CN101348570A

CN101348570A - 一种星型共聚物自组装纳米胶束的制备方法

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Publication number: CN101348570A
Application number: CNA2008101070542A
Authority: CN
Inventors: 刘云海; 曹小红; 乐长高; 罗明标
Original assignee: East China Institute of Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology; East China Institute of Technology
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2008-09-03
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2028-09-03
Also published as: CN101348570B

Abstract

一种星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：制备端基为羧基的聚甲基丙烯酸甲酯∶制备三臂聚合物tri－arm P(NIPAAm－co－DMAEMA)∶以铈－醇组成的氧化还原体系为引发剂，将单体N－异丙基丙烯酰胺和N，N－二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯进行自由基共聚合；制备星形共聚物，将上述制得的星形两亲共聚物溶于透析袋中，置入蒸馏水中进行透析，得到共聚物胶束。本发明星型聚合物胶束做为一种药物载体，能够通过利用外部的或体内固有的环境的变化而达到在病理区域的药物靶向释放，提高药物治疗效率。

Description

一种星型共聚物自组装纳米胶束的制备方法

背景技术

在过去的十年中，两亲共聚物不仅在基础科学领域，而且在生物医药领域，特别是在药物运载体系中，已经吸引了人们众多的关注。在选择性溶剂中，两亲嵌段共聚物能够自组装形成多种形态的纳米聚集体，尤其是由疏水性的内核及亲水性的外壳所组成的球形聚合物胶束，在药物载体***中有着重要的应用。在用于药物载体***的核-壳型聚合物胶束中，疏水性的内核可以作为一个纳米容器用来装载疏水性的药物，而亲水性的外壳则起到有效的空间保护防止胶束间的聚集，另外还可能对亲水外壳进行修饰增加靶向或其它功能基团。与传统的表面活性剂形成的胶束相比较，聚合物胶束具有高得多的热力学稳定性。聚合物胶束的低临界胶束浓度(CMC)比传统的表面活性剂胶(10^-3-10^-4mol/L)束低大约1000倍。同样的，聚合物胶束还有许多的优点：如制备方法简便易行；无须对装载药物进行修饰即可获得较高的包封率；在体内慢性积累的风险较小以及易于实现对药物释放行为的控制等。与粒子尺寸较大的其它药物载体相比较，由于聚合物胶束在水溶液中的尺寸较小(＜200nm)，不但可以减小网状内皮吞噬***(RES)对其的非特异性吸收，还可以利用非选择性滞留效应(EPR effect)，从而实现对抗癌药物的选择性传递作用。如上所述，目前，聚合物胶束被认为是极有前景的药物传递***(DDSs)之一。

药物载体的主要目的是为了能够控制和调节药物在体内的分布。由于在不同组织或器官的许多病理区域(如发炎，肿瘤和外伤等)都会表现出区域的温度升高(2-5℃)或者是pH下降(1-2.5个pH单位)，并且在实体肿瘤区域进行定位加热的技术已有应用，刺激响应(如温度或环境pH等)激发的药物载体的应用将会是增强病理区域药物活性的有效途径。通过化学设计可以很容易地制备刺激敏感的聚合物胶束。通常，这一类聚合物是由温度或pH敏感的链段所构成，如聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯(PDMAEMA)以及它们的共聚物等。

在过去的几年中，研究者都对基于PNIPAAm的温度响应聚合物胶束进行了研究。Yokoyama等报道了由温度响应的Poly(NIPAAm-co-DMAAm)链段作为亲水嵌段，生物可降解的聚乳酸(poly(D，L-lactide))，聚己内酯(poly(ε-caprolactone))或者乳酸与己内酯的共聚物(poly(D，L-lactide-co-ε-caprolactone))作为疏水链段的共聚物胶束。这些共聚物胶束能够装载抗癌药阿霉素(doxorubicin)，并表现出了温度响应的药物释放行为。同样的，基于PNIPAAm的两亲嵌段聚合物PSt-b-PNIPAAm和PBMA-b-PNIPAAm的合成也有文献报道。这一类共聚物胶束在水溶液中，对应于重复的温度变化显示出了可逆的分散/聚集行为。研究者希望这些共聚物胶束不但能够利用EPR效应在体内显示空间的选择性，而且能够通过定位加热的方法增强聚合物胶束在靶向区域的保持能力。Yang等合成了不同组成的poly(NIPAAm-co-DMAAm)-b-poly(D，L-lactide-co-glycolide)嵌段共聚物，并研究了共聚物胶束的温度敏感性及其对阿霉素的释放行为。Zhang等报道了数种具有独特结构的基于PNIPAAm的自组装聚合物胶束，包括一种星型的嵌段共聚物^[27]和“Y”型的共聚物。由于它们具有独特的胶束结构，这些聚合物都显示出了较高的药物包封率以及独特的温度响应药物释放行为。他们的研究也表明，通过选择合适的共聚物结构能够有效的控制相应的药物运载体系的药物释放动力学特性，如药物的包封效率和药物的释放速率等。

