CN101333530A

CN101333530A - 一种凋亡相关基因及以其为靶点用于治疗白血病的药物

Info

Publication number: CN101333530A
Application number: CNA2007100434250A
Authority: CN
Inventors: 王海嵘; 陈芳源
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2008-12-31

Abstract

本发明提供了一种凋亡相关基因，所述的基因含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示的碱基序列。本发明还提供了一种载体，所述的载体中含有至少一种抑制上述所述的凋亡相关基因的RNA干扰的靶序列。本发明还提供了一种细胞，所述的细胞中含有上述所述的载体。本发明还提供了一种用于治疗白血病的药物，所述的药物中含有有效量的上述所述的RNA干扰的靶序列、或者(含有上述所述RNA干扰靶序列的)载体或者上述所述的细胞。本发明应用RNA干扰技术抑制PNAS－2，对白血病治疗具有显著的效果。

Description

一种凋亡相关基因及以其为靶点用于治疗白血病的药物

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及基因重组技术，特别是一种凋亡相关基因及以其为靶点用于治疗白血病的药物。

背景技术：

细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康，和细胞增殖一样，细胞凋亡也是受基因调控的精确过程。目前公认细胞凋亡受抑是白血病等恶性肿瘤发生的重要原因之一，临床上内科治疗恶性肿瘤的主要手段化疗就是使肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗的目的。

白血病是造血***的恶性肿瘤，由于骨髓、脾、肝等造血器官中白血病细胞过度增生、凋亡减少所致。目前白血病的治疗方法有化疗、中西医结合治疗、骨髓移植、生物调节剂治疗等方面。目前认为化疗治疗有效的主要原因在于其可促白血病细胞发生凋亡，但化疗等毒副反应大，常见耐药现象，疗效差，病人最终往往死于复发；骨髓移植的效果较佳，但需要找到合适的供者，把握好移植的时机，花费大；中西医结合、生物调节剂等疗效欠佳，只能作为辅助性治疗。因此，临床上需要找到更有效的治疗方法。随着基因组学研究的进一步深入，人们发现急性白血病的发病往往与染色体、基因异常有关，因此基因治疗被认为是潜在的、很有希望根治白血病的方法之一。

基因治疗就是向靶细胞(组织)导入外源基因，以纠正补偿或抑制某些异常或缺陷基因，从而达到治疗目的。其治疗方式可分成四类：①基因补偿：把有正常功能基因转入靶细胞以补偿缺失或失活。②基因纠正：消除原药异常基因，以外源基因取代之。③基因代偿：外源正常基因表达水平超过原药的异常基因表达水平。④反义技术：用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段或其化学修饰产物抑制或封闭异常或缺失的基因表达。基因治疗白血病作为一个新的方法正逐步从理论研究向临床试验过渡，在美国已通过II期临床试验阶段，目前基因治疗主要是应用反义寡核基酸封闭原癌基因。

反义技术是基因治疗方法中最简单明了的手段，应用反义核酸技术的主要的难点就是找到白血病发病的致病基因。CML存在特异性的致病基因：BCR/ABL融合基因，因此CML是目前应用反义核酸技术研究最多的白血病。通过现有技术的改进，使用包括BCR/ABL融合基因在内的多种反义DNA/RNA和辅助基因***，有望不久对CML基因治疗取得突破。

目前在genebank上公开了一段基因(apoptosis-related protein gene，GenBank编号：AF229832)，该基因的序列为：5′ACAATC TTG CCC AAC AGT CATTCA ACA TGG AAC AAG CCA ATT ATA CCA TCC AGT CTT TGA AGGACA CCA AGA CCA CGG TTG ATG CTA TGA AAC TGG GAG TAA AGGAAA TGA AGA AGG CAT ACA AGC AAG TGA AGA TCG ACC AGA TTGAGG ATT TAC AAG ACC AGC TAG AGG ATA TGA TGG AAG ATG CAAATG AAA TCC AAG AAG CAC TGA GTC GCA GTT ATG GCA CCC CAGAAC TGG ATG AAG ATG ATT TAG AAG CAG AGT TGG ATG CAC TAGGTG ATG AGC TTC TGG CTG ATG AAG ACA GTT CTT ATT TGG ATGAGG CAG CAT CTG CAC CTG CAA TTC CAG AAG GTG TTC CCA CTGATA CAA AAA ACA AGG ATG GAG TTC TGG TGG ATG AAT TTG GATTGC CAC AGA TCC CTG CTT CAT AGA TTT GCA TCA TTC AAG CATATC TTG TAA AAC AAA CAC ATA TTA TGG GAC TAG GAA ATA TTTATC TTT CCA AAT TTG CCA TAA CAG ATT TAG GTT TCT TTC CTTTCT TTG AAG GAA AGT TTA ATT ACA TTG CTC TTT TAT TTT TTCCAT TTA AGA GAC TCA TTG CTT GGG AAA TGC TTT CTT CGT ACTAAA TTT GAT TTC CTT TTT TCT TAT GAA AAA CGA ACT CAG TTTAAA AGT TTT TTA AGC TCG TAT GAC TTG TTT TCA TTC ATT AATAAT AAT TGA ATA AAA CTA AGG AAT GGG AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA AAA AAA A 3′，虽然该基因被命名为“凋亡相关蛋白基因PNAS-2”。但是未见研究该基因表达与细胞凋亡关系的文献。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种凋亡相关基因及以其为靶点用于治疗白血病的药物，所述的这种治疗白血病的药物要解决现有技术中的药物和技术手段治疗白血病效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种凋亡相关基因，所述的基因含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

本发还提供了一种抑制上述的凋亡相关基因的RNA干扰的靶序列，含有GT AGA GCA TCC ATT GA或者AG CAC TGA GTC GCA GTT AT的碱基序列。

本发还提供了一种载体，含有至少一种抑制上述的凋亡相关基因的RNA干扰的靶序列。

进一步的，所述的一种载体中含有RNA干扰的靶序列GT AGA GCA GAATCC ATT GA。

进一步的，所述的一种载体中含有RNA干扰的靶序列AG CAC TGA GTCGCA GTT AT。

本发还提供了一种细胞，含有上述的RNA干扰的靶序列。

本发还提供了一种细胞，含有上述的载体。

本发还提供了一种用于治疗白血病的药物，含有有效量的上述的RNA干扰的靶序列、或者上述的载体、或者上述的细胞、或者上述的细胞。

进一步的，上述所述的药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。

进一步的，上述所述的药物的剂型为粉剂、或者注射液、或者胶囊、或者片剂、或者口服液。

本发明通过RACE，得到了凋亡相关基因PNAS-2的2种不同的全长序列，这两种全长序列的染色体定位均为9p13.3，它们657bp的开放阅读框完全一致，编码的是同一条包含219个氨基酸的蛋白质。通过Real-TimePCR，发现该基因在白血病初发、复发、未完全缓解时存在高表达，而达到完全缓解时PNAS-2的表达下调至正常水平，该基因在其它肿瘤中不存在表达上调；本发明通过构建真核表达载体并转染细胞，得到高表达PNAS-2的细胞株，高表达PNAS-2细胞株的抗凋亡能力明显上调，本发明发现PNAS-2是抗细胞凋亡基因：过量表达PNAS-2基因后细胞凋亡率下降；PNAS-2基因高表达后执行细胞凋亡的caspase 3蛋白、AIF(凋亡诱导因子)蛋白等的含量下降；应用基因芯片及抗体芯片后发现PNAS-2基因高表达后通过抑制AIF介导的非caspase依赖途径及通过抑制caspase依赖途径中的Granzyme B-Perforin通路而抗细胞凋亡，并通过抑制抑癌基因参与白血病的发病；亚细胞定位研究发现PNAS-2蛋白的定位异常可能参与了细胞凋亡及白血病发生。表明高表达的PNAS-2基因及蛋白是白血病的发病因素，PNAS-2是新发现的原癌基因。

本发明应用PNAS-2靶向shRNA表达载体，转染白血病细胞后可使白血病细胞生长阻滞、显著增加白血病细胞的凋亡率，并可增加抑癌蛋白如p53、Rb的翻译从而抑制白血病细胞增殖，表明了靶向抑制PNAS-2的shRNA表达载体可用于白血病的治疗。

本发明发现PNAS-2特异性参与了白血病的发病：通过Northern Blot及Real-Time PCR，发现该基因在白血病初发、复发、未完全缓解时存在高表达，而达到完全缓解时PNAS-2的表达恢复正常水平，但该基因在其它肿瘤中不存在表达上调，提示其高表达是白血病特异的；应用抗体芯片后发现该基因及蛋白高表达后可通过抑制抑癌蛋白如p53、Rb等参与白血病的发病；该基因及蛋白高表达后可通过抑制Granzyme B-Perforin通路导致白血病细胞通过“免疫逃避”而得到进一步发展；PNAS-2蛋白在白血病细胞存在亚细胞定位异常，由此参与了白血病发生。

本发明发现抑制PNAS-2表达可治疗白血病：应用靶向针对PNAS-2的shRNA表达载体，转染后可使白血病细胞阻滞于G2期，白血病细胞的凋亡率显著增加，表明靶向抑制PNAS-2的shRNA表达的载体可用于白血病的治疗。PNAS-2特异性shRNA表达载体治疗白血病的机理为：使剪切型Caspase3、AIF及Granzyme B的含量上升，使白血病细胞发生凋亡；使p53及Rb等抑癌蛋白含量显著增加，并激活Granzyme B-Perforin通路，也是PNAS-2特异性shRNA能有效治疗白血病的机制之一。

