CN101320039B - 一种***胶体金法检测试纸及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种***胶体金法检测试纸及制备方法,属于生物学免疫方法的测定技术领域。本发明检测试纸由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成,塑料底板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,结合释放垫上包被了抗***多抗-胶体金标记物,硝酸纤维素膜上依次包被有***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体,以***偶联抗原作为测试线,以羊抗兔IgG抗体作为质控线。本发明具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
Description
技术领域
一种***胶体金法检测试纸及制备方法,属于生物学免疫方法的测定技术领域。
背景技术
***(Diazepam)为苯二氮卓类镇静***,化学名称为:1-甲基-5-苯基-7-氯-1,3-二氢-2H-1,4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作动物饲料添加剂,作为生长促进剂,具有使动物嗜睡少动,生长快且有改变肉质的作用。也用在屠宰和动物检疫之前,或将动物转移屠宰之前,起镇静作用,以减轻动物紧张状态,降低动物伤害和死亡率。此类药物常见嗜睡,可见无力、头痛、晕眩、恶心、便秘,偶见皮疹、肝损害、骨髓抑制等不良反应。若随意在饲料中添加此类药物,蓄积的药物通过食物链进入人体,将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名单。目前,国内外有关***的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等,但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备,对检材的要求也比较高,需要进一步的提纯处理才能进行,且不能适应高通量、现场的快速检测。因此实现具有快速,便携优点的免疫检测方法的多残留检测具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种***胶体金法检测试纸及制备方法,为了克服现有检测技术的缺陷,提供一种便携,快速适合进行现场检测***的免疫层析色谱检测法(gold immunochromatography assay;GICA)。
本发明的技术方案:一种***胶体金法检测试纸,由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成,塑料底板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,结合释放垫上包被了抗***多抗-胶体金标记物,硝酸纤维素膜上依次包被有***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体,以***偶联抗原作为测试线,以羊抗兔IgG抗体作为质控线;
制备步骤为:
(1)将***与牛血清蛋白分子进行偶联,作为***偶联抗原;
(2)用***偶联抗原按常规方法免疫制得抗***多抗;
(3)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒;
(4)将3mL胶体金调至pH 9,搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的抗***多抗0.05mL,放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使终浓度为1%,放置至少30min后,10000转离心50min,移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/LpH 9.0的硼酸盐缓冲液3mL重悬,重复2次,最后用0.3mL缓冲液溶解,得到稳定的抗***多抗-胶体金标记物;
(5)将抗***多抗-胶体金标记物包被在胶体金结合释放垫上,将***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,***偶联抗原作为测试线和羊抗兔IgG抗体作为质控线,在37℃烘箱干燥;
(6)试纸条的组装:将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在塑料底板上,即得到用于免疫检测的***胶体金法检测试纸。
本发明检测原理是利用样品垫形成的毛细管虹吸效应,使被检测物质首先与胶体金标记的抗***多抗发生竞争形式的结合,其后果是,当胶体金标记的抗***多抗过量时,多余的多抗漂移到测试线,与***偶联抗原结合并显色;而与检测物结合的胶体金标记的抗***多抗,其V区结合位点被检测物质占据,只能跨越测试线漂移到质控线以C区位点与羊抗兔IgG抗体非特异性结合,同测试线进行比色而得到检测结果。
本发明的有益效果:本发明应用层析式一步竞争法原理,试纸中上下线比色来半定量检测血清或尿液样品中的***残留量,在5-10min内,快速准确地检测出样品是否含有***,以确定***是否超标,能够满足食品安全对***残留量检测需求,适用于屠宰企业及政府检测机构。
本发明与现有技术相比,其效果不言而喻,即具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。
附图说明
图1本发明***胶体金法检测试纸的侧视图。
具体实施方式
实施例1:***检测试纸的制备
(1)将***与牛血清蛋白分子偶联,作为***偶联抗原,
(2)用***偶联抗原免疫获得抗***多抗:
(3)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒;
