_000514.2、NM_010275.1和NM_019139.1。这些序列还可见于本申请，分别为SEQ ID NO：3，5和7。

前述转录物编码前-原-前体。前-和原-肽被加工，分泌成熟GDNF蛋白。对于人、小鼠和大鼠GDNF(分别为SEQ ID NO：9，10和11)，分泌型成熟GDNF均由C-末端的134个氨基酸组成。

GDNF是TGF-β超家族的成员(Massague，et al，.1994，Trends in CellBiology，4：172-178)，也是神经胶质细胞系衍生的神经营养因子配体家族的成员。GDNF家族包括GDNF、PSP蛋白(persephin)(″PSP″；Milbrandt et al.，1998，Neuron 20：245253)、NBN蛋白(Neublastin)(“NBN”；WO 00/01815)和NTN蛋白(neurturin)(″NTN″；WO 97/08196)。GDNF超家族的配体都具有通过RET受体酪氨酸激酶发信号的能力。GDNF超家族的配体在它们对一个神经营养受体家族——GFRα受体的相对亲和力方面是不同的。GDNF优选通过GFRα1-RET或GFRα2-RET复合物起作用。

表1：

GDNF(SEQ ID NO 4)与PSP蛋白、NTN蛋白和NBN蛋白的氨基酸序列比较

^*指示有单一、完全保守的残基的位置。

：指示以下“强”组之一是完全保守的：

-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW。

.指示以下“弱”组之一是完全保守的：

-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY。

根据表1所示氨基酸序列比对，可见GDNF在TGFβ超家族内的保守位置具有七个半胱氨酸残基。基于此序列比对，GDNF包含GDNF超家族指纹(LGLG-FRYCSGSC-QACCRP-SAKRCGC，GDNF超家族指纹，表1中标有下划线)。

表2：

小鼠(SEQ ID NO 6)、大鼠(SEQ ID No 8)和人GDNF(SEQ ID NO 4)直向同源物的ClustalW(1.83)多序列比对。保守性的表示方式如表1。

GDNF_MOUSE MKLWDVVAVCLVLLHTASAFP LPAGKRLLEAPAEDHSLGHRRVPFALTSD SNMPEDYPDQ

GDNF_RAT MKLWDVVAVCLVLLHTASAFP LPAGKRLLEAPAEDHSLGHRRVPFALTSD SNMPEDYPDQ

GDNF_HUMAN MKLWDVVAVCLVLLHTASAFP LPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSD SNMPEDYPDQ

************************** ******：***：**.****：************

GDNF_MOUSE FDDVMD FIQATIKRLKRSPDKQAAAL PRRERNRQAAAASPENSRGKGRRGQRGKNRGCVL

GDNF_RAT FDDVMD FIQATIKRLKRSPDKQAAAL PRRERNRQAAAASPENSRGKGRRGQRGKNRGCVL

GDNF_HUMAN FDDVMD FIQATIKRLKRSPDKQMAVL PRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVL

********************** *.*************.*********************

GDNF_MOUSE TAIHLNVTDLGLGYETKEELI FRYCS GSCESAETMYDKILKNLSRSRRLTSDKVGQACCR

GDNF_RAT TAIHLNVTDLGLGYETKEELI FRYCS GSCEAAETMYDKILKNLSRSRRLTSDKVGQACCR

GDNF_HUMAN TAIHLNVTDLGLGYETKEELI FRYCS GSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCR

*****************************：：*** **********.***.**********

GDNF_MOUSE PVAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI

GDNF_RAT PVAFDDDLSFLDDSLVYHILRKHSAKRCGCI

GDNF_HUMAN PIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI

*：***********.*****************

本发明细胞系所分泌的GDNF多肽可以是任何生物活性形式，包括成熟蛋白质的形式、糖基化蛋白质的形式、磷酸化蛋白质的形式、截短的形式、或任何其它经过翻译后修饰的蛋白质的形式。，对于每种GDNF变体而言，生物活性GDNF被假定为二聚化形式，因为二聚体的形成是活性必需的。单体GDNF多肽观察到的活性很小乃至没有。生物活性GDNF多肽包括这样的二聚化多肽：在存在辅因子(诸如GFRα1或GFRα2)时，其与RET或与GFRα1或2同RET所成的复合物结合，诱导RET二聚化和RET自磷酸化。

本发明细胞系所产生的GDNF多肽展现出天然GDNF的至少一种生物学活性。为本发明目的的生物学活性可以通过任何合适方法来测定。生物学活性GDNF多肽指在二聚化后能与GFRα1或2一起与RET结合并诱导RET二聚化和自磷酸化的多肽(见例如Sanicola et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：6238)。可以使用任何测定受体结合和受体自磷酸化的方法来评估通过本发明方法所产生的GDNF多肽的生物学活性。例如，可以使用KIRA测定法(ELISA)来评估GDNF生物学活性(还可见Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，235(2)：207)。

还可以使用实施例4中所描述的RetL1 ELISA测定法来检测生物活性形式的GDNF。RetL1 ELISA测定法不会检出没有生物学功能的GDNF。

以下“野生型”GDNF氨基酸(″aa″或″AA″)序列是可用于本发明的方法和组合物的分泌型GDNF多肽的例子：

--SEQ ID NO：4或9的AA₁-AA₁₃₄(人，成熟的)；

--SEQ ID NO：6或10的AA₁-AA₁₃₄(小鼠，成熟的)；和

--SEQ ID NO：8或11的AA₁-AA₁₃₄(大鼠，成熟的)。

在一个实施方案中，优选的GDNF多肽包含如SEQ ID NO.4中41、68、72，101、102、131和133位的(七个)保守半胱氨酸。已知这七个保守半胱氨酸残基在TGF超家族中形成三个单体内二硫键(设想，例如SEQ ID No.4中的半胱氨酸残基41-102，68-131和72-133之间)和一个单体间二硫键(设想，例如SEQ ID NO.4中的半胱氨酸残基101-101之间)，它们与延伸的β链区一起构成TGFβ超家族的保守结构基序(见例如Daopin et al.，Proteins1993，17：176-192)。

优选的是，分泌型GDNF多肽是野生型蛋白质的成熟形式之一。

分泌型GDNF多肽的长度可以有所变化。尽管成熟人GDNF多肽通常由前-原-GDNF的C-末端134个氨基酸组成，并非所有这134个氨基酸都是实现有用的GDNF生物学活性所必需的。氨基末端截短是允许的(WO97/11964)。因此，分泌型GDNF多肽可以包含天然人GDNF的大约94-134个C-末端氨基酸，优选至少95个C-末端氨基酸(对应于SEQ ID NO 12)。待分泌的GDNF多肽的确切长度的选择是设计选项(design choice)，这可以由本领域技术人员来决定。除了长度的变化以外，分泌型GDNF多肽的序列可以有所变化。

分泌型GDNF多肽还包括全长GDNF分子的截短形式。在此类截短分子中，从N-末端或C-末端，优选从N-末端删除了一个或多个氨基酸。可以使用编码截短形式和适宜信号序列(以确保多肽分泌)的表达构建物来获得截短的GDNF多肽。

本文所述截短型GDNF多肽优选包括这样的多肽序列，该序列涵盖成熟GDNF序列中保守的那七个半胱氨酸残基。在优选的实施方案中，截短型GDNF多肽至少包含成熟人GDNF的95个羧基末端氨基酸(SEQ ID NO12)。截短型GDNF多肽还可以相对于野生型序列包含一处或多处氨基酸替代，只要神经营养活性得到保留。因此，本发明还包括与SEQ ID NO 12、13或14所示序列之一具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性的分泌型神经营养多肽的用途。优选的是，参比序列是SEQ ID NO 12。

一种截短形式包含从成熟GDNF的七个半胱氨酸残基中的第一个起到最后一个止的93个氨基酸。这对应于SEQ ID No 4的氨基酸编号41-133。

应当理解，本文所公开的截短型GDNF(例如134个AA-95个AA的形式)具有神经营养活性。

还设想了截短型小鼠和大鼠GDNF。它们可以包含SEQ ID No 6(小鼠)的94-133个C-末端氨基酸，或者它们可以包含SEQ ID No 8(大鼠)的94-133个C-末端氨基酸。优选的截短型小鼠和大鼠序列见SEQ ID NO 13和14。

可用于本发明的GDNF还包括那些具有与上文所列各种前原-、原-、成熟和截短GDNF多肽有实质的相似性或同一性的氨基酸序列的GDNF多肽。优选的是，分泌型GDNF多肽与SEQ ID NO.9、10和11所示序列之一具有至少70％、更优选85％、仍更优选90％、或仍进一步优选95％的同一性或相似性。最优选的是，分泌型GDNF多肽与SEQ ID No.9、10和11所示序列之一、优选与SEQ ID NO 9(人成熟GDNF)，具有至少98％的相似性或同一性。

优选的是，任何变异GDNF多肽在人类中不诱导针对该多肽的抗体形成。此外，重要的是，表达构建物应编码为分泌型生物活性GDNF的正确加工和折叠提供条件的多肽，因为错误折叠可能触发针对该蛋白质的抗体的形成。

候选多肽与本发明GDNF多肽享有同源性的程度是作为两种氨基酸序列之间相似性或同一性的程度来确定的。

高序列同一性水平指示第一种序列衍生自第二种序列的可能性。氨基酸序列同一性要求所比对的两种序列之间有相同的氨基酸序列。由此，与参比序列具有70％氨基酸序列同一性的候选序列要求在比对后，候选序列中70％的氨基酸与参比序列中的对应氨基酸相同。同一性如本申请定义部分所述来测定。使用ClustalW比对程序，多肽的成熟部分与本文SEQ ID NO：4(人GDNF)、SEQ ID NOS：6和8(啮齿类GDNF)所示氨基酸序列可展现至少70％、更优选85％、仍更优选90％、或仍进一步优选95％、最优选至少98％的同一性程度。优选的是，参比序列是SEQ ID NO 4。

如上所述，本发明的GDNF多肽包括变异多肽。在本发明的语境中，术语“变异多肽”包括具有如下所述的氨基酸序列的多肽(或蛋白质)：该序列与作为SEQ ID NO.4(人GDNF)、SEQ ID No.6或8(啮齿类GDNF)一部分显示的成熟肽在一个或多个氨基酸位置上有所不同。此类变异多肽包括经保守替代而被修饰的多肽、剪接变体、同工型(isoforms)、来自其它物种的同源物、和多态性。

如本文所定义的，术语“保守替代”指将氨基酸残基用生物学上相似的另一种残基替换。通常，生物学相似性，如上文提到的，反映了保守氨基酸对野生型序列的替代。优选的是，保守替代在ClustalW比对程序所定义的意义上是保守的。GDNF序列中可以加以改变且不影响生物活性的位置可以通过例如进行GDNF直向同源物ClustalW比对(表2)并鉴定非保守或半保守残基来进行鉴定。还可以通过参考GDNF蛋白质家族的比对(表1)来鉴定这些位置。在GDNF子家族间保守的残基对于这些蛋白质的生物活性可能是至关重要的。

为了避免在接受本发明的封装的或裸露的细胞的受试者中产生针对GDNF的循环(circulating)抗体，细胞所分泌的GDNF应当与所讨论受试者中天然存在的GDNF相同。对于人类，这意味着人分泌型GDNF优选由GDNF的134个C-末端氨基酸组成(SEQ ID NO 9)，并且如人类细胞分泌GDNF时通常的那样是糖基化的。

细胞系

本发明涉及分泌GDNF的人细胞系，它们通过***异源永生化基因而实现了永生化；自发永生的细胞系；和扩增生长因子的细胞系。在本发明的一个优选实施方案中，人细胞系尚未通过***异源永生化基因而永生化。由于本发明涉及特别适于细胞移植的细胞，优选以封装细胞的形式，此类永生化细胞系是不太优选的，因为如果它们携带已知癌基因的话，它们具有在人体中启动失控方式的扩增并潜在形成肿瘤的内在风险。

生长因子扩增的细胞系的优势在于它们的持续增殖依赖于添加丝裂原。因此，在将细胞装入装置之前或同时停用丝裂原后，细胞停止增殖且不会在植入人体后再次增殖。有些生长因子扩增的细胞系还可能在停用丝裂原后分化。生长因子扩增的细胞系包括干细胞，诸如神经干细胞和胚胎干细胞。

优选的是，细胞系能够吞噬。通过吞噬，细胞将能够清除装置内衰退或垂死细胞脱落的碎片。

优选的是，细胞系是接触抑制性细胞系。接触抑制性细胞系指当在常规条件下作为单层在培养瓶中培养时生长至汇合，然后基本上停止***的细胞系。这不排除有限数目的细胞脱离单层的可能性。在胶囊或装置内，细胞生长至汇合，然后显著减缓增殖速率或完全停止***。

一种特别优选的细胞类型包括上皮细胞，它们在本质上是接触抑制性的，而且在培养中形成稳定的单层。

甚至更优选的是视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞的来源是从哺乳动物视网膜分离原代细胞。RPE细胞能够吞噬，而且也是接触抑制性的。

