CN101339135B - 利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于对生物样品中多种蛋白质和基因进行检测的方法，特别涉及利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法。本发明是利用光子晶体的特性，配合荧光标记生物功能物质，利用荧光标记生物功能物质对目标生物物质的特异响应性或特异亲和性，目标生物物质与生物功能物质发生响应，引起用荧光标记分子标记的生物功能物质发光的改变，通过光子晶体增强荧光标记分子的荧光信号的读出和辨别，可以有效的增强目标生物物质的检测体系的灵敏度，从而实现高灵敏生物检测。

Description

利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法

技术领域

本发明属于对生物样品中多种蛋白质和基因进行检测的方法，特别涉及利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法。

背景技术

生命科学的飞速发展对分析化学提出了大量新的课题，目前集中在多肽、蛋白质、核酸等生物大分子分析，生物药物分析，超痕量、超微量生物活性物质分析，甚至微生物分析等。因此，生物分析已成为现代分析化学发展的最重要的前沿领域之一。为了适应这种形势的要求，众多分析化学工作者正在不断努力开发新的分析方法和技术。生物传感器是一种在多学科交叉背景下发展起来的新型分析仪器，目前生物传感器使用的探测机制共有电、光、热、量4种，其中以光信号作为探测机制的称为光学生物传感器。光学生物传感器因具有快速、灵敏、准确和高选择性等特点而最为引人瞩目。由于光学生物传感器具有非破坏性的操作模式、较高的信号产生与读取速度，加上近年来光纤技术的发展与应用，使光学生物传感器的测试方式和应用领域都得到极大的扩展，成为迄今应用最为普遍的生物传感器，具有广阔的发展前景。

以荧光信号为读出信号，是光学生物传感器的一种最主要的信号采集形式。荧光分析法作为一种分析方法，早在19世纪60年代就已出现。该方法具有许多突出优点：①选择性好；②具有多种测定参数(如荧光寿命、荧光各向异性、荧光量子产率、荧光激发波长、发射波长等)；③灵敏度高；④具有多种检测技术和方法(如同步荧光、导数荧光、荧光偏振、荧光动力学分析法、三维荧光光谱法及相分辨、时间分辨荧光分析法等)。故可以依据实际测定条件的不同加以选择，因而具有适用性强、选择性好、线性范围较宽的特点。

然而，在实际过程中，由于样品的特殊性，荧光技术已有的灵敏度仍然不能满足所有测定的需要。因此，希望能够进一步提高荧光检测的灵敏度，使其应用范围更加扩大。用于提高荧光检测灵敏度的方法有多种，例如：利用新技术、新器件，进一步提高仪器的检测灵敏度[CN1602420A]；荧光放大分离[CN101082583]；[X.Gao，Y.Cui，R.M.Levenson，L W.K.Chung，and S.Nie，Nat.Biotechnol.22，969(2004).]利用酶联免疫反应、[R.M.Lequin，Clin.Chem.51，2415(2005).]聚合酶链反应、[R.K.Saiki，S.Scharf，F.Faloona，K.B.Mullis，G.T.Horn，H.A.Erlich，and N.Arnheim，Science230，1350(1985).]多荧光发色团探针[B.S.Gaylord，A.J.Heeger，G.C.Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，10954(2002).]等生物化学方法提高荧光信号的放大倍数。

但以上述这些方法提高荧光技术的检测灵敏度局限性很大，提高的程度受制于荧光物种自身的量子产率、光解性以及背景荧光的干扰等。从改进仪器方面考虑，要达到高灵敏的测试要求，需要严格控制实验条件，最大限度地降低背景荧光，需要用到复杂的光学***，对检测器的质量要求也特别高，因此仪器价格昂贵，实验过程要求严格，要将该方法推广应用存在现实困难，严重制约了其实用化的步伐。因此，很有必要寻找新的提高荧光检测灵敏度的途径。

光子晶体是一种具有介电常数(或折射率)周期性的有序结构，能够限制、控制和调控光子。光子晶体可以作为一种良好的光学腔，为控制光的发射和传播提供了很好的理论设想和试验依据，尤其近年来在可见光范围的光子晶体的研究，使得它在光电器件和光学芯片等方面有着诱人的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种综合性能高、灵敏度高、成本低、快速、方便、易实现的利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法。