另一方面，基于PEG和甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸丙酯或者丙烯酸丁酯的pH敏感嵌段共聚物的聚合物胶束也已用于对药物candesartan cilexetil(CDN)的装载和控制释放。Leroux的小组报道了这些共聚物能够自组装形成胶束，并且显示出对CDN的高载药率和pH依赖型的药物释放模式。Yang的工作小组报道了基于两嵌段共聚物poly(2-ethyl-2-oxazoline)-b-poly(L-lactide)的共聚物胶束。他们的实验结果显示，在通常的生理条件下(pH 7.4)聚合物胶束的结构能够保持疏水药物DOX，当聚合物胶束感受到类似于细胞内的pH变化(内涵体和溶酶体中约为pH 4~5)时，能够选择性的释放DOX。Bae的研究小组开发了一种pH敏感的肿瘤定位聚合物胶束，该胶束由共聚物poly(L-lacticacid)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-histidine)自组装形成。他们推断该聚合物胶束在水溶液中能够形成以PLA和polyHis链段为疏水内核，以PEG链段为外壳的“花”状(flower-like)胶束。聚合物胶束的pH敏感性来源于当环境轻微酸化，polyHis链段发生离子化，所引起的胶束的疏水内核的解离。这一机理就为聚合物胶束经历微小的pH变化(pH 7.2-6.5)而触发聚合物胶束释放装载药物提供了可能性。

近来，为了提高药物载体的靶向定位能力和治疗效率，人们制备了许多具有双刺激响应的药物载体。人们合成了一种胆固醇接枝的共聚物poly(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)，并且用于包封水溶性极差的抗癌药物，紫杉醇(paclitaxel)。基于该胆固醇接枝聚合物的载药胶束显示出了一种极为有用的pH相关的温度响应特性，而且在pH 5.0的环境下其药物释放速率显著高于在pH 7.4的环境下，有利于抗癌药物在肿瘤区域的定位释放。Zhang的研究小组开发了基于十一烯酸和NIPAAm的温度、pH双响应共聚物poly(UA-b-NIPAAm)，并作为药物载体对疏水药物强的松(prednisone acetate)进行包封。该药物载体***表现出了显著的温度响应的控制释放行为和独特的pH响应药物释放行为。Jiang的研究小组报道了一种基于共聚物P(NIPAAm-co-AA)-b-PCL的纳米自组装粒子。该粒子表现出了对温度和pH敏感的双响应特性，并且其响应温度和pH变化的范围非常适合应用于靶向抗癌药物的载体***。然而，我们注意到，大多都是使用了含有羰基的单体(AA，MAor UA)作为pH敏感基团，通常都在pH低于7.4的环境中，表现出更高的药物释放速率，而应用于肿瘤的靶向定位。为了能够拓展双响应的药物载体在生物医药中的应用范围，开发能够对具有不同微环境的其它病理区域进行靶向定位的，新型的双响应药物载体，也显得十分重要。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种星型共聚物自组装纳米胶束的制备方法，能在水溶液中能够形成纳米聚合物胶束。

本发明一种星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：

a.制备端基为羧基的聚甲基丙烯酸甲酯：以巯基丙酸为链转移剂，将单体甲基丙烯酸甲酯用引发剂偶氮二异丁腈在有机溶剂中，一定温度下，进行自由基聚合反应；

b.制备三臂聚合物tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)：以铈-醇组成的氧化还原体系为引发剂，将单体N-异丙基丙烯酰胺和N，N-二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯进行自由基共聚合；

c.制备星形共聚物：将以上制备的两种聚合物在溶剂中加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，反应一定时间，产物在***中沉淀，过滤后真空干燥至恒重；

d.将上述制得的星形两亲共聚物溶于透析袋中，置入蒸馏水中进行透析，得到共聚物胶束。

上述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，步骤a所述的温度为50℃-80℃之间，反应时间为5小时-48小时，所述有机溶剂是二氧六环，甲酰胺，二氯甲烷，苯，甲苯任一种。

上述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，步骤b中，所述的引发体系是由三羟甲基甲胺和硝酸铈组成，它们的质量比为1∶5-1∶100之间，引发体系与聚合单体的质量比控制在1∶100-1∶10000之间，反应温度为2-12小时，反应温度为50℃-80℃之间。