本发明和已有技术相比，其技术进步性是显而易见的。本发明应用RNA干扰技术抑制我们发现的急性白血病特异性的致病基因PNAS-2，对白血病治疗具有显著的效果。抑制PNAS-2后白血病细胞的凋亡率显著增加；细胞周期中出现了G2期阻滞，从而使细胞有机会修复损伤的DNA，确保基因的准确遗传，阻滞白血病细胞的增殖；同时p53，Rb等原先受到抑制的抑癌蛋白含量的增加，也是抑制PNAS-2表达对白血病治疗有效的原因之一。

附图说明：

图1显示了RACE时菌落PCR的结果，M为100bp marker，A、B、C、D、E、F、G、H、I、J及K分别为不同的菌落PCR产物。

图2显示了pCR4TOPO重组质粒直接或酶切后行PCR的电泳结果，左起分别为100bp marker、质粒A的PCR产物、质粒C的PCR产物、质粒A酶切后的PCR产物、质粒C酶切后的PCR产物及500bp marker。

图3显示了PNAS-2的全长序列剪切方式1和2的ORF分析结果，F1 PNAS-2(即剪切方式1)，F2PNAS-2(即剪切方式2)，CHMP5，CGI-34，HSPC177基因5′端序列比较。

图4显示了PNAS-2的全长序列剪切方式1和2的染色体定位。

图5显示了过量表达PNAS-2后细胞凋亡率的改变，图5a为综合三次流式细胞仪检测结果得到的细胞凋亡率，对照组的细胞凋亡率为5.51±0.12％，PNAS-2-pTracer转染组的细胞凋亡率为4.07±0.30％，二者之间有显著性差异(p＜0.01)；图5b及图5c分别为激光共聚焦显微镜观察对照组和PNAS-2-pTracer转染组细胞凋亡情况的一个典型视野；从图中可大致看出对照组的凋亡率要高于PNAS-2-pTracer转染组；图5b及图5c中左上象限为收集的7-AAD荧光信号；右上象限为光镜下的细胞；左下象限为收集的Annexin V-APC荧光信号；右下象限为融合上述三个象限后得到的图像。

图6显示了过量表达PNAS-2后细胞凋亡通路的变化，图中的Gra B为Granzyme B的缩写。

图7显示了GFP融合蛋白表达载体转染细胞后的Western Blot鉴定结果。

图8显示了PNAS-2-GFP融合蛋白的亚细胞定位，图8a应用激光共聚焦显微镜可见PNAS-2-GFP融合蛋白弥漫分布于整个白血病细胞，细胞核区的融合蛋白分布似乎更为明显；与图8b相比，存在不一致，即PNAS-2-GFP融合蛋白在白血病细胞浆中的分布明显增多；图8b为文献——Diane McVey Ward，Michael B.Vaughn，Shelly L.Shiflett，et al.The Role of LIP5 andCHMP5 in Multivesicular Body Formation and HIV-1Budding in Mammalian Cells THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2005.Vol.280，No.11：p.10548-10555.中CHMP5-DsRed中PNAS-2的同源基因CHMP5的亚细胞定位，该文献显示了融合蛋白在Cos-7细胞中主要局限分布于核周小囊泡中；图8a中左图为荧光显微镜下观察到的细胞，右图为该细胞在光镜下的图像；图8b中左图为光镜下观察到的细胞，右图为该细胞在荧光显微镜下的图像。

图9显示了各shRNA位点对PNAS-2的抑制效果，M：100bpmarker；con：shRNA对照组；1：shRNA I；2：shRNA II；3：shRNA III。

图10显示了抑制PNAS-2表达后细胞周期的变化，图10a为G1期的变化情况；图10b为S期的变化情况；图10c为G2期的变化情况。

图11显示了抑制PNAS-2表达后细胞凋亡率的改变，图11a为综合三次实验结果；图11b、图11c及图11d分别为激光共聚焦显微镜检测shRNA对照组、shRNA I组与shRNA II组细胞凋亡率的视野之一。

图12显示了抑制PNAS-2后的抑癌蛋白及凋亡相关蛋白的变化。

具体实施方式：

实施例1凋亡相关基因PNAS-2的全长序列的获得及基因信息学研究

1，细胞培养：NB4急性早幼粒细胞白血病细胞株，由上海市血液学研究所提供。细胞置于含10％小牛血清的RPMI 1640中，于37℃，5％CO2湿空气中培养，每3天传代1次，实验时取对数生长期细胞。

2，总RNA抽提，RNA完整性检测：取5×10⁶个NB4细胞加入15ml离心管中，于低温离心机中以1500rpm，4℃离心，弃上清。细胞沉淀用冰PBS缓冲液(PH 7.4)洗涤后再次离心，弃上清。加入1ml Trizol，吹打混匀后转入1.5ml EP管中，室温静置5min，然后加入氯仿200μl，剧烈振荡15-30秒，使液体充分混匀，室温静置2-3分钟。低温离心机4℃，12000rpm离心20分钟，吸取上层无色透明水相液(约500-600μl)转移至另一DEPC处理过的1.5ml EP管中，加等量体积异丙醇，混匀，-40℃静置1小时，取出后于4℃12000rpm离心20分钟，弃上清，加入1ml75％乙醇，混匀，4℃12000rpm离心20分钟，取出后除去上清，室温自然干燥至总RNA沉淀透明(约需15分钟)，加入15μl DEPC处理过的水溶解。取1μl总RNA于1.0％琼脂糖凝胶行电泳，可见3条清晰条带(28s，18s，5s)，表明所提取的RNA没有降解，符合进一步实验的要求。

3，5′cDNA末端快速扩增法：使用Invitrogen公司的GeneRacer Kit行5′cDNA末端快速扩增法(5′RACE)，具体参见说明书，步骤如下：

3.1总RNA脱磷酸：10×CIP buffer 1μl，RNaseOut(40u/μl)1μl；小牛小肠碱性磷酸酶(CIP.10u/μl)1μl，总RNA(2μg/μl)5μl，DFPC处理过的水2μl；混匀，瞬时离心，50℃孵育1小时。

3.2沉淀RNA：脱磷酸后加入90μl DEPC处理过的水，100μl苯酚∶氯仿(25∶24)，剧烈混匀，室温下以13000rpm离心5min；转移上层水相至新的EP管中，加入10mg/ml的贻贝糖原(Mussel Glycogen)2μl，3M的醋酸钠10μl，混匀后再加入95％的乙醇220μl。置于-40℃10min。13000rpm离心20min，弃上清，加500μl 70％的乙醇，颠混；4℃，13000rpm离心2min，弃上清，再次4℃13000rpm离心2min以收集乙醇；小心去除残留乙醇，室温空气干燥2分钟，用7μl DEPC处理过的水溶解RNA。

3.3mRNA脱帽反应：上述7μl RNA中加入10×TAP Buffer 1μl，TAP(0.5u/μl)1μl，RnaseOut(40u/μl)1μl；混匀，瞬时离心，37℃孵育1小时。再次沉淀RNA，方法同3.2。

3.4连接RNA寡核苷酸至脱帽的mRNA：加7μl脱磷酸、脱帽反应后的mRNA至含有250ng RNA寡核苷酸(GeneRacer RNA Oligo，序列为5′-CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGUAGAAA-3′)的管中，混匀，瞬时离心，65℃5min以去除RNA二级结构，置于冰上2min，加入10×Ligaes Buffer 1μl；10Mm ATP 1μl；RnaseOut(40u/μl)1μl；T4RNA连接酶(5u/μl)1μl。37℃孵育1小时。再次沉淀RNA，方法同3.2。

3.5逆转录mRNA：连接有RNA寡核苷酸的mRNA 10μl，GeneRacerOligo dT Primer(序列为5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGCATG ACA GTG(T)24-3′)1μl，dNTP Mix(25μM each)1μl，ddH₂O 1μl；65℃5min以去除RNA二级结构，置于冰上2min，瞬时离心。在上述13μl反应体系中加入5×First Strand Buffer 4μl，0.1M DTT 1μl，SuperScriptIII逆转录酶(200u/μl)1μl，RnaseOut(40u/μl)1μl；轻柔混匀，瞬时离心，50℃1h进行逆转率，72℃15min灭活逆转录反应，4℃5min结束。瞬时离心。

3.6去除残留RNA：连接有GeneRacer RNA Oligo的mRNA完成逆转录后，在反应体系中加入2u/μl的RNase H 1μl，37℃20min孵育以去除残留的RNA。瞬时离心。

4.巢式PCR

使用TAKARA公司的高保真Taq酶(TAKARA LA Taq)，按说明书操作。引物设计使用的软件为Primer Premier 5，PNAS-2下游引物1：5′CGAAGA AAG CAT TTC CCA AGC 3′，位于该基因PNAS-2原先序列的第584-604bp；PNAS-2下游引物2：5′CTC CCA GT TTC ATA GCA T 3′，位于原先序列的第82-99bp；PNAS-2下游引物3：5′GAC TGT TGG GCAAGATTG T 3′，位于原先序列的第1-19bp。引物均由上海生工公司合成；上游引物1是GeneRacer 5′Primer：5′CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACTGA 3′，上游引物2为GeneRacer 5′Nested Primer：5′GGA CAC TGA CATGGA CTG AAG GAG TA 3′。PCR反应条件均为为94℃2min；94℃30s，72℃2min，循环4次；94℃30s，70℃2min，循环4次；94℃30s，60℃30s，72℃2min，循环19次；72℃20min，4℃20min结束反应。