用于收获RPE细胞的方案已经确立(Li and Turner，1988，Exp.Eye Res.47：911-917；Lopez et al.，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30：586-588)，而且被认为是常规的方法学。在RPE细胞共移植的大多数已公开报告中，细胞是衍生自大鼠的(Li and Turner，1988；Lopez et al.，1989)。根据本发明，RPE细胞衍生自人。除了分离的原代RPE细胞以外，培养的人RPE细胞系也可用于实施本发明。

所有正常二倍体脊椎动物细胞所具有的增殖能力都是有限的，即称为海弗里克极限(Hayflick limit)或复制衰老(replicative senescence)的现象。在人成纤维细胞中，此限制发生于50-80次群体倍增之后，此后细胞保持可存活但不***的衰老状态达很多个月。这与大多数癌细胞的表现形成对比，癌细胞逃脱了限制其增殖能力的控制，有效地实现了永生。

优选的是，细胞能够进行一定次数的细胞***，使得它们能进行遗传修饰和扩增以生成足够的细胞用于封装细胞疗法或移植疗法。因此，优选细胞系能够进行至少50次倍增、更优选至少60次倍增、更优选至少70次倍增、更优选至少80次倍增、更优选至少90次倍增、诸如大约100次倍增。

为了封装，需要细胞能够在CNS的低氧张力水平条件下存活并维持功能性GDNF分泌。优选的是，本发明的细胞系能够在低于5％、更优选低于2％、更优选低于1％的氧张力存活。1％氧张力对应于脑中的氧水平。

要成为供基于封装细胞的投递***用的平台细胞系，细胞系应当具有尽可能多的以下各项特征：(1)细胞应当是强壮的，即在严紧条件下能存活(封装细胞应当在血管和无血管组织腔中是有功能的，诸如在中枢神经***中实质内或脑室内或鞘内流体空间中或眼中，尤其是在眼内环境中)；(2)细胞应当能够被遗传修饰而表达GDNF；(3)细胞应当具有相对较长的寿命(细胞应当生成足够的后代，用于存储、表征、工程化、安全性测试和临床批次生产)；(4)细胞必须是人源的(这可提高封装细胞与宿主之间的相容性)；(5)细胞应当在装置中在体内在超过1个月的时间里表现出大于80％的生存力(这确保了长期投递)；(6)封装细胞应当投递有效数量的GDNF(这确保了治疗有效性)；(7)封装后，细胞应当不会引起显著的宿主免疫反应(这确保了移植物的寿命；(8)细胞应当是非致瘤的(增加在装置泄露情况下对宿主的安全性)。

在数种细胞系的筛选和表征中，发现ARPE-19细胞系(Dunn et al.，62Exp.Eye Res.155-69(1996)；Dunn et al.，39 Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2744-9(1998)；Finnemann et al.，94Proc.Natl.Acad.Sci.USA 12932-7(1997)；Handa et al.，66Exp.Eye.411-9(1998)；Holtkamp et al.，112 Clin.Exp.Immunol.34-43(1998)；Maidji et al.，70 J.Virol.8402-10(1996))具有作为供基于封装细胞的投递***(US 6,361,771，Tao et al)用的成功平台细胞的所有特征。ARPE-19细胞系优于所测试的其它细胞系。

ARPE-19细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得，ATCC编号CRL-2302。ARPE-19细胞系衍生自正常视网膜色素上皮(RPE)细胞的培养物，并表达视网膜色素上皮细胞特异性标志物CRALBP和RPE-65。ARPE-19细胞形成稳定的单层，表现出形态学上和功能上的极性。

ARPE-19细胞可以在完全生长培养基(Complete Growth Medium)，即细胞保***所推荐的含血清培养基中培养。完全生长培养基或是Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基与Ham氏F12培养基(含3mM L-谷氨酰胺，90％；胎牛血清，10％)的1∶1混合物；或是Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基与Ham氏F12培养基(及含10％胎牛血清，56mM终浓度的碳酸氢钠和2mML-谷氨酰胺的HEPES缓冲液)的1∶1混合物。细胞优选于37℃在5％CO₂中温育。细胞通常在经处理的6或12孔Falcon组织培养板中或T25或T75瓶中铺板和培养。

对于传代培养，除去培养基，并优选将ARPE-19细胞用0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA溶液漂洗，然后除去胰蛋白酶。再添加1-2ml胰蛋白酶溶液。将培养物于室温(或37℃)培养，直到ARPE-19细胞脱附。推荐1∶3到1∶5的传代培养比率。

供封装细胞疗法用的候选细胞系的耐性可以使用如下三步筛选来测试：(a)细胞生存力筛选(可以使用人造房水(aAH)介质或人造脑脊髓液(aCSF)介质在应激条件下评估细胞)；(b)体外ECM筛选(可以在体外细胞外基质(ECM)筛选中评估细胞)；(c)体内装置生存力筛选(可以在体内膜筛选中评估封装细胞)。上述筛选的详述和用数种人和非人细胞系得到的结果见US 6,361,771(通过提述并入上述文献)。

在上文所述三种类型的筛选中，ARPE-19细胞证明了优于所测试的许多其它细胞系(见US 6,361,771)。具体而言，应当注意到已经在现有技术中用于分泌GDNF的BHK和C2C12细胞未能通过细胞生存力筛选。

在另一个实施方案中，细胞系选自下组：人永生化成纤维细胞细胞系、人永生化间充质干细胞、人永生化星形胶质细胞细胞系、人永生化中脑细胞系、和人永生化内皮细胞系，优选用SV40T、vmyc、或端粒酶(TERT)的催化亚基永生化。

依照本发明的另一种类型的优选人类细胞是永生化人星形胶质细胞细胞系。这些细胞系还可以具有依照本发明的用途所要求的特性。用于生成永生化人星形胶质细胞细胞系的方法先前已有记载(Price TN，Burke JF，Mayne LV.A novel human astrocyte cell line(A735)with astrocyte-specificneurotransmitter function.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5)：279-88)。此方案可用于生成星形胶质细胞细胞系。

为了生成单克隆细胞系，如实施例1中所述，在只容许经转染的细胞存活的条件下接种经遗传修饰而分泌GDNF的细胞。在选出存活的细胞或集落后，可以将它们扩增以形成单克隆细胞系的组合物。还可以使用有限稀释来生成单克隆细胞系，这种方法需要测试每一个所选择的克隆，因为没有进行经转染细胞的选择。

随后可以对单克隆细胞系进行GDNF高分泌的选择、体外和体内长期稳定性筛选，然后选出合适的克隆。对选出的单克隆细胞系可以进一步进行安全性测试和细胞存储，然后用于人体治疗。

长期稳定性

优选的是，本发明中所使用的细胞系在体内作为封装细胞移植后能够存活较长一段时间(数个月到一年或更长时间)。细胞系优选还能够以足以确保治疗功效的水平维持生物活性GDNF分泌长于1个月、优选长于3个月、更优选长于6个月的时间。还优选细胞能够在封装后维持有关的生物活性GDNF分泌达至少1个月、更优选至少3个月、更优选至少6个月时间。如实施例8中所示，GDNF分泌和生存力在植入正常大鼠的脑中2个月后仍然较高。

分泌水平优选为至少0.5ng生物学活性GDNF每10⁵个细胞每24小时，为至少0.5ng、更优选至少0.75ng、更优选至少1ng、更优选至少2ng、更优选至少2.5ng、更优选至少5ng、更优选至少7.5ng、更优选至少10ng、更优选至少15ng、更优选至少20ng、更优选至少25ng、更优选至少50ng。如所附实施例所证明的，已建立了分泌超过5ng/10⁵个细胞/24小时、甚至10ng/10⁵个细胞/24小时的数种人接触抑制性克隆。

在装置水平上测量时，装置(含有封装细胞)优选能够分泌超过0.1ng生物学活性GDNF/24小时。更优选的是，每24小时每个装置的生物学活性GDNF的量为至少1ng、更优选至少2ng、更优选至少2.5ng、更优选至少5ng、更优选至少7.5ng、更优选至少10ng、更优选至少15ng、更优选至少20ng、更优选至少25ng。这些数值是就长度为5-7mm、内径为500-700μm且装载50000个细胞的圆柱体装置而言的。

保藏物

根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)，NsGene A/S(Baltorpvej 154，DK-2750 Ballerup，Denmark)于2005年9月21日将两种优选的人类(Homosapiens)细胞系保藏于DSMZ(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，编号为DSM ACC2733(NGC-0363)和DSM ACC2732(NCG-0301)。这两种保藏细胞系为转染了pCIn.hG的ARPE-19克隆，如本文所定义的。上述保藏细胞系在实施例中被命名为C101(NCG-0301)和C63(NGC-0363)。

表达载体

用于在本发明中重组表达GDNF的载体的构建可以使用常规技术来实现，不需要对本领域技术人员详细解释。然而，普通技术人员可参考Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY1982)中Maniatis等人的综述。

在用于本文时，术语“载体”指能够运输与其相连的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可将其它DNA区段连接入表达基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括发挥等效功能的其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体包含基于将用于表达的宿主细胞而选择的、与将表达的核酸序列可操作连接的一种或多种调控序列。在重组表达载体内，“可操作连接”意图意味着感兴趣的核苷酸序列与调控序列以容许核苷酸序列表达(例如在载体导入宿主细胞后在宿主细胞中表达)的方式相连。

术语“调控序列”意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。此类调控序列记载于例如Goeddel，GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185，Academic Press，SanDiego，Calif.(1990)。调控序列包括在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成性表达的调控序列，和只在特定宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员将领会，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明中所使用的表达载体导入宿主细胞，由此生成由本文所述核酸编码的GDNF和GDNF突变体和变体。

在本发明的一个优选实施方案中，细胞转染了非病毒表达载体。优选使用非病毒表达载体，原因在于细胞植入受体受试者后的安全性。

在一个优选的实施方案中，表达载体是哺乳动物质粒表达载体。哺乳动物质粒表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987.Nature 329：840)、pCI(Promega Inc)、pSI(Promega)、pNS(实施例1)、pUbilz(Johansen et al 2003，J Gene Medicine，5：1080-1089)、和pMT2PC(Kaufman，et al.，1987.EMBO J.6：187195)。在用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常常由病毒调控元件来提供。对于用于真核细胞的其它合适表达***，参见例如Sambrook，etal.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL.第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989的第16和17章。

基因的表达在转录、翻译或翻译后水平受到控制。转录起始是基因表达中的早期和关键事件。它依赖于启动子和增强子序列，而且受到与这些序列相互作用的特定细胞因子的影响。许多基因的转录物单位包含启动子，有些情况下还有增强子或调控元件(Banerji et al.，Cell 27：299(1981)；Cordenet al.，Science 209：1406(1980)；Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于逆转录病毒，逆转录病毒基因组复制所牵涉的控制元件位于长末端重复序列(LTR)中(Weiss et al.，eds.，The molecular biology oftumor viruses：RNA tumor viruses，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY1982))。莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR包含启动子和增强子序列(Jolly et al.，Nucleic Acids Res.11：1855(1983)；Capecchi et al.，In：Enhancer and eukaryotic gene expression，Gulzman and Shenk，eds.，pp.101-102，Cold Spring Harbor Laboratories(NY 1991))。其它强启动子包括那些衍生自巨细胞病毒(CMV)的和其它野生型病毒启动子的启动子，和衍生自人遍在蛋白C的UbiC启动子(WO 98/32869)。

许多非病毒启动子的启动子和增强子区也已有记载(Schmidt et al.，Nature 314：285(1985)；Rossi and deCrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5590-5594(1987))。用于在静止细胞中维持和提高转基因表达的方法包括使用启动子，包括I型胶原(1和2)(Prockop and Kivirikko，N.Eng.J.Med.311：376(1984)；Smith and Niles，Biochem.19：1820(1980)；de Wet et al.，J.Biol.Chem.，258：14385(1983))、SV40和LTR启动子。

根据本发明的一个实施方案，启动子是选自下组的组成性启动子：遍在蛋白启动子、CMV启动子、JeT启动子(US 6,555,674)、SV40启动子、Mt1启动子、和延伸因子1α启动子(EF-1α)。一种特别优选的启动子是在体内不被下调的启动子。

可诱导/可阻抑型启动子的例子包括：Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素诱导型启动子、Mx1。

在使用病毒和非病毒启动子来驱动转基因病毒之外，还可以使用增强子序列来提高转基因的表达水平。增强子不仅能提高它们天然基因的转录活性，而且能提高有些外来基因的转录活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：2702(1973))。例如，在本发明中，可以与胶原启动子2(I)一起使用胶原增强子序列来提高转基因表达。另外，在SV40病毒中找到的增强子元件可用于提高转基因表达。此增强子序列由72个碱基对的重复序列组成(Gruss et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943(1981)；Benoist and Chambon，Nature 290：304(1981)；Fromm and Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1：457(1982)，都收入本文作为参考)。此重复序列在与多种启动子串联存在时能提高许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau et al.，Nucleic Acids Res.9：6047(1981))。