上述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，步骤c中，所述有机溶剂是二氧六环、甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯任一种，反应时间为10-72小时，温度控制在0℃-80℃之间。

本发明采用了一种简便的合成方法，制备了一种新型的星形的两亲共聚物，并且在水溶液中能够形成纳米聚合物胶束。该星形共聚物由一根短的疏水聚甲基丙烯酸(PMAA)PMMA链段和三根亲水的共聚物poly\\Poly(NIPAAm-co-DMAEMA)链段构成。在亲水的链段中，NIPAAm和DMAEMA分别作为聚合物的温度敏感和pH敏感基团。如图1所示，星形聚合物在水溶液中能够自组装形成胶束，并且能够响应温度和pH的变化。在不同的pH条件下，聚合物的低临界溶液温度(LCST)和自组装胶束的尺寸都发生变化。因而，温度和pH都能够对聚合物胶束的结构进行调控。作为一种有效的刺激敏感型药物传递***，该聚合物纳米粒子对疏水药物甲蝶呤(MTX)表现出了温度和pH响应的药物释放行为。更为重要的是，加速的药物释放行为可以很容易的通过温度或pH的调控来达到。因此，该星型聚合物胶束做为一种药物载体，能够通过利用外部的或体内固有的环境的变化而达到在病理区域的药物靶向释放，提高药物治疗效率。

本发明合成了由亲水的三臂tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)链段与疏水的PMMA链段所组成的新型两亲星形嵌段共聚物。在水溶液中，该星形共聚物能够自组装形成具有核壳结构的纳米胶束粒子。由于亲水链段中PDMAEMA链段在不同pH条件下的离子化与去离子化作用，共聚物胶束在不同的pH条件下表现出不同的LCST。当环境的pH分别为5，7.4和9时，共聚物胶束相应的LCST分别为32℃，36.6℃ and 39.5℃，而且共聚物胶束的粒径也随着pH的变化而发生微小变化。由于亲水链段具有的温度和pH双响应特性，载药的自组装共聚物胶束也显示出了温度和pH双重响应的药物释放行为。在体外药物释放实验中，载药共聚物胶束在pH 7.4的条件下表现出温度触发的药物释放速率加速现象，并且在37℃的条件下表现出pH除法的药物释放速率加速现象。因此，我们合成的新型共聚物纳米胶束粒子是一种具有极大潜在应用价值的智能药物传递载体，它能够通过环境温度或pH的微小改变，实现在目标病理区域的药物释放和积累，以提高药物的治疗效率，减小副作用。

下面过一步对本发明共聚物胶束的形成作一描述，作为在水中溶解度很小的药物的载体，疏水的内核是其装载药物的必要条件。另外，载体具有亲水的表面也是其具有长的血液循环时间的保证。因此，我们希望合成的聚合物胶束能够在水溶液中具有疏水核/亲水壳的结构。对于我们合成的星形两亲嵌段共聚物，通过比较其分别在CDCl3和D2O溶剂，就可以确定是否能在水溶液中形成具有疏水核/亲水壳结构的聚合物胶束。图3和图4是共聚物分别在CDCl3和D2O溶剂中的1H NMR图谱，以及共振峰的归属。我们发现，在CDCl3溶剂的图谱中如图3，出现了共聚物中所有组成链段的共振峰，然而，在D2O溶剂的图谱如图4中，只出现了PNIPAAm和PDMAEMA链段的共振峰，没有检测到PMMA链段的共振峰。这表明，在水溶液中，共聚物自己红疏水的PMMA链段被亲水的链段所包裹，形成了具有疏水核/亲水壳结构的共聚物胶束。