5.TOPO TA克隆

TOPO TA克隆试剂盒(TOPO TA Cloning Kit for Sequencing)购自Invitrogen公司。取新鲜巢式PCR产物4μl，Salt Solution 1μl，pCR4-TOPO质粒载体1μl，室温孵育5min后置于冰上。

6.转化化学感受态细菌

加2μl TOPO TA克隆产物至化学感受态细菌(One Shot ChemicallyCompetent E.coli)中，轻柔混匀，42℃30s热休克细菌后立即置于冰上，加250μl室温S.O.C培养基，37℃200rpm振荡摇菌1h。取菌液50μl，铺在含氨苄青霉素50μg/ml的LB平板上。37℃孵育过夜后可见在LB平板上有多个细菌克隆形成，挑选11个形态饱满、典型的单个菌落置于含氨苄青霉素100μg/ml的LB选择培养基中振摇过夜。然后取摇菌产物1μl行菌落PCR，引物：上游引物为GeneRacer 5′Nested Primer(同前)，下游引物使用与巢式PCR不同且更靠近5′端的PNAS-2下游引物3(同前)，该下游引物位于原先序列的第1-19bp。结果可见11个菌落PCR产物均在三百多bp处，但C菌落PCR产物比其它产物略长(如图1所示)。

7.质粒抽提

使用QIAGEN公司的QIAprep spin mimiprep kit从摇菌产物A和C中抽提质粒。质粒抽提的实验步骤如下：取3-5ml菌液置于15ml离心管中，4000rpm离心5min，弃上清，用250μl buffer P1重新悬浮细菌沉淀，并转至1.5ml的EP管中。加入250μl buffer P2后轻柔颠混EP管6次。加入350μl buffer N3，立即轻柔颠混EP管6次。之后在台式离心机(Effendorf Minispin)上以12000rpm离心10min。将上清液转入QIAprep离心柱中，12000rpm离心1min，弃下清。在QIAprep离心柱中加入0.5mlbuffer PB，12000rpm离心1min，弃下清。在QIAprep离心柱中加入0.75ml buffer PE，12000rpm离心1min，弃下清。再次12000rpm离心1min以去除残留的洗涤缓冲液。将QIAprep离心柱放入一干净的1.5ml离心管中，将50μl buffer EB加入QIAprep离心柱中，静置1min，12000rpm离心1min，收集的管底液体即为质粒。

8.质粒的鉴定及测序

根据pCR4TOPO质粒载体在***位点两侧均有限制性内切酶EcoR I的特点，限制性内切酶EcoR I酶切质粒后进行PCR验证质粒是否含有***序列。酶切体系为20μl，包括：10×EcoR I buffer 2μl，质粒10μl，EcoRI酶2μl，灭菌水6μl。37℃90min进行酶切，65℃20min灭活。结果示摇菌产物C中提取的质粒直接或酶切后的PCR产物均略长于摇菌产物A的PCR产物(如图2所示)。上述结果提示在NB4细胞株中，PNAS-2基因的5′端存在两种不同长度的剪切形式。选择质粒送上海生工测序，测序后拼接结果见下：

PNAS-2全长序列剪切方式1(如SEQ ID NO：1所示)(下划线部分为5′RACE扩增出的部分，粗体字部分为原先的PNAS-2序列)：5′T TCC GTT TCT GGT TTT GCT CTA GTG TTT GGG TTT CTTC GCG GCT GCT CAAG ATG AAC CGA CTC TTC GGG AAA GCG AAA CCC AAG GCT CCG CCG CCC AGC CTG ACT GAC TGC ATT GGC ACG GTG GAC AGT AGA GCA GAA TCC ATT GAC AAG AAG ATT TCT CGA TTG GAT GCT GAG CTA GTG AAG TAT AAG GAT CAG ATC AAG AAG ATG AGA GAG GGT CCT GCA AAG AAT ATG GTC AAG CAG AAA GCC TTG CGA GTT TTA AAG CAA AAG AGG ATG TAT GAG CAG CAG CGGG ACA ATCTTG CCC AAC AGT CAT TCA ACA TGG AAC AAG CCA ATT ATA CCATCC AGT CTT TGA AGG ACA CCA AGA CCA CGG TTG ATG CTA TGAAAC TGG GAG TAA AGG AAA TGA AGA AGG CAT ACA AGC AAG TGAAGA TCG ACC AGA TTG AGG ATT TAC AAG ACC AGC TAG AGG ATATGA TGG AAG ATG CAA ATG AAA TCC AAG AAG CAC TGA GTC GCAGTT ATG GCA CCC CAG AAC TGG ATG AAG ATG ATT TAG AAG CAGAGT TGG ATG CAC TAG GTG ATG AGC TTC TGG CTG ATG AAG ACAGTT CTT ATT TGG ATG AGG CAG CAT CTG CAC CTG CAA TTC CAGAAG GTG TTC CCA CTG ATA CAA AAA ACA AGG ATG GAG TTC TGGTGG ATG AAT TTG GAT TGC CAC AGA TCC CTG CTT CAT AGA TTTGCA TCA TTC AAG CAT ATC TTG TAA AAC AAA CAC ATA TTA TGGGAC TAG GAA ATA TTT ATC TTT CCA AAT TTG CCA TAA CAG ATTTAG GTT TCT TTC CTT TCT TTG AAG GAA AGT TTA ATT ACA TTGCTC TTT TAT TTT TTC CAT TTA AGA GAC TCA TTG CTT GGG AAATGC TTT CTT CGT ACT AAA TTT GAT TTC CTT TTT TCT TAT GAAAAA CGA ACT CAG TTT AAA AGT TTT TTA AGC TCG TAT GAC TTGTTT TCA TTC ATT AAT AAT AAT TGA ATA AAA CTA AGG AAT GGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′

PNAS-2全长序列剪切方式2(如SEQ ID NO：2所示)(下划线部分为5′RACE扩增出的部分，粗体字部分为原先的PNAS-2序列)：5′A GTG TTT GGG TTT CCT CGC GGC TGC TCAAG ATG AAC CGA CTC TTC GGG AAA GCG AAA CCC AAG GCT CCG CCG CCC AGC CTG ACT GAC TGC ATT GGC ACG GTG GAC AGT AGA GCA GAA TCC ATT GAC AAG AAG ATT TCT CGA TTG GAT GCT GAG CTA GTG AAG TAT AAG GAT CAG ATC AAG AAG ATG AGA GAG GGT CCT GCA AAG AAT ATG GTC AAG CAG AAA GCC TTG CGA GTT TTA AAG CAA AAG AGG ATG TAT GAG CAG CAG CGGG ACA ATC TTG CCC AAC AGT CAT TCAACA TGG AAC AAG CCA ATT ATA CCA TCC AGT CTT TGA AGG ACACCA AGA CCA CGG TTG ATG CTA TGA AAC TGG GAG TAA AGG AAATGA AGA AGG CAT ACA AGC AAG TGA AGA TCG ACC AGA TTG AGGATT TAC AAG ACC AGC TAG AGG ATA TGA TGG AAG ATG CAA ATGAAA TCC AAG AAG CAC TGA GTC GCA GTT ATG GCA CCC CAG AACTGG ATG AAG ATG ATT TAG AAG CAG AGT TGG ATG CAC TAG GTGATG AGC TTC TGG CTG ATG AAG ACA GTT CTT ATT TGG ATG AGGCAG CAT CTG CAC CTG CAA TTC CAG AAG GTG TTC CCA CTG ATACAA AAA ACA AGG ATG GAG TTC TGG TGG ATG AAT TTG GAT TGCCAC AGA TCC CTG CTT CAT AGA TTT GCA TCA TTC AAG CAT ATCTTG TAA AAC AAA CAC ATA TTA TGG GAC TAG GAA ATA TTT ATCTTT CCA AAT TTG CCA TAA CAG ATT TAG GTT TCT TTC CTT TCTTTG AAG GAA AGT TTA ATT ACA TTG CTC TTT TAT TTT TTC CATTTA AGA GAC TCA TTG CTT GGG AAA TGC TTT CTT CGT ACT AAATTT GAT TTC CTT TTT TCT TAT GAA AAA CGA ACT CAG TTT AAAAGT TTT TTA AGC TCG TAT GAC TTG TTT TCA TTC ATT AAT AATAAT TGA ATA AAA CTA AGG AAT GGG AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAAAAAAAAAAAA3′

9.RACE结果的验证：

为了验证在NB4细胞株中存在F1PNAS-2及F2PNAS-2基因序列，我们在靠近PNAS-2全长序列剪切方式1和2的5′末端处设计引物。全长序列剪切方式1的上游引物为5′CCG TTT CTG GTT TTG CTC TAG TGTT 3′；全长序列剪切方式2的上游引物为5′GCA TTG GCA CGG TGG ACAGTA GAG C 3′。下游引物均为：5′GTG GGAACA CCT TCT GGAAT 3′。根据设计的引物可以推断，扩增出的全长序列的剪切方式1的PCR产物长度约在650bp，全长序列的剪切方式2的PCR产物长度约在520bp。以NB4细胞的RT产物为模板，PCR条件：94℃2min；94℃45s，60℃45s，72℃45s，循环30次；72℃10min，4℃10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上行电泳后可见两种剪切方式PCR产物的长度在我们估计范围之内，表明RACE的结果是可靠的。

