CN101324545A - 采用液相层析串联质谱技术检测丹参素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液相层析串联质谱法定量检测生物样本中丹参素的方法，包括步骤(1)样品制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)中的样品制备采用包括如下步骤的方法：a.在待测样本中加入酸性物质，调节其pH值至小于等于5，并混匀；b.加入1倍或1倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于250℃的有机溶剂，并混匀；c.离心，收集有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；d.步骤c的干燥物用步骤(2)所用的流动相重新溶解。本发明的方法，快速、灵敏、选择性高。
Description
技术领域
本发明涉及药品检验领域，特别涉及生物样本中有效成分的检验。
背景技术
丹参为唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根，其活性成分主要包括脂溶性成分和水溶性酚酸类成分，前者主要包括丹参酮IIA、丹参酮I和隐丹参酮等；后者主要包括丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和丹酚酸C等。丹参，特别是多种复方药物的重要组成成份，广泛地用于冠心病、肝炎、***、闭经、血液循环障碍，和其它心脑血管疾病的治疗。20世纪早期的研究主要集中在以丹参酮为代表的脂溶性成分方面，但丹参的传统应用方式为水煎液，因此，其有效成分多以水溶性物质为主。
丹参素，化学名称为β-3，4-二羟苯乳酸(3，4-hydroxybenyl lactic acid)，作为水溶性成分主要的活性物质，不仅具有扩张冠状动脉，抗缺氧、减少细胞中胆固醇合成的作用，还能抑制低密度脂蛋白氧化。
以前的研究表明可以用高效液相色谱/紫外技术(HPLC/UV)、高效液相色谱/荧光技术(HPLC/LF)或者液相层析串联质谱技术(LC/MS/MS)检测生物样本中的丹参素。HPLC/UV技术已用于检测大鼠血浆或者人尿液中丹参素的含量，其缺点是灵敏度较低，最低定量限(Lower Limit ofquantitation，LLOQ)≥50ng/ml，并且需要的检测样本比较大(≥0.25ml)。HPLC/LF法检测的灵敏度也不高(LLOQ约为125ng/ml)并且检测所需时间较长(检测每个样本至少需要15分钟)。
质谱检测器是以分子量测定为基础的分析方法，近年来，其与高效液相层析法(HPLC)或毛细管电泳法(CE)等分离机制的联用不仅提高了其抗杂质干扰的能力和节省了分析时间，而且大大提高了测定的灵敏度。软电离技术，如电喷雾离子化技术(ESI)的发展，则扩大了分子量检测的范围。此外，电喷雾离子化技术可在大气压下进行，方便与液相层析仪连结，使液相层析质谱联用技术(LC/MS)成为了一种高灵敏度、高选择性且快速分析的技术，其能在短时间之内，同时实现分析物的分离与结构鉴定。通过液相层析质谱联用技术(LC/MS/MS)能更清楚地了解药物在动物活体内的药物动力学规律，从而让研究人员能够更好地掌握药物的药理作用。另外还可以省去复杂、繁琐且耗时的样本前处理工作。
Li等(Li XC，Yu C，Cai YB，Liu GY，Jia JY，Wang YP.J.Chromatogr.B 2005；820：41.)建立了一种LC/MS/MS检测体液中的丹参素的方法，他们用甲酸(蚁酸)/丙酮/水溶液来提取血清中的丹参素，LLOQ提高到8ng/ml。然而，为了研究丹参，特别是含有丹参的复方药物的药代动力学，需要更加灵敏的测定方法。
发明内容
本发明提供了一种灵敏的定量检测生物样本中丹参素的方法。
本发明提供的方法，是采用液相层析串联质谱技术定量检测生物样本中丹参素的方法，包括步骤(1)样品制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)中的样品制备采用包括如下步骤的方法：
a.在待测血浆样品中加入酸性物质，调节其pH值至小于等于5，并混匀；
b.加入1倍或1倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于250℃的有机溶剂，并混匀；
c.离心，收集(去除)有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；
d.步骤c的干燥物用步骤(2)所用的流动相重新溶解。
按照上面的描述，本发明的方法的产品制备步骤，本领域的人员不需要创造性的劳动就可完成。液相层析串联质谱技术(LC/MS/MS)可采用现有的商品化的仪器设备根据产品说明实施，这是本领域的技术人员不需要创造性的劳动就可以完成的。通过调节生物样本的pH值，使丹参素以分子的形式，而非离子的形式存在，从而更完全的被有机溶剂萃取，然后收集并蒸干有机溶剂层，用流动相重新溶解后，注入液相层析质谱联用***(LC/MS/MS)进行分析。
本发明的方法，其中所述的生物样本可以是任何种类的生物样本，包括但不限于血液(血浆、血清)，体液，尿液，组织匀浆等，优选血浆。
本发明的方法，其中步骤a所述的酸性物质是强酸，包括但不限于盐酸、硫酸、高氯酸，磷酸，甲酸，乙酸等，优选盐酸。