本发明低临界胶束浓度(CMC)的确定方法如下：

CMC是研究胶束形成，以及评价胶束稳定性的重要参数之一。通常而言，在两亲共聚物中，疏水链段比例的增加会导致共聚物的CMC降低，也意味着热力学稳定性有所增加。因而，通常我们希望两亲聚合物能够具有比较低的CMC。在本章中，我们选择芘作为外源的荧光探针。共聚物的CMC由芘在水相中以及在胶束疏水核中分配的比例所引起的荧光发射或激发光谱变化来确定。图3-4是在不同的pH环境中，共聚物浓度的对数(lgc)对聚合物溶液中芘发射光谱中的强度比值I391/I374所做的曲线图。随着聚合物浓度的增大，比值也在增大。这是由于由于聚合物形成了胶束，更多的芘分子进入了疏水的内核环境中。该曲线的转折点两侧的切线交叉点即确定为共聚物的CMC值。从图5中我们可以看到在不同pH条件下荧光发射光谱中I391/I374对logC的曲线图。λex＝342nm，[pyrene]＝6×10-7M.共聚物在不同的pH环境中，CMC值有一定的变化。当聚合物的溶液pH分别为5，7.4，和9时，所对应的CMC分别为7.5mg/L，8.7mg/L和11.2mg/L。显然，星形共聚物在不同的pH条件下的CMC值都比较小，表明在pH从5至9的范围内，其都能够在水溶液中形成稳定的自组装聚合物胶束。由于具有比较低的CMC值，该共聚物胶束可望在极稀的水溶液中，如人体体液环境，作为药物载体而应用。同时，我们也注意到，该共聚物胶束的CMC值表现出了显著的pH相关性。这是由于在不同的pH条件下，共聚物的亲水链段中DMAEMA基团发生了质子化或去质子化，改变了亲水链段的亲水-疏水性质，从而影响了共聚物的CMC，表现出了CMC的pH相关特性。

本发明温度和pH敏感的共聚物胶束结构变化如下：

PNIPAAm是一种人们熟知的具有低临界溶液温度(LCST)的聚合物，其相变温度大约为32℃。低于此温度，PNIPAAm是水溶性聚合物，聚合物分子链以伸展链的形态存在。高于此温度，PNIPAAm经历一个可逆的相转变，从水溶性聚合物转变为水不溶的聚集体。另外，通过NIPAAm单体与不同比例的其它亲水或疏水单体进行共聚合，可以很容易地在一定范围内调节PNIPAAm的LCST值。由于具有大量的叔胺基团，PDMAEMA在水溶液中表现为一种pH敏感的聚合物。在不同的pH条件下，PDMAEMA可以表现出离子化或去离子化的状态。因此，PDMAEMA的水溶性是与溶液的pH相关的。在酸性的环境中，PDMAEMA离子化，带有正电荷，表现出极强的水溶性。在碱性环境中，PDMAEMA去离子化，电荷减小，成为水不溶聚合物。我们不仅关注共聚物胶束在不同温度下结构的变化，同时也关注不同pH环境中，温度敏感特性的改变。如我们所预料，图6给出了不同pH条件下共聚物的LCST值，图6在不同pH条件下共聚物水溶液透过率随温度的变化曲线，表明随着温度的升高，共聚物胶束的亲水链结构由伸展的亲水链转变为收缩的疏水聚集体。随着温度的变化，亲水外壳链结构的改变也破坏了稳定的聚合物胶束。更为重要的是，我们注意到聚合物胶束显示出了pH相关的温度响应特性。对应于pH 5，pH 7.4和pH 9，测得的共聚物LCST值分别为32℃，36.6℃和39.5℃。为了解释所共聚物表现出的温度、pH双敏感特性，我们可以将星形共聚物中的PDMAEMA链段分为两个部分：一部分是由去离子化的DMAEMA单体所组成的疏水链段，而另一部分则是由离子化的DMAEMA单体所组成的亲水链段。显然，这两部分的比例是可以通过pH的变化而进行调节的。因此，在tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)链段中，亲水/疏水链段的比例随着pH的变化而变化，从而影响了共聚物的LCST值：pH升高，疏水链段比例增加，LCST下降，反之亦然。作为药物的载体，共聚物胶束的结构响应温度、pH的变化而发生转变，必然会引起其对药物的释放行为的变化，这将在以下部分予以讨论。

本发明纳米胶束粒子的形态及其尺寸的pH相关性如下：

在选择性的溶剂中，两亲嵌段共聚物能够自组装形成多种形态的聚集体，如球形，棒状，囊泡，薄层状，管状等。众所周知，直径小于200nm的球形胶束粒子是抗肿瘤药物药物载体的最佳选择]。这是由于其能够充分利用选择性滞留效应(EPR效应)在肿瘤区域积聚，并且能够避免网状内皮吞噬***的去除作用。图3-6是在pH 7.4条件下，空的聚合物胶束(图7)以及载药聚合物胶束(图7)的电镜图片。图片显示，无论是聚合物胶束还是载药后的胶束，都能够在水溶液中分散成为孤立的具有球形的纳米胶束粒子。并且我们注意到，载药后的胶束粒子(80-120nm)较空的胶束粒子(60-100nm)大一些，这表明共聚物胶束载药后，胶束的尺寸略有增大。此外，粒子纳米粒子尺寸的测定结果(图8)表明，聚合物胶束的粒径不仅是载药后有微小的增加，而且随着溶液pH的变化，胶束的粒径也有微小的变化。在pH 5的条件下，聚合物胶束粒子的直径约为113nm，随着pH升高至9，聚合物胶束的粒径减小至约85nm，载药后的聚合物胶束也具有相似的变化规律。这种聚合物胶束粒径随着pH变化而发生变化的也是由于在不同的pH环境中，PDMAEMA链段中的叔胺基(pKa-7.4)的离子化程度不同所造成的。在较低的pH条件下，PDMAEMA链段的离子化程度较高，带有较多的正电荷，因此，聚合物胶束的亲水壳显示出了较强的静电排斥作用，伸展了外壳的亲水链段，导致了较大的共聚物胶束尺寸。然而，在较高的pH条件下，PDMAEMA链段去离子化，带有的正电荷减小，亲水外壳收缩，导致了共聚物胶束粒子的减小。