其它表达增强序列包括但不限于Kozak共有序列、Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件、WPRE、SP163增强子、CMV增强子、τ、TH或APP基因的非翻译5’或3’区、和鸡β-球蛋白绝缘子(insulator)或其它绝缘子。优选的增强元件包括Kozak共有序列、WPRE和β-球蛋白绝缘子。

可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和逆转录病毒。合适的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV。

一个特别和优选的逆转录病毒类型包括慢病毒，它们能转导细胞并整合入该细胞的基因组而无需细胞***。慢病毒颗粒可以由慢病毒载体生成，该载体包含5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、与编码GDNF的多核苷酸信号可操作连接的启动子、DNA第二条链合成的起点、和3’慢病毒LTR。

逆转录病毒载体是在人临床试验中最常用的载体，因为它们可携带7-8kb异源DNA，而且因为它们有能力以很高的效率感染细胞并使其遗传物质稳定的整合到宿主细胞中(见例如WO 95/30761；WO 95/24929)。肿瘤病毒亚科病毒(Oncovirinae)需要至少一轮靶细胞增殖来使外源核酸序列转移和整合到患者中。逆转录病毒载体随机整合入细胞基因组。

已经记载了三类逆转录病毒颗粒：亲嗜性的，它能高效感染鼠细胞；双嗜性的，它能感染许多物种的细胞；第三类包括异嗜性的逆转录病毒，它能感染生成病毒的物种以外的另一种物种的细胞。逆转录病毒具有只整合到***中细胞的基因组中的能力，这使得它们在发育研究中标记细胞谱系方面和在将治疗用基因或***基因投递至癌或肿瘤方面有吸引力。

逆转录病毒载体优选是复制缺陷的。这防止了在靶组织中进一步生成感染性逆转录病毒颗粒-而是，复制缺陷型载体成为稳定整合入靶细胞基因组的“被俘”转基因。复制缺陷型载体中通常删除了gag、env和pol基因(连同大部分剩余病毒基因组)。***异源DNA代替所删除的病毒基因。异源基因可以处于内源异源启动子、在靶细胞中有活性的另一异源启动子、或逆转录病毒5′LTR(病毒LTR在多种组织中有活性)的控制之下。通常，逆转录病毒载体具有大约7-8kb的转基因容量。

复制缺陷型逆转录病毒载体需要反式提供复制和包装所必需的病毒蛋白质，例如由工程化包装细胞系来提供。重要的一点是，包装细胞不释放复制胜任病毒和/或辅助病毒。这可通过由缺乏ψ信号的RNA表达病毒蛋白质并由另外的转录单元表达gag/pol基因和env基因来实现。另外，在有些第2代和第3代逆转录病毒中，5’LTR已经被控制这些基因表达的非病毒启动子所取代，而3’启动子被最小化到只包含最接近的启动子。这些设计最大程度地减少了导致生成复制胜任载体或辅助病毒的重组的可能性(见例如US 4,861,719，并入本文作为参考)。

内含子

在本发明的一个优选实施方案中，编码GDNF或GDNF变体的表达构建物在转录物中包含内含子。用含内含子的表达构建物得到了最高产量的细胞系。

根据对GenBank的人基因组的分析，可以推导出最小的已知内含子为4bp，最长的已知内含子为1,022,077bp。基于此知识，设想对于本发明语境中所使用的内含子的长度可加以相当大的变化。除了Genbank给出的已知上限外，难以给出在本发明语境中有功能的内含子长度的任何上限。在最宽泛的可能语境中，内含子的长度没有上限，只要它能成功的克隆到表达载体中。出于实践的原因，本领域技术人员将选择长度少于100,000bp、更优选少于10,000bp的内含子。

内含子中唯一真正高度保守的部分是紧接着在内含子内的序列。由此通用内含子由下式标识：

GT.....AG。

末端沿着内含子从左至右命名为左侧(或5’)和右侧(或3’)剪接位点。有时将它们称为供体和受***点。紧邻供体和受***点的碱基保守度较低。不同碱基在相对于剪接位点的特定位置的频率遵循以下百分率(LewinB，Genes V，Oxford University Press，Oxford，1994，page 914)：

外显子内含子外显子

A G G T A A G T------C A G N

64％ 73％ 100％ 100％ 62％ 68％ 84％ 63％ 65％ 100％ 100％

这些剪接位点内的序列，对于每一个内含子而言，可以通过碱基添加、删除或替代而加以相当可观的改变。在本发明的一个优选实施方案中，内含子包含衍生自天然存在的内含子并与所述天然存在的内含子具有至少50％的序列同一性的核苷酸序列。更优选的是，该内含子与所述天然存在的内含子具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性。较高的％序列同一性是优选的，因为装配表达构建物所需的工作较少，而且内含子功能改变的可能性随天然存在的内含子与其变体之间差异的数目而升高。

在一个优选的实施方案中，内含子较短，诸如少于10,000bp，这将显著减轻克隆工作。因而，内含子的长度可以少于9,000bp、优选少于8,000、更优选少于7,000、更优选少于6,000、更优选少于5,000、更优选少于4,500、更优选少于4,000、更优选少于3,500、更优选少于3,000、更优选少于2,500、更优选少于2,000、更优选少于1,500、更优选少于1,000、诸如少于750、例如少于500、诸如少于250、例如少于200。

类似的，为了在翻译前从转录物中正确剪接出来，预期内含子应当具有一定的长度。因此，优选的是，内含子的长度大于4bp、诸如大于10bp、例如大于20bp、优选大于50bp、更优选大于75bp。

内含子的长度可以是4bp到1mio bp、更优选10-10,000bp、更优选20-2000bp、例如50-1500bp、诸如优选75-200bp、例如优选500-1500bp。本发明的优选内含子在100-1000bp范围内。

内含子可以是任何起源。它还可以是合成内含子，只要它能发挥内含子的功能。由于本发明关注人细胞系，优选使用来自与人类尽可能密切接近的物种的内含子。因此，优选的是，内含子是真核生物起源的。更优选的是，内含子是哺乳动物起源的。例如，内含子可以是啮齿类起源的或灵长类起源的。仍更优选的是，内含子是人起源的。

优选的是，内含子位于5’UTR中，或位于编码序列最接近起始密码子的部分，即编码序列的第一个部分中。当内含子位于转录物的5’UTR中时，克隆更为容易。本发明人设想，可以通过将内含子克隆到编码GDNF的序列中来得到类似的效果。在克隆到编码序列中的情况下，内含子优选位于编码序列最接近起始密码子的部分，即编码序列的第一个部分中。

在一个优选的实施方案中，内含子衍生自第一内含子。第一内含子指衍生它的基因中位置与转录起始位点最接近的内含子。尽管优选第一内含子，应当理解，也可以使用任何内含子，诸如第二、第三、第四、第五、或第六内含子。特定基因的第一内含子可以称为内含子A。

预计在本发明人细胞系中的表达构建物中包含一个内含子就足够了。包含更多的内含子当然也是可能的，而且本发明人也想到了。原则上，***转录物的内含子的数目没有上限，但出于实践原因，熟练从业人员将选择使这一数目保持尽可能低，以保持表达构建物的长度在实践限制内。内含子的数目可以是2个、3个、4个、5个或更多。

一种特别优选的内含子是可以从Promega Corp(Madison Wisconsin，USA，产品目录编号：E1731)得到的pCI表达载体中所包含的嵌合内含子。此内含子由来自人b-珠蛋白基因第一内含子的5’-供***点，及来自免疫球蛋白基因重链可变区前导序列与主体之间的内含子的3’-受***点和分支(branch)构成(Bothwell et al，1981，Cell 24：625)。供体和受***点以及分支点的序列已经被改变，以匹配供剪接用的共有序列(Senapathy et al，1990，Meth.Enzymol.183：252)。pCI表达载体可以从Promega Corp得到。该内含子的长度为113bp，该内含子的序列见SEQ ID No 1(碱基890-1022)。位于“pCI内含子”剪接位点间的序列可以改变。优选的是，内含子包含衍生自“pCI内含子”的序列，该衍生序列与上文所列序列具有至少50％序列同一性。更优选的是，内含子包含与所述“pCI内含子”具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的序列。

另一种优选的内含子衍生自胰岛素。优选啮齿类胰岛素II、更优选大鼠前原胰岛素II内含子A(GenBank编号J00748的碱基982..1100)。位于大鼠胰岛素II内含子A的剪接位点之间的序列可以改变。优选的是，内含子包含衍生自大鼠胰岛素II A内含子且因此与上文所列序列具有至少50％的序列同一性的序列。更优选的是，内含子包含与所述序列具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的序列。

又一种优选的内含子是遍在蛋白启动子内含子、优选人遍在蛋白C启动子内含子(Johansen et al.1990，FEBS Lett.267，289-294)。UbiC内含子的长度为811bp(GenBank编号D63791的碱基3959..4769)。遍在蛋白C启动子内含子可以从pUbilz表达载体(Johansen et al 2003，J Gene Medicine，5：1080-1089中有记载)得到。位于所述遍在蛋白内含子的剪接位点之间的序列可以改变。优选的是，内含子包含衍生自大鼠遍在蛋白内含子且与上文所列序列具有至少50％的序列同一性的序列。更优选的是，内含子包含与所述遍在蛋白内含子序列具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％序列同一性的序列。

另一种优选的内含子是EF-1α内含子A(Genbank编号：J04617 J04616人延伸因子EF-1α基因完整cds的碱基609..1551)。此内含子的长度为943bp。位于所述EF-1α内含子A的剪接位点之间的序列可以改变。优选的是，内含子包含衍生自EF-1α内含子且与上文所述序列具有至少50％的序列同一性的序列。更优选的是，内含子包含与所述EF-1α内含子A具有至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的序列。

优选的是，内含子选自下组：pCI内含子、大鼠INS-intrA、和遍在蛋白内含子；及与任何所述内含子的序列具有至少80％序列同一性的序列变体。

更优选的是，内含子选自下组：pCI内含子及其与所述内含子的序列具有至少80％的序列同一性的序列变体。

封装

封装细胞生物投递是基于通过在植入宿主内之前用半透性生物相容性材料包围细胞来保护细胞免受接受者宿主免疫***攻击的概念。本发明包括一种装置，其中细胞被封装在免疫绝缘性(immunoisolatory)装置中。“免疫绝缘性装置”意味着该装置在植入宿主接受者后使宿主的免疫***对该装置核心中的细胞的有害作用最小化。通过将细胞装入(enclose within)由多微孔膜制成的可植入式聚合物装置(implantable polymeric devices)而使它们与宿主免疫绝缘。这种方法防止了宿主与所植入组织之间的细胞-细胞接触，消除了通过直接呈递进行的抗原识别。还可以调适(tailor)所用的膜以基于分子量控制分子(如GDNF)的扩散。使用封装技术，可以将细胞移植到宿主中而没有免疫排斥，无论是否使用免疫抑制性药物。有用的生物相容性聚合物装置通常包括：内含细胞的核心，其中细胞或悬浮在液体培养基中或固定在固定化基质中；和位于周围或外周的选择渗透性基质或膜(“夹套”)区域，此区域不含分离的细胞，具有生物相容性，而且足以保护核心中的细胞免受有害的免疫学攻击。封装阻碍了免疫***的成分进入装置，由此保护封装细胞免于免疫破坏。装置膜的半透性质还允许所关注的生物学活性分子容易地从装置扩散到周围宿主组织中。

所述装置可以用生物相容性材料制成。“生物相容性材料”指在植入宿主后不会引发足以导致对装置的排斥或使之无法工作(例如通过降解)的有害宿主应答的材料。生物相容性材料对于大分子如宿主免疫***的组分是相对不能渗透的，但是对小分子诸如胰岛素、生长因子和养分是能渗透的，同时还容许代谢废物的移除。多种生物相容性材料适用于通过本发明的组合物来投递生长因子。许多生物相容性材料是已知的，具有各种外表面形态和其它机械和结构特征。优选的是，本发明的装置与以下文献中所描述的相似：WO 92/19195或WO 95/05452，通过提述并入上述文献；美国专利US 5,639,275、5,653,975、4,892,538、5,156,844、5,283,187或5,550,050，通过提述并入上述文献。此类装置容许代谢物、养分和治疗性物质通过，同时使宿主免疫***的有害作用最小化。生物相容性材料的组分可以包括周围的半透膜和内部的细胞支持支架(cell-supporting scaffold)。优选的是，重组细胞接种到用选择性渗透膜封装的支架上。丝状细胞支持支架可以用选自下组的任何生物相容性材料制成：丙烯酸树脂(acrylic)、聚酯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯、丝绸、棉花、几丁质、碳、或生物相容性金属。还有，粘结(bonded)纤维结构也可用于细胞植入(US 5,512,600，通过提述并入上述文献)。生物可降解聚合物包括那些由聚(乳酸)PLA、聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA、和聚(乙醇酸)PGA及其等同物构成的。泡沫支架(foam scaffolds)已经被用于提供接种细胞可粘附的表面(WO 98/05304，通过提述并入上述文献)。编织网管(woven mesh tubes)已经用作血管移植物(WO 99/52573，通过提述并入上述文献)。另外，核心可以由水凝胶形成的致固定化性(immobilizing)基质构成，它稳定细胞的位置。水凝胶是基本上由水构成的、凝胶形式的交联亲水性聚合物的三维网状结构。