本发明是利用光子晶体的特性，配合荧光标记生物功能物质，利用荧光标记生物功能物质对目标生物物质的特异响应性或特异亲和性，目标生物物质与生物功能物质发生响应，引起用荧光标记分子标记的生物功能物质发光的改变，通过光子晶体增强荧光标记分子的荧光信号的读出和辨别，可以有效的增强目标生物物质的检测体系的灵敏度，从而实现高灵敏生物检测。

本发明利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法包括以下步骤：

(1)在水溶液中，利用单个荧光标记分子或给受体荧光标记对，对生物功能物质进行荧光标记，得到含有单个荧光标记分子或给受体荧光标记对标记的生物功能物质的水溶液；

(2)选择光子禁带带边与步骤(1)中的单个荧光标记分子标记的生物功能物质中的荧光标记分子的发光峰相匹配的光子晶体，利用光子晶体的光子禁带带边增强荧光标记分子的荧光信号的读出和辨别，从而提高检测体系的灵敏度；或

选择光子禁带或光子禁带带边与步骤(1)中的给受体荧光标记对标记的生物功能物质中的给体的发光峰相匹配的光子晶体，利用光子晶体的光子禁带或光子禁带带边增强给受体荧光标记对的荧光信号的读出和辨别，从而提高检测体系的灵敏度。其原理是利用光子晶体的光子禁带对给体发光的局域化或光子禁带带边对给体发光的增强，促进给受体荧光标记对之间的荧光共振能量传递。

(3)采用本领域常用的渗透法、包埋法、吸附法、共价键法或交联法等多种方法，将步骤(1)得到的含有单个荧光标记分子或给受体荧光标记对标记的生物功能物质的水溶液中的单个荧光标记分子或给受体荧光标记固定在步骤(2)的光子晶体上，得到填充了荧光标记生物功能物质的光子晶体；所述渗透法、包埋法、吸附法、共价键法或交联法可参见(a)李瑛秀，朱连德，朱果逸，分析测试学报，2002，21，89；(b)钱军民，李旭祥，传感器技术，2001，20，6。

(4)将目标生物物质溶液滴到步骤(3)所得到的填充了荧光标记生物功能物质的光子晶体上，对目标生物物质进行检测，通过荧光光谱仪或荧光共聚焦显微镜等荧光检测仪器记录荧光标记生物功能物质的荧光信号的变化，完成对目标生物物质的识别。

所述的含有单个荧光标记分子或给受体荧光标记对标记的生物功能物质的水溶液的摩尔浓度优选为10^-16摩尔/升～10摩尔/升。

所述的目标生物物质溶液的摩尔浓度优选为10^-16摩尔/升～1摩尔/升。

所述的目标生物物质选自核酸、抗原抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体等中的一种。

所述的生物功能物质选自酶、核酸、抗原抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体等中的一种。

所述的单个荧光标记分子选自有机染料、发光量子点、复合型荧光纳米粒子、镧系螯合物中3价稀土镧系元素等的螯合物、荧光蛋白等中的一种。

所述的给受体荧光标记对的给体和受体分别选自有机染料、发光量子点、复合型荧光纳米粒子、镧系螯合物中3价稀土镧系元素等的螯合物、荧光蛋白等中的一种。

所述的有机染料是四甲基罗丹明、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸荧光素、溴乙锭、吖啶、菲啶、荧光素、TOTO[S.C.Benson，R.A.Mathie，A.N.Glazer et al.Nucleic Acids Research，1993b，21，5720]或YOYO[S.C.Benson，P.Singh，A.N.Glazer.Nucleic Acids Research，1993a，21，5727]等。

所述的发光量子点是由II-VI族元素和III-V族元素组成的纳米颗粒，它们是CdS、CdSe或CdTe等。

所述的复合型荧光纳米粒子可参见J.R.Taylor，M.M.Fang，S.M.Nie，Anal Chem，2000，72(9)，1979。

所述的镧系螯合物中3价稀土镧系元素的螯合物是铕(Eu3)、铽(Tb3)或铈(Ce3)等。

所述的荧光蛋白是藻胆色素蛋白或绿色荧光蛋白等。

所述的光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构，自组装排列具有蛋白石结构的光子晶体或具有反蛋白石结构的光子晶体等。

所述的具有蛋白石结构的光子晶体是由粒径均为150nm～1.5um的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)或二氧化硅的单分散微球自组装所制备的。所述的具有蛋白石结构的光子晶体的制备方法包括模板法[O.D.Velev，E.W.Kaler，Adv.Mater.2000，12，531]、重力沉降[H.Miguez，F.Meseguer，C.Lopez，et al.Langmuir，1997，13，6009]、慢速离心的方法[C.F.Blanford，H.Yan，R.C.Schroden，et al.Adv.Mater.2001，13，401]、用毛细管力在平面上自组装[N.D.Denkov，O.D.Velev，Kralchevsky P A，et al.Nature1993，361，26]、垂直沉积方法[P.Jiang，J.F.Bertone，K.S.Hwang，et al.Chem.Mater.1999，11，2132]等。