本发明温度和pH响应的体外药物释放行为如下：

智能型的药物载体在体内稳定循环时，尽可能不释放所载药物，而当经历外界刺激，如温度或pH的变化时，则能够在病理区域加速药物的释放速率。从在实验部分可以看出，共聚物胶束的药物包封率(encapsulation efficiency，EE)为31.5％，表明在使用的模型药物MTX(8.0mg)中大约有31.5％(2.45mg)进入了聚合物胶束的疏水核。较传统的聚合物胶束而言，该共聚物胶束显示出了更高的载药能力，这可能是由于形成胶束的共聚物具有了特殊的星形结构[39，40]，增强了疏水内核与药物的相互作用能力。

图9是载药共聚物胶束在pH 7.4的环境中，分别在25℃，低于低临界溶液温度(LCST)和40℃(高于LCST)时的累积药物释放曲线图。当药物释放环境温度低于共聚物的LCST(36.6℃，pH 7.4)时，共聚物以稳定的核壳型胶束的形式存在，药物被包封在疏水的内核中，因此药物释放速率较小。当温度高于共聚物的LCST时，聚合物胶束的外壳从伸展的亲水链变为收缩的疏水链，共聚物胶束的稳定核壳结构被破坏，药物释放速率加快。基于此种在近似生理环境下的温度触发的药物释放行为，该共聚物纳米胶束粒子将会是一种非常有前景的定位药物载体。它可以利用区域加热技术或病理区域固有的温度升高来实现药物释放的触发。

从图10中，我们可以观察到，在给定的pH条件下，在25℃，MTX从共聚物胶束粒子中的释放速率和累计释放量(低于35％)都是比较低的。此外，我们还可以注意到，尽管在不同的pH条件下，总的累计药物释放量基本上相同，但是在药物释放的初始阶段，当pH为5时的药物释放速率要较pH为7.4和9时略高一些。在这个实验中，释放温度为25℃，低于给定pH条件下的共聚物LCST值。因此，在整个药物释放过程中，共聚物胶束粒子都是保持着稳定的核-壳结构，在不同的pH条件下，没有表现出pH响应的特性。在不同的pH条件下，载药共聚物胶束粒子的初始药物释放速率的不同，表明在较高的pH条件下，胶束粒子外壳亲水链段的收缩也有可能会阻碍疏水核中的药物向释放介质的扩散，从而减小了药物释放速率，但是对总的药物释放量却基本上没有影响。

释放温度保持37℃不变，不同的pH条件下载药共聚物胶束表现出显著不同的药物释放行为如图11，表现出了显著的pH响应药物释放特性。当pH＝5时，药物的释放速率较小，且累计药物释放量小于35％。而当pH＝7.4或9时，药物释放速率显著加大，释放时间为40h时，累计药物释放量已经达到70-80％。在不同pH条件下的不同药物释放行为可以由不同pH条件下，共聚物的LCST的差异来进行解释。在pH＝5时，共聚物的LCST确定为约39.5℃，高于实验的释放温度，此时，载药共聚物胶束是在低于共聚物的LCST的温度下进行释放，共聚物胶束呈稳定的核壳结构，因此释放速率较小，累计释放量也较低。当pH改变为7.4和9时，共聚物的LCST分别为36.6℃和32℃，低于实验的释放温度，此时，载药共聚物胶束是在高于共聚物的LCST的温度下进行释放，共聚物的稳定结构被破坏，共聚物胶束转变成为沉淀，包封药物的能力下降，因此药物进入释放介质的速率较大，累计释放量也较高。基于该共聚物胶束在正常生理温度条件下的pH响应药物释放特性，该新型纳米胶束粒子可望成为一种具有巨大潜在应用价值的口服药物载体。它将能够在酸性的pH条件下(如在胃部环境中)保持所装载的药物，而在接近正常生理pH的条件下(如在肠内环境中)加速释放所装载的药物。