本发明的方法，其中步骤a调节pH值优选至小于等于4，更优选调节至小于3，最优选调节至0.5；步骤b是加入2倍或2倍以上体积的有机溶剂，最好是加入15倍体积的有机溶剂；步骤b所述的有机溶剂可以是任何不与水混溶的，且沸点低于250℃的有机溶剂，包括但不限于乙酸乙酯，***，丙酮等，最优选乙酸乙酯。
优选地，本发明的方法，步骤a加入的酸是盐酸，调节其pH值至0.5，步骤b是加入15倍体积的乙酸乙酯。
优选地，本发明的方法，检测方式优选地为采用电喷雾模式，负离子选择性反应监测，以阿魏酸作为内标。用于定量分析的母/子离子对分别为m/z 196.8→134.8(丹参素)和m/z 192.8→133.8(阿魏酸)，参数可以选择仪器推荐的参数进行，也可以进一步优化。丹参素和阿魏酸的特征性质谱图见图1和图2。
本发明的方法，层析可以采用本领域常用的反相色谱柱，可以使用该色谱柱推荐的参数，也可以进一步优化，使用的色谱柱优选Inertsil ODS-3色谱柱，流动相优选pH为小于等于6.5的甲醇∶甲酸铵缓冲液，其中甲醇∶甲酸铵的体积比为98∶2～2∶98；优选地，层析时流动相采用的是pH为4.0的甲醇∶甲酸铵缓冲液，其中甲醇∶甲酸铵的体积比30∶70。
本发明的方法，快速、灵敏、选择性高。每天可以检测150多个样品。特别是灵敏度高，可以检测的血浆丹参素的LLOQ为5ng/ml。
附图说明
图1丹参素的特征性质谱图
图2阿魏酸的特征性质谱图
图3口服丹参提取物后，平均血浆丹参素浓度-时间曲线
具体实施方式
下面是一个采用本方法进行的药代动力学研究的实施例，结合实施例，对本发明的作进一步的说明。实施例只是为了方便理解本发明，而不对本发明构成任何限制。
实施例1
实验方法
丹参提取物，制备成2％的水溶液，给大鼠口服，剂量为200mg/kg，每个大鼠分别在服药后的0、5、10、20、30、45、60、90、120、150、180、240和360分钟抽取静脉血样250μl，置于肝素化的试管中，血样立即离心10,000g，5分钟得到血浆。标记并保存于-20℃待检。
最大血药浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)均以实测值表示，曲线下面积(AUC0-t)以梯形法计算，AUC0-∞按公式计算：AUC0-∞＝AUC0-t+Ct/λZ(t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测定样本药物浓度；λZ系对数浓度-时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数，可用对数浓度-时间曲线末端直线部分的斜率求得)；t1/2用公式t1/2＝0.693/λZ计算。
仪器
LC/MS/MS***包括Surveyor质谱泵，美国Surveyor自动加样器(ThermoFinnigan，USA)，ThermoFinnigan TSQ Quantum三级四极杆质谱联用仪(San Jose，CA，USA)，配有电喷雾离子源(ESI)；数据分析采用的是Xealibur 1.3软件(ThermoFinnigan，USA)，峰整合和校正采用LCQuan软件(ThermoFinnigan，USA)。
试剂与药品
丹参素和阿魏酸购自国家药品生物制品检定所，其他化学药品根据需要分别为色谱级或者分析级，Sprague-Dawley大鼠(190-210g)购自Sino-British Sippr/BK实验动物有限公司(上海)。
色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液(30∶70)，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.0，即得。
质谱条件
毛细管电压温度为320℃，电喷雾ESI源，喷雾电压为3.5kV，氮作为鞘气体和辅助气体，压力分别为30psi和3psi。诱导碰撞碎裂(CID)用氩进行，碰撞气流压力为1.4mTorr，丹参素和阿魏酸碰撞能量分别为17eV和14eV。SRM扫描宽度为m/z 0.01，扫描时间为0.5s，峰宽的设定值为0.7u。
贮存液和工作液的配置
用甲醇配制丹参素贮存液(500μg/ml)和阿魏酸贮存液(500μg/ml)，然后用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度为5μg/ml的贮存液。而后丹参素贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度分别为25、50、100、250、500、1000和2500ng/ml的工作液，阿魏酸贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释配制成浓度为500ng/ml的工作液。贮存液和工作液存贮于4℃。
标准品和质控(QC)样品的制备
将20μl工作液加入80μl空白的大鼠血浆中制备标准曲线。血浆有效丹参素浓度分别是5、10、20、50、100、200、500ng/ml。在方法学验证和药代动力学研究中所用的QC样品按照标准品的同样的方法制备。质控样品的血浆丹参素浓度分别是10、50和200ng/ml。样品制备QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：在100μl的血浆样品中，加入10μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，100μl的1mol/L的盐酸，混合后(pH值约为0.5)，加入3ml的乙酸乙酯，混合物混悬约2分钟，离心5,000g，10分钟，去除上层的有机溶剂层并在40℃，氮气存在的条件下干燥，干燥物重悬于流动相，然后漩涡混合器混匀。取10μl用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