10.全长PNAS-2基因信息学分析

5′RACE结果显示凋亡相关基因PNAS-2的mRNA在急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4中存在两种不同的剪切形式，PNAS-2的全长序列剪切方式1除了在5′端比剪切方式2多出21bp外其它序列二者完全一致。剪切方式2的5′端第一个碱基为“A”，符合真核生物mRNA第一个甲基化碱基通常为“G”或“A”的形式；虽然剪切方式1的5′端第一个碱基为“T”，但不可能是混入的RNase破坏mRNA后形成的，因为RNase作用后形成的mRNA的5′端是羟基而不是磷酸基，而5′端羟基是不能连接上寡核苷酸的，因此我们认为剪切方式1是另一种剪切形式。由于PNAS-2原先已知序列中已出现“AATAAA”序列且其后存在“Poly A”结构，这是真核生物转录终止的典型结构，故我们未再行3′RACE。

BLAST比对分析〔http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站中的Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)〕后我们发现剪切方式1和2与CHMP5(genbank编号：NM_016410)，SNF7DC2基因(Homo sapiens SNF7domain containing 2，Genbank编号分别为BC007457、BC021168、BC020796、BC006974)，Homo sapiens CGI-34protein mRNA(Genbank编号为AF132968)，HSPC177(Genbank编号为AF161525)等的全长序列均存在有98-99％的同源性。剪切方式1和2与上述基因的657bp的“开放读码框”(Open Reading Frame，ORF)完全一致(如图3所示，其启始ATG的位点完全一致，启始ATG后的序列完全一致，且从启始ATG到第一个出现的终止密码子TAG之间657bp的“ORF”序列完全一致(图中未完全显示)，提示这些基因编码的是同一蛋白质，提示上述基因是同源基因)，表示它们编码的是同一条包含219个氨基酸的蛋白质(如SEQ IDNO：3所示)，上述基因是同源基因。编码的蛋白质序列见下：(N端)MNR LFG KAK PKA PPP SLT GCI GTV DSR AES IDK KIS RLD AEL VKYKDQ IKK MRE GPA KNM VKQ KAL RVL KQK RMY EQQ RDN LAQ QSF NME QAN YTIQSL KDT KTT VDA MKL GVK EMK KAY KQV KID QIE DLQ DQL EDM MED ANE IQEALS RSY GTP ELD EDD LEA ELD ALG DEL LAD EDS SYL DEA ASA PAI PEG VPTDTK NKD GVL VDE FGL PQI PAS(C端)。

应用NCBI网站中的人类基因组BLAST对全长PNAS-2的染色体定位进行了研究，发现全长PNAS-2定位于9p13.3，与CHMP5等基因的染色体定位一致(图4，由左图可见全长PNAS-2(图中标记部分)定位于9号染色体p13.3。右图为9号染色体短臂的局部放大，由于全长PNAS-2剪切方式1的序列暂未上传至Genbank数据库，故染色体定位图上显示的基因是其同源基因CHMP5。

PNAS-2基因的命名是由于原先PNAS-2序列编码的蛋白质与一条与本发明细胞凋亡有关的蛋白质有高度同源性，故取名为“凋亡相关蛋白基因PNAS-2”。由于行RACE后得到的全长PNAS-2的蛋白质表达序列与原先PNAS-2编码的蛋白质相比可能会有移位，这样的话全长PNAS-2可能与凋亡相关的蛋白质没有同源性，全长PNAS-2可能与细胞凋亡没有关系。在我们对PNAS-2基因信息进行了分析后，发现原先的启始“ATG”与全长PNAS-2的启始“ATG”之间有261个碱基，为3的整数倍，因此，原先推测的PNAS-2蛋白正好是全长PNAS-2蛋白的一部分，故原先对PNAS-2的命名是正确的，也提示全长PNAS-2的功能可能与细胞凋亡有关。

实施例2本发明的凋亡相关基因PNAS-2与细胞凋亡的关系研究

虽然原先的PNAS-2被命名为“凋亡相关基因”，但没有关于该基因与细胞凋亡关系的实验研究。虽然我们发现全长PNAS-2与CHMP5等基因是同源基因，也未见CHMP5等与细胞凋亡关系的实验研究。

1.PNAS-2的表达与细胞凋亡的关系

1.1高保真PCR及PCR产物的回收、纯化：根据我们先前行5′RACE得到的PNAS-2全长序列，使用Primer Premier 5设计引物，并在上、下游引物的5′端加上Bst X I酶切位点及保护性碱基(下面小写字部分)，上游引物为：5′tag cca gtg tgg tgg TGC TCAAGATGAACC GAC TCT 3′，下游引物为：5′tgt cca ctg tgc tgg CGA AGA AAG CAT TTC CCA AGC 3′，按照设计，PCR后我们可得到一段编码完整PNAS-2蛋白的DNA序列，PCR产物长851bp。使用TAKARA公司的高保真Taq酶(LATaq)，按说明书配置PCR反应体系。PCR的反应条件为94℃4min；94℃45s，55℃1min，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延伸10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。琼脂糖凝胶电泳后使用北京鼎国生物公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收、纯化851bp的PCR产物，操作的步骤如下：紫外灯下切取含DNA片段的琼脂糖(100mg-300mg)并移入1.5ml EP管中，用移液器吸头捣碎后按切取重量：溶液A的体积比为1：3的比例加入溶液A。65℃水浴5-10min，振荡2次，待胶完全融化后置室温，加入15μl溶液B，充分混匀后转入离心柱中，静置2min，10000rpm30s，弃下清。加500μl溶液C于离心柱中，10000rpm 30s，弃下清。重复此步骤一次。12000rpm再次离心1min，弃下清。将离心柱装入新的离心管中，敞开离心管管口室温静置10min。加入20μl 50℃水浴预热的溶液D，静置2min，13000rpm离心1min，管底液体即为回收的DNA。

1.2Bst XI限制性内切酶单酶切：使用MBI公司的限制性内切酶BstXI分别酶切PCR产物及真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd(购自Ivitrogen公司)，琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化酶切产物。酶切后的PCR产物及pTracer-CMV/Bsd质粒使用T4DNA连接酶(MBI公司)相连接，对照质粒为pTracer-CMV/Bsd空质粒。

1.3感受态细胞的转化及阳性菌落的筛选：取新鲜TOPO 10感受态菌200μl，加2μl连接物，混匀，冰上放置30min。42℃热休克30s，冰上放置2min。加入250μl S.O.C培养基，37℃200rpm振摇1h。取40μl涂抗氨苄青霉素琼脂平板，37℃过夜后选择典型的单个菌落扩菌。

1.4测序鉴定：使用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒抽提质粒，送上海生工生物公司测序，测序结果证实我们成功构建了PNAS2-pTracer重组质粒。

1.5细胞转染及筛选：测序得到含正确构建的PNAS-2-pTracer质粒的细菌，使用QIAprep Spin Miniprep Kit抽提细菌中的质粒(方法同前)。紫外分光光度计定量后各取1μg PNAS-2-pTracer质粒及pTracer空质粒，使用Superfect transfection reagent(购自Qiagen公司)转染质粒至U937细胞，转染的大致步骤如下：将培养的细胞转至15ml离心管中，4℃1500rpm离心5min，弃上清。在细胞沉淀中加入RPMI 1640培养基，调节细胞浓度至2×10⁶/ml，取1.6ml细胞悬液分别加入6孔板中。用PH7-8的TE缓冲液稀释2μg的质粒DNA(稀释后的最低浓度为0.1μg/μl)，加不含血清及抗生素的RPMI 1640至100μl，混匀，瞬时离心。加8μl Superfectreagent至质粒DNA液中，用移液器吹打5次后置室温孵育10min。加入400μl含血清及抗生素的RPMI 1640至上述转染复合物中，用移液器吹打2次，立即用移液器滴入6孔板中。实验分3组，PNAS-2-pTracer组、对照组即con-pTracer组及未转染组。转染后48h加含5μg/ml杀稻瘟菌素及10％胎牛血清的RPMI 1640培养液2ml进行筛选，2周后可见转染组均有***相细胞并形成集落，而未转染组的细胞几乎全部死亡。根据pTracer-CMV/Bsd质粒带GFP这一特点，在转染第28天使用流式细胞仪分选出GFP阳性细胞，继续培养。

1.6半定量PCR鉴定PNAS-2过量表达效果：TRIZOL法抽提PNAS-2-pTracer组及con-pTracer组细胞的总RNA，使用SuperScript III逆转录酶进行逆转录。PCR使用的PNAS-2上游引物为：5′GAG CAG CAGCGG GAC AAT 3′，下游引物；5′GTG GGA ACA CCT TCT GGA AT 3′。以β-actin为内参照，上游引物：5′TCG ACA ACG GCT CCG GCA T 3′，下游引物：5′AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC 3′。94℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后使用复日凝胶成像***分析PNAS-2及β-actin的灰度值。我们发现PNAS-2-pTracer组中PNAS-2基因的表达较con-pTracer组升高1.73倍。

1.7凋亡检测：检测细胞凋亡时磷脂酰丝氨酸外翻的Annexin V-APC及核染料7-AAD(7-Amino-actinomycin)均购自BD PharMingen公司。检测细胞凋亡的操作步骤大致为：收集2×10⁵细胞，PBS洗涤2次，重新悬浮于1×Binding Buffer，加5μl Annexin V-APC，避光孵育15min后加5μl7-AAD，继续避光孵育5min；1小时内流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测。FCM检测Annexin V-APC时使用FL-4通道，用远红外通道(650nmlong-pass filter)检测7-AAD荧光，重复实验三次，配对t检验结果示对照组的凋亡率为5.51±0.12％，PNAS-2-pTracer转染组为4.07±0.30％(p＝0.0096＜0.01)，表明PNAS-2过量表达可致细胞凋亡率下降。使用激光共聚焦显微镜检测凋亡时，Annexin V-APC的激发波长(EX)为633nm，检测波长(EM)为700-780nm；7-AAD的EX为543nm，EM为560-615nm。随机取视野，计数至少200个细胞，计算Annexin V-APC(+)/7-AAD(-)和Annexin V-APC(+)/7-AAD(+)细胞占细胞总数的百分比。得到对照组的细胞凋亡率为6.90％，PNAS-2-pTracer转染组的细胞凋亡率为3.76％，实验组的细胞凋亡率与对照组相比下降，表明PNAS-2过量表达确实可致细胞凋亡率下降，说明PNAS-2是抗细胞凋亡基因(如图5所示)。