此外，为了进一步地确认载药共聚物胶束的温度、pH双响应药物释放行为，我们考察了在药物释放过程中改变释放介质的温度或pH时，药物释放行为的变化。图12显示了在pH 7.4的条件下，温度触发的药物加速释放行为。这是由于温度升高，载药共聚物胶束由稳定的核壳型胶束(25℃)转变为不溶聚集体(37℃)的缘故。与此相似，图13显示了在37℃的条件下，pH触发的药物加速释放行为。结果表明，在接近人体生理环境的载药共聚物胶束释放药物过程中，温度或pH的改变都会引起药物释放行为的变化。因此，我们认为这种具有温度和pH双重响应的纳米共聚物粒子能够作为温度和pH触发的定位药物载体，它将能够通过目标区域的温度或pH的变化，增强药物在靶向病理区域的积累从而提高药物的治疗效率。

附图说明

图1为星型共聚物自组装及其响应温度和pH的结构变化的示意图

图2为星型共聚物的合成路线

图3为(a)三臂P(NIPAAm-co-DMAEMA)共聚物在CDCl₃中以及(b)星型共聚物在CDCl₃中的¹H NMR谱图

图4为星型共聚物在D₂O中的¹H NMR谱图

图5为在不同pH条件下荧光发射光谱中I₃₉₁/I₃₇₄对logC的曲线图。

图6为在不同pH条件下共聚物水溶液透过率随温度的变化曲线

图7为透射电镜图(a)空的纳米胶束粒子(b)载药后的纳米胶束粒子

图8为在不同pH条件下，胶束粒子的粒径变化图

图9为在pH 7.4的PBS缓冲溶液中温度敏感的药物释放曲线

图10为在25℃下的pH敏感药物释放曲线

图11为在37℃下pH敏感的药物释放曲线

图12为在pH 7.4条件下的温度触发药物加速释放图以及

图13为在37℃下pH触发的药物加速释放曲线图。

具体实施例

本发明具体实施例用的N，N-二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯(DMAEMA，98％)购于Arcos公司，使用前经减压蒸馏提纯。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)购于Arcos公司，使用前经甲苯/正己烷重结晶提纯。三羟甲基甲胺和硝酸铈铵(IV)是上海化学试剂厂产品，未经处理直接使用。3-巯基丙酸(MPA)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和dicylohexyl-carbodiimide(DCC)均为Acros公司产品，未经处理直接使用。偶氮二异丁腈(AIBN)购于上海化学厂，使用前经甲醇重结晶提纯。二氧六环和二甲基甲酰胺为上海化学试剂厂产品，使用前按照标准方法处理。溴化-3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑(MTT)为Sigma公司产品。Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)由中国典型物保藏中心(CCTCC)提供。改进的Eagle培养基(MEM)和磷酸缓冲溶液(PBS)购于Gibco公司。其余试剂和溶液均为市售，未经处理直接使用。

本发明具体实施例由以下步骤完成：

1、半遥爪聚合物PMMA-COOH的制备

通过以MPA为链转移剂的自由基聚合制备了末端为羧基的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA-COOH)。将MMA(9×10^-2mol)，MPA(2.2×10^-3mol))以及AIBN(4.5×10^-4mol)溶于40mL DMF中。溶液通入氮气鼓泡除氧30min(工艺参数请给一个数值区间，以扩大专利保护范围，后面涉及的也要这样处理)。体系升温至60℃，搅拌聚合8h。反应完成后，将反应液倾入水中，析出白色沉淀，水洗过滤。将得到的白色固体溶于DMF中，再在水中沉淀，反复三次，产品真空干燥至恒重。

2、三臂聚合物tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)的制备

单体NIPAAm和DMAEMA的共聚合反应，以铈-醇组成的氧化还原体系为引发剂，在具有搅拌装置、回流冷凝管和氮气保护装置的三口烧瓶中进行。将NIPAAm 3.4g(3×10^-2mol)，DMAEMA 0.94g(6×10^-3mol)，以及三羟甲基甲胺0.18g(1.5×10^-3mol)和70％硝酸溶液1mL溶解于70mL去离子水中，然后将混合溶液通入氮气流除氧30min。加热至55℃，搅拌，保温1h(要用规范的用词，H改为小时)。用注射器加入溶有3.278g(6×10^-3mol)硝酸铈铵(IV)的0.5M硝酸溶液3mL引发聚合反应。在氮气流的保护下，保温搅拌反应8小时，然后冷却至室温。反应液移入透析袋(截留分子量为8,000-10,000g/mol，上海化学试剂公司)中，浸入蒸馏水中透析4天，以除去未反应的单体，冷冻干燥得到产品。