从线性、LLOQ、准确度、精确度、回收率等方面验证。
标准曲线：以丹参素血浆浓度对丹参素与阿魏酸(IS)的峰面积比作线性回归，为了评价线性，血浆标准曲线在连续的5天内，重复制备5遍。按以上方法，得到的标准曲线为y＝4.72×10-2+1.31×10-2x，r＝0.9993，其中y代表丹参素峰与阿魏酸(IS)的峰面积比，x代表血浆丹参素的浓度。根据以上分析结果，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。
丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
根据使用3个浓度的丹参素的血浆样品，在连续5天内，重复5次，测定QC样品的浓度。准确度用相对误差(RE)表示，精密度用相对标准偏差(RSD)表示。根据实验结果，RSD％在3.20％～10.82％范围内，RE％≤11.92％。准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。大鼠血浆丹参素测定的准确度和精密度见下表。
回收率
空白血浆按照上述的样品制备方法进行处理，在重悬液体中加入于与不同血浆样品终浓度的相应的丹参素，代表100％的回收率。通过比较6个提取的低、中、高浓度的QC样品的平均峰面积和同一浓度的6个100％的回收率的样品的平均峰面积，来计算提取回收率。IS回收率按照同样的方法计算。
丹参素在10、50和200ng/ml的回收率分别是82.9±8.4％，76.2±6.1％和78.3±3.5％(n＝3)，回收率的RSD好于10.4％，表明丹参素的血浆回收率是稳定的。IS的回收率为76.1±2.6％(n＝3)。
结果
口服丹参提取物后，平均血浆丹参度浓度-时间曲线见图3。
Cmax为104.78±45.30ng/mL，Tmax为0.80±0.21h，t1/2为0.50±0.27h，AUCO-6h为179.81±84.14ng·h/mL。
实施例2
按照实施1的方法，区别之处在于：
色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液(98∶2)，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至6.0，即得。
样品制备
QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：在100μl的血浆样品中，加入10μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，1mol/L的硫酸至pH为5，混合后，加入150μl的乙酸乙酯，混合物混悬约2分钟，离心5,000g，10分钟，去除上层的有机溶剂层并在40℃，氮气存在的条件下干燥，干燥物重悬于流动相，然后漩涡混合器混匀。取10μl用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
标准曲线：按照实施例1的方法绘制标准曲线，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。
实施例3
按照实施1的方法，区别之处在于：
色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液(2∶98)，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至0.5，即得。
样品制备
QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：在100μl的血浆样品中，加入10μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，0.1mol/L的硫酸至pH为4，混合后，加入300μl的***，混合物混悬约2分钟，离心5,000g，10分钟，去除上层的有机溶剂层并在40℃，氮气存在的条件下干燥，干燥物重悬于流动相，然后漩涡混合器混匀。取10μl用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
标准曲线：按照实施例1的方法绘制标准曲线，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。
实施例4
按照实施1的方法，区别之处在于：
色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液(30∶70)，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.0，即得。
样品制备
QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：在100μl的血浆样品中，加入10μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，1mol/L的甲酸至pH为3，混合后，加入700μl的丙酮，混合物混悬约2分钟，离心5,000g，10分钟，去除上层的有机溶剂层并在40℃，氮气存在的条件下干燥，干燥物重悬于流动相，然后漩涡混合器混匀。取10μl用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
