CN101310730A - 酪酸梭菌在制备防治类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酪酸梭菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌在制备预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用，酪酸梭菌选自但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、CGMCC、保存编号0313.1。酪酸梭菌以活菌的形式和药学上可接受的不同载体制成片剂、胶囊剂、散剂、液体制剂等所需要的各种剂型，酪酸梭菌属于益生菌，没有任何毒副作用，类风湿性关节炎、强直性脊柱炎患者可以通过口服等方式长期应用，缓解症状、减缓病情进展和预防发病，对于早期患者甚至可以治愈。

Description

酪酸梭菌在制备防治类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用

技术领域

本发明涉及酪酸梭菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌在制备预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用，其中所述酪酸梭菌作为活性成份制成活菌制剂，属于生物技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)和强直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis，AS)是风湿性疾病中发病率最高的两种自身免疫性疾病，属于关节的一种慢性、炎症性和破坏性疾病，严重影响患者的生活质量，致残率很高。病因至今尚未完全阐明，涉及遗传、感染、免疫调节等多种因素，属于难治性疾病。目前临床上尚缺乏根治的方法以及预防本病的措施，治疗本病的目的是：①减轻或消除患者因关节炎引起的关节肿痛、压痛、晨僵或关节外的症状；②控制疾病的发展，防止和减少关节骨的破坏，达到较长时间的临床缓解，尽可能保持受累关节的功能。

目前治疗RA和AS的药物有非甾体类抗炎药(NSAIDs)、改善病情抗风湿药(DMARDs)、免疫抑制剂、中成药、糖皮质激素等。这些药物普遍存在的问题是随着用药时间的延长，副作用随之暴露出来，有些品种还引发了较为严重的不良反应事件。

2004年1月份以来，5名曾服用过法国安万特公司爱诺华的日本人患上了间质性肺炎和肺纤维症，并最终不治身亡，其中有4人是年龄在57岁到71岁之间的中老年人。

2004年10月1日起，默沙东公司开始在全球范围内回收治疗关节炎药物“万络”(药品通用名为罗非昔布)，原因是该药会增加服用者心脏病和中风的发病几率。

2004年11月9日，FDA和雅培(Abbott)公司向医药人员发出信函，告知肿瘤坏死因子(TNF-a)阻断剂的标签中加入警告标示，这类药物包括阿达木单抗(adalimumab)，警告称使用TNF-a阻断剂和白介素-1(IL-1)时有发生严重感染的潜在危险。

2005年4月7日，美国食品药品监督管理局(SFDA)发布所有消炎止痛药的最新用药指导，就如何使用消炎止痛药发表了声明，声明中指出综合现有的研究数据，所有的非甾体消炎药均有潜在的心血管风险，而这些药中就包括我们比较常用的扶他林、芬必得、西乐葆等。SFDA已要求这些药品生产厂家在其说明书中加入黑框警示。

由于RA和AS患者需要长时间用药，因此寻找毒副作用小，甚至没有毒副作用的药物显得尤为重要，本发明的微生物制剂不但能缓解症状、减缓病情进展，对于早期患者可以治愈，而且没有任何毒副作用，可以长时间服用，由于所选微生物菌种的独有特性，其治疗效果是其它微生物制剂所没有的，特申请此发明专利。

发明内容

本发明人通过深入的基础和临床研究发明以酪酸梭菌为主要药物活性成份制成药物、保健食品或饮品，长期应用可以有效预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎，缓解症状、减缓病情进展，对于早期患者可以治愈，而且酪酸梭菌属于益生菌，没有任何毒副作用，可以长时间服用。

类风湿性关节炎、强直性脊柱炎均是由于体液免疫和细胞免疫异常，导致的免疫和炎症损伤，酪酸梭菌主要是通过调节免疫功能恢复正常、下调炎症因子过度表达来预防和治疗类风湿性关节炎和强直性脊柱炎，疗效显著，具体作用机制主要为以下几个方面：

1、调节免疫功能恢复正常，提高免疫***耐受性

研究表明RA和AS患者的淋巴细胞免疫功能紊乱，IgG表达水平升高。本发明人研究发现酪酸梭菌能使降低的T-淋巴细胞转化率升高，使T-淋巴细胞免疫功能恢复正常，同时能下调IgG升高的表达水平，使IgG表达恢复正常。

2、消除炎症

RA和AS患者TNF-α、IL-8等致炎症因子水平高于正常人，使各关节处于慢性炎症状态，TNF-α更进一步破坏关节软骨和骨，结果造成关节畸形，目前开发的抗TNF-α药物治疗RA和AS取得很好的疗效，但有很大的副作用。酪酸梭菌通过分泌酪酸调控核因子-κB的活性，从而下调TNF-α、IL-8等致炎症因子的过度表达，使之恢复到正常水平，且没有任何副作用。

3、分泌酪酸菌素，预防肠道感染

感染与强直性脊柱炎的发生有密切关系，而感染中肠道感染又占有很重要的位置。有学者对20例强直性脊柱炎患者进行纤维结肠镜检查及活体组织检查，结果显示强直性脊柱炎病人55％有明显的肠道非特异性炎症改变，其中伴随腹泻的占27.3％，结肠粘膜活检示阳性炎症改变者达65％，病变部位累及结肠和直肠者占63.6％。而强直性脊柱炎骶髂关节的病变及脊柱上行性受累的病变位置恰好直接毗邻直肠和结肠。肠道感染是强直性脊柱炎发病和病情进展的重要诱因，酪酸梭菌能分泌酪酸菌素，抑制肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌等肠道有害菌，预防肠道感染，从而预防强直性脊柱炎发病和减缓病情进展。

4、分泌酪酸(丁酸)，修复肠粘膜，改变肠粘膜通透性

研究发现强直性脊柱炎患者的肠粘膜通透性高于正常人，并随病情的加重而升高，因此，肠粘膜通透性的升高可能诱发了AS的发病或促进了病情的进展。肠粘膜所需能量的70％来源于酪酸，酪酸是肠粘膜细胞的主要能量来源和营养物质，能为肠提供代谢能量，促进肠上皮细胞增殖与粘膜生长。同时，酪酸能刺激介导肠上皮细胞增殖和肠粘膜生长的胃肠激素的生成，如胃泌素、肠高糖素、酪酪肽等。酪酸梭菌进入肠道能分泌大量酪酸，从而改变肠粘膜的通透性，减少AS发病和病情进展的诱发因素。

5、提高机体免疫力

感染因素与类风湿性关节炎和强直性脊柱炎发病相关，包括细菌、支原体、病毒、原虫等感染之后，在机体内作为持续存在的抗原引起连续的免疫反应。酪酸梭菌能促进单核-巨噬细胞***的吞噬功能，增加血清溶血素的生成，升高白细胞等，提高机体免疫力，从而预防感染，减少发病和病情进展的诱发因素。

6、减少肠道毒素入血，避免对关节的进一步损伤

酪酸梭菌能分泌酪酸菌素，抑制肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌等肠道有害菌，消除产毒源，减少肠道氨、胺、吲哚、粪臭素等肠道毒素，避免其吸收入血对关节造成进一步损伤。

本发明所述酪酸梭菌选自但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、CGMCC、保存编号0313.1，其他的酪酸梭菌均可以。

本发明所述的酪酸梭菌指活生物个体。

本发明以酪酸梭菌为主要活性成份制成的制剂，可以是单独以酪酸梭菌为活性成份制成相关剂型的活菌制剂，也可以是与其他活性成份组合制成相关剂型的活菌制剂，起到协同治疗作用，以提高治疗效果。

本发明是以有效剂量的酪酸梭菌根据上面所述作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋性剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液体制剂、其他液体制剂或灌肠剂等所需剂型。

本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌根据上面所述作为主要活性成份制成的最终固体活菌制剂包含的总活菌数一般不低于1×10⁵CFU/g，一般在1×10⁷CFU/g以上，最高可达到1×10¹²CFU/g或1×10¹²CFU/g以上。

本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌根据上面所述作为主要活性成份制成的最终液体活菌制剂包含的总活菌数一般不低于1×10⁵CFU/mL，一般在1×10⁷CFU/mL以上，最高可达到1×10¹²CFU/mL或1×10¹²CFU/mL以上。

本发明优选的制剂工艺为，先在液体培养基中接种菌种，进行培养或多级扩增培养，然后将液态培养物离心，收集湿菌泥，并将所述菌泥干燥、粉碎，得到干燥菌粉。将所得干燥菌粉与药用载体混合，制成最终剂型。