所述的具有反蛋白石结构的光子晶体是以上述具有蛋白石结构的光子晶体为模板，利用模板法制备得到的。

利用单个荧光标记分子或给受体荧光标记对，对生物功能物质进行荧光标记的方法可参见(a)O.Seitz，Angew.Chem.2000，39，3249；(b)D.M.Hammond，A.Manetto，J.Gierlich，V.A.Azov，P.M.E.Gramlich，G.A.Burley，M.Maul，T.Carell，Angew.Chem.2007，119，4262；Angew.Chem.Int.Ed.2007，46，4184；(c)F.He，Y.L.Tang，M.H.Yu，S.Wang，Y.L.Li，D.B.Zhu，Adv.Func.Mater.2006，16，91；(d)W.C.W.Chan，S.M.Nie，Science1998，281，2016。

本发明是利用光子晶体可以调制荧光材料的发光特性，配合荧光标记生物功能物质，得到高灵敏度及高效的生物识别体系。荧光标记分子发光随生物识别所引起的周围环境的改变而变化，经由光子晶体的光子禁带或光子禁带带边调制荧光标记分子的发光强度和传播途径，使得检测体系光信号增强，从而实现对目标生物物质的高灵敏度检测。

本发明主要是提供了一种利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法，除了上述荧光标记分子外尚有其它可用的荧光材料，本发明中所述的荧光标记分子并不代表本发明只限用上述荧光材料，亦包括了其它生物标记荧光材料。按照本发明提供的方法，均能够实现利用光子晶体提高生物检测灵敏度。

本发明的方法可以广泛用于临床检测、药物筛选、生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域的检疫、基因序列及基因功能分析和各种微生物的检测。

本发明的方法具有下列优点：

1.本发明利用光子晶体的对光调控的特性，可以增强检测体系的光信号的强度并能够控制其传播途径，从而可以提高检测体系的灵敏度。

2.本发明中的光子晶体中的多孔道结构有利于单个荧光标记分子或给受体荧光标记对的给体或受体的分散，减少荧光标记分子浓度淬灭对检测稳定性和灵敏度的影响，提高光信号的稳定性和灵敏度。

3.本发明利用的光子晶体是采用具有良好的生物兼容性的材料来制备的，能够为生物功能物质提供优良的固定载体，并且存在多孔道结构，有利于生物功能物质分子的快速均匀分布，能够提高检测的稳定性、灵敏度和响应速度等问题。

4.本发明制备程序简单，制作成本低，尤其是自组装亚微米胶体颗粒制备的近红外及可见光区域的光子晶体。同时，利于生物功能物质的固定化，并且适用范围广，能够实现更高灵敏度、更好选择性的生物检测。

具体实施方式

实施例1.

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为210nm的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为50℃，湿度为50％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体，聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构，光子晶体的光子禁带位于518～527nm。

3.用水配制浓度为10^-5mol/L的溴乙啶(EB)溶液。

4.将荧光素(F1)标记的DNA探针分子溶液滴加在步骤3所得的EB溶液中得到给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液，其中得到的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液的浓度为10^-6mol/L。

5.将步骤2得到的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体浸泡在步骤4所得的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液中，得到含有填充了DNA探针分子的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体的溶液。

6.利用荧光光谱仪，以波长488nm为激发源，采用透射光路，垂直入射，聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体垂直于光路，记录给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液的荧光光谱。

7.在步骤5得到的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液中逐滴滴加目标单链DNA分子待测溶液(目标单链DNA分子待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)，振荡，使样品充分杂交，得到生物样品溶液，记录随着目标单链DNA分子浓度的增大，生物样品溶液的荧光光谱的变化。F1的发射光为516～525nm，EB的吸收光为507～527nm，当目标单链DNA分子碱基序列与给受体荧光标记对标记的DNA探针分子碱基序列相匹配时，形成双链DNA，EB分子嵌入双链DNA的碱基对，与F1荧光探针发生荧光共振能量转移，随着目标单链DNA浓度的增加，F1荧光强度减弱，EB荧光强度增强。聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体的光子禁带位于518～527nm，能够将F1的发光局域在聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体内，减少F1光的损耗，使得F1能够更有效的将能量传递给EB，从而提高了检测的灵敏度，可检测出10^-13mol/L目标单链DNA分子。

