CN101343643B - 多步发酵法生产甘油的高产方法 - Google Patents
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Abstract
一种多步发酵法生产甘油的高产方法,属于生物化工技术领域。通过通气量和转速的调节将发酵分为四个阶段分段发酵,工艺步骤为:将耐高渗酵母种子液按体积5~10%的接种量加入含葡萄糖浓度为250~380g/l的初始发酵培养基中,30~40℃条件下进行有氧发酵;每间隔6hr调高一次通空气量,最终通气量调到0.6~3.5vvm,搅拌转速70~600rpm,当葡萄糖浓度低于30~50g/l时,进入第三阶段的发酵,每间隔4~6hr调低一次通气量,最终通气量调到0vvm,搅拌转速10~50rpm,则进入第四阶段的厌氧发酵,当葡萄糖浓度低于2g/l时中止发酵。发酵结束后,将发酵液固液分离,将甘油分离、提纯,制备成产品。优点在于,使发酵后期残糖显著降低,而甘油不返耗。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域,特别涉及多步发酵法生产甘油的高产方法。
背景技术
甘油即丙三醇是一种重要的多羟基醇,其用途广泛,应用于牙膏、烟草、化妆品、涂料工业等行业,已知在1700多种产品的生产中直接或间接以甘油为原料,甘油的生产方法有化学合成法、油脂皂化水解法和微生物发酵法,在前两种方法生产的甘油无法满足市场需求时,人们将注意力集中在微生物发酵法生产甘油的研究上,其中研究最多的是耐高渗酵母的发酵生产,提出了流加、连续生产及细胞固定化等技术,无锡轻工学院与中科院化冶所等共同承担的“发酵法生产甘油”专题攻关任务(诸葛健、方慧英,微生物好氧发酵法生产甘油,精细与专用化学品,2001-20:22-23)中,发酵水平平均达到:甘油含量106.9g/l,对糖转化率达到50.39%;但发酵法生产甘油工艺产业化的技术“瓶颈”在于甘油的提取(P.kishore,Concentration of Glycerol inFermentation Baths by Reverse Osmosis,J.Microbio,Biotechnol,1987,2(1):22-27),原因是在发酵后期,细胞对糖的消耗速率降低,尽管发酵液中残糖浓度还处于一定水平,但甘油却开始被细胞消耗(Liu YQ,Liu DH,Su Q,Xie DM,Glycerol production byCandida krusei employing NaCl as an osmoregulator in batch and continuousfermentations.,Biotechnol Lett2002,24:1137-1140)。使得发酵被迫中止,这不仅影响了最终甘油产量,而且在甘油蒸馏提取时,过高浓度的残糖在高温下易焦化结垢,使甘油蒸馏十分困难,甚至无法进行;为此,人们相继提出树脂吸附法、载体蒸馏法(诸葛建,中国专利,申请号:89103615)、残糖氧化法(蔡水洪,中国专利,申请号:94112202.6)、溶剂抽提(蔡水洪,中国专利,申请号:94112180.1)等方法,这些方法的出发点是一致的,既不是通过发酵工艺优化或菌种选择来降低残糖,而是待发教停止后再设法将残糖和甘油分开,虽有一定效果,但受技术和成本的限制,都不尽理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多步发酵法生产甘油的高产方法,通过通气量和转速的调节将发酵分为四个阶段,从而使发酵后期残糖显著降低,而甘油不返耗,同时能够得到较高的发酵甘油浓度和总糖转化率,拉大了甘油和残糖含量的比例,使甘油的后提取更加容易。所述发酵工艺过程为:
将酵母接入含10-50g/l葡萄糖的种子培养基中,30℃~37℃培养20~24h,再将种子液按体积5~10%的接种量加入含葡萄糖浓度为250~380g/l的初始发酵培养基,30~40℃条件下进行有氧发酵,发酵过程中监测发酵液的pH值、菌浓、葡萄糖和甘油浓度,发酵12—24小时为第一阶段,每间隔5—7小时调高一次通空气量,根据发酵罐的容量及罐型,最终通气量调到0.6~3.5vvm,搅拌转速70~600rpm,继续发酵进入第二阶段,保持通气量和转速不变并监测葡萄糖、甘油浓度,当葡萄糖浓度低于30~50g/l时,进入第三阶段的发酵,即每间隔4~6小时调低一次通气量,最终通气量调到0vvm,搅拌转速10~50rpm,则进入第四阶段的厌氧发酵,整个发酵过程中,当葡萄糖浓度低于2g/l时即可中止发酵,一般发酵周期为72-96小时,发酵生产结束后,采用板框、膜过滤、离心等手段将发酵液固液分离,清液通过浓缩、蒸馏、离子交换和脱色等步骤将甘油分离、提纯,制备成产品。
本发明所述的酵母为假丝酵母,属产甘油的菌株。通气量和转速的调节方式为单独或同时调节发酵通气量和转速。所述发酵方式包括:批次流加发酵和连续发酵。