(4)将3mL胶体金调至pH 9,搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的抗***多抗0.05mL,放置30min后加入5%牛血清白蛋白(BSA)溶液使终浓度为1%,放置至少30min后,10000转离心50min,移去上清液后用0.002mol/L pH9.0的硼酸盐缓冲液(含5%蔗糖)3mL重悬,重复2次,最后用0.3mL缓冲液溶解,得到稳定的抗***多抗-胶体金标记物;
(5)将抗***多抗-胶体金标记物包被在胶体金结合释放垫上,将***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为测试线和质控线,在37℃烘箱干燥。
(6)试纸条的组装:将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在塑料底板上,即得到用于检测的***胶体金法检测试纸。
实施例2:试纸要求
(1)阴性参考品符合率
用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01mol/L,pH 7.4)配制浓度为10ng/mL的盐酸异丙嗪标准品溶液进行10次平行检测,以正常或矫正目力观察结果,反应时间在5min时观察结果,应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01mol/L,pH 7.4)配制浓度为10ng/mL的巴比妥标准品溶液进行10次平行检测,以正常或矫正目力观察结果,反应时间在5min时观察结果,应为阴性。
(2)阳性参考品符合率
用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01mol/L,pH 7.4)配制浓度为50、100、150ng/mL的***标准品进行平行检测,各浓度进行10次平行实验,反应时间在5min时观察结果,不得出现阴性。
(3)最低检出量
用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01mol/L,pH 7.4)分别配制浓度为0、2、5、10、20、50、100ng/mL的***标准品溶液,各浓度进行10次平行实验,反应时间在5min时,以正常或矫正目力观察结果,最低检出量不高于50ng/mL。
(4)再现性
用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01mol/L,pH 7.4)分别配制浓度为50ng/mL的***标准品溶液,进行10次平行实验,反应时间在5min时,以正常或矫正目力观察结果,结果一致,显色度均一。
(5)稳定性测试
37℃放置10天后,各项指标应符合以上要求。
实施例3:试纸使用方法
(1)样品制备
血清:抽取待检动物血液,离心或静置后取透明上清液使用;若血清有过度溶血现象,将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验,否则试剂片红色太深,影响测试结果。
尿液:用尿液直接进行测试,如浑浊,先离心取上清液或以蒸馏水1∶1稀释。
(2)操作
将试纸箭头端浸泡在待测样本中,不要超过样品垫1cm。浸入30sec取出放平,10min读取结果。
(3)检测结果
阴性:
两条带都显色,且测试线颜色深于质控线颜色,说明样品中不含***。
两条带都显色,且测试线颜色与质控线颜色相同或接近,说明样品的***含量低于50ppb(50ng/mL)。
阳性:
两条带都显色,但测试线颜色浅于质控线颜色,说明检测样品中***含量超过50ppb(50ng/mL)。
测试线不显色,质控线显色,说明样品中的***含量高于100ppb(100ng/mL)。
Claims (1)
1.一种***胶体金法检测试纸的制备方法,
所述***胶体金法检测试纸由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成,塑料底板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,结合释放垫上包被了抗***多抗-胶体金标记物,硝酸纤维素膜上依次包被有***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体,以***偶联抗原作为测试线,以羊抗兔IgG抗体作为质控线;
其特征在于,其制备步骤为:
(1)将***与牛血清蛋白分子进行偶联,作为***偶联抗原;
(2)用***偶联抗原按常规方法免疫制得抗***多抗;
(3)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒;
(4)将3mL胶体金调至pH9,搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的抗***多抗0.05mL,放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使终浓度为1%,放置至少30min后,10000转离心50min,移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/LpH9.0的硼酸盐缓冲液3mL重悬,重复2次,最后用0.3mL缓冲液溶解,得到稳定的抗***多抗-胶体金标记物;
(5)将抗***多抗-胶体金标记物包被在胶体金结合释放垫上,将***偶联抗原和羊抗兔IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,***偶联抗原作为测试线和羊抗兔IgG抗体作为质控线,在37℃烘箱干燥;
(6)试纸条的组装:将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在塑料底板上,即得到用于免疫检测的***胶体金法检测试纸。
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