2，PNAS-2抗细胞凋亡的途径

2.1蛋白质抽提：各取PNAS-2-pTracer转染组及con-pTracer转染组细胞约1×10⁷左右，悬浮细胞总蛋白抽提试剂盒购自上海康成生物工程公司，按说明书操作。

2.2.BCA蛋白质定量：蛋白质定量试剂盒购自上海康成生物工程公司，按说明书操作。

2.3生物素标记蛋白样品：取1mg生物素反应物，溶解于0.1ml DMF，终浓度为10mg/ml，取不超过200μg的蛋白样品，用标记缓冲液稀释到50μl。在200μg蛋白样品中加入29μg生物素标记物，生物素标记物和蛋白样品的比值保持在1∶7。混合均匀，在室温振荡孵育2h。

2.4纯化生物素标记的蛋白：反复颠倒纯化柱，使胶重悬后将纯化柱放入2ml收集管中，通过重力作用使其干燥。倒掉收集管中的溶液，重新将纯化柱放入2ml收集管，使用Eppendorf台式离心机，4000rpm离心4min，倒掉溶液。将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中，小心地将生物素标记蛋白样品加到纯化柱子的中心。4000rpm离心4min，收集纯化的生物素标记的蛋白样品。

2.5生物素标记的蛋白样品与芯片杂交：将抗体芯片(AntibodyMicroArray，购自美国LAB VISION公司)浸在封闭缓冲液中室温孵育30min以封闭抗体芯片。将芯片放在纸巾上，空气中干燥。在生物素标记的蛋白样品中加入杂交缓冲液，终体积为100μl。将芯片放入潮湿的片匣中，缓慢的将盖玻片覆在芯片上，小心地向盖玻片下杂交区内加入样品，在室温下孵育2h。将芯片从潮湿的片匣中取出，浸入50ml洗液中，洗掉盖玻片。

2.6芯片结果检测：在50ml离心管中加入约40ml洗液，将芯片浸入，室温下摇动10min。共清洗三次，每次更换新的洗液。将芯片取出，放在纸上，小心快速地从芯片边缘将液体吸干(芯片杂交区要保持湿润)。揭掉检测匣的塑料衬垫后小心地将检测匣放在芯片上，通过检测匣的一个孔，缓慢的向匣内加入约1000μl链亲和素。将芯片放在架子上，室温孵育45min后取下检测匣，在50ml锥形离心管中加入洗液，将芯片浸入，以60rpm低速连续摇动清洗芯片。将芯片浸入50ml锥形离心管中的35ml洗液中，室温，60rpm连续摇动10min以清洗芯片。重复此步骤步3次。将芯片取出，放在纸上，小心快速地从芯片边缘将液体吸干，但芯片杂交区要保持湿润。揭掉检测匣的塑料衬垫后小心地将检测匣放在芯片上，通过检测匣的一个孔，缓慢的向匣内加入约1000μl抗体-Cy3检测试剂。将芯片放在架子上，室温孵育45min。在50ml锥形离心管中加入洗液，将芯片浸入，以60rpm低速连续摇动清洗芯片。将芯片浸入50ml锥形离心管中的35ml洗液中，室温，60rpm连续摇动10min以清洗芯片。重复此步骤步3次。在50ml离心管中加入ddH₂O，小心迅速的将芯片浸入后取出，空气干燥。

2.7扫描及标准化：使用Genepix 4000B于532nm激发后进行图像扫描。用Genepix Pro 6.0分析软件读取芯片上每个点的数值，获得数据文件后根据三次重复的点的信号强度并计算均值，取均值的中位数做标准化后获得标准值。将两张需比较的芯片的标准值相比，获得比值，根据比值筛选上调及下调1.5倍的蛋白。

2.8芯片结果分析：PNAS-2基因高表达后执行细胞凋亡的caspase 3蛋白、AIF蛋白等的含量下降，表明细胞凋亡途径受抑，再次证实PNAS-2是抗细胞凋亡基因；PNAS-2过量表达后也抑制了Granzyme B及Perforin蛋白的表达，表明溶酶体凋亡途径中的AIF通路及Granzyme B-Perforin通路被抑制，高表达的PNAS-2通过抑制溶酶体凋亡途径抑制细胞凋亡。因此，PNAS-2基因高表达后通过抑制AIF介导的非caspase依赖途径及通过抑制caspase依赖途径中的Granzyme B-Perforin通路抗细胞凋亡。(如图6所示，显示了经典内外源性凋亡通路中的caspase9，caspase8的含量没有变化，提示上述经典通路没有改变。)

实施例3本发明的凋亡相关基因PNAS-2的表达与白血病发病的关系

目前未见PNAS-2及其同源基因如CHMP5等与白血病发病关系的实验研究。

1.RealTime PCR方法检测PNAS-2在患者中的表达

1.1病例收集：患者均为上海交通大学医学院附属仁济医院的住院及门诊患者。其中包括：①、初发急性白血病患者样本44例，其中急性淋巴细胞白血病9例；急性髓细胞白血病35例，包括M2患者3例，M3患者8例，M4患者18例，M5患者6例。②、完全缓解(CR)样本27例，包括4例M2患者，18例M3，1例M4，2例M5及2例ALL患者。③、复发样本12例，分别为2例M2，5例M3，4例M4和1例ALL患者。④、未CR样本9例，包括2例M3，3例M4，3例M5，1例ALL。⑤、非白血病患者样本66例，包括42例非肿瘤性疾病患者和24肿瘤性疾病患者。以上样本均为骨髓液或外周血，分离出单个核细胞后检测PNAS-2基因的表达。⑥此外还取了31例接受手术治疗的恶性肿瘤患者的组织标本，标本取自癌组织和正常组织，组织样本均由病理科医师明确诊断。

1.2单个核细胞的分离：采集患者骨髓液或外周血3-5ml，肝素抗凝。Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精高科技生物有限公司)分离单个核细胞。操作如下：抗凝骨髓液或外周血用等量生理盐水稀释后，沿管壁缓慢加入已放有4-6ml Ficoll淋巴细胞分离液的试管中，2500rpm室温离心20min，吸出单个核细胞层，用生理盐水洗涤两次。如混杂有红细胞，用4-6ml红细胞裂解液4℃放置8min，1500rpm离心5min，沉淀加入5ml生理盐水洗涤。分离出的单个核细胞中幼稚细胞的比例在90％以上，计数板计数，分装后液氮存储备用。

1.3总RNA抽提、RNA完整性检测及cDNA合成：操作同前。

1.4引物设计：使用引物设计软件Primer Premier 5设计引物。PNAS-2上游引物为：5′CAG AAA GCC TTG CGA GTT 3′，下游引物为：5′ACCGTG GTC TTG GTG TCC 3′，产物长度131bp。RPII〔NM 000937Homosapiens polymerase(RNA)II(DNA directed)polypeptide A〕作为参照，其上游引物为：5′gCA CCA CgT CCA ATg ACA T 3′，下游引物为：5′gTg CggCTg CTT CCA TAA 3′，产物长度267bp。

1.5Real Time PCR检测：使用TaKaRa公司的Real Time PCR试剂盒，Real Time PCR仪为ABI 7900HT(ABI公司)。实时定量PCR反应采用10μl体系，384孔板，3复孔，并用U937细胞株的RT产物作为校准样本，在冰上按说明进行如下操作：SYBR Premix Ex Taq TM(2X)5μl，ROX 0.2μl，10uM上游引物0.2μl，10uM下游引物0.2μl，cDNA模板1.0μl，ddH2O3.4μl；混匀后瞬时离心，置PCR仪上进行反应，反应条件：95℃10s；95℃5s，60℃30s，40个循环。在实时荧光定量PCR反应的后期，产物经融解、冷却后得到融解曲线。反应结束后，使用Real Time PCR仪自带的SDS 2.1软件分析实验结果。

1.6患者中PNAS-2相对含量的检测：根据每例样本3复孔的CT值，减去同一384孔板上的校准样本的CT值，分别得到PNAS-2的delta CT(ΔCT)平均值及RPII的ΔCT平均值。用PNAS-2的ΔCT平均值减去其对应RPII的ΔCT平均值得到的即为PNAS-2的delta delta CT(ΔΔCT)，ΔΔCT值越小，表明PNAS-2基因的表达越高；反之则表明PNAS-2基因表达越低。

1.7RealTime PCR的结果：PNAS-2及RP II的融解曲线成单峰，说明扩增产物单一。PNAS-2在44例初发急性白血病患者样本中的(ΔΔCT值为-3.02±1.85)表达显著高于27例CR患者样本(ΔΔCT值为0.99±1.85)，p＝0.0000。与27例CR样本相比，PNAS-2在9例未CR(ΔΔCT值为-2.25±1.04)和12例复发急性白血病患者样本中的表达(ΔΔCT值为-3.11±1.68)也显著高于CR样本(p值均为0.0000)；但初发、复发及未CR患者样本两两之间并无统计学差异(p值均大于0.05)(见表1)。