标准曲线：按照实施例1的方法绘制标准曲线，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。
实施例5
实验方法
丹参提取物，制备成2％的水溶液，给大鼠口服，剂量为200mg/kg，收集给药后6小时内大鼠的尿液。
仪器
LC/MS/MS***包括Surveyor质谱泵，美国Surveyor自动加样器(ThermoFinnigan，USA)，ThermoFinnigan TSQ Quantum三级四极杆质谱联用仪(San Jose，CA，USA)，配有电喷雾离子源(ESI)；数据分析采用的是Xealibur 1.3软件(ThermoFinnigan，USA)，峰整合和校正采用LCQuan软件(ThermoFinnigan，USA)。
试剂与药品
丹参素和阿魏酸购自国家药品生物制品检定所，其他化学药品根据需要分别为色谱级或者分析级，Sprague-Dawley大鼠(190-210g)购自Sino-British Sippr/BK实验动物有限公司(上海)。
色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax C18柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.0，即得。
质谱条件
毛细管电压温度为320℃，电喷雾ESI源，喷雾电压为3.5kV，氮作为鞘气体和辅助气体，压力分别为30psi和3psi。诱导碰撞碎裂(CID)用氩进行，碰撞气流压力为1.4mTorr，丹参素和阿魏酸碰撞能量分别为17eV和14eV。SRM扫描宽度为m/z 0.01，扫描时间为0.5s，峰宽的设定值为0.7u。
贮存液和工作液的配置
用甲醇配制丹参素贮存液(500μg/ml)和阿魏酸贮存液(500μg/ml)，然后用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度为5μg/ml的贮存液。而后丹参素贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度分别为25、50、100、250、500、1000和2500ng/ml的工作液，阿魏酸贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释配制成浓度为500ng/ml的工作液。贮存液和工作液存贮于4℃。
标准品和质控(QC)样品的制备
将200μl工作液加入4.8ml空白的大鼠尿液中制备标准曲线。
QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：
在5ml的大鼠尿液中，加入100μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，70℃减压浓缩至近干，用流动相溶解并定容至2ml，进0.45μm微孔滤膜，取10μl滤液用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
标准曲线：按照实施例1的方法绘制标准曲线，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。
实施例6
实验方法
丹参提取物，制备成2％的水溶液，给大鼠口服，剂量为200mg/kg，每个大鼠分别在服药后20分钟、45分钟或150分钟处死，每个时点各5只，取其肝、肾、脑和心，制备组织匀浆。
仪器
LC/MS/MS***包括Surveyor质谱泵，美国Surveyor自动加样器(ThermoFinnigan，USA)，ThermoFinnigan TSQ Quantum三级四极杆质谱联用仪(San Jose，CA，USA)，配有电喷雾离子源(ESI)；数据分析采用的是Xealibur 1.3软件(ThermoFinnigan，USA)，峰整合和校正采用LCQuan软件(ThermoFinnigan，USA)。
试剂与药品
丹参素和阿魏酸购自国家药品生物制品检定所，其他化学药品根据需要分别为色谱级或者分析级，Sprague-Dawley大鼠(190-210g)购自Sino-Briitsh Sippr/BK实验动物有限公司(上海)。
色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3柱(2.1×150mm，5μm)，预柱：菲罗门公司预柱(KJO-4282)。流动相：甲醇∶甲酸铵缓冲液，流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。甲酸铵缓冲液配制方法：配制10mmol/L的甲酸铵水溶液，用甲酸调节pH至4.0，即得。
质谱条件
毛细管电压温度为320℃，电喷雾ESI源，喷雾电压为3.5kV，氮作为鞘气体和辅助气体，压力分别为30psi和3psi。诱导碰撞碎裂(CID)用氩进行，碰撞气流压力为1.4mTorr，丹参素和阿魏酸碰撞能量分别为17eV和14eV。SRM扫描宽度为m/z 0.01，扫描时间为0.5s，峰宽的设定值为0.7u。
贮存液和工作液的配置