3、星形两亲共聚物的制备

将以上制备的tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)共聚物1.0g，PMMA-COOH0.5g，以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6.0×10^-4mol溶于10mL二氧六环中。在氮气保护及搅拌下下，往上述溶液中逐滴加入含有DCC(6.0×10^-4mol)的二氧六环5mL。滴加完毕后，室温下搅拌反应48h。产物在大量的***中沉淀以除去未参加反应的PMMA-COOH。产物在真空中干燥至恒重。

4、星形两亲共聚物胶束的形成

本章采用透析法制备共聚物胶束。具体方法如下：将星形两亲共聚物2mg溶于透析袋(截留分子量8000-10,000g/mol，上海化学试剂公司)中，置入500mL蒸馏水中进行透析48小时，冷冻干燥，得到共聚物胶束。

上述本发明实施例聚合物分子量的测定

所得聚合物分子量(数均分子量M_n及重均分子量M_w)的测定使用配备有Waters 2690D分离模块及Waters 2410折光率检测器的凝胶渗透色谱(GPC)进行。DMF为洗脱液，流速0.3mL/min。以窄分子量分布的聚苯乙烯为标准，Waters millennium module软件用于计算分子量。

本发明H NMR的测定

H NMR谱图用Varian VX-300 Mercury(300MHz)核磁共振仪测定(内标为TMS，溶剂分别为CDCl₃和D₂O)。

上述实施例光学透过率测定

不同pH条件下的星形共聚物浓度为4mg/mL的磷酸缓冲溶液(0.1M)的光学透过率测定使用配有循环水浴夹套的UV-8500紫外光谱仪(中国)测定。测定波长为500nm，升温速率为0.5℃/min。聚合物溶液的LCST确定为光学透过率为50％所对应的温度。

上述实施例透射电镜的观察

为了观察聚合物胶束在溶液中的尺寸和形态，试样制备如下：一滴共聚物的水溶液置于覆有聚乙烯醇缩甲醛膜的铜网上，在室温(低于聚合物的LCST)下干燥。用JEM-100CX II透射电镜(日本)进行观察，加速电压80kV。

上述实施例共聚物胶束粒子直径的测定

共聚物胶束粒子直径的测定使用Malvern Zetasizer Zs90(英国，Malvern)进行。测定时，温度为25℃，低于共聚物的LCST值，溶液为含有0.01M NaCl的不同pH的磷酸缓冲溶液(0.1M)。

本发明上述实施例共聚物水溶液荧光的测定

同我们以前的工作所描述的一致，静态荧光光谱用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪(日本)测定。芘作为疏水荧光探针。1mL芘的丙酮溶液(6×10^-6M)置入试管中，将丙酮在空气中自然蒸发除去。一系列不同浓度的，10mL的聚合物水溶液分别加入上述含有残存芘的试管中。所有的待测聚合物溶液试样中具有相同的芘浓度(6×10^-7M)。聚合物溶液在室温下静置24小时，以使芘在溶液中的溶解达到平衡。激发波长为340nm，发射光谱记录350至600nm范围。激发与发射狭缝宽度均为5nm。在芘的发射光谱中，第三发射带(391nm，I₃)与第一发射带(374nm，I₁)的发射强度(发射峰高度)之比(I₃/I₁)对聚合物的浓度作图。该曲线的转折点两侧的切线交叉点即确定为聚合物的CMC值。

本发明上述实施例药物的装载

将8mg星形共聚物和8mg氨甲蝶呤(MTX)溶于4mL二甲酰胺中。溶液移入透析袋中(上海化学试剂公司产品，截留分子量：8000-10,000g/mol)，在1000mL蒸馏水中透析24小时。为了测定聚合物的载药量，将载药聚合物溶液过滤，除去不溶物，然后冷冻干燥，得到载药聚合物粉末。将一定重量的载药聚合物粉末溶于二甲酰胺中，用紫外光谱标准曲线法进行测定药物的量，吸收波长371nm。氨甲蝶呤/二甲酰胺标准曲线由实验获得。实验测得，该共聚物的载药率约为31.5wt.％。

本发明上述实施例体外药物释放行为的测定

通过透析装载药物后，将透析袋直接浸入400mL具有不同pH或温度的释放介质中，搅拌。每隔一定时间，从蒸馏水中移取3mL溶液，测定药物浓度。每次取完样后，补加3mL的释放介质，以保持溶液体积恒定。从聚合物胶束中释放出的药物浓度用紫外吸收光谱法测定，吸收波长371nm。