实施例2

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为255nm的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为50℃，湿度为50％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体，聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构。

3.选用市售的以氨基为端基的单链DNA为探针分子，将EB加入到以氨基为端基的单链DNA探针分子的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到EB浓度为10^-4mol/L，以氨基为端基的单链DNA探针分子浓度为10^-5摩尔/升的探针分子溶液。

4.将步骤2制备得到的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体浸泡在步骤3所得到的探针分子溶液中，聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体表面羧基与氨基为端基的单链DNA探针分子的氨基充分杂化固定，然后用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液多次洗涤光子晶体，去除未杂化的DNA分子，得到单链DNA探针分子和EB填充的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体。

5.将目标单链DNA分子待测溶液(目标单链DNA分子待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)滴加在步骤4所得的单链DNA探针分子和EB填充的聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体上，然后利用荧光共聚焦显微镜，聚焦于聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)光子晶体上，检测其荧光强度。

6.当目标单链DNA分子碱基序列与单链DNA探针分子碱基序列相匹配时，EB荧光强度大幅度提高，从而实现目标单链DNA分子碱基序列的检测。EB的发光为620～625nm，步骤1所得的光子晶体的光子禁带位于625～630nm，光子晶体的光子禁带蓝带边与EB的发光分布一致，利用光子晶体光子禁带蓝带边增强EB的发光，提高检测的灵敏度，可检测出10^-13mol/L目标单链DNA分子。

实施例3

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为354nm的聚甲基丙烯酸甲酯乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为80℃，湿度为80％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体。聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构。

3.以乙醇为溶剂，浓盐酸为催化剂水解原硅酸四乙酯并进行改进制备得到SiO₂溶胶。具体方法如下：28wt％的原硅酸四乙酯3.5ml，无水乙醇10ml混合后磁搅拌下加入催化量的37wt％的浓盐酸，室温下继续搅拌4小时，即得到粒径约为20～30nm的SiO₂透明溶胶。

4.将步骤2得到的在基片上自组装排列有具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的模板垂直放置，将步骤3得到的SiO₂溶胶竖直滴在模板表面保证其表面完全润湿为止，然后室温下放置2小时使其晾干。SiO₂溶胶通过毛细管力可以渗透到紧密排列的蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的缝隙中，并在聚合物微球周围形成固体的骨架。滴填2～5次SiO₂溶胶确保蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体模板的缝隙完全填充了SiO₂纳米粒子。最后，样品以约2℃/min的速度升温到500℃，然后保持500℃约3小时，以确保完全去除蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体模板，制备得到反蛋白石结构SiO₂光子晶体。

5.用水配制浓度为10^-3mol/L异性抗体溶液，将步骤4得到的反蛋白石结构SiO₂光子晶体表面功能化，在异性抗体溶液中浸泡24小时，使得反蛋白石结构SiO₂光子晶体载体与异性抗体充分接触反应，然后用水溶液多次洗涤，除去未结合的异性抗体，然后自然干燥，形成特异性抗体包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体固相抗体。然后加入蛋白抗原待测溶液，(目标蛋白抗原待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)，使其中的蛋白抗原与特异性抗体包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体固相抗体中的特异性抗体形成抗原抗体复合物包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体。

6.选用市售的异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的与蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原具有特异响应性的抗体；用水配制浓度为10^-4mol/L的FITC荧光标记的与蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原具有特异相应性的抗体的溶液，然后将该溶液滴加在步骤5得到的抗原抗体复合物包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体上，使FITC荧光标记的与蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原具有特异相应性的抗体，与抗原抗体复合物包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体的蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原特异性响应，形成异性抗体—蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原—FITC荧光标记的与蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原具有特异相应性的抗体复合物包埋的反蛋白石结构SiO₂光子晶体。

7.利用荧光共聚焦显微镜，聚焦于异性抗体—蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原—FITC荧光标记的与蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原具有特异相应性的抗体复合物的包埋反蛋白石结构SiO₂光子晶体上，根据荧光强度，即可对蛋白抗原待测溶液中的蛋白抗原进行定量测试。FITC发射光520～530nm，明亮的黄绿色荧光，由步骤1～4所得到的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体的光子禁带位于525～535nm，反蛋白石结构的SiO₂光子晶体的光子禁带蓝带边与FITC的发光分布一致，利用光子晶体光子禁带蓝带边增强FITC的发光，提高了检测的灵敏度。