表1团体t检验的结果1：样本来源于外周血或骨髓液的单个核细胞。

P值	初发	未CR	复发	CR	非肿瘤性疾病
P值	初发	未CR	复发	CR	非肿瘤性疾病	未CR	0.0890
复发	0.8891	0.1921				未CR	0.0890

CR	0.0000
CR	0.0000			非肿瘤性疾病	0.0000	0.0011	0.0000	0.0675
肿瘤性疾病	0.0001	0.3770	0.4572	非肿瘤性疾病	0.0000	0.0011	0.0000	0.0675

初发、复发及未CR样本中PNAS-2表达也显著高于44例非肿瘤性疾病患者的单个核细胞样本(ΔΔCT值为0.10±1.97)及22例肿瘤患者的单个核细胞样本(ΔΔCT值为0.49±2.11)，p值均小于0.01。PNAS-2的表达随着急性白血病病人的病程改变而变化且具有统计学意义：即初发时高表达，完全缓解后表达下调，复发时PNAS-2的表达又上升。PNAS-2在肿瘤患者的癌组织、正常组织中的表达显著低于初发、复发及未CR患者且有统计学意义。癌组织(ΔΔCT值为0.10±1.94)和正常组织(ΔΔCT值为0.55±1.89)之间PNAS-2的表达并无统计学差异(p＝0.0907)。癌组织、正常组织与CR样本、非肿瘤患者样本及肿瘤患者样本之间无统计学差异(p值均大于0.05)，均处于低水平表达(见表2)。

表2.团体t检验的结果2：初发、未CR、复发、CR、非肿瘤性疾病及肿瘤性疾病患者标本来自单个核细胞，癌组织和正常组织标本来自恶性肿瘤患者的组织样本。

p值	癌组织	正常组织
p值	癌组织	正常组织	初发	0.0000	0.0000
未CR	0.0000	0.0002	初发	0.0000	0.0000

复发	0.0014	0.0146
复发	0.0014	0.0146	非肿瘤性疾病	0.9843	0.1552
肿瘤性疾病	0.4737	0.0586	非肿瘤性疾病	0.9843	0.1552

2.PNAS-2高表达后与肿瘤发生有关蛋白的变化

2.1抗体芯片中抑癌蛋白的变化：抗体芯片的操作同前。PNAS-2过量表达后抑癌蛋白APC(Adenomateous Polyposis Coli)、BRCA2、CD84、FHIT(Fragile Histidine Triad)、p 130/Rb2、p14^ARF/p16Beta、p53、Retinoblastoma(Rb)、Wilm Tumor Protein(WT1)下降，而抗体芯片中其余的抑癌蛋白无变化。

2.2抗体芯片中其它与肿瘤发生有关蛋白的变化：PNAS-2过量表达后抑制了Granzyme B及Perforin蛋白的表达，表明Granzyme B-Perforin通路受到抑制。

3.PNAS-2蛋白的亚细胞定位研究

3.1高保真Taq酶PCR：高保真Taq酶PCR扩增由5′RACE得到的全长PNAS-2基因，按pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO的说明书及文献设计引物。PNAS-2的上游引物为：5′TGC TCAAGATGAACC GAC 3′，下游引物为5′TGA CCA TAT TCT TTG CAG GA 3′。PCR反应体系配制同前。PCR反应条件为94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循环30次；72℃10min，4℃20min结束反应。Control 1DNA由寡核苷酸正链5′GTTAAC GAA TTC CCG CGG GGT GAC CA 3′和负链5′GGT CAC CCC GCGGGA ATT CGT TAA CA 3′序列退火后连接而得；Control 2DNA由寡核苷酸正链5′GAA TTC ATG CAC CAC CAC CA 3′和负链5′GGT GGT GGT GCATGAATT CA 3′序列退火后连接而得。

3.2质粒构建PCR产物或退火后的DNA寡核苷酸经琼脂糖凝胶电泳鉴定后应用TOPO TA克隆***pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO质粒，操作同前。我们将能表达PNAS-2N端蛋白、连接区蛋白及GFP蛋白的重组质粒命名为PNAS-2-GFP-pcDNA3；将仅能表达GFP蛋白的重组质粒命名为GFP-pcDNA3(TOPO TA***的序列为Control 1DNA)；将能表达3个组氨酸、连接区蛋白及GFP蛋白的重组质粒命名为His-GFP-pcDNA3(TOPOTA***的序列为Control 2DNA)。质粒转化TOPO 10化学感受态菌、挑选菌落等实验步骤同前。

3.3质粒抽提及测序鉴定使用QIAMini Prep Kit抽提质粒，操作同前。质粒送上海生工生物工程公司测序，测序结果示重组质粒构建成功。

3.4转染及筛选使用Superfect transfection reagent转染重组质粒至U937细胞。方法同前。实验时设置了未转染的U937对照组，加500μg/ul的G418约21天未转染的U937对照组细胞几乎全部死亡，而重组质粒转染的各组细胞生长良好。

3.5Western Blot鉴定：蛋白质抽提及BCA蛋白质定量同前。

(1)变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)：按下述配方制备10％的分离胶(pH 8.8)，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺30∶0.8％w/v 2.5ml，1.0MTris-Cl pH 8.83ml，20％SDS 38μl，ddH2O 1.9ml；混合，灌胶前加入10％APS 36μl，TEMED 5μl；用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6厘米左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖0.1％SDS，放置1小时左右至聚合完全。

(2).制备4％的积层胶(pH 6.8)：丙烯酰胺∶双丙烯酰胺30∶0.8％w/v 660μl，1M Tris-Cl pH6.8630μl，20％SDS 25μl，ddH2O 3.6ml；混合，灌胶前加入10％APS 25μl，TEMED 5μl；使用Whatman 3mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心***梳子。1小时左右凝胶聚合完全。

(3).样品准备：准备1×上样缓冲液的样品液，如6μl蛋白样品加入3μl 3×上样染液储存液。每孔配制含30μg总蛋白样的样品液。上样前煮沸3分钟。3×上样染液储存液(Laemmli上样染液)的配方：1M Tris-Cl pH 6.82.4ml，20％SDS 3ml，甘油(100％)3ml，β-巯基乙醇1.6ml，溴酚蓝0.006g，加水至总体积10ml(储存于4℃)。

(4).上样及电泳：凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1到2cm。BioRad电泳槽中需加入500ml的1×电泳缓冲液。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中。使用BioRad电泳装置，凝胶电泳于4℃，样品首先在20mA恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后60mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。

(5).蛋白质转移：准备好BioRad蛋白转移装置夹板，凝胶用1×转移缓冲液稍微清洗。吸水纸，滤纸(比凝胶稍大一些)用1×转移缓冲液预湿，如下顺序装配于转移装置上。(负极)吸水纸-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-吸水纸(阳极)。30m A恒流条件下，4℃转移过夜。1×转移缓冲液配方：Tris碱15.14g，甘氨酸72.07g，甲醇1L，加水至为总体积5L。

(6).膜的封闭和抗体孵育：膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。TBS洗膜3次，每次5分钟。封闭过的膜加入anti-GFPIgG抗体(购自Molecμlar Research Center公司)孵育，室温孵育1.5小时以使抗原抗体结合。TBS洗膜3次，每次5分钟。加入HRP标记的二级抗体(Anti-rabbit，康成生物工程公司，稀释比例为1∶2000)以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。TBS洗膜3次，每次5分钟。

(7).结果检测及分析：化学发光试剂盒购自上海康成生物工程公司；显影液、定影液及X光胶片均购自上海冠龙照相器材有限公司。化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合即为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5分钟，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光，图片扫描保存为电脑文件，并用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。如图7所示，图中的PNAS为转有PNAS-2-GFP-pcDNA3质粒的U937细胞，可见检测出一条约30-40KD的PNAS-2-GFP融合蛋白；图中的GFP为转有GFP-pcDNA3质粒的U937细胞，可见检测出一条约20-30KD的GFP蛋白；图中所示的His为转有His-GFP-pcDNA3质粒的U937细胞，可见检测出一条约20-30KD的GFP融合蛋白；图中所示的U937为未转有pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO质粒的U937细胞，因无GFP而不能检测出GFP蛋白。结果与我们的设计相符，表明上述质粒构建成功且已成功转入了U937细胞，可进行下一步的亚细胞定位研究。也说明了在体内，PNAS-2确实可以翻译成蛋白质。

3.6亚细胞定位研究：转染4周后研究PNAS-2-GFP融合蛋白的亚细胞定位。PBS洗涤各组细胞后固定与载玻片上。激光共聚焦显微镜检测GFP蛋白，见PNAS-2-GFP-pcDNA3质粒转染的U937白血病细胞中GFP融合蛋白不均匀分布于整个细胞(如图8a所示)，其在细胞核区的融合蛋白分布与文献报道的PNAS-2同源蛋白CHMP5在Cos-7细胞(为非洲绿猴肾脏细胞)中的分布(如图8b所示)相似，但细胞浆中弥漫分布的GFP融合蛋白明显比图8b要多。综合文献(Diane McVey Ward，Michael B.Vaughn，Shelly L.Shiflett，et al.The Role of LIP5and CHMP5 inMultivesicular Body Formation and HIV-1Budding in Mammalian Cells THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2005.Vol.280，No.11：p.10548-10555.)报道及激光共聚焦显微镜检测图像，PNAS-2蛋白在白血病细胞中不仅仅定位于细胞核周的小囊泡结构，还弥漫分布于细胞浆中。而GFP-pcDNA3及His-GFP-pcDNA3转染组的结果相似，GFP融合蛋白均弥漫分布于细胞浆及细胞核中。