本发明的优点在于,多步发酵法的新工艺使发酵后期残糖显著降低,而甘油不返耗,同时能够得到较高的发酵甘油浓度和总糖转化率,拉大了甘油和残糖含量的比例,使甘油的后提取更加容易。
具体实施方式
本发明提出了通过通气量和转速的调节采用多步发酵法生产甘油的高产工艺,下面再以具体实施例对本发明予以进一步说明:
实例1
(1)菌种:克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)
(2)发酵方式:2L机械搅拌发酵罐,通空气批次发酵
(3)发酵过程:2L发酵罐,装液量1.5L,发酵温度控制在37℃,采用自然pH值。发酵培养基初始含葡萄糖浓度为343.7g/L,通入空气,通气量1.5vvm,发酵罐搅拌转速400rpm,发酵过程中监测发酵液的pH值、菌浓、葡萄糖和甘油浓度,第一阶段于发酵6、12、18、24hr分别调高通气量为2.0、2.5、3.0、3.5vvm,转速450、500、550、600rpm;第二阶段维持通气量3.5vvm,转速600rpm,并继续监测葡萄糖、甘油浓度,发酵54hr时葡萄糖浓度为45.3g/l,则进入第三阶段的发酵,于发酵54、58、62hr分别调低通气量为3.0、2.5、2.0vvm,转速550、500、450rpm;此时葡萄糖浓度分别为45.3、17.7、6.5g/l,甘油浓度为168、181.1、182.7g/l,66hr时葡萄糖浓度为0,甘油浓度为183.8g/l,尚未进入第四阶段即可停止发酵,此时对糖转化率为53.48%。
同样条件下,不采用多步发酵工艺进行发酵,则发酵到66hr葡萄糖浓度分别为52.8g/l,甘油浓度为150.3g/l,84hr时葡萄糖和甘油浓度分别为21.5g/l、142.3g/l,耗糖的同时甘油被反耗,发酵不得不停止,相比之下,采用多步发酵工艺甘油浓度由142.3g/L上升到182.7g/L,葡萄糖浓度浓度由21.5g/L下降到0g/L,转化率由44.17%上升到53.48%,效果显著。
实例2
(1)菌种:克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)
(2)发酵方式:5吨机械搅拌发酵罐,通空气批次发酵
(3)发酵过程:5吨发酵罐,装液量4吨,发酵温度控制在37℃,采用自然pH值。发酵培养基初始含葡萄糖浓度为308.5g/L,通空气量0.2vvm,发酵罐搅拌电机不可调,固定转速126rpm,发酵过程中监测发酵液的pH值、菌浓、葡萄糖和甘油浓度,第一阶段于发酵6、12、18、24hr分别调高通气量为0.3、0.4、0.5、0.6vvm,转速126rpm不变;第二阶段维持通气量0.6vvm,转速126rpm,继续监测葡萄糖、甘油浓度,发酵72hr时葡萄糖浓度为48.4g/l,则进入第三阶段的发酵,于发酵72、76、80、84hr分别调低通气量为0.5、0.4、0.3、0vvm,在84hr时停止搅拌;用蠕动泵进行罐外液体循环,此时葡萄糖浓度分别为48.4、37.2、20.4、7.1g/l,甘油浓度为136.2、139.6、147.6、152.2g/l,然后进入第四阶段的厌氧发酵,88hr时葡萄糖浓度为0,甘油浓度为152.8g/l,停止发酵,转化率为49.53%。发酵生产结束后,采用板框过滤将发酵液固液分离,清液通过浓宿、蒸馏、离交和脱色等步骤将甘油分离、提纯,后提取总收率达到88.93%,产品甘油浓度为99.2%,并达到国家质量标准。
Claims (1)
1.一种多步发酵法生产甘油的高产工艺,通过通气量和转速的调节将发酵分为四个阶段分段发酵,具体工艺过程为:
将酵母接入含10-50g/l葡萄糖的种子培养基中,30℃~37℃培养20~24小时,再将种子液按体积5~10%的接种量加入含葡萄糖浓度为250~380g/l的初始发酵培养基,30~40℃条件下进行有氧发酵,发酵过程中监测发酵液的pH值、菌浓、葡萄糖和甘油浓度,发酵12-24小时为第一阶段,每间隔5-7小时调高一次通空气量,根据罐子的容量及罐型,最终通气量调到0.6~3.5vvm,搅拌转速70~600rpm,继续发酵进入第二阶段,保持通气量和转速不变并监测葡萄糖、甘油浓度,当葡萄糖浓度低于30~50g/l时,进入第三阶段的发酵,每间隔4~6小时调低一次通气量,最终通气量调到0vvm,搅拌转速10~50rpm,则进入第四阶段的厌氧发酵,无论进入那个阶段,当葡萄糖浓度低于2g/l时中止发酵,发酵周期为72-96小时,发酵生产结束后,采用板框、膜过滤、离心手段将发酵液固液分离,清液通过浓宿、蒸馏、离子交换和脱色步骤将甘油分离、提纯,制备成产品;
所述的酵母为克鲁斯假丝酵母;所述发酵方式为批次流加发酵。
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