夹套优选具有少于1000kD、更优选50-700kD、最优选70-300kD的分子量截留值。分子量截留值的选择应当确保生物活性GDNF能从所述装置脱出，同时保护被封装的细胞免于患者免疫***的攻击。

夹套的厚度通常在2-200微米、更优选50-150微米的范围内。夹套的厚度应当使得装置的强度足以保持细胞封装，同时在考虑这一点的前提下，应当注意保持尽可能的薄以占用尽可能小的空间。

多种聚合物和聚合物混合物可用于制造周围的半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)、聚偏二乙烯(polyvinylidenes)、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷嗪、聚丙烯腈、聚(丙烯腈共氯乙烯)、及其衍生物、共聚物和混合物。优选的是，周围的半透膜是生物相容性半透性中空纤维膜。此类膜及其生产方法披露于US 5,284,761和5,158,881，通过提述并入上述文献。周围的半透膜可以由聚醚砜中空纤维形成，诸如US 4,976,859或US4,968,733所记载的，通过提述并入上述文献。一种备选的周围半透膜材料是聚(丙烯腈共氯乙烯)。

装置可以是适于维持生物学活性和提供产物或功能的投递通路的任何构造，包括例如圆柱体、长方体、盘形、片形、卵形体、星形、或球形。此外，装置可以盘绕(coiled)或缠绕(wrapped)成网状(mesh-like)或嵌套(nested)结构。如果装置要在植入后收回，则不优选趋向于导致装置从植入位点迁移的构造，诸如小到足以在接受宿主的血管中移动的球形装置。某些形状，诸如长方体、片、盘、圆柱体、和平板，提供更好的结构完整性，在期望收回的场合是优选的。一种特别优选的形状是圆柱体，因为这种形状易于用中空纤维制成，可以工业生产。

在使用大胶囊时，优选在每个装置中封装至少10³个细胞，诸如封装10³-10⁸个细胞，最优选封装10⁴-10⁷个细胞。当然，每个装置中的细胞数目取决于装置的尺寸。根据经验，在具有泡沫(下文所述)的装置中，本发明人发现装载为10,000-100,000个细胞每μL装置(体积是以内部体积计算的，包括支持物)、更优选15,000-50,000个细胞每μL、更优选20,000-30,000个细胞每μL。待装载的细胞数目还取决于细胞的尺寸。可以通过植入更少或更多数目的装置来控制剂量，优选每位患者1-10个装置。

本发明语境中的大胶囊是指体积为至少0.5μL、诸如1-10μL的装置。

支架可以用胞外(ECM)基质分子包被。胞外基质分子的合适例子包括例如胶原、层粘连蛋白、和纤连蛋白。支架的表面还可以通过等离子体照射处理给予电荷来改性以增强细胞附着。

可以使用任何合适方法来密封装置，包括使用聚合物粘合剂或卷边、打结和热封。另外，还可以使用任何合适的“干”封法，例如US 5,653,687所记载的，通过提述并入上述文献。

依照已知技术植入封装细胞装置。为本发明的装置和方法设想了许多植入位点。这些植入位点包括但不限于中枢神经***，包括脑、脊髓(见US5,106,627、5,156,844、和5,554,148，通过提述并入上述文献)、及眼的房水和玻璃体液(见WO 97/34586，通过提述并入上述文献)。

泡沫支架：

泡沫支架可以由任何可形成生物相容性的具有开放室(open cell)的泡沫或具有多孔网络的大孔结构的合适材料形成。开放室泡沫是一种互联孔的网状结构。泡沫支架提供非生物可降解的、稳定的支架材料，容许贴壁细胞附着。在可用于形成本发明装置的泡沫支架的聚合物中有热塑性塑料和热塑性弹性体。

表3中列出了可用于形成合适泡沫支架的材料的一些例子。

表3

热塑性材料

热塑性塑料：弹性体：

丙烯酸树脂(acrylic) 聚酰胺

变性腈纶(Modacrylic) 聚酯

聚酰胺聚乙烯

聚碳酸酯聚丙烯

聚酯聚苯乙烯

聚乙烯聚氨酯

聚丙烯聚乙烯醇

聚苯乙烯硅树脂(silicone)

聚砜

聚醚砜

聚偏二氟乙烯

由聚砜和聚醚砜制成的热塑性塑料泡沫支架，及由聚氨酯和聚乙烯醇制成的热塑性弹性体泡沫支架是优选的。

泡沫必须有一些(但不必所有)孔的尺寸容许细胞附着至孔内的壁或表面。孔的尺寸、孔的密度和泡沫支架的外水体积可以有所变化。孔的形状可以是原形、椭圆形、或不规则的。因为孔的形状可以有相当大的变化，它的尺寸可以依照所测量的轴而有所变化。为了本发明的目的，泡沫中的至少有些孔应当具有20-500μm、优选50-150μm的孔直径。优选的是，前述尺度代表泡沫的平均孔尺寸。如果孔不是圆形的，那么可以具有可变的尺寸，只要它的大小足以容许贴壁细胞附着至孔内的壁或表面。在一个实施方案中，设想了具有一些椭圆形孔的泡沫，这些孔沿短轴的直径为20-500μm、沿长轴的直径可长达1500μm。

在前述细胞许可性孔尺寸以外，优选泡沫中的至少一部分孔应当小于10μm，从而是非细胞许可性的，但仍提供将养分和生物学活性分子运输到整个泡沫的通道。泡沫的孔密度(即单体体积中可容纳细胞的孔的数目，如上所述)可以在20-90％、优选在50-70％范围内变化。类似的，泡沫的外水体积可以在20-90％、优选在30-70％范围内变化。

孔的壁或表面可以用胞外基质分子或其它合适分子包被。此包被可用于促进细胞对孔壁的粘附、保持细胞处于特定表型、和/或诱导细胞分化。

可粘附至泡沫的孔内表面的胞外基质(ECM)分子的优选例子包括：胶原、层粘连蛋白、玻连蛋白、聚鸟氨酸和纤连蛋白。其它合适的ECM分子包括糖胺聚糖和蛋白聚糖；诸如硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸(hyaluron)、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和弹性蛋白。

可以通过培养已知可沉积ECM的细胞来获得ECM，包括间充质细胞或星形细胞起源的细胞。施旺(Schwann)细胞可以在用抗坏血酸和cAMP处理后被诱导合成ECM见例如Baron-Van Evercooren et al.，″Schwann CellDifferentiation in vitro：Extracellular Matrix Deposition and Interaction，″Dev.Neurosci.，8，pp.182-96(1986))。

另外，粘连肽片段(adhesion peptide fragments)，例如含RGD的序列(ArgGlyAsp)、含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg)、及含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal)等，已经发现可用于促进细胞附着。有些含RGD的分子可通过商业途径获得，例如PepTite-2000^TM(Telios)。

本发明的泡沫支架还可用促进细胞在装置内分散(distribution)的其它材料进行处理。例如，可以在泡沫的孔中填充抑制细胞增殖或迁移的非许可性水凝胶。此类改良可改善贴壁细胞对泡沫支架的附着。合适的水凝胶包括阴离子水凝胶(例如藻酸盐或角叉菜聚糖)，它们由于电荷的原因而排斥细胞。或者，还可利用“固体”水凝胶(例如琼脂糖或聚环氧乙烷)阻碍细胞所分泌的胞外基质分子的结合，来抑制细胞增殖。

通过用非许可性材料区处理泡沫支架，可以在装置内封装两种或更多种不同细胞群而不会使一种细胞群蔓延到另一种细胞群。这样，可在泡沫支架内使用非许可性材料，以分隔不同的封装细胞群。不同细胞群可以是相同或不同细胞类型的，而且可以产生相同或不同的生物学活性分子。在一个实施方案中，一种细胞群生成提升另一细胞群生长和/或存活的物质。在另一个实施方案中，封装生成多种生物学活性分子的多种细胞类型。这就为接受者提供了治疗性物质的混合物或“鸡尾酒”。

本发明的装置可以依照任何合适方法来制成。在一个实施方案中，可以预先成型泡沫支架并作为离散组件***预先制作的夹套，例如中空纤维膜。

可以将任何合适的热塑性塑料或热塑性弹性体泡沫支架材料预先成型，用于***预先制造的夹套。在一个实施方案中，优选使用聚乙烯醇(PVA)海绵作为泡沫支架。数种PVA海绵可通过商业途径获得。例如，PVA泡沫海绵#D-3，60μm孔径是合适的(Rippey Corp，Kanebo)。类似的，PVA海绵可以从Ivalon Inc.(San Diego，Cailf.)购买。PVA海绵是水不溶性泡沫，通过充气(aerated)的聚(乙烯醇)溶液与作为交联剂的甲醛蒸汽反应来形成。PVA上的羟基基团与醛基共价交联，以形成聚合物网络。泡沫在湿润时是柔性的和弹性的，在干燥时是半刚性的。

或者，可以如US 6,627,422中所述使用支持物网或纱。

为了易于收回装置和将装置固定在头骨上，装置可以配有系绳锚(tetheranchor)。类似的，为了易于收回装置和扎牢在眼上，装置可以配有缝合孔。

胶囊可以如实施例中所述使用注射器来填充。或者，可以使用自动化或半自动化填充。

微胶囊

除上文所述大胶囊以外，本发明的GDNF分泌细胞可以封装在微胶囊或微球体中。微胶囊或微球体在本文中定义为容纳少于10⁴个细胞每胶囊的胶囊。微胶囊可含有实质性少于10⁴个细胞、诸如少于1000个细胞每个胶囊、例如少于100个细胞每个胶囊、诸如少于50个细胞每个胶囊、例如少于10个细胞每个胶囊、诸如少于5个细胞每个胶囊。此类微胶囊可以在结构上是相对简单的，因为它们含有在基质中或多或少均匀分散的细胞。还可以对微胶囊进行包被以提供更多的双层结构并确保没有细胞穿过微胶囊表面而突出在外。由于微胶囊通常较小(直径通常少于250μm、诸如少于150μm、例如少于100μm、诸如少于50μm、例如少于25μm)，它们可以像液体悬浮液一样操作，并注射到治疗部位。

供GDNF生产细胞用的支持物基质

本发明的方法进一步包括在植入哺乳动物脑之前在支持物基质上体外培养GDNF生产细胞。细胞在植入脑之前对微载体预先附着的设计，旨在增强所移植细胞的长期生存力和提供长期功能效益。用于在支持物基质上培养细胞的方法和用于将所述细胞植入脑的方法记载于US 5,750,103(通过提述并入上述文献)。

为了提高所移植细胞的长期生存力，可以在移植前将待移植的细胞体外附着于支持物基质。可用于构成支持物基质的材料包括那些在体外温育后细胞能对其附着、细胞能在其上生长、可植入哺乳动物体内而不引起有毒反应或炎性反应(这些反应将破坏所植入细胞或以其它方式干扰所植入细胞的生物学活性或治疗性活性)的材料。此类材料可以是合成的或天然的化学物质，或者是具有生物学起源的物质。

基质材料包括但不限于玻璃或其它硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氨酯、聚藻酸盐/酯(polyalginate)、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯(polypentent)、尼龙、淀粉酶、天然的和改性的明胶、天然的和改性的胶原、天然的和改性的多糖包括葡聚糖和纤维素(例如硝酸纤维素)、琼脂、和磁铁矿。可以使用可再吸收的或不可再吸收的材料。还设想了本领域众所周知的胞外基质材料。胞外基质材料可以通过商业途径获得的，或者可以通过培养分泌此类基质的细胞、除去分泌细胞、并让待移植的细胞与基质相互作用并附着于基质来制备。待植入的细胞在其上生长或所述细胞与其混和的基质材料可以是细胞的固有产物。因此，例如，基质材料可以是由待植入细胞生成和分泌的胞外基质或基膜材料。

为了改进细胞粘附、存活和功能，任选将固体基质在其外表面包被上本领域已知促进细胞粘附、生长或存活的因子。此类因子包括细胞粘附分子、胞外基质，诸如例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖、或蛋白聚糖或生长因子。

或者，如果植入细胞所附着的固体基质是由多孔材料构成的，那么可以将促进生长或存活的因子掺入基质材料，在体内植入后所述因子将所述基质材料中缓慢释放出来。

在附着于依照本发明的支持物后，供移植用的细胞通常位于支持物的“外表面”上。支持物可以是实心的或多孔的。然而，即使在多孔支持物中，细胞也与外部环境直接接触而没有介入的膜或其它屏障。由此，依照本发明，即使细胞所粘附的表面可能是多孔支持物材料的内部折叠或褶皱形式，并不位于颗粒或珠的外部，也认为细胞在支持物的“外表面”上。

支持物的构造优选是球形的，如珠子，但是也可以是圆柱体、椭圆形、平板或带、针头或钉形、诸如此类。一种优选形式的支持物基质是玻璃珠子。另一种优选的珠子是聚苯乙烯珠子。