用甲醇配制丹参素贮存液(500μg/ml)和阿魏酸贮存液(500μg/ml)，然后用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度为5μg/ml的贮存液。而后丹参素贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释成浓度分别为25、50、100、250、500、1000和2500ng/ml的工作液，阿魏酸贮存液用甲醇∶甲酸铵缓冲液系列稀释配制成浓度为500ng/ml的工作液。贮存液和工作液存贮于4℃。
标准品和质控(QC)样品的制备
将200μl工作液加入空白组织匀浆中制备标准曲线和质控(QC)样品。
QC样品、标准样品和待测血浆样品按如下方法制备：
在各种不同的组织匀浆中，加入100μl的内标溶液(即500ng/ml阿魏酸)，加入50％的甲醇水溶液(v/v)5ml，超声提取45分钟，5000rpm离心10min，取上清液，用15ml乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯层，50℃减压浓缩至近干，用流动相溶解并且定容至1ml，进0.45μm微孔滤膜，取10μl滤液用于LC/MS/MS***上样。
方法验证
标准曲线：按照实施例1的方法绘制标准曲线，丹参素血浆浓度在5～500ng/ml的范围内成线性。丹参素的LLOQ为5ng/ml。
准确度和精确度：
准确度和精密度的测定结果，都在可接受的范围内(＜±15％)，表明本方法满足生物样本的分析要求。
Claims (10)
1.一种液相层析串联质谱法定量检测生物样本中丹参素的方法，包括步骤(1)样品制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)中的样品制备采用包括如下步骤的方法：
a.在待测样本中加入酸性物质，调节其pH值至小于等于5，并混匀；
b.加入1倍或1倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于250℃的有机溶剂，并混匀；
c.离心，收集有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；
d.步骤c的干燥物用步骤(2)所用的流动相重新溶解。
2.如权利要求1的方法，其特征在于其中所述的生物样本是血浆。
3.如权利要求1的方法，其特征在于步骤a加入的酸性物质是强酸。
4.如权利要求1的方法，其特征在于步骤a调节pH值至小于等于4。
5.如权利要求1的方法，其特征在于步骤b是加入2倍或2倍以上体积的有机溶剂。
6.如权利要求5的方法，其特征在于步骤b是加入15倍体积的有机溶剂。
7.如权利要求1的方法，其特征在于步骤a加入的酸是盐酸，调节其pH值至0.5，步骤b是加入15倍体积的乙酸乙酯。
8.如权利要求1的方法，其特征在于采用电喷雾模式，负离子选择性反应监测，以阿魏酸作为内标。
9.如权利要求1的方法，其特征在于层析使用的是反相色谱柱，流动相采用的是pH小于等于6.5的甲醇∶甲酸铵缓冲液，其中甲醇∶甲酸铵的体积比为98∶2～2∶98。
10.如权利要求8的方法，其特征在于层析时流动相采用的是pH为4.0的甲醇∶甲酸铵缓冲液，其中甲醇∶甲酸铵的体积比为30∶70。
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| CN107957452A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 天士力医药集团股份有限公司 | 一种检测血浆中酚酸类物质的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN107957452A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 天士力医药集团股份有限公司 | 一种检测血浆中酚酸类物质的方法 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: TASLY PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: TIANJIN TASLY PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 300402 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee after: Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd. Address before: 300402 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee before: Tianjin Tianshili Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 300402 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee after: Tasly Pharmaceutical Group Limited by Share Ltd Address before: 300402 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee before: Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |