CN101314616B

CN101314616B - 肠出血性大肠杆菌o157:h7志贺毒素ⅱb表位肽及其应用

Info

Publication number: CN101314616B
Application number: CN2008100697852A
Authority: CN
Inventors: 邹全明; 罗萍; 毛旭虎; 曾浩; 石云; 郭刚; 张卫军; 刘璐
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2028-05-30
Also published as: CN101314616A

Abstract

发明属于医药生物技术领域，涉及来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIB表位肽及其应用，其中优选的4个多肽来自EHEC O157:H7志贺毒素IIA1亚单位(Stx2A1)的B细胞表位本发明所述肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIB表位肽可用于制备诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中。

Description

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素ⅡB表位肽及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIB表位肽及其应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7为重要的新发人畜共患传染病原，其引发的食物中毒在世界各地包括中国均有大规模的暴发流行。2006年在美国爆发的波及26个州的毒菠菜事件就是由该菌污染所致，1999年末至2000年初，在我国东部部分地区发生了迄今为止世界上最大规模的O157:H7感染爆发流行，因此，该菌的感染已经成为一个全球性的公共卫生问题。由于EHEC O157:H7菌培养容易、感染力强、传播途径多样，使O157菌极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC O157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。此外，EHEC O157:H7菌的烈性致病因子还有可能用于新型生物武器——基因武器的构建。

然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明：抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Shiga toxin，Stx)，从而使患者病情加重。2002年中国国家***制定的“肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻应急处理预案(试行)”第5条规定：肠出血性大肠杆菌O157:H7病人和疑似病人禁止使用抗生素。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，探索新的治疗手段迫在眉睫。

研究表明：志贺毒素II(Stx2)是O157:H7主要的致病因子。Stx2进入血液循环后，可引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤，最终导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症的发生。因此，Stx2是目前治疗O157:H7菌感染的药物研究的主要靶标。

Stx2毒素由1个A亚基(32KDa)和5个B亚基(7.7KDa/单体)组成。Stx2通过B亚基与受体Gb3结合后，进入细胞内质网A亚基被裂解为A1和A2两个片段后，A1片断经内质网进入细胞质作用真核生物核糖体28SrRNA，导致蛋白质合成停止。这种作用会导致肾内皮细胞、肠上皮细胞、Vero细胞、Hela细胞或其他任何具有Gb3受体的细胞的死亡。

鉴于Stx2的结构和致病其机理，针对Stx2的药物研究主要集中在Stx2的疫苗和中和性抗体的研究，但目前国内外尚无Stx2的疫苗和中和性抗体上市。

鉴于以上研究背景本发明预测并和成了Stx2A1毒性亚单位上的B细胞表位，并对预测的B细胞表位的免疫原性和免疫保护性进行了鉴定，本发明的B细胞表位肽可用于EHEC O157:H7感染的肽疫苗研究和利用B细胞表位肽制备Stx2特异的单克隆抗体诊断和治疗O157:H7的感染。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种来自肠出血性大肠杆菌O157:H7Stx2A1毒性亚单位的B细胞表位肽，其具有下述氨基酸序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

2)将所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种编码上述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7Stx2A1毒性亚单位上的B细胞表位肽的核苷酸序列，其具有下述核苷酸序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

2)与所述SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供上述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II A1亚单位的B细胞表位肽的应用，其可用于制备预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物组合物，或制备单克隆抗体。

本发明所述的预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物，其包含上述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II A1亚单位的B细胞表位肽和药学上可接受的载体，其中上述的药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。如本发明的B细胞表位肽可以与佐剂不耐热肠毒素一起组成药物制剂后口服，与铝佐剂一起组成药物制剂静脉输注射。

本发明所述的另外一种可预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的疫苗组合物，其也包含上述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIA1亚单位的B细胞表位肽。本发明的B细胞表位肽及其药物制剂可用于预防和治疗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染所致出血性肠炎；溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少紫癜。

本发明的思路如下：首先基于Stx2与配体腺嘌呤相互作用的晶体结构，按B细胞表位的预测原则，对包含毒性活性位点的Stx2A1亚单位的氨基酸序列进行分析，预测Stx2A1的B细胞表位，并采用DNAStar软件分析评价，人工合成B表位肽，用合成的B细胞表位肽偶联载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpethemocyanin，KLH)后免疫日本大耳兔，鉴定其免疫原性；Dot ELISA和Westernblot鉴定兔抗血清的特异性，获得了4条B细胞表位肽；用4条B细胞表位肽分别免疫Balb/c小鼠，以天然Stx2攻毒，鉴定4条B细胞表位肽的免疫保护性，结果显示：P1B细胞表位肽能刺激机体产生中和Stx2的抗体，该肽段位于Stx2A1片段N端第53～80位氨基酸，包含Stx2的毒性活性位点-位于Stx2A1片段N端77位上的酪氨酸。本发明的B表位肽可以用来研制人或小鼠用的O157:H7的肽疫苗，可以用来开发预防或治疗EHEC O157:H7感染的多肽药物。

本发明经过深入而广泛的研究，基于EHEC O157:H7的Stx2蛋白的晶体结构，辅以DNAStar软件分析，选择性的合成了4条可能诱导机体产生体液免疫应答的B细胞表位肽，并对其免疫特性进行评价，发现此4条表位肽能够在Balb/c小鼠体内诱导特异性的体液免疫应答，产生的抗血清均能与Stx2蛋白发生特异性结合。因此，此四条多肽可以用于EHEC O157:H7的多表位肽疫苗的设计；本发明的4条多肽可以用于人及动物用的疫苗及药物的开发。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1A-图1B表示斑点酶联免疫吸附试验鉴定兔抗血清的特异性

A.斑点酶联免疫吸附试验包被抗原的示意图；B.斑点酶联免疫吸附试验结果

1.P1B表位肽兔抗血清

2.P2B表位肽兔抗血清

3.P3B表位肽兔抗血清

4.P4B表位肽兔抗血清

5.正常兔血清；

6.PBS空白对照

图2表示免疫印迹鉴定兔抗血清的特异性

1.阴性兔血清的免疫印迹

2.P1B表位肽兔抗血清的免疫印迹

3.P2B表位肽兔抗血清的免疫印迹

4.P3B表位肽兔抗血清的免疫印迹

5.P4B表位肽兔抗血清的免疫印迹；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，及对本发明表位肽及其核苷酸序列的利用都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 B表位的筛选鉴定：

1.表位肽的预测及合成

在NCBI的结构数据库检索EHEC O157:H7的Stx2以及Stx2与配体腺嘌呤晶体结构解析图(编号1R4P和2GA4)，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝Structure)。基于Stx2与配体腺嘌呤相互作用的立体结构，依据暴露在蛋白质表面、含伸展区和无规则卷曲或β转角、以及肽段长度约15～30个氨基酸等B表位肽的预测原则，选取Stx2A1毒性片段上的氨基酸肽段，采用DNAStar软件对预测的氨基酸肽段进行亲水(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karp lus-Schulz方案)、二级结构(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等参数进行评价，如果某肽段中，抗原指数≥1、亲水性指数≥0、氨基酸的表面可能性指数≥1，同时其内部或附近又具有柔性结构，则这一区段为抗原表位的可能性较大。通过BLAST检索比较预测的B细胞表位肽与人、兔、鼠的同源性后，最终确定本研究所用的4条可能的B细胞表位肽序列，人工合成4条可能的B表位多肽(由北京中科亚光公司协助合成，4条B细胞表位肽的基本信息见表1)，并分别偶联载体蛋白KLH。

表1预测合成后的Stx2B表位的基本信息

2.STX2A1B细胞表位肽免疫原性鉴定

2.1免疫日本大耳兔

雄性日本大耳兔，随机分成5组，每组两只，分别用偶联KLH的4条B细胞表位肽(P1-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)加完全福氏佐剂皮下多点注射免疫，每只注射1ml，含抗原肽1mg，此后每隔两周用同样剂量加不完全弗氏佐剂加强免疫，共加强3次，再隔两周后不加佐剂同样剂量免疫一次，一周后放血，间接ELISA检测抗血清效价，对照组PBS替代多肽进行免疫，免疫方法及程序相同。

2.2ELISA检测血清效价

间接ELISA的包被抗原分别为4条未偶联KLH的多肽和天然Stx2。具体方法如下：

包被：用包被液将抗原稀释为2μg/ml，加入酶标板，100μl/孔，4℃过夜，PBS洗涤5遍，空干；封闭：加1％BSA封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用；兔血清稀释：按1∶100，1∶200，1∶400......进行系列倍比稀释至第10管；取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤5遍，空干；加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干；加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟；加终止液100μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值；结果判断：OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1∶10倍稀释)的2.1倍为抗Stx2抗体阳性。呈抗体阳性的最大稀释倍数即为抗体效价。

结果：间接ELISA结果显示4条合成多肽均能刺激日本大耳兔产生抗多肽和Stx2的抗体，兔血清抗体与多肽和天然Stx2反应的效价如表2所示，而免疫前的兔血清与PBS免疫对照组血清检测为阴性，此结果表明本发明的4条B细胞表位多肽具有较好的反应原性和免疫原性。

表2 B细胞表位肽免疫兔血清效价

3多克隆抗体的特异性鉴定

3.1斑点酶联免疫吸附试验检测抗体的特异性

包被抗原：在硝酸纤维膜(NC膜)上分别加入4条抗原肽、KLH及天然Stx2各2μl/点，待其室温干燥。封闭：将包被抗原的NC膜浸入5％的脱脂奶粉中，置37℃1小时。洗涤：弃去封闭液，用TTBS漂洗膜3次，每次1分钟，NC膜下点溪水滤纸和海绵。分别加入4种抗血清和阴性兔血清，2μl/点，置37℃15分钟，TTBS冲洗3次。NC膜入HRP标记的羊抗兔IgG，工作浓度为1∶10000，置37℃15分钟，TTBS冲洗3次。加入DAB显色液，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

3.2免疫印迹检测抗体的特异性

取已处理的天然Stx2，并设定蛋白质分子量标准，在5％浓缩胶，15％分离胶上进行垂直SDS-PAGE，80V，30分钟，调整电压为150V，约1.5小时。电泳结束后，取下凝胶，一块用考马斯亮蓝R-250染液快速染色，另一块置于硝酸纤维素膜上，15V恒压电转移过夜。转移后的硝酸纤维素膜在丽春红S中染色1分钟，标记蛋白质分子标准，再用蒸馏水脱去红色。将转移膜置于封闭液(TTBS)中，37℃，150rpm，轻轻振摇封闭60分钟弃去封闭液，用洗涤液(TTBS)漂洗膜4次，每次10～15分钟。加入以洗涤液1∶1000稀释的兔抗血清，37℃，150rpm，轻轻振摇反应60分钟。TBS漂洗膜4次，每次10～15分钟。加入以TBS稀释的HRP标记的羊抗小兔IgG(1∶20000)，150rpm，轻轻振摇反应60分钟。TBS漂洗4次，每次10～15分钟。加入DAB显色液，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

斑点酶联免疫吸附试验检测结果(图1A和图1B所示)显示：4条B细胞表位肽制备的兔抗血清分别在相应的多肽抗原、KLH和Stx2处出现显色斑点，为阳性，而正常兔血清上述抗原处未出现显色，为阴性，该结果说明：4条B细胞表位肽制备的兔多克隆抗体能特异的与B细胞表位肽、Stx2和载体蛋白KLH反应；采用免疫印迹对4种兔抗血清的特异性作进一步鉴定，结果(图2)表明：在分子量约32KDa处即天然Stx2的A亚单位处，可见清晰的单一阳性反应条带；而用免疫前血清为一抗孵育，无特异反应条带出现，说明4条B细胞表位肽诱导机体产生特异针对Stx2A亚单位的多克隆抗体。

实施例2免疫小鼠攻毒试验筛选保护性B细胞表位肽

6～8周龄雌性Balb/c小鼠，随机分成5组，每组5只，分别用偶联KLH的4条B细胞表位肽(P1-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)皮下多点加腹腔注射免疫Balb/c小鼠，每只注射0.51ml，含抗原100μg，免疫时间为0、2、4、6、8周，共5次，第1次加入福氏完全佐剂第2～4次加福氏不完全佐剂，最后一不加佐剂同样剂量腹腔注射免疫一次，第2、3、4、5次免疫后7d断尾采血，采用间接ELISA法检测免疫Balb/c小鼠血清效价(操作步骤同前)；计算抗体的阳转率和几何滴度平均数(GMT)和平均增长倍数。末次免疫10天后每只小鼠腹腔注射致死剂量(LD₁₀₀)的天然Stx2，50ng/kg，观察10天内各组小鼠的存活率。对照组PBS替代多肽进行免疫，免疫方法及程序相同。

表3免疫小鼠血清特异性抗体阳转率

分析ELISA检测结果(表3)，以免疫前后抗体滴度增长4倍为阳转标准，分别计算各组免疫2、3、4、5次后的抗体阳转率、几何平均滴度(GMT)及平均增长倍数。表3数据显示，免疫2次后P1、P2、P3、P4组的阳转率分别为93.3％、93.3％、73.3％和66.7％，免疫4次后的阳转率分别为100％、100％。93.3％和86.7％。

表4免疫小鼠血清Stx2抗体水平

如表4所示：4组抗Stx2抗体的GMT随免疫次数的增加呈逐次上升趋势，第5次免疫后P1、P2、P3、P4的GMT分别为11380、12211、6948、5171，分别是免疫前的113.8倍、122.1倍、69.5倍、51.7倍，而PBS对照组的GMT为1∶106仅为免疫前的1.06倍。(表3～4)。

以上结果证明4条单一的B细胞表位肽均能刺激小鼠产生特异、有效的体液免疫应答。可以作为肽疫苗组分。

Stx2攻毒保护试验结果显示：小鼠腹腔注入50ng/kg(LD₁₀₀)剂量天然Stx2后，各组小鼠均先后出现了较重的中毒症状，表现为皮毛蓬松皱摺、活动呆滞、摄食减少、精神委靡嗜睡。尤其以对照组、P2、P3、P4的小鼠中毒症状出现快(24h～72h)，且呈进行性加重直至死亡，而P1组的小鼠中毒症状出现相对较慢(96h)，症状出现后有部分小鼠能够逐渐恢复。各组小鼠具体的存活与死亡情况表5所示：

表5小鼠免疫后攻毒的保护效果观察

*.P＜0.01vs PBS组；**.P＞0.05vs PBS组

由表5可见，PBS对照组小鼠攻毒后144h内全部死亡，而P1、P2、P3、P4抗原免疫组的部分小鼠能够耐受致死剂量的Stx2毒素攻击而得以存活，10天后的存活率分别为70％、20％、10％、10％，经χ2检验分析P1组与PBS对照组有显著性差异(P＜0.01)，P2、P3、P4免疫组和PBS对照组无显著性差异(P＞0.05)，说明单一的P1B细胞表位肽能够刺激机体产生中和Stx2的抗体，具有较强的免疫保护作用，而单一的P2、P3、P4B细胞表位肽保护效率差，但不能排除P2、P3、P4B细胞表位肽联合应用时会产生免疫保护作用。此结果为利用B细胞表位肽制备Stx2中和性单克隆抗体和O157:H7肽疫苗的候选组分提供了有力的实验依据。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIB表位肽及其应用

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>28

<212>PRT

<213>来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIA1亚单位的B细胞表位肽的氨基酸序列

<400>1

Asp Ile Arg Gly Leu Asp Val Tyr Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ile Ile Glu Gln Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly

20 25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<400>2

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu

1 5 10 15

Phe Arg Gln Ala Leu Ser Glu Thr Ala Pro Val

20 25

<210>3

<211>22

<212>PRT

<400>3

Leu Glu His Ile Ser Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn His

1 5 10 15

Thr Pro Pro Gly Ser Tyr

20

<210>4

<211>15

<212>PRT

<400>4

Val Pro Gly Val Thr Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr

1 5 10 15

<210>5

<211>84

<212>DNA

<213>编码肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIA1亚单位的B细胞表位肽的核苷酸序列

<400>5

gatatacgag ggcttgatgt ctatcaggcg cgttttgacc atcttcgtct gattattgag 60

caaaataatt tatatgtggc cggg 84

<210>6

<211>81

<212>DNA

<400>6

gtcactgtca cagcagaagc cttacgcttc aggcagatac agagagaatt tcgtcaggca 60

ctgtctgaaa ctgctcctgtg 81

<210>7

<211>66

<212>DNA

<400>7

cttgaacata tatctcaggg gaccacatcg gtgtctgtta ttaaccacac cccaccgggc 60

agttat 66

<210>8

<211>45

<212>DNA

<400>8

gtgcccggtg tgacaacggt ttccatgaca acggacagca gttat 45

Claims

1.一种来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II A1亚单位的B细胞表位肽，其特征在于所述表位肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

2.一种编码权利要求1所述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II A1亚单位的B细胞表位肽的核苷酸序列，其特征在于所述表位肽的核苷酸序列为：SEQ ID NO：5。

3.权利要求1所述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素IIA1亚单位的B细胞表位肽在制备单克隆抗体中的应用。

4.一种预防肠出血性大肠杆菌感染的疫苗，其特征在于包含权利要求1所述的来自肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II A1亚单位的B细胞表位肽和药学上可接受的载体。