珠子的尺寸可以在大约10μm-1mm的范围内(直径)，优选大约90μm-大约150μm。关于各种微载体珠的记载见例如Fisher Biotech Source 87-88，Fisher Scientific Co.，1987，pp.72-75；Sigma细胞培养物目录，Sigma ChemicalCo.，St，Louis，1991，pp.162-163；Ventrex产品目录，Ventrex Laboratories，1989；通过提述将这些参考文献收入本文。珠子的尺寸的上限可以由珠子对不良宿主反应的刺激作用来决定，这些反应可能干扰所移植细胞的功能或者引起对周围组织的破坏。珠子的尺寸的上限还可以由施用方法来决定。本领域技术人员可容易的确定此类限制。

******

本发明封装GDNF分泌细胞的装置可以在需要时从患者中收回。作为进一步的安全性防范，可以为细胞配备******，它确保可以在对所讨论的患者施用合适药物后选择性杀死这些细胞。

******对于依照本发明的裸细胞移植是特别优选的，因为在移植后除去裸细胞的可能性非常有限的。

一种这样的******基于胸苷激酶。利用其中组成性或诱导性表达胸苷激酶的内置式******，可以对个体施用治疗有效量的核苷类似物诸如AZT来杀死细胞。若封装细胞开始不受控制地增殖，则可以施用核苷类似物。还可能仅仅因为不再需要GDNF分泌细胞，因为必须立即终止且不能等候手术清除封装细胞，或者因为进一步的治疗是通过某些其它途径，而希望终止治疗。

在所移植的或所封装的细胞已经在移植前条件性永生化的场合，理论上存在癌基因在移植后启动转录，结果使所移植的细胞产生致瘤性的风险。每当细胞通过转导诱导型启动子(例如Tet开关***、Mx1启动子等等)控制下的癌基因而实现永生化时，就可以在载体构建物中***胸苷激酶(TK)酶编码序列到相同启动子的控制之下(例如通过使用IRES构建物)，或者将TK编码序列***具有相同启动子的另一载体。这确保了无论何时癌基因转录，TK也会得以转录，从而可以通过施用药物前体来选择性杀死被转导的致瘤性细胞。

本领域已有记载的胸苷激酶(TK)基因有数个例子。一种优选的TK是HSV-胸苷激酶。其它优选的激酶包括黑腹果蝇胸苷激酶(Munch-Petersen etal 2000，J.Biol.Chem.275：6673-6679)。此特定激酶的突变体甚至是更加优选的，因为它们的LD₅₀相对于数种核苷类似物有所降低(WO 01/88106)。另一组优选的胸苷激酶包括WO 03/100045中所述的植物激酶。

免疫刺激性细胞表面蛋白

在一个实施方案中，提供了除GDNF或GDNF变体以外还能够表达免疫刺激性细胞表面多肽的封装人类细胞。这些免疫刺激性细胞表面表达细胞在为植入人类患者而封装时是特别有用的，因为逃离破裂装置的细胞被患者免疫***破坏。完整装置中表达免疫刺激性细胞表面多肽的重组细胞不会触发宿主免疫应答。然而，在装置发生故障时，所释放的细胞被吞噬细胞有效地清除，而不发生补体激活或产生免疫记忆。

在一个具体的实施方案中，包含人运铁蛋白受体膜结构域的嵌合多肽将人IgG1 Fc以“倒向”锚定至细胞质膜的表面，如此模拟IgG在调理作用中的构型。人IgG1嵌合多肽结合Fc受体以激活吞噬细胞，诸如巨噬细胞，但避免了还激活补体级联(“补体结合”)的不良特性。慢性激活的补体***会杀死宿主细胞，而且越来越多的证据表明这种机制可引起许多变性疾病，包括炎性和神经变性疾病。本发明此实施方案的更多细节记载于US6,197,294。

依照此实施方案，细胞系进一步包含如下构建物，其包含可操作相连的启动子和编码融合蛋白的多核苷酸序列，所述融合蛋白包含免疫刺激性细胞表面蛋白，其氨基末端连接于第二细胞表面多肽，其中所述第二细胞表面多肽包含跨膜区，其中在表达后，所述融合蛋白表达在细胞表面上。

优选的是，免疫刺激性细胞表面多肽激活吞噬细胞，但不结合补体。在一个实施方案中，免疫刺激性细胞表面多肽是IgG的一个区，优选Fc。第二细胞表面多肽可以是运铁蛋白受体铰链区。

神经学病症

GDNF建议作为治疗性因子用于治疗帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌萎缩侧索硬化(Lateral Sclerosis)、阿耳茨海默氏病(US 5,731,284)、NMDA相关病症诸如亨庭顿氏病(Huntington’s Disease)(US 5,741,778)、感觉神经性耳聋(sensorineural hearing loss)(US 5,837,681)、眼科疾病(US 6,299,895)、疼痛、脊髓损伤、中风、外伤、和癫痫。

依照本发明，设想了将人类细胞体内合成的GDNF以1-1500ng/天的范围胶囊投递至脑室、脑实质、或其它合适CNS位置。GDNF的真实剂量可以因植入或高或低产量的克隆、或多或少的细胞、或者或多或少的装置而有所变化。我们设想了对脑室投递0.1-1500、优选1-1000、更优选10-600、最优选50-500ng GDNF/人/天，对实质投递0.1-1500、优选10-150ng GDNF/人/天。为了比较，以每月25-4,000μg的剂量脑室内施用在大肠杆菌中生产的重组人甲硫氨酰GDNF(r-metHuGDNF)，(Nutt et al，2003，Neurology，60：69-73)。还以连续输注的形式将r-metHuGDNF施用到后背壳核(posterodorsal putamen)中，每日剂量为14.4-43.2μg/壳核/天(Love et al，2005，Nature Medicine，vv(7)：703-704))。

眼内、优选在玻璃体中，我们设想了投递50pg-500ng、优选100pg-100ng、最优选1ng-50ng/眼/患者/天。对于眼周投递，优选在特农(Tenon)间隙或区域下的投递，设想了略高的剂量范围，可高达1μg/患者/天。

在一个实施方案中，将经遗传修饰而分泌人GDNF(hGDNF)的人类细胞封装在半透膜中，并植入合适哺乳动物宿主，优选灵长类，最优选人的眼内、脑室内、或实质内。

因而，认为本发明的GDNF表达细胞系可用于在体内促进神经元发育、维持、或再生，包括中枢(脑和脊髓)、外周(交感、副交感、感觉、和肠神经元)、和运动神经元。本发明的GDNF表达细胞系被用于多种神经学疾病和病症的治疗方法中。在一个优选的实施方案中，将本发明的细胞系施用于患者以治疗神经学病症。“神经学病症”在本文中指与神经元变性或损伤或损失有关的中枢和/或外周神经***病症。神经病症的具体例子包括但不限于阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、亨庭顿氏病、中风、CNS创伤、ALS、外周神经病、神经性疼痛、和其它特征为神经元坏死或损失或其过程的疾患，无论是中枢的或外周的，加上治疗因外伤、烧伤、肾功能障碍、损伤、和用于治疗癌症或AIDS的化疗剂的毒副作用而受损的神经。例如，可以使用本发明的制剂来治疗与某些疾患有关的外周神经病，诸如与糖尿病、AIDS或化疗有关的神经病。

在本发明的不同实施方案中，将GDNF表达细胞系施用于神经***因特发性过程、外伤、手术、中风和缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、恶性肿瘤、或毒剂而遭到破坏的患者，以促进神经元的存活或生长，或者用于已经发现可用GDNF治疗的任何疾患。例如，本发明的GDNF表达细胞系可用于促进因外伤或手术而遭到破坏的运动神经元的存活或生长。还有，本发明的GDNF表达细胞系可用于治疗变性运动神经元病症，诸如肌萎缩侧索硬化(Lou Gehrig氏病)、贝耳氏麻痹(Bell′s palsy)、和涉及脊髓性肌萎缩的各种疾患、或麻痹。本发明的GDNF表达细胞系可用于治疗人神经变性病症，诸如阿耳茨海默氏病和其它痴呆、极微的认知缺损(MCI)、帕金森氏病、癫痫、多发性硬化、亨庭顿氏病、唐氏综合征、神经性耳聋、和梅尼尔氏(Meniere)病。本发明的GDNF表达细胞系特别可用于治疗帕金森氏病。

另外，植入外周组织或CNS的本发明GDNF分泌细胞系或装置优选用于治疗神经病，尤其是外周神经病。“外周神经病”指影响外周神经***的病症，最常见的是表现为运动、感觉、感觉运动、或自主神经功能障碍之一或组合。外周神经病所表现出来的形态极其多样，每一种形态都可特异地归因于同样千差万别的原因。例如，外周神经病可以是遗传获得的，可以源自***性疾病，或者可以是由毒剂诱发的。例子包括但不限于糖尿病性外周神经病、远端感觉运动神经病、AIDS相关神经病、或自主神经病诸如胃肠道运动降低或膀胱松弛。与***性疾病有关的神经病的例子包括小儿麻痹症后综合征；遗传性神经病的例子包括夏科-马里-图思(Charcot-Marie-Tooth)病、雷弗素姆氏(Refsum)病、无β脂蛋白血症、丹吉尔(Tangier)病、克腊比氏(Krabbe)病、异染性脑白质营养不良、法布里氏(Fabry)病、以及代-索二氏(Dejerine-Sottas)综合征；而由毒剂引起的神经病的例子包括那些用化疗剂诸如泰素(taxol)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、或3′-叠氮-3′-脱氧胸苷进行的治疗引起的神经病。

将治疗有效剂量的GDNF分泌细胞或装置施用于患者。“治疗有效剂量”在本文中指产生施用所期效果的剂量或者在特定施用方案中提供治疗效果的量。从本发明细胞系或装置释放出来的GDNF的剂量，是在体内达到对具体受治疾患有效的GDNF浓度所需要的剂量，尽管剂量随GDNF变体的类型、释放的期望持续时间、目标疾病、受试动物物种、和其它因素诸如患者状况而变化。精确剂量将取决于待治疗的病症和植入部位，而且将本领域技术人员能够使用已知技术加以确定。由于原位合成的GDNF与施用的蛋白质制剂相比效力更高，而且从装置持续和局部释放能够获得更好的剂量特性，一般而言，本发明的GDNF分泌细胞系或装置的施用大约每天给予0.01ng GDNF/kg体重到大约100μg/kg，优选0.02ng/kg到10μg/kg、更优选0.03-500ng/kg、最优选0.5ng/kg到100ng/kg。在有些实施方案中，给予0.03-1.0ng/kg、更优选0.1-0.3ng/kg的剂量。另外，正如本领域已知的，根据能力以及体重、一般健康状况、性别、饮食习惯、施药时间、药物相互作用和疾病严重程度进行调整可能是必要的，而且将由本领域技术人员凭常规实验来确定。通常，临床医师将施用本发明的GDNF分泌细胞系或装置，直到达到缓解、修复、维持、和/或任选重建神经元功能的剂量。剂量也可以是预防或减轻神经元变性的预防性剂量。此疗法的进展易于通过常规测定法来监测。

眼科病症

本发明的GDNF释放装置和细胞系可用于治疗眼科病症，诸如记载于US 6,436,427(通过提述并入上述文献)。GDNF已经显示了治疗视网膜病变的潜力，因此在一个优选的实施方案中，本发明的GDNF释放装置用于治疗视网膜病变。

一般而言，将装置植入眼的玻璃体液以得到对视网膜的施用。优选将装置***玻璃体液的面部(pars planum)。

视网膜病变，例如糖尿病性视网膜病变，特征在于血管发生和视网膜变性。视网膜病变包括但不限于糖尿病性视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变、和中毒性视网膜病变。视网膜病变可以通过眼内、优选玻璃体内植入装置来治疗。对此适应证，最优选投递到玻璃体中。可能还希望眼内、优选玻璃体内共投递一种或多种抗血管发生因子。

葡萄膜炎牵涉发炎和继发变性，可能影响视网膜细胞。本发明设想了优选通过玻璃体或前房植入装置来治疗由葡萄膜炎引起的视网膜变性。

相比之下，色素性视网膜炎特征在于原发性视网膜变性。本发明设想了通过眼内、优选玻璃体植入装置来治疗色素性视网膜炎。

年龄相关的黄斑变性牵涉血管发生和视网膜变性。年龄相关的黄斑变性包括但不限于干性年龄相关的黄斑变性、渗出性年龄相关的黄斑变性、和近视性变性。本发明设想了通过眼内、优选玻璃体内植入一个或多个装置和/或眼内或眼周施用一种或多种抗血管发生因子来治疗此病症。

青光眼的特征在于眼压升高和视网膜神经节细胞损失。本发明中所设想的青光眼治疗包括通过眼内、优选玻璃体内植入来投递GDNF，保护视网膜细胞免于青光眼相关损伤。

眼部新血管化是与许多眼部疾病和病症有关的疾患，多数的严重视力损失是由它导致的。例如，我们设想了治疗视网膜缺血相关眼部新血管化，它是糖尿病和许多其它疾病中致盲的主要原因；角膜新血管化，它使患者易于发生角膜移植失败；和与糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、和可能的年龄相关的黄斑变性有关的新血管化。

在本发明的一个实施方案中，将本发明的细胞封装，并通过手术***(在眼球后麻醉下)眼的玻璃体。为了玻璃体安置，可以将装置穿过巩膜植入，使装置的一部分或系绳穿过巩膜向外伸出。最优选的是，将装置整体***玻璃体，没有哪部分装置突出而超过巩膜。优选的是，将装置系到巩膜(或其它合适眼结构)上。系绳可以包含缝合孔或任何其它合适的锚定手段(见例如US 6,436,427)。装置可以在玻璃体中维持实现期望的预防或治疗所必需的时间。此类疗法例如包括促进神经元或光感受器存活或修复，或者抑制和/或逆转视网膜新血管化，以及抑制葡萄膜、视网膜、和视神经炎症。

实施例

实施例1：GDNF的克隆和表达

从尾状核polyA mRNA克隆GDNF

如先前所述(Current Protocols in Molecular Biology)，自尾状核polyAmRNA(Clontech，Becton Dickinson，产品目录编号636132)合成cDNA。基本上如Schaar et al.1994(Exp.Neurol.130，387-393)所述，使用引物rGDNFs(5’-GGTCTACGGAGACCGGATCCGAGGTGC-3’；SEQ ID No 15)和rGDNFas(5’-TCTCTGGAGCCAGGGTCAGATACATC-3’；SEQ ID No 16)通过PCR自cDNA扩增编码长同工型前-原-的片段。将所得PCR产物纯化，并克隆入pCRScript载体(Stratagene)的SrfI位点。随后，将GDNF cDNA片段亚克隆入pNS1n和pCIn.hNGF的BamHI/XhoI位点，分别生成pNS1n.hGDNF和pCIn.hG。pNS1n是衍生自pcDNA3(Invitrogen)的定制载体，在巨细胞病毒启动子的控制下表达，携带neo抗性标记而非zeo(Jensenet al 2002，J Biol Chem，277：41438-41447)。pCIn.hNGF先前已有记载(WO2005/068498)。所克隆GDNF的***片段见图1。

pCIn.hG中从CMV启动子/增强子第一个碱基起至初级转录物(包括GDNF编码序列)末端止的核苷酸序列见SEQ ID NO 1。pNS1n.hGDNF中CMV启动子第一个碱基至初级转录物(包括GDNF编码序列)最后一个碱基的相应序列见SEQ ID NO 17。

细胞系的培养和转染

将ARPE-19细胞(ATCC编号CRL-2302，Dunn KC et al.ARPE-19，Ahuman retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.Exp.EyeRes.62：155-169，1996)在补充有10％FBS(REF Hyclone)的DMEM/F12培养基中(REF Invitrogen)以5％CO₂于37℃进行培养。

转染了pCIn.hG和pNS1n.hGDNF的稳定克隆的分析

为了生成重组细胞克隆，使用FuGENE 6转染试剂(REF Roche)依照制造商的推荐用线性化质粒转染细胞。转染后，重组克隆在补充有G418(REFSigma)的生长培养基中进行选择，并使用常规细胞培养技术进行分离。在生长培养基中接种固定数目的细胞，接着在细胞附着后更换培养基。温育4小时后，除去培养基，并使用DuoSet人GDNF ELISA试剂盒(REF R&DSystems)依照制造商的推荐进行GDNF ELISA分析。ELISA值计算为ngGDNF/10⁵个细胞/24小时。、转染了pCIn.hG和pNS1n.hGDNF的有和无内含子的代表性克隆的GDNF水平分别见图2A(有内含子)和2B(无内含子)。pCIn.hG和pNS1n.hGDNF克隆分别以第一个字母“C”和“N”命名。所有选出的克隆分泌超过50ng GDNF/10⁵个细胞/24小时。

克隆C101(NGC-0301)和C63(NGC-0363)已经根据布达佩斯条约保藏于DSMZ(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，编号分别为DSM ACC2732和DSM ACC2733。

实施例2：来自汇合的稳定克隆的GDNF释放的评估

为了评估稳定克隆的汇合培养物中的GDNF释放的稳定性，在生长培养基中接种固定数目的细胞。次日，将培养基更换成Invitrogen的人内皮无血清培养基(HE-SFM)(目录编号11111-044)或生长培养基。温育4小时后，除去培养基，并使用DuoSet人GDNF ELISA试剂盒(REF R&D Systems)依照制造商的推荐进行GDNF ELISA分析。ELISA值以ng GDNF/ml/24小时计算。让细胞在HE-SFM或生长培养基中生长至汇合，并维持培养长达8周。每周测定4h培养基中的GDNF释放。转染了构建物pCIn.hG和pNS1n.hGDNF的代表性克隆的GDNF水平见图3A和3B。在实验结束时，将细胞用胰蛋白酶处理并计数。图4A显示了HE-SFM中第4周的GDNF释放，以ng GDNF/10⁵个细胞/24小时计算。图4B显示了来自两组构建物的GDNF释放的平均值。

实施例3：ARPE-19细胞所分泌GDNF的加工和糖基化

此实验的目的是在Western印迹分析中分析转染的ARPE-19克隆所分泌的GDNF，以证实所分泌GDNF的糖基化和正确加工。

简而言之，将来自产GDNF的ARPE-19细胞的条件化培养基用脱糖基化反应缓冲液(Prozyme酶促脱糖基化试剂盒#GK80110)稀释至浓度为0.2ng/μl(根据ELISA结果)。将哺乳动物生成的重组hGDNF(R&D Systems#212GD)稀释至相同浓度并用作参照。依照制造商提供的方案3.2和3.3进行有和无变性步骤的脱糖基化。将样品在8-18％梯度SDS凝胶上电泳。将大肠杆菌生成的hGDNF(Alomone Labs#G-240)用作非糖基化GDNF的参照。将蛋白质转移至PVDF膜。将经过封闭的膜与抗GDNF抗体(R&DSystems，No AF-212-NA 1∶500)一起温育，接着与联有HRP的抗山羊抗体(1∶2000)一起温育，并用ECL(Amersham)检测。

结果：

在含有来自产GDNF的ARPE-19细胞(NGC-0301)的条件化培养基的样品中，检测到对应于GDNF单体的一条带。来自R&D Systems的GDNF缺少N-末端的31个氨基酸，因而显示出较低的分子量(图5)。ARPE-19所生成的GDNF的脱糖基化产生分子量为15kDa的GDNF(与大肠杆菌所生成的GDNF相同)，而R&D GDNF的MW为大约12kDa。对应于GDNF单体的条带的分子量显示，ARPE-19细胞所分泌的GDNF是经过糖基化且得到正确加工的。

实施例4：ARPE-19细胞所生成的GDNF在三元复合物形成测定中测出的生物活性

GDNF通过与酪氨酸激酶受体Ret和GDNF特异性共受体GFRα1形成受体复合物来介导胞内信号传导和细胞应答。如先前所述(Sanicola et al.1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：6238-43)测量ARPE-19产生的GDNF形成信号传导受体复合物的能力。简而言之，将GDNF捕捉于包被了GFRα1-Ig的板中。随后，添加Ret与碱性磷酸酶的融合蛋白(Ret-AP)。清洗后，添加AP的底物，并测量显色。细菌生成的人GDNF和哺乳动物生成的人GDNF分别购自Alomone Labs(#G-240)和R&D Systems(#212GD)，用作对照。

结果：

ARPE-19细胞所生成的GDNF形成受体复合物是剂量依赖性的，而且与来自其它来源的GDNF相当(图6)。

实施例5：ARPE-19细胞所生成的GDNF在PC12细胞中测出的生物活性

PC12细胞是表达TrkA的嗜铬细胞瘤细胞，广泛用作NGF诱导的分化的模型***。另外，PC12细胞表达酪氨酸激酶受体Ret。在GDNF特异性共受体GFRα1存在下，GDNF-GFRα1-Ret信号传导复合物的形成导致与NGF-TrkA信号传导相似的细胞应答：生长阻滞、长神经突延长、和与交感神经元相似的表型。内源水平的GFRα1不足以引起显著应答，但是可以通过转染包含GFRα1 cDNA的质粒或者通过添加GFRα1-Ig融合蛋白来得到较高的GFRα1水平。在此实验中，将一个PC12亚克隆用于测试经转染的ARPE-19克隆所生成的人GDNF在GFRα1-Ig(R&D Systems#714-GR)存在时的生物活性。将哺乳动物所生成的重组hGDNF(R&D Systems#212GD)和大肠杆菌所生成的重组hGDNF(Alomone Labs#G-240)用作阳性对照。

在T75烧瓶中接种亲本ARPE-19细胞和产GDNF的克隆(3x10⁶个细胞/烧瓶)。次日，将细胞换至预热的无血清DMEM。24小时后，收集条件化培养基，并离心(3000xG，5分钟)以除去细胞碎片。依照制造商的说明，通过GDNF DuoSet ELISA(R&D Systems#DY212)测定条件化培养基中的GDNF浓度。根据ELISA结果调整R&D Systems GDNF和Alomone GDNF的浓度。

将PC12细胞在含4.5g/l葡萄糖和glutamax(Life Technologies#32430-027)及7.5％供体马血清(Life Technologies#16050-098)和7.5％FBS(Life Technologies#10099-141)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中在5％CO₂存在下于37℃进行培养。每2-3天更换培养基，并通过轻敲烧瓶并分配到新的烧瓶中，将细胞1∶3-1∶6传代培养每周两次。

对于存活测定，将PC12细胞在含血清的培养基中以25,000个细胞/cm²(2x10⁴个细胞/孔)的密度接种到包被了胶原的48孔培养皿中。次日，将来自亲本ARPE-19细胞的条件化培养基在无血清DMEM中1∶2稀释。用培养基制备来自条件化培养基的GDNF以及来自R&D Systems和AlomoneLabs的GDNF的稀释液。将GDNF稀释液与1μg/ml Add GFRα1-Ig一起添加至PC12细胞。将细胞温育3天，并通过依照制造商的指示实施MTS测定(Promega#G5430)来测定细胞存活。

结果：

ARPE-19细胞所生成的GDNF以剂量依赖性方式提高了MTS的降低幅度。ARPE-19所生成的GDNF的生物活性至少与来自其它来源的GDNF一样高(图7)。

实施例6：供CNS用的装置的制备

用外径为800-1000μm、壁厚为大约100μm的聚砜(PS)、或聚醚砜(PES)或等效的聚合物中空纤维膜制作装置。由聚乙烯醇(PVA)海绵、聚乙烯(PET)纱或类似材料构成，并***膜纤维腔中的支架材料，确保了适宜的细胞分散和细胞附着。最后，用聚氨酯(PU)或等效材料制成，固定于装置末端的系绳，提供了在植入后收回装置的手段。

用于临床前测试(在大鼠中)的装置的长度为大约5-7mm。设想用于植入人脑的装置的长度为大约5-20mm。

细胞装载通过在远离系绳的末端附着于中空纤维装置的集线段(hubsegment)和端口(port)来进行。将以单细胞悬浮液形式制备的GDNF细胞注入端口，收回集线段，并用胶水将注入孔密封。对于每mm装置长度，装载了大约10,000个GDNF表达细胞。将装置维持在培养基中直至使用。

用以下材料制成供植入大鼠脑用的装置：

膜：PS装置：聚砜中空纤维膜(PS90/700，Minntech Corp，Minneapolis，Minnesota，USA)，分子量截留值为90kDa。尺度：内径为700μm+/-50μm，壁为100μm+/-20μm。PES装置：聚醚砜：来自Akzo Nobel的PES5，分子量截留值为280kDa。尺寸：内径为520μm+/-50μm，壁为100μm+/-20μm。将中空纤维切成大约5mm(PS装置)和7mm(PES装置)的长度。

泡沫：PS装置：PVA泡沫，产品编号160LD，来自Hydrofera Inc，Cleveland，Ohio，USA。PES装置：Clinicel海绵，来自M-PACT，Eudora，Kansas，USA)。将PVA泡沫切成适合中空纤维的内径。

装载管：全氟烷氧基共聚物。尺寸：PS装置：内径(ID)为.0037”+/-.0005”，壁为.005”+/-.001”。PES装置：内径为410μm+/-50μm，壁为45μm+/-5μm。二者都来自Zeus Industrial Products，Orangeburg，SouthCarolina，USA。将装载管一段胶合至中空纤维，另一端胶合至集线段。

集线段：产品编号P/N 02030200 Rev 1，Abtec，Bristol，PA，USA。

用于将装载管胶合至集线段的胶水：Dymax 201-CTH(Diatom，Hvidovre，Denmark)。

用于中空纤维的胶水：PS装置：Dymax 1181-M。PES装置：Dymax1188-M。

在受控环境中组装装置，包装到Falcon 15mL聚丙烯试管(BectonDickinson，Cat#352096)中，暴露于环氧乙烷进行灭菌，然后装填细胞。

实施例7：封装的产GDNF的ARPE-19细胞克隆的体外测试

如上所述在生长培养基中扩增细胞。封装前一天，将细胞用胰蛋白酶消化，计数，并在生长培养基中重新接种。即将封装前，将细胞用胰蛋白酶消化，计数，清洗，并重悬于人内皮无血清培养基(HE-SFM，Invitrogen)中。将悬浮液在整个实验期间保持在室温。依照实施例6中的说明制作装置。使用Hamilton注射器将细胞小心地注入装置。对于实验装置，将8μl的50,000个细胞注入每个装置。封装细胞并密封装置后，将装置转移至HE-SFM。将剩余细胞接种在常规细胞培养皿中的生长培养基中以证实细胞生存力。在整个实验期间，将装置维持在HE-SFM中、37℃/5％CO₂。在所需的时间点采集样品供用于GDNF ELISA：将装置在HE-SFM中清洗，随后在1ml HE-SFM中温育4小时。使用DuoSet人GDNF-ELISA(R&DSystems)测量所释放的GDNF。每个装置所分泌的GDNF的量见图8。

体外14天后，将装置使用标准组织学技术在低聚甲醛中固定，包埋和切片，并进行曙红/苏木精染色。测定装置切片的细胞存活。装置切片证明体外存活优良。

实施例8：封装的GDNF产ARPE-19的细胞克隆的体内测试

植入前14天，如实施例6中所述封装细胞。封装克隆C11、C63、C71、C74、C101和克隆N2的样品。将封装细胞维持在HE-SFM中、37℃/5％CO₂条件下直到植入。将一批装置在体外维持10周。如别处所述每周两次测量GDNF释放(1小时的)。与GDNF释放测量一起更换培养基。体外2周后，将一批装置植入大鼠脑。

将在12小时亮：暗循环、自由获取鼠粮和水条件下笼养的成年、220克雌性Sprague-Dawley大鼠用于植入手术。在以下相对于前囟点的坐标所描述的部位，将装置双侧植入异氟烷麻醉的(1.5-2％)动物的纹状体：AP：0.0，ML：+/-3.2，DV：-8，TB：3.3。手术后，隔周评估一般行为并监测体重。植入后8周，将动物去头。将装置从脑中取出，并在PBS中漂洗一次。将PBS换成1ml无血清培养基并温育，以进行如上所述的GDNF释放测量。随后将装置在4％低聚甲醛中固定，并通过苏木精/曙红染色处理用于组织学分析。将脑解剖出来，在冷盐水中漂洗1分钟，然后在4％低聚甲醛中制备并于4℃浸泡固定过夜。然后将脑转移到25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液中，48小时后，在冷冻切片机上切出40μm切片。随后处理脑切片供一般形态学用(苏木精/曙红，甲酚紫)。

大鼠的体重和行为是正常的，而且在不同处理间没有不同。

图10所示结果显示了，PS和PES装置组中正常大鼠于8周后均有显著的细胞存活。外植装置的GDNF分泌像植入前分泌一样高，而且似乎从PES装置(图9A)的分泌高于从PS装置的分泌(图9B)。

实施例9：装置的鞘内植入

可以沿椎管进行鞘内植入，优选在低于脊髓圆锥(例如在人类中的)的腰部水平进行。在腰部水平做一小切口，并用脊髓穿刺针进入鞘内空间。建立CSF流后，将导线***鞘内空间，并用扩张***进入间隙。取回导线，并将封装装置***间隙，使得活性部分完全封入CSF隔室。将系绳通过不可再吸收缝合线、优选使用固定夹(securing clip)固定于腰部筋膜。使用标准手术规程缝合皮肤。

实施例10：人纹状体结构中的植入

在全身麻醉或局部麻醉和镇静下，将神经手术立体支架(stereotacticframe)固定至患者头部。运用基准盒(fiducial box)和后续MRI成像来确定解剖区域和植入坐标。也可以通过弥散张量成像(diffusion tensor imaging)和利用定制软件和导航设备(BrainLAB AG)绘图来引到植入。接着将患者带至手术室，在那里将他/她做好准备并盖上布帘。根据立体图像资料，在额侧(frontolaterally)做一小皮肤切口，并做一穿过头骨的小孔(burrhole)。切穿硬膜和下面的脑膜，并将带套管针的引导套管***壳核和尾状核目标区域。取出套管针，并将装置滑入位置。取出导管，并将装置系绳用钛板或定制固定夹系至头骨。可以将一个或多个装置***同一结构。用断续的3-0尼龙缝合线缝合皮肤。在对侧重复此规程。

序列表

<110>Ns基因公司(NsGene A/S)

<120>用于投递GDNF的可植入式生物相容性免疫绝缘性媒介物

<130>P541PC00

<150>DK PA 2005 01497

<151>2005-10-28

<150>US 60/730,852

<151>2005-10-28

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1952

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pCIn.hG

<220>

<221>增强子

<222>(1)..(659)

<223>CMV立即早期增强子

<220>

<221>启动子

<222>(669)..(750)

<223>CMV立即早期启动子

<220>

<221>前体_RNA

<222>(735)..(1952)

<223>初级转录物

<220>

<221>内含子

<222>(890)..(1022)

<223>pCI嵌合内含子

<220>

<221>CDS

<222>(1154)..(1789)

<223>GDNF

<400>1

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660

cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780

agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840

gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900

ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960

cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020

aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact 1080

ataggctagc gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccgaggtg ccgccgccgg 1140

acgggacttt aag atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg 1189

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val

1 5 10

ctg ctc cac acc gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg cct 1237

Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro

15 20 25

ccc gag gcg ccc gcc gaa gac cgc tcc ctc ggc cgc cgc cgc gcg ccc 1285

Pro Glu Ala Pro Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro

30 35 40

ttc gcg ctg agc agt gac tca aat atg cca gag gat tat cct gat cag 1333

Phe Ala Leu Ser Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln

45 50 5 560

ttc gat gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa 1381

Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys

65 70 75

agg tca cca gat aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg aat 1429

Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn

80 85 90

cgg cag gct gca gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt cgg 1477

Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg

95 100 105

aga ggc cag agg ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata cat 1525

Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His

110 115 120

tta aat gtc act gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg 1573

Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu

125 130 135 140

att ttt agg tac tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg tac 1621

Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr

145 150 155

gac aaa ata ttg aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt gac 1669

Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp

160 165 170

aaa gta ggg cag gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg 1717

Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu

175 180 185

tcg ttt tta gat gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc 1765

Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser

190 195 200

gct aaa agg tgt gga tgt atc tga ccctggctcc agagagggct agagcggccg 1819

Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

205 210

ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 1879

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 1939

actgtccttt cct 1952

<210>2

<211>211

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>2

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

20 25 30

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

50 55 60

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

65 70 75 80

Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

100 105 110

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

130 135 140

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

165 170 175

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

180 185 190

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

195 200 205

Gly Cys Ile

210

<210>3

<211>836

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(201)..(833)

<220>

<221>成熟_肽

<222>(432)..(833)

<400>3

ccgcctccag cgcgcccttg ctgccccgcg cgaccccagg attgcgaact cttgcccctg 60

acctgttggg cggggctccg cgctccagcc atcagcccgg atgggtctcc tggctgggac 120

ttggggcacc tggagttaat gtccaaccta gggtctgcgg agacccgatc cgaggtgccg 180

ccgccggacg ggactttaag atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg 233

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu

-75 -70

gtg ctg ctc cac acc gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg 281

Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg

-65 -60 -55

cct ccc gag gcg ccc gcc gaa gac cgc tcc ctc ggc cgc cgc cgc gcg 329

Pro Pro Glu Ala Pro Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala

-50 -45 -40 -35

ccc ttc gcg ctg agc agt gac tca aat atg cca gag gat tat cct gat 377

Pro Phe Ala Leu Ser Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp

-30 -25 -20

cag ttc gat gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg 425

Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu

-15 -10 -5

aaa agg tca cca gat aaa caa atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg 473

Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg

-1 1 5 10

aat cgg cag gct gca gct gcc aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt 521

Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly

15 20 25 30

cgg aga ggc cag agg ggc aaa aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata 569

Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile

35 40 45

cat tta aat gtc act gac ttg ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa 617

His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu

50 55 60

ctg att ttt agg tac tgc agc ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg 665

Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr

65 70 75

tac gac aaa ata ttg aaa aac tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt 713

Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser

80 85 90

gac aaa gta ggg cag gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac 761

Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp

95 100 105 110

ctg tcg ttt tta gat gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat 809

Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His

115 120 125

tcc gct aaa agg tgt gga tgt atc tga 836

Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130

<210>4

<211>211

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>4

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

-75 -70 -65

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

-60 -55 -50

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

-45 -40 -35 -30

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

-25 -20 -15

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

-10 -5 -1 1

Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

5 10 15

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

20 25 30 35

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

40 45 50

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

55 60 65

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu

70 75 80

Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

85 90 95

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

100 105 110 115

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

120 125 130

Gly Cys Ile

<210>5

<211>3509

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(131)..(763)

<220>

<221>成熟_肽

<222>(362)..(763)

<400>5

cggggccccg cgctcctgcc cgaggtccgg atgggtctcc tggatgggat tcgggccact 60

tggagttaat gtccaactgg gggtctacgg agaccggatc cgaggtgccg ccgccggacg 120

ggactctaag atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ttg 169

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu

-75 -70 -65

ctc cac acc gcg tct gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg ctt ctc 217

Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu

-60 -55 -50

gaa gcg ccc gct gaa gac cac tcc ctc ggc cac cgc cgc gtg ccc ttc 265

Glu Ala Pro Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe

-45 -40 -35

gcg ctg acc agt gac tcc aat atg cct gaa gat tat cct gac cag ttt 313

Ala Leu Thr Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe

-30 -25 -20

gat gac gtc atg gat ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg 361

Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg

-15 -10 -5 -1

tca cca gat aaa caa gcg gca gcg ctt cct cga aga gag agg aat cgg 409

Ser Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

1 5 10 15

cag gct gca gct gcc agc cca gag aat tcc aga ggg aaa ggt cgc aga 457

Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

20 25 30

ggc cag agg ggc aaa aat cgg ggg tgc gtt tta act gcc ata cac tta 505

Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu

35 40 45

aat gtc act gac ttg ggt ttg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg atc 553