实施例4

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为306nm的聚甲基丙烯酸甲酯乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为80℃，湿度为80％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体。聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构。

3.以乙醇为溶剂，浓盐酸为催化剂水解原硅酸四乙酯并进行改进制备得到SiO₂溶胶。具体方法如下：28wt％的原硅酸四乙酯3.5ml，无水乙醇10ml混合后磁搅拌下加入催化量的37wt％的浓盐酸，室温下继续搅拌4小时，即得到粒径约为20～30nm的SiO₂透明溶胶。

4.将步骤2得到的在基片上自组装排列有具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体模板垂直放置，将步骤3得到的SiO₂溶胶竖直滴在模板表面保证其表面完全润湿为止，然后室温下放置2小时使其晾干。SiO₂溶胶通过毛细管力可以渗透到紧密排列的蛋白石结构聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体的缝隙中，并在聚合物微球周围形成固体的骨架。滴填2～5次SiO₂溶胶确保蛋白石结构光子晶体模板的缝隙完全填充了SiO₂纳米粒子。利用光降解的方法去除蛋白石结构的聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体模板，得到反蛋白石结构的SiO₂的光子晶体。

5.用水配制浓度为10^-3mol/L特异性抗体及10^-5mol/L绿色荧光蛋白溶液，然后将步骤4得到的反蛋白石结构的SiO₂的光子晶体在该溶液中浸泡24小时，取出自然干燥得到特异性抗体及绿色荧光蛋白标记分子包埋的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体。

6.将目标蛋白抗原溶液(目标蛋白抗原待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)滴加在步骤5所得到的特异性抗体及绿色荧光蛋白标记分子包埋的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体上，使其中的目标蛋白抗原与特异性抗体及绿色荧光蛋白标记分子包埋的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体中的特异性抗体形成抗原抗体复合物，得到抗原抗体及绿色荧光蛋白包埋的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体，然后利用荧光共聚焦显微镜，聚焦于抗原抗体及绿色荧光蛋白包埋的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体上，监测绿色荧光蛋白的荧光强度的变化，根据绿色荧光蛋白荧光强度，即可对目标蛋白抗原溶液实现定量检测。由步骤1～4所得到的反蛋白石结构的SiO₂光子晶体的光子禁带的长带边位于506～515nm与绿色荧光蛋白发光507～511nm相匹配，利用光子晶体的光子禁带长带边增强绿色荧光蛋白的发光，提高检测的灵敏度。

实施例5.

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为210nm的二氧化硅乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为50℃，湿度为50％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到二氧化硅光子晶体。二氧化硅光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构，光子晶体光子禁带位于518～527nm。

3.用水配制浓度为10^-3mol/L的溴乙啶(EB)溶液。

4.将荧光素(F1)标记的DNA探针分子溶液滴加在步骤3所得的EB溶液中得到给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液，其中得到的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液的浓度为10^-5mol/L。

5.将步骤2得到的二氧化硅光子晶体浸泡在步骤4所得的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液中，得到含有填充了DNA探针分子的二氧化硅光子晶体的溶液。

6.利用荧光光谱仪，以波长488nm为激发源，采用透射光路，垂直入射，二氧化硅光子晶体垂直于光路，记录给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液的荧光光谱。

7.在步骤5得到的给受体荧光标记对标记的DNA探针分子溶液中逐滴滴加目标单链DNA分子待测溶液(目标单链DNA分子待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)，振荡，使样品充分杂交，得到检测样品溶液，记录随着目标单链DNA分子浓度的增大，检测样品溶液的荧光光谱的变化。F1的发射光为516～525nm，EB的吸收光为507～527nm，当目标单链DNA分子碱基序列与给受体荧光标记对标记的DNA探针分子碱基序列相匹配时，形成双链DNA，EB分子嵌入双链DNA的碱基对，与F1荧光探针发生荧光共振能量转移，随着目标单链DNA浓度的增加，F1荧光强度减弱，EB荧光强度增强。二氧化硅光子晶体的光子禁带位于518～527nm，能够将F1的发光局域在二氧化硅光子晶体内，减少F1光的损耗，使得F1能够更有效的将能量传递给EB，从而提高了检测的灵敏度，可检测出10^-14mol/L目标单链DNA分子。

实施例6.