由于本发明首次公开了以酪酸梭菌为主要活性成份在制备预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用，因此，以酪酸梭菌作为药物活性成份与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎，均属于本发明的保护范围。

本发明的酪酸梭菌在制成任何一种剂型时，均具有预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的作用。任何药剂，如果其组份中含有酪酸梭菌成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的作用，则落入本发明的保护范围之内。

本发明的酪酸梭菌属于益生菌。因此，也可以将酪酸梭菌制成保健食品或饮品。将酪酸梭菌制成的保健食品或饮品，如果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的作用，则落入本发明的保护范围之内。

具体实施方式

药物制备例说明：以酪酸梭菌为药物活性成份制成胶囊剂为例，说明制备方法。制备方法不只局限于以下的方法，公知的方法均可以。

药物制备实施例1、酪酸梭菌活菌菌粉制备：

取酪酸梭菌活菌菌种管一支，溶于已灭菌装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中，活化10分钟，用1ml无菌吸管吸取1ml菌悬液接种装有50ml扩增培养基的250ml三角瓶中，置摇摆床内37℃恒温振荡(190rpm)培养24小时，转接装有450ml扩增培养基2500ml档板三角瓶中，37℃恒温振荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.5L扩增培养基的种子罐中，厌氧培养(充气量3∶1)24小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养基的发酵罐中，37℃厌氧培养24小时，镜检芽孢率达80％以上，停止培养。用连续离心机，12000rpm离心。收集湿菌泥，称重，按1∶1(w/v)添加适量脱脂奶粉等保护剂后，干燥，粉碎，常温保存备用。

药物制备实施例2、酪酸梭菌活菌胶囊制备

成份                    重量百分比

酪酸梭菌活菌菌粉        20.00份

微晶纤维素              40.00份

葡萄糖                  40.00份

将上述组份中1～3组中充分拌匀，然后利用常规灌装胶囊技术按单位剂量制成胶囊。

疗效观察试验例1、酪酸梭菌调节免疫和炎症因子表达的研究

1实验材料与方法

1.1实验动物：雄性SD大鼠，180-220g，购自维通利华实验动物中心，清洁级，合格证号为：SCXP(京)(2002)-0003。

1.2实验药物：酪酸梭菌(CGMCC No.0313.1株，10⁷CFU/ml)由青岛东海药业有限公司提供。

1.3实验试剂：弗氏完全佐剂(sigma)，MTT(sigma)，伴刀豆素球蛋白(ConA)(Sigma)；脂多糖(LPS)(Sigma)；MTT(Sigma)，购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公司；1640培养液(Gibco)；牛结肠粘膜蛋白冻干粉(自制)；IL-8ELISA试剂盒(BD)；TNF-αELISA试剂盒(Ebioscience)；大鼠IgG参考血清；兔抗大鼠IgG抗血清，外购。

2实验方法

2.1牛结肠粘膜蛋白冻干粉的制备取新生小牛结肠，刮取牛结肠粘膜，反复冻溶法获取牛结肠粘膜蛋白，纯化浓缩，真空冻干后于4℃保存备用。

2.2免疫异常性大鼠模型的建立取牛结肠粘膜蛋白与完全弗氏佐剂(1∶1)制成完全抗原，选用体重在200±20g的SD大鼠，造模大鼠首次每只足跖内注射抗原4mg，于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg，最后1次注射不加佐剂，至血清IgG达到一定效价。

2.3动物分组及治疗设正常对照组(8只)。造模成功后，将造模大鼠随机分组，1)模型对照组(10只)，给予生理盐水灌胃；2)酪酸梭菌(10⁷CFU/ml)治疗组(10只)。每次1ml/100g·体重，1次/天，灌胃，连续给生理盐水或治疗药21天。

2.4指标测定给生理盐水或药物至第21天后，断头处死动物，测定模型对照组和酪酸梭菌治疗组淋巴细胞转化率、IL-8、TNF-α和IgG等指标。

2.4.1淋巴细胞转化率无菌环境下取大鼠肠系膜淋巴细胞，过200目细胞筛，无菌PBS洗涤两次，1000rpm，5min。用完全1640培养液调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，每孔100μl，接种于96孔圆底细胞板中，同时加ConA(终浓度为3μg/ml)或LPS(终浓度为5μg/ml)，100μl/孔。另设定空白对照孔(未加诱导剂)，37℃、5％CO₂孵育72h，培养结束前4h，加MTT(5mg/ml)20μl，培养结束后，测定540nm处测定OD值，计算淋巴细胞刺激指数。淋巴细胞刺激指数(SI)＝刺激组OD值/未刺激组OD值药物。