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

50 55 60

ttt cga tat tgc agc ggt tcc tgt gaa tcg gcc gag aca atg tat gac 601

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ser Ala Glu Thr Met Tyr Asp

65 70 75 80

aaa ata cta aaa aac ctg tct cgg agt aga agg cta aca agt gac aaa 649

Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys

85 90 95

gta ggc cag gca tgt tgc agg ccg gtc gcc ttc gac gac gac ctg tcg 697

Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

100 105 110

ttt tta gat gac aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc gct 745

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala

115 120 125

aaa cgg tgt gga tgt atc tgaccccggc tccagagact gctgtgtatt 793

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130

gcattcctgc tacagtgcga agaaagggac caaggttccc aggaaatgtt tgcccagagt 853

ggaagataag gaccaagatg gcggaggcag aggcagaaga agagaaaaag aaggaggaag 913

gtagccaccg tgggagcctg gtggaagaag gcccagctac agaaaactgg ataggagtga 973

gaacagccgt ctgagcactt cagggtggca gctgatgtca ccagaagctc agggctggtg 1033

tccttactta gctgttggca gtgtttatct gatacagtcc atggtcaccg atggcggtcc 1093

gagtcgtgga tgcatgcaaa gaaccaagcc agtgtatctc ctgtggtttg ttttcacgtg 1153

tttgaagacg ccagggaaat gtgacgattc cggtgtcacc tcttgtcact acattttact 1213

gctgaaaata agaaagatgt attttcctgt cactcaatgg attcataccc tggaaaggaa 1273

agggggtggg gaggacaaag gcagagacga taaaaagatg acaacctttg aatttgaaaa 1333

ccggggcctg aggtctatta catccagcat tttgggggac gcttggtggt tgattctgga 1393

cacagagtgt gggggtatgg agaagttggc taggaaccca aaaaaggctg tcctcatact 1453

tagaaacaaa cctggaggca tctccttcgt gccctcagaa acaggaagca agttgtggtt 1513

ttcggcagca ttctcatagg agagccaatg gggaaagccc ccagctgccc cggccaggga 1573

gaccccgggg cctgttggtt tacaaagacg gatgttacat acacagctcc gttcatgcgt 1633

ggtcaccagt gaccacagaa gctcctcgat gcaatgcatc tgtttcaaat acagagatat 1693

agagaagata tttattgaga ttttaagtta ttattattta ttaccattca ctaatgaata 1753

tcttttttct tcccttattt attaaagtct cttttcaaag gtgccaaagt atatgtgctc 1813

acaaaataca aaggtgacag aggaaatatt aacattgaga acgagggtcc attctcttca 1873

gagtataaga gggtttttgc tagccaaaaa atcacttact ttataaggca gtccttcact 1933

aactgccaca gatttcagca tttccctccc cctctttctg tggacaggat ctcctgtagc 1993

ctaggctgac cttgaactta ctgcttggtc aaggacgacc ttggccttct gatcctctga 2053

cttcctgtgg tcttggcatg gcagacatca atcacaccgt atccacagga ctaagtatag 2113

aattcagggc ttcatccatg ccaggcaact gtaggtacca actgggttac acccagcccc 2173

tgctttctat ctgctaaagg aaagggtcag gagggccatc tcagctccac cccctcactg 2233

ggagtaccag tgggactgcc acctgtttgc atctcctctt ctatccatct gagcagcaag 2293

gccccagctc cactgcccat tgagttcaac tctttttccc ccttcatcat gggcaatatc 2353

ataaccacgc attcagaagg ctgaactgcc cttggaagcc ctgaacatat tgtcacctga 2413

aagtgcaatg aaggcccctg acaggcagcc agggtttaac agccccctca ccccccgggg 2473

gaggtggtac ctcttcctct atccttgccc acctgcttcg tccctatggt tacacagaca 2533

ggagaacata ggggaactgt gcagggagag gccatctgcc ttgtcctttg ccagggctca 2593

gttgtcacct gggctcaact tttgctaccc cctcaaaccc aatggattcc aaggagaaag 2653

atggacagga agagacatct gactggccat agaacaaaga agaggccctc cctcattgtt 2713

tggagggaag aagcagaggg tgggaatggc aactctccct gcaccccata atgtccttgt 2773

ctggcagcca acaaacaggt catgccttga gtcctatgtt agagccttga gtcctatgtt 2833

acagatttca taaatggaat ttttatgtag aagttaatgt atcactccct ttgtggctgc 2893

tatcccccgc ccccagagta ggacagatag atctaaaata ataaatgacc aattaattgg 2953

cctctctcga atagtcatgt caaattttca aagtaaccaa gaggtaaaag ttactaggta 3013

tcctttcccc ttccgtggcc ctaaagaccc acgtttcgca tggttccaca ccccctgcag 3073

gactgggaag tggagctacg tatgcgctgc tctctccgct cctcctgctc aaaattgtga 3133

caacctcagc tgcccagcac atttcagatg tcgttccaga ccctctgttc actccagaga 3193

atcctgaaag atgtggtagc tgatgctccc aggtccagac acagcctcta gctcttgggg 3253

gaatccctgg agaactcagc atctcgagca ggttcgaatg ggagcaggct gccccaccca 3313

gtccgcagca gggtaaagtt tgcgacggtt ctttactgtt gtgatcagca tctgccccag 3373

taaagagcac acttctttgg aagttctgac ctctctgatg tctcggtcgt ttgtgttata 3433

caaccaaagt tctctacaaa ctttattttt gtacaatatc attttgtaac tttttacaaa 3493

taaaagctca tttcta 3509

<210>6

<211>211

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

-75 -70 -65

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro

-60 -55 -50

Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr

-45 -40 -35 -30

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

-25 -20 -15

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

-10 -5 -1 1

Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

5 10 15

Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

20 25 30 35

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

40 45 50

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

55 60 65

Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ser Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu

70 75 80

Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val Gly Gln

85 90 95

Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

100 105 110 115

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

120 125 130

Gly Cys Ile

<210>7

<211>700

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221>CDS

<222>(50)..(682)

<220>

<221>成熟_肽

<222>(281)..(682)

<400>7

ggtctacgga gaccggatcc gaggtgccgc cgccggacgg gactctaag atg aag tta 58

Met Lys Leu

-75

tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ttg ctc cac acc gcg tct gcc 106

Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala

-70 -65 -60

ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg ctt ctc gaa gcg ccc gcc gaa gac 154

Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp

-55 -50 -45

cac tcc ctc ggc cac cgc cgc gtg ccc ttc gcg ctg acc agt gac tcc 202

His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr Ser Asp Ser

-40 -35 -30

aat atg ccc gaa gat tat cct gac cag ttt gat gac gtc atg gat ttt 250

Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe

-25 -20 -15

att caa gcc acc atc aaa aga ctg aaa agg tca cca gat aaa caa gcg 298

Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Ala

-10 -5 -1 1 5

gcg gca ctt cct cga aga gag agg aac cgg caa gct gca gct gcc agc 346

Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser

10 15 20

cca gag aat tcc aga ggg aaa ggt cgc aga ggc cag agg ggc aaa aat 394

Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn

25 30 35

cgg ggg tgc gtc tta act gca ata cac tta aat gtc act gac ttg ggt 442

Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly

40 45 50

ttg ggc tac gaa acc aag gag gaa ctg atc ttt cga tat tgt agc ggt 490

Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly

55 60 65 70

tcc tgt gaa gcg gcc gag aca atg tac gac aaa ata cta aaa aat ctg 538

Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu

75 80 85

tct cga agt aga agg cta aca agt gac aag gta ggc cag gca tgt tgc 586

Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys

90 95 100

agg ccg gtc gcc ttc gac gac gac ctg tcg ttt tta gac gac agc ctg 634

Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu

105 110 115

gtt tac cat atc cta aga aag cat tcc gct aaa cgg tgt gga tgt atc 682

Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

120 125 130

tgaccctggc tccagaga 700

<210>8

<211>211

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>8

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

-75 -70 -65

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro

-60 -55 -50

Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr

-45 -40 -35 -30

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

-25 -20 -15

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

-10 -5 -1 1

Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

5 10 15

Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

20 25 30 35

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

40 45 50

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

55 60 65

Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu

70 75 80

Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val Gly Gln

85 90 95

Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

100 105 110 115

Asp Ser Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

120 125 130

Gly Cys Ile

<210>9

<211>134

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>9

Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

20 25 30

Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu

35 40 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys

85 90 95

Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala

115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130

<210>10

<211>134

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

Ser Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

20 25 30

Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu

35 40 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ser Ala Glu Thr Met Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys

85 90 95

Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala

115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130

<210>11

<211>134

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>11

Ser Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg

1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

20 25 30

Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu

35 40 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys

85 90 95

Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala

115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130

<210>12

<211>95

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>12

Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser

35 40 45

Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg

50 55 60

Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val

65 70 75 80

Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

85 90 95

<210>13

<211>95

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>13

Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Glu Ser Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser

35 40 45

Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg

50 55 60

Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val

65 70 75 80

Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

85 90 95

<210>14

<211>95

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>14

Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser

35 40 45

Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg

50 55 60

Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val

65 70 75 80

Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

85 90 95

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>15

ggtctacgga gaccggatcc gaggtgc 27

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>16

tctctggagc cagggtcaga tacatc 26

<210>17

<211>1752

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pNS1n.hGDNF

<220>

<221>启动子

<222>(198)..(851)

<223>CMV启动子

<220>

<221>前体_RNA

<222>(813)..(1752)

<223>初级转录物

<220>

<221>CDS

<222>(953)..(1585)

<223>GDNF

<400>17

agatctcccg atcccctatg gtcgactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 60

agccagtatc tgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg agtagtgcgc gagcaaaatt 120

taagctacaa caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg 180

cgttttgcgc tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact 240

agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 300

gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 360

acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 420

tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 480

agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 540

atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 600

atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 660

tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 720

gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 780

cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg 840

cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg tttaaactta 900

agcttggtac cgagctcgga tccgaggtgc cgccgccgga cgggacttta ag atg aag 958

Met Lys

1

tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc gcg tcc 1006

Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser

5 10 15

gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg cct ccc gag gcg ccc gcc gaa 1054

Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro Ala Glu

20 25 30

gac cgc tcc ctc ggc cgc cgc cgc gcg ccc ttc gcg ctg agc agt gac 1102

Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser Ser Asp

35 40 45 50

tca aat atg cca gag gat tat cct gat cag ttc gat gat gtc atg gat 1150

Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp

55 60 65

ttt att caa gcc acc att aaa aga ctg aaa agg tca cca gat aaa caa 1198

Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln

70 75 80

atg gca gtg ctt cct aga aga gag cgg aat cgg cag gct gca gct gcc 1246

Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala

85 90 95

aac cca gag aat tcc aga gga aaa ggt cgg aga ggc cag agg ggc aaa 1294

Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys

100 105 110

aac cgg ggt tgt gtc tta act gca ata cat tta aat gtc act gac ttg 1342

Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu

115 120 125 130

ggt ctg ggc tat gaa acc aag gag gaa ctg att ttt agg tac tgc agc 1390

Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser

135 140 145

ggc tct tgc gat gca gct gag aca acg tac gac aaa ata ttg aaa aac 1438

Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn

150 155 160

tta tcc aga aat aga agg ctg gtg agt gac aaa gta ggg cag gca tgt 1486

Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys

165 170 175

tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt tta gat gat aac 1534

Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn

180 185 190

ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa agg tgt gga tgt 1582

Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys

195 200 205 210

atc tgaccctggc tccagagagg gctagagcgg ccgctcgagt ctagagggcc 1635

Ile

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 1695

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttccta 1752

<210>18

<211>211

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>18

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

20 25 30

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

50 55 60

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

65 70 75 80

Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

100 105 110

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

130 135 140

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

165 170 175

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

180 185 190

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

195 200 205

Gly Cys Ile

210

PCT/RO/134表

申请人或代理人档案号P541PC00

国际申请号PCT/DK2006/000596

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)

Claims

1.一种生物相容性装置，其包括：含有人类细胞组合物的内部核心，该人类细胞包含编码GDNF的异源表达构建物；和包围所述细胞组合物的半透膜，该膜允许GDNF的扩散，其中所述人类细胞来自一种细胞系。

2.权利要求1的装置，其中所述细胞系是单克隆细胞系。

3.权利要求1的装置，其中所述细胞转染了非病毒表达构建物。

4.权利要求1的装置，其中所述表达构建物是质粒。

5.权利要求1的装置，其中所述人类细胞是接触抑制性细胞。

6.权利要求1的装置，其中所述细胞能够进行吞噬。

7.权利要求1的装置，其中所述细胞是非致瘤的。

8.权利要求1的装置，其中所述细胞已经通过***异源永生化基因进行了永生化。

9.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系尚未通过***异源永生化基因而永生化。

10.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系在哺乳动物中、优选在人类中是非致瘤的。

11.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系能够在低氧张力、诸如在低于5％、更优选低于2％、更优选低于1％的氧张力存活。

12.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系源自原代培养物。

13.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系能够进行至少50次、更优选至少60次、更优选至少70次、更优选至少80次、更优选至少90次、更优选至少100次倍增。

14.前述权利要求任一项的装置，其中所述细胞系触发低水平的人类宿主免疫反应，优选其中与非人动物中相比，人类中的人类抗体和/或补体依赖性细胞毒性较低。

15.权利要求1的装置，其中所述细胞衍生自上皮细胞。

16.权利要求15的装置，其中所述上皮细胞是视网膜色素上皮细胞。

17.权利要求1的装置，其中所述表达构建物在转录物中包含内含子。

18.权利要求17的装置，其中所述内含子位于转录物的5’UTR中。

19.权利要求1的装置，其中所述装置能够分泌超过1ng GDNF/24小时。

20.权利要求1的装置，其含有10,000-100,000细胞/μL、更优选15,000-50,000细胞/μL、更优选20,000-30,000细胞/μL装置。

21.权利要求1的装置，其具有至少0.5μL、优选至少1μL的体积。

22.权利要求1的装置，其含有实质性少于10⁴个细胞/胶囊、诸如少于1000个细胞/胶囊、例如少于100个细胞/胶囊、诸如少于50个细胞/胶囊、例如少于10个细胞/胶囊、诸如少于5个细胞/胶囊。

23.权利要求1的装置，其具有少于250μm，诸如少于150μm、例如少于100μm、诸如少于50μm、例如少于25μm的直径。

24.权利要求1的装置，其中所述核心包括细胞的支持物。

25.权利要求1的装置，其中所述半透膜能够防止核心中的细胞与装置外的细胞之间的细胞-细胞接触。

26.权利要求25的装置，其中所述膜具有300kDa或更小的分子量截留值。

27.权利要求1的装置，进一步包括系绳。

28.权利要求1的装置，进一步包括缝合孔。

29.权利要求1的装置，其含有可从保藏在DSMZ、编号DSMACC2732或DSM ACC2733的细胞系得到的细胞。

30.衍生自一种细胞系的人类细胞的组合物，其中所述细胞包含编码GDNF的异源表达构建物。

31.权利要求30的组合物，其中所分泌的GDNF具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列。

32.权利要求30的组合物，其含有可从保藏在DSMZ、编号DSMACC2732或DSM ACC2733的细胞系得到的细胞。

33.权利要求30的组合物，其中所述细胞是在支持物-基质上培养的。

34.治疗帕金森氏病的方法，包括将至少一个依照权利要求1-29任一项的装置或依照权利要求30-33任一项的细胞组合物植入有所需要的受试者的壳核和纹状体结构。

35.治疗肌萎缩侧索硬化的方法，包括将至少一个依照权利要求1-29任一项的装置或依照权利要求30-33任一项的细胞组合物植入有所需要的受试者的鞘内空间和/或脊髓。

36.治疗亨庭顿氏病的方法，包括将至少一个依照权利要求1-29任一项的装置或依照权利要求30-33任一项的细胞组合物植入有所需要的受试者的壳核和纹状体结构。

37.治疗视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、青光眼、眼部新血管化或视网膜变性的方法，包括将至少一个依照权利要求1-29任一项的装置或依照权利要求30-33任一项的细胞组合物植入有所需要的受试者的眼。