文献(Diane McVey Ward，Michael B.Vaughn，Shelly L.Shiflett，et al.The Role of LIP5and CHMP5 in Multivesicular Body Formation and HIV-1Budding in Mammalian Cells THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY 2005.Vol.280，No.11：p.10548-10555.)报道CHMP5-DsRed或CHMP5-GFP在Cos-7细胞中局限分布于核周的小囊泡我们发现PNAS-2-GFP融合蛋白在U937白血病细胞株中不仅仅存在于细胞核周的小囊泡，还弥漫分布于细胞浆内，说明了PNAS-2蛋白在U937白血病细胞株中的定位与文献报道不一致。由于CHMP5/PNAS-2参与多泡体(MVB)的组成，而MVB是局限分布于细胞浆的，由此可见PNAS-2蛋白的应该是较局限定位于细胞浆而非弥漫性分布于细胞浆中的。因此，PNAS-2蛋白在U937细胞中的亚细胞定位很可能存在异常。PNAS-2-GFP融合蛋白在U937白血病细胞株中的弥漫分布提示了PNAS-2蛋白不仅作为构成成份存在于MVB结构中，还可能独立存在于细胞浆中。大量文献表明蛋白质定位的异常可参与肿瘤的发生、发展，如TRAF4基因在乳腺癌细胞中存在异常高表达，表明其参与恶性肿瘤的发生。而且还有实验发现TRAF4蛋白正常情况下定位于细胞浆，但在绝大多数的乳腺癌患者中TRAF4蛋白则定位于细胞核中，提示TRAF4蛋白的异常定位肿瘤的发病有关(Krajewska M，Krajewski S，Zapata JM，et al.TRAF-4expression inepithelial progenitor cells.Analysis in normal adult，fetal，and tumor tissues.Am.J.Pathol.，1998.152：p.1549-1561.；Regnier C.H.，Tomasetto C.，Moog-Lutz C.，et al.Presence of a new conserved domain in CART 1，a novelmember of the tumor necrosis factor receptor-associated protein family，whichis expressed in breast carcinoma.J.Biol.Chem.，1995.270：p.25715-25721.)。与之类似，PNAS-2蛋白在急性白血病细胞株中存在的亚细胞定位异常也参与了白血病的发生。

实施例4抑制本发明的凋亡相关基因PNAS-2表达对白血病治疗效果的研究

由于上述实验结果表明PNAS-2基因为抗细胞凋亡基因，且是在白血病中存在特异性高表达的新发现的原癌基因，因此我们应用RNA干扰技术，研究抑制凋亡相关基因PNAS-2表达对白血病的治疗作用。

1.靶向PNAS-2基因的特异性shRNA质粒载体的构建：

1.1shRNA序列的设计：将我们行5′RACE后得到的PNAS-2全长序列1输入Genescript公司的在线shRNA设计软件“siRNA Target Finder”，软件自动分析和显示候选shRNA并最终构建出***片段。根据文献报道的shRNA设计原则和经验，进一步在候选shRNA中筛选最佳者，并在Blast中对靶序列进行同源性分析，排除shRNA非特异性抑制其它基因片段的可能，最终确定3条高度特异性针对PNAS-2的19nt片段，并设计了不与人体任何mRNA序列配对的对照组序列。我们在上游DNA模板单链前加上限制性内切酶BamH I的酶切位点序列，下游DNA模板单链前加上限制性内切酶Hind III的酶切位点序列，这样相应的2条DNA模板单链退火后形成的5′及3′末端能直接与BamH I及HindIII限制性内切酶双酶切后的pRNAT U6.1/NEO相连接。

shRNA I的设计位点

F：5′GATCC C

ttc aag aga

TTT TTT CC AAA 3′

下划线部位为BamH I的酶切位点；小写字部分为环结构(loop结构)；斜体字部分为PNAS-2特异的靶序列；下同。

R：5′AGCT TTT GGAAAAAGT AGA GCA GAA TCC ATT GA tct ctt gaaTCA ATG GAT TCT GCT CTA CGG G 3′

粗体字部位为Hind III的酶切位点，下同。

shRNA II的设计位点

F：5′GATCC C

ttc aag aga

TT TTT TCC AAA 3′

R：5′AGCT TTT GGAAAAAAG CAC TGA GTC GCA GTT AT tct ctt gaaATAACT GCG ACT CAG TGC TGG G 3′。

shRNA III的设计位点

F：5′GATCC C

ttc aag aga

TT TTT TCC AAA 3′

R：5′AGCT TTT GGAAAAAGAATT TGG ATT GCC ACA GA tct ctt gaaTCT GTG GCAATC CAAATT CGG G 3′。

shRNA control的设计位点

F：5′GATCC C

ttc aag aga

TT TTT TCC AAA 3′

R：5′AGCTTTTGGAAAAATTCTCCGAACG TGTCACGT tct ctt gaaACG TGA CAC GTT CGG AGAAGG G 3′。

上述DNA模板单链均由上海博亚生物工程公司合成。

1.2退火：建立20μl反应体系：DNA模板单链F、R各1μl，20×SSC 1μl，ddH₂O 17μl，混匀，95℃加热10min；取出后室温放置1小时。

1.3pRNAT u6.1/NEO双酶切：shRNA表达质粒载体pRNAT U6.1/NEO购自Genescript公司，使用限制性内切酶BamH I及HindIII(均为MBI公司)双酶切shRNA表达质粒载体pRNAT U6.1/NEO，酶切产物行琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化后回收(操作同前)。BamH I及HindIII双酶切反应体系：10×Y⁺/Tango 4μl，pRNAT U6.1/NEO空质粒载体2μl，BamH I(10u/μl)2μl，HindIII(10u/μl)2μl，ddH₂O 10μl；37℃孵育6小时。

1.4连接：T4连接酶(MBI公司)反应体系为10μl，包括：退火后的shRNA***片断3μl，酶切后的pRNAT U6.1/NEO 3μl，10×T4LigaseBuffer 1μl，T4连接酶1μl，ddH₂O 2μl，混匀后，置22℃孵育16h。

1.5感受态细胞的转化及阳性菌落的筛选：取新鲜TOPO10化学感受态菌200μl，加2μl连接产物，小心混匀，冰上放置10min。42℃热休克30秒，冰上放置2min后加入250μl S.O.C培养基，置于细菌摇床37℃200rpm振摇2h。取40μl菌液涂于含50μg/μl氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃孵育过夜。

1.6PCR及测序鉴定：孵育24后挑选典型的单个菌落入3ml含100μg/μl氨苄青霉素的LB培养液中，37℃200rpm振摇培养过夜，取菌液2μl进行PCR，上游引物：5′TAC GAT ACA AGG CTG TTA GAGAG 3′，下游引物：5′TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3′。94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延伸10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，菌落PCR的结果提示质粒构建成功。取2ml经菌落PCR鉴定的菌液，送上海博亚生物工程公司测序，测序结果表明质粒构建成功。

2.细胞转染及筛选：

质粒抽提采用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep Kit，抽提质粒方法同前。定量后各取1μg，使用Superfect transfection reagent(购自Qiagen公司)转染重组质粒至U937，HL-60等白血病细胞，转染步骤同前。实验分5组，shRNA control组、shRNA I组、shRNA II组、shRNA III组及未转染组。转染48h后加含500μg/ml G418及10％胎牛血清的RPMI1640培养液2ml进行筛选，3周后可见转染组均有***相细胞并形成集落，而未转染组细胞均死亡。将转染组细胞由24孔板转至6孔板及细胞培养瓶中继续培养。根据pRNAT U6.1/NEO质粒带GFP这一特点，在药物筛选后第28天使用流式细胞仪(Becton Dickinson公司)分选出GFP阳性细胞，继续培养。

3.半定量PCR鉴定shRNA封闭效果：TRIZOL法抽提shRNA control组、shRNA I组、shRNA II组、shRNA III组细胞总RNA，使用SuperScriptIII逆转录酶(购自Invitrogen公司)按说明书进行逆转录。PCR使用的PNAS-2上游引物为：5′TGC TCA AGA TGAACC GAC TCT 3′，下游引物；5′GTG GGA ACA CCT TCT GGAAT 3′。以β-actin为内参照，上游引物为：5′TCG ACA ACG GCT CCG GCA T 3′，下游引物：5′AAG GTG TGG TGCCAG ATT TTC 3′。94℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后使用复日凝胶成像***分析PNAS-2及β-actin的灰度值。结果显示shRNAI组中PNAS-2的抑制效果最佳，PNAS-2的表达下降了80％以上，shRNAII组中，PNAS-2的表达下降了75％以上，(如图9所示，可见shRNA I组及shRNA II组转染的U937细胞中PNAS-2的抑制效果佳)，故我们使用shRNAI组和II组质粒研究其对白血病的治疗作用。

4.治疗效果的评定：

4.1抑制PNAS-2后对细胞周期的影响：我们发现shRNAI组转染细胞在培养时增殖较对照组细胞要慢，提示抑制PNAS-2后存在细胞周期阻滞，因此我们进行了细胞周期分析。取对照组及shRNA I干扰组细胞U937细胞各2×10⁶/ml，1500rpm 5分钟离心后弃上清，加入4℃储存的PBS 1.5ml并摇匀。加入-20℃储存的无水乙醇1ml慢滴慢摇，再加入-20℃无水乙醇1ml来回摇匀，1500rpm 5分钟离心后弃上清。用70％1×PBS固定细胞，12h室温过夜后1500rpm 5分钟离心后弃上清，摇匀。PBS 2ml洗涤细胞后1500rpm 5分钟离心后弃上清，摇匀。用1％RNA酶100-200ul 37℃水浴15分钟后上机检测。通过流式细胞仪发现对照组和干扰组的G1期分布无显著性差异(P＞0.05)。两组细胞的S期分布也无明显变化。shRNA I干扰组的G2期细胞明显增多，说明出现了细胞周期阻滞，经统计后显示显著性差异(P＜0.05)，即抑制PNAS-2后，细胞周期中出现了G2期阻滞(如图10所示)。HL-60等白血病细胞的结果与U937白血病细胞的结果一致。