2.4.2IL-8、TNF-α和IgG断头处死大鼠，取血，4℃静置过夜，3000rpm，20min离心，取上清，分装，放于-20℃待测。使用ELISA试剂盒，按照说明书，测定大鼠血清中大鼠IL-8及TNF-α的含量。使用单向免疫扩散法测定血清中IgG的含量。

2.5统计学处理各组间的数据差异的统计学显著性检验，用t-student’t检验，差异显著性界限为p＜0.05。

3实验结果

3.1淋巴细胞转化率

建立免疫异常性大鼠模型成功后，B淋巴细胞转化率升高，但与正常对照组相比无统计学差异，经酪酸梭菌21天治疗后B淋巴细胞转化率与模型对照组比较相对降低，但也无统计学差异；T淋巴细胞转化率降低，与正常对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，经酪酸梭菌21天治疗后T淋巴细胞转化率均比模型对照组的显著升高(P＜0.01)，见表1。

表1酪酸梭菌对免疫异常性大鼠淋巴细胞转化率变化的影响(x±s)

3.2血清IL-8含量

模型对照组大鼠血清中的IL-8含量比正常对照组的显著升高(P＜0.05，)，酪酸梭菌治疗组大鼠治疗21天后血清中的IL-8含量与模型对照组相比显著降低(P＜0.05)，见表2。

表2酪酸梭菌对免疫异常性大鼠血清IL-8含量变化的影响(x±s)

3.3血清TNF-α含量

模型对照组大鼠血清中的TNF-α含量与正常对照组比较显著升高(P＜0.05)，酪酸梭菌治疗组大鼠治疗21天后血清中的TNF-α含量与模型对照组相比显著降低(P＜0.05)，见表3。

表3酪酸梭菌对免疫异常性大鼠血清TNF-α含量变化的影响(x±s)

3.4血清IgG含量

模型对照组大鼠血清中的IgG含量比正常对照组的显著升高(P＜0.05)，酪酸梭菌治疗组大鼠治疗21天后血清中的IgG含量与模型对照组相比显著降低(P＜0.05)，见表4。

表4酪酸梭菌对免疫异常性大鼠血清IgG含量变化的影响(x±s)

4讨论

通过免疫的方法建立的免疫异常性大鼠模型相当于人类的自身免疫性疾病，模型建立后淋巴细胞免疫功能紊乱，IgG、IL-8、TNF-α表达水平升高，与类风湿性关节炎和强直性脊柱炎的变化趋势一致，通过酪酸梭菌治疗21天后升高的B淋巴细胞转化率降低，降低的T淋巴细胞转化率升高，IgG含量降低，IL-8、TNF-α等致炎症因子含量降低，各项指标由于治疗时间短虽然没有完全恢复到正常水平，但向正常趋势变化，有的指标经酪酸梭菌治疗后甚至接近正常水平，随着治疗时间的延长，一定会使免疫功能和致炎症因子的表达调节到正常水平。免疫功能和致炎症因子的表达恢复正常，可以缓解RA和AS患者的症状和减缓病情进展，甚至使早期的RA和AS患者治愈。

疗效观察试验例2、口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗类风湿性关节炎疗效观察

1对象与方法

1.1病例资料

经临床明确诊断为类风湿性关节炎的患者，共8例，平均年龄40岁，病史在2年～15年。临床症状为：关节肿胀、疼痛、晨僵或有关节摩擦音。

1.2给药方法

口服酪酸梭菌活菌胶囊，每粒420mg(含酪酸梭菌活菌数不低于1.0×10⁷cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3粒/次，一天2～3次。

以上疗程均为12～24周。

1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后关节肿胀、疼痛、晨僵或关节摩擦音的改善情况。

1.4疗效评定标准(按国家中医药管理局1994年发布的《中医病证诊断标准》)。

痊愈：关节疼痛肿胀消失、晨僵消除；

好转：关节疼痛肿胀消失，偶有痛感，晨起稍有僵硬；

无效：关节疼痛肿胀、晨僵同治疗前。

2结果判定

用口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗8例中，痊愈5例，好转3例，无效0例，总有效率100％，且未见任何不良反应。