本发明上述实施例两亲星形共聚物的合成及结构

星形嵌段共聚物是由末端为羧基的PMMA链段与三臂的tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA)聚合物链段偶合而制备的。共聚物的合成路线如图2所示。

第一步是采用自由基聚合，以MPA为链转移剂合成了以羧基封端的PMMA，作为目标聚合物的疏水嵌段。第二步是合成多臂的亲水链段tri-armP(NIPAAm-co-DMAEMA)。高价的铈盐与还原试剂，如醇、醛、酮等共同组成的引发体系，引发乙烯基单体的聚合反应已有文献报道。本章中，NIPAAm和DMAEMA的共聚合由硝酸铈铵与三羟甲基甲胺组成的氧化还原体系引发。在三羟甲基甲胺分子中，与羟基相连的碳原子在铈(IV)的作用下生成自由基，从而引发聚合单体的聚合。如式3-1所示，在Ce⁺⁴的氧化作用下，三羟甲基甲胺中的-CH₂OH基团产生了自由基。在聚合中，形成的自由基从-CH₂OH基团向NIPAAm和DMAEMA单体转移，从而实现了聚合链的增长。由于在一个三羟甲基甲胺分子中有三个-CH₂OH基团，能够形成三个引发自由基，因此，得到了具有三臂的NIPAAm与DMAEMA的共聚物。最后，在NHS与DCC的作用下，末端为羧基的PMMA链段与亲水的三臂tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)共聚物进行偶合，得到了两亲的星形嵌段共聚物。各个步骤中得到的聚合物的及目标聚合物的分子量及分子量分布结果如表3-1所示。聚合物的分子量结果表明，在第三步合成中，星形聚合物的分子量的增加与PMMA-COOH的分子量相当，证明了两个相应链段之间的偶合。

表1PMMA，tri-arms P(NIPPAm-co-DMAEMA)和星形共聚物的分子量

此外，由D和星形嵌段共聚物在CCl₃D中的¹H NMR图3可见，星形嵌段共聚物的¹H NMR不但显示出了PNIPAAm、PDMAEMA的特征峰，还出现了明显的PMMA的特征峰，而未参加反应的PMMA-COOH已通过在***中沉淀而除去，因而证实了该共聚物是由PMMA链段和NIPAAm、DMAEMA共聚链段偶合构成。基于共聚物的¹H NMR图，tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)的共聚物组成可以通过归属于NIPPAm的共振峰的强度(3.97)与归属于DMAEMA的共振峰(2.25)强度计算而得到。结果表明，共聚物中PNIPAAm与PDMAEMA的比例与投料比一致。这也就是说，我们成功的制备了一种新型的两亲星形嵌段共聚物。该共聚物由一个相对较短的疏水PMMA链段和一个具有温度和pH响应能力的三臂的亲水链段所组成。

Claims

1、一种星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

e.制备端基为羧基的聚甲基丙烯酸甲酯：以巯基丙酸为链转移剂，将单体甲基丙烯酸甲酯用引发剂偶氮二异丁腈在有机溶剂中，一定温度下，进行自由基聚合反应；

f.制备三臂聚合物tri-arm P(NIPAAm-co-DMAEMA)：以铈-醇组成的氧化还原体系为引发剂，将单体N-异丙基丙烯酰胺和N，N-二甲基胺乙基甲基丙烯酸甲酯进行自由基共聚合；

g.制备星形共聚物：将以上制备的两种聚合物在溶剂中加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，反应一定时间，产物在***中沉淀，过滤后真空干燥至恒重；

h.将上述制得的星形两亲共聚物溶于透析袋中，置入蒸馏水中进行透析，得到共聚物胶束。

2、如权利要求1所述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，其特征是，步骤a中，所述的温度为50℃-80℃之间，反应时间为5小时-48小时，所述有机溶剂是二氧六环，甲酰胺，二氯甲烷，苯，甲苯任一种。

3、如权利要求1所述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，其特征是，步骤b中，所述的引发体系是由三羟甲基甲胺和硝酸铈组成，它们的质量比为1∶5-1∶100之间，引发体系与聚合单体的质量比控制在1∶100-1∶10000之间，反应温度为2-12小时，反应温度为50℃-80℃之间。

4、如权利要求1所述的星形共聚物自组装纳米胶束的制备方法，其特征是，步骤c中，所述有机溶剂是二氧六环、甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯任一种，反应时间为10-72小时，温度控制在0℃-80℃之间。