4.2抑制PNAS-2后细胞凋亡率的变化：流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测方法同前。综合三次实验结果，流式细胞仪检测示shRNA对照组的凋亡率为3.52±1.25％，而shRNA I组的细胞凋亡率增加至12.00±0.54％，两者有显著统计学差异(P＜0.01)，shRNA II组的细胞凋亡率增加至8.85±1.80％，两者有显著统计学差异(P＜0.05)。激光共聚焦显微镜检测示shRNA对照组的细胞凋亡率为5.5％，shRNA I组的细胞凋亡率为14.7％，shRNA II组的细胞凋亡率为13.8％。(如图11所示，可见抑制PNAS-2后细胞凋亡率上升。)HL-60等白血病细胞的结果与U937白血病细胞的结果一致。表明抑制PNAS-2表达后可促使白血病细胞发生凋亡。

4.3抑制PNAS-2后的抑癌蛋白及凋亡相关蛋白的变化：如图12所示，应用Western Blot(方法同前)检测了shRNA I组与对照组转染细胞中剪切型Caspase3(单抗购自R&D公司)，AIF(单抗购自abcam公司)，GranzymeB(单抗购自Clontech公司)，p53(单抗购自R&D公司)，Rb(单抗购自CST公司)等蛋白的变化。发现抑制PNAS-2表达后剪切型Caspase3、AIF及Granzyme B的含量上升，表明抑制PNAS-2表达后细胞凋亡增加，凋亡通路中AIF介导的途径及Granzyme B-Perforin通路激活。抑制PNAS-2表达后p53及Rb等抑癌蛋白含量的显著增加，加之能避免白血病细胞发生“免疫逃避”的Granzyme B-Perforin通路的激活，是PNAS-2特异性shRNA治疗白血病有效的机制之一。

由此我们可知，本发明应用RNA干扰技术抑制PNAS-2对白血病治疗有效。具体表现为白血病细胞的凋亡率显著增加；细胞周期中出现了G2期阻滞，从而使细胞有机会修复损伤的DNA，确保基因的准确遗传，阻滞白血病细胞的增殖；而p53，Rb等原先受到抑制的抑癌蛋白含量的增加，也是抑制PNAS-2表达对白血病治疗有效的原因之一。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

王，海嵘陈，芳源

<120>一种凋亡相关基因及以其为靶点用于治疗白血病的药物

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1040

<212>DNA

<213>PNAS-2-1

<400>1

ttccgtttct gg ttttgctc tagtgtttgg g tttcttcgc g gctgctcaa g atgaaccga 60

ctcttcggga aagcgaaacc caaggctccg ccgcccagcc tgactgactg cattggcacg 120

gtggacagta gagcagaatc cattgacaag aagatttctc gattggatgc tgagctagtg 180

aagtataagg atcagatcaa gaagatgaga gagggtcctg caaagaatat ggtcaagcag 240

aaagccttgc gagttttaaa gcaaaagagg atgtatgagc agcagcggga caatcttgcc 300

caacagtcat tcaacatgga acaagccaat tataccatcc agtctttgaa ggacaccaag 360

accacggttg atgctatgaa actgggagta aaggaaatga agaaggcata caagcaagtg 420

aagatcgacc agattgagga tttacaagac cagctagagg atatgatgga agatgcaaat 480

gaaatccaag aagcactgag tcgcagttat ggcaccccag aactggatga agatgattta 540

gaagcagagt tggatgcact aggtgatgag cttctggctg atgaagacag ttcttatttg 600

gatgaggcag catctgcacc tgcaattcca gaaggtgttc ccactgatac aaaaaacaag 660

gatggagttc tggtggatga atttggattg ccacagatcc ctgcttcata gatttgcatc 720

attcaagcat atcttgtaaa acaaacacat attatgggac taggaaatat ttatctttcc 780

aaatttgcca taacagattt aggtttcttt cctttctttg aaggaaagtt taattacatt 840

gctcttttat tttttccatt taagagactc attgcttggg aaatgctttc ttcgtactaa 900

atttgatttc cttttttctt atgaaaaacg aactcagttt aaaagttttt taagctcgta 960

tgacttgttt tcattcatta ataataattg aataaaacta aggaatggga aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1040

<210>2

<211>1019

<212>DNA

<213>PNAS-2-2

<400>2

agtgtttggg tttcctcgcg gctgctcaag atgaaccgac tcttcgggaa agcgaaaccc 60

aaggctccgc cgcccagcct gactgactgc attggcacgg tggacagtag agcagaatcc 120

attgacaaga agatttctcg attggatgct gagctagtga agtataagga tcagatcaag 180

aagatgagag agggtcctgc aaagaatatg gtcaagcaga aagccttgcg agttttaaag 240

caaaagagga tgtatgagca gcagcgggac aatcttgccc aacagtcatt caacatggaa 300

caagccaatt ataccatcca gtctttgaag gacaccaaga ccacggttga tgctatgaaa 360

ctgggagtaa aggaaatgaa gaaggcatac aagcaagtga agatcgacca gattgaggat 420

ttacaagacc agctagagga tatgatggaa gatgcaaatg aaatccaaga agcactgagt 480

cgcagttatg gcaccccaga actggatgaa gatgatttag aagcagagtt ggatgcacta 540

ggtgatgagc ttctggctga tgaagacagt tcttatttgg atgaggcagc atctgcacct 600

gcaattccag aaggtgttcc cactgataca aaaaacaagg atggagttct ggtggatgaa 660

tttggattgc cacagatccc tgcttcatag atttgcatca ttcaagcata tcttgtaaaa 720

caaacacata ttatgggact aggaaatatt tatctttcca aatttgccat aacagattta 780

ggtttctttc ctttctttga aggaaagttt aattacattg ctcttttatt ttttccattt 840

aagagactca ttgcttggga aatgctttct tcgtactaaa tttgatttcc ttttttctta 900

tgaaaaacga actcagttta aaagtttttt aagctcgtat gacttgtttt cattcattaa 960

taataattga ataaaactaa ggaatgggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1019

<210>3

<211>219

<212>PRT

<213>PNAS-2

<400>3

Met Asn Arg Leu Phe Gly Lys Ala Lys Pro Lys Ala Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Leu Thr Gly Cys Ile Gly Thr Val Asp Ser Arg Ala Glu Ser Ile Asp

20 25 30

Lys Lys Ile Ser Arg Leu Asp Ala Glu Leu Val Lys Tyr Lys Asp Gln

35 40 45

Ile Lys Lys Met Arg Glu Gly Pro Ala Lys Asn Met Val Lys Gln Lys

50 55 60

Ala Leu Arg Val Leu Lys Gln Lys Arg Met Tyr Glu Gln Gln Arg Asp

65 70 75 80

Asn Leu Ala Gln Gln Ser Phe Asn Met Glu Gln Ala Asn Tyr Thr Ile

85 90 95

Gln Ser Leu Lys Asp Thr Lys Thr Thr Val Asp Ala Met Lys Leu Gly

100 105 110

Val Lys Glu Met Lys Lys Ala Tyr Lys Gln Val Lys Ile Asp Gln Ile

115 120 125

Glu Asp Leu Gln Asp Gln Leu Glu Asp Met Met Glu Asp Ala Asn Glu

130 135 140

Ile Gln Glu Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Gly Thr Pro Glu Leu Asp Glu

145 150 155 160

Asp Asp Leu Glu Ala Glu Leu Asp Ala Leu Gly Asp Glu Leu Leu Ala

165 170 175

Asp Glu Asp Ser Ser Tyr Leu Asp Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ile

180 185 190

Pro Glu Gly Val Pro Thr Asp Thr Lys Asn Lys Asp Gly Val Leu Val

195 200 205

Asp Glu Phe Gly Leu Pro Gln Ile Pro Ala Ser

210 215

Claims

1.一种凋亡相关基因，其特征在于：所述的基因含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

2.一种抑制权利要求1所述的凋亡相关基因的RNA干扰的靶序列，其特征在于：含有GTAGA GCA GAA TCCATTGA或者AG CAC TGA GTC GCA GTT AT的碱基序列。

3.一种载体，含有至少一种抑制权利要求1所述的凋亡相关基因的RNA干扰的靶序列。

4.如权利要求3所述的一种载体，其特征在于：含有RNA干扰的靶序列GT AGA GCA GAA TCC ATT GA。

5.如权利要求3所述的一种载体，其特征在于：含有RNA干扰的靶序列AG CAC TGA GTC GCA GTT AT。

6.一种细胞，含有权利要求2所述的RNA干扰的靶序列。

7.一种细胞，含有权利要求3所述的载体。

8.一种用于治疗白血病的药物，含有有效量的权利要求2所述的RNA干扰的靶序列、或者权利要求3所述的载体、或者权利要求6所述的细胞、或者权利要求7所述的细胞。

9.如权利要求8所述的一种用于治疗白血病的药物，其特征在于：所述的药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。

10.如权利要求9所述的一种用于治疗白血病的药物，其特征在于：所述的药物的剂型为粉剂、或者注射液、或者胶囊、或者片剂、或者口服液。