1.用水配制质量浓度为0.2％的单分散粒径为210nm的二氧化硅乳胶粒溶液，充分超声，使乳胶粒均匀分散。

2.以洁净的载波片为基片，在温度为50℃，湿度为50％的恒定条件下，通过竖直沉积法将步骤1得到的乳胶液沉积在基片上，在基片上自组装排列制备得到二氧化硅光子晶体。二氧化硅光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构的蛋白石结构。

3.用水配制浓度为10^-5mol/L的CdSe标记的激素分子探针的探针分子溶液。

4.将步骤2得到的光子禁带与CdSe发光峰相匹配的二氧化硅光子晶体浸泡在步骤3所得的CdSe标记的激素分子探针的探针分子溶液中，得到含有填充了CdSe标记的激素分子探针的二氧化硅光子晶体的溶液。

5.利用荧光光谱仪，以波长488nm为激发源，采用透射光路，垂直入射，二氧化硅光子晶体垂直于光路，用荧光光谱仪，记录CdSe标记的激素分子探针的探针分子溶液的发光光谱。

6.用水配制浓度为10^-4mol/L的四甲基罗丹明(TMR)溶液，将目标激素受体分子待测溶液滴加在该溶液中(目标激素受体分子待测溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升)，得到TMR标记的激素受体分子溶液。

7.将步骤6所得的TMR标记的目标激素受体分子待测溶液滴加在步骤4得到的含有填充了CdSe标记的激素分子探针的二氧化硅光子晶体的溶液中，振荡，使样品充分杂交，得到检测溶液，记录随着TMR标记的目标激素受体分子浓度的增大，检测溶液的荧光光谱的变化。CdSe的发射光为540～543nm，TMR的吸收光为539～545nm，CdSe标记的激素分子探针的CdSe与TMR标记的目标激素受体分子的TMR发生荧光共振能量转移，随着TMR标记的目标激素受体分子浓度的增加，CdSe荧光强度减弱，TMR荧光强度增强。二氧化硅光子晶体的光子禁带位于533～545nm能够将CdSe的发光局域在二氧化硅光子晶体内，减少CdSe光的损耗，使得CdSe能够更有效的将能量传递给TMR，从而提高了检测的灵敏度，可检测出10^-10mol/L目标激素受体分子。

Claims (10)

1.一种利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

(1)在水溶液中，利用单个荧光标记分子，对生物功能物质进行荧光标记，得到含有单个荧光标记分子标记的生物功能物质的水溶液；

(2)选择光子禁带带边与步骤(1)中的单个荧光标记分子标记的生物功能物质中的荧光标记分子的发光峰相匹配的光子晶体，利用光子晶体的光子禁带带边增强荧光标记分子的荧光信号的读出和辨别，从而提高检测体系的灵敏度；

(3)将步骤(1)得到的含有单个荧光标记分子标记的生物功能物质的水溶液中的单个荧光标记分子标记固定在步骤(2)的光子晶体上，得到填充了荧光标记生物功能物质的光子晶体；

(4)将目标生物物质溶液滴到步骤(3)所得到的填充了荧光标记生物功能物质的光子晶体上，对目标生物物质进行检测，通过荧光检测仪器记录荧光标记生物功能物质的荧光信号的变化，完成对目标生物物质的识别。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的含有单个荧光标记分子标记的生物功能物质的水溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～10摩尔/升。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的目标生物物质溶液的摩尔浓度为10^-16摩尔/升～1摩尔/升。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的光子晶体是具有光子禁带的周期性介电结构，自组装排列具有蛋白石结构的光子晶体或具有反蛋白石结构的光子晶体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的具有反蛋白石结构的光子晶体是以具有蛋白石结构的光子晶体为模板，利用模板法制备得到的。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是：所述的具有蛋白石结构的光子晶体是由粒径均为150nm～1.5um的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸)或二氧化硅的单分散微球自组装所制备的。

7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征是：所述的目标生物物质选自核酸、抗原抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体中的一种。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述的生物功能物质选自酶、核酸、抗原抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体中的一种。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述的单个荧光标记分子选自有机染料、发光量子点、复合型荧光纳米粒子、镧系螯合物中3价稀土镧系元素的螯合物、荧光蛋白中的一种。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是：所述的有机染料是四甲基罗丹明、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸荧光素、溴乙锭、吖啶、菲啶、荧光素、TOTO或YOYO；

所述的发光量子点是由II-VI族元素和III-V族元素组成的纳米颗粒；

所述的镧系螯合物中3价稀土镧系元素的螯合物是铕、铽或铈；

所述的荧光蛋白是藻胆色素蛋白或绿色荧光蛋白。