典型病例：刘××，女，55岁，类风湿性关节炎合并慢性腹泻10多年，慢性腹泻可能是类风湿性关节炎的诱因。应用非甾体类抗炎药物缓解症状、减缓病情进展，用药时症状减轻，停药就复发，并遭受抗炎药副作用的折磨。后口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗，3粒/次，3次/天，共服用24周，慢性腹泻治愈，关节疼痛肿胀消失、晨僵消除，且未发现任何不良反应，停药1个月后复查，无复发。

3讨论

目前治疗类风湿性关节炎的药物很多，但均存在各种副作用制约临床的应用，有的副作用甚至可以导致死亡，尤其类风湿性关节炎患者需要长时间服药，病人很难耐受副作用。酪酸梭菌通过调节免疫和炎症因子表达、预防感染等多个方面发挥作用，疗效显著，且没有任何毒副作用，病人可以长时间服用，并且酪酸梭菌除可以制成药品外，还可以制成保健品或饮品应用治疗类风湿性关节炎。

疗效观察试验例3、口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗强直性脊柱炎疗效观察

1对象与方法

1.1病例资料

经临床明确诊断为强直性脊柱炎的患者，共6例，平均年龄32岁，病史在1年～10年。临床症状为：腰脊疼痛，遇寒加重，脊柱僵硬，俯仰不利，或有双髋部痛，双腿活动受限，畏寒肢冷，乏力多汗。

1.2给药方法

口服酪酸梭菌活菌胶囊，每粒420mg(含酪酸梭菌活菌数不低于1.0×10⁷cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3粒/次，一天3～4次。

以上疗程均为12～24周。

1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后腰脊疼痛、双髋部痛等临床症状的改善情况。

1.4疗效评定标准根据全国中西医结合研究会风湿类疾病专业委员会1987年8月讨论修订的疗效标准制定。

显著好转：经治疗后受累部位疼痛消失，活动功能改善或恢复正常，血沉恢复正常，x线示骨质病变有改善或无发展，恢复日常劳动；

好转：受累部位疼痛减轻，活动范围增大，血沉降低；

无效：经治疗3个疗程(90天)以上，受累部位症状无改善。

2结果判定

用口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗6例中，显著好转4例，好转2例，无效0例，总有效率100％，且未见任何不良反应。

3讨论

强直性脊柱炎病程长病情重，需要长时间吃药，尚无根治的办法，目前治疗主要缓解症状，保持良好姿势和减缓病情进展。目前治疗药物虽很多，但均存在各种副作用制约临床的应用，有的副作用甚至可以导致死亡，因此目前疗效好和没有副作用的药物是临床最需要的。目前认为强直性脊柱炎是遗传因素和肠道因素相互作用所致，是肠道感染和肠粘膜通透性增加等因素在遗传因素的基础上引起免疫异常诱发强直性脊柱炎发病和使病情进展。酪酸梭菌一方面，调节免疫恢复正常和下调炎症因子表达，缓解症状；另一方面，抑制肠道有害菌，预防感染，分泌酪酸修复肠粘膜，改变肠粘膜通透性，恢复肠道健康，消除强直性脊柱炎发病和病情进展的诱发因素。疗效显著，且没有任何毒副作用，病人可以长时间服用，并且酪酸梭菌除可以制成药品外，还可以制成保健品或饮品应用治疗强直性脊柱炎。

本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年7月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所邮编100080)保藏，但本发明所述的酪酸梭菌并不局限于这种微生物菌株。

分类命名：酪酸梭菌Clostridium butyricum，保存编号0313.1。

上述微生物菌株经该微生物中心检测，检测结果均为存活。

Claims (5)

1、酪酸梭菌在制备预防或治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎微生物制剂中的应用。

2、按权利要求1所述应用，其特征在于酪酸梭菌包含但不限于酪酸梭菌CGMCC0313.1株。

3、按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的酪酸梭菌和药学上可接受的不同载体制成所需要剂型。

4、按权利要求1所述应用，其特征在于微生物制剂可以是酪酸梭菌单独作为活性成份制成活菌制剂，也可以是酪酸梭菌与其他活性成份组合制成活菌制剂。

5、按权利要求1所述应用，其特征在于微生物制剂包含但不限于药品、保健食品、饮品。