CN101309699A - 稳定化的病毒样颗粒和表位展示*** - Google Patents

稳定化的病毒样颗粒和表位展示*** Download PDF

Info

Publication number
CN101309699A
CN101309699A CNA2006800405270A CN200680040527A CN101309699A CN 101309699 A CN101309699 A CN 101309699A CN A2006800405270 A CNA2006800405270 A CN A2006800405270A CN 200680040527 A CN200680040527 A CN 200680040527A CN 101309699 A CN101309699 A CN 101309699A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xaa
exist
polypeptide
virus
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800405270A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101309699B (zh
Inventor
A·J·伯克特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celldex Therapeutics Ltd
Original Assignee
Celldex Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celldex Therapeutics Ltd filed Critical Celldex Therapeutics Ltd
Publication of CN101309699A publication Critical patent/CN101309699A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101309699B publication Critical patent/CN101309699B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

公开了一种嵌合多肽，该多肽包含：i)第一部分，自组装形成包含至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，其共价连接于ii)第二多肽部分，包含长度约15－约80个氨基酸残基的肽。第二部分肽自组装形成平行多聚体。本发明精心设计的嵌合多肽形成的颗粒比第一多肽形成的颗粒更稳定，该第一多肽除缺少第二多肽部分的共价连接的自结合肽序列外，在序列的其它方面相同。

Description

稳定化的病毒样颗粒和表位展示***
技术领域
本发明涉及免疫学和多肽工程学的交叉领域，具体涉及经基因工程改造的嵌合多肽和其超分子组装体，用来减少核酸结合、增强稳定性和展示免疫原性表位。
发明背景
尽管病毒颗粒通常由一个或多个不同的多肽组成，但它们能比其分离的成份触发更强的免疫反应。对B细胞反应，已知病毒颗粒免疫原性的一个重要因素可为表面表位的重复性和顺序。多数病毒颗粒表面包含以整齐的、对称准晶体方式的多肽，展示出规则排列的表位，从而使B细胞的表位-特异性免疫球蛋白充分地交联[Bachmann等，(1996)Immunol.Today 17：553-558]。这种B细胞免疫球蛋白的表面交联是强激活信号，直接诱导细胞循环进程和IgM抗体的产生。另外，这种激发的B细胞能激活T辅助细胞，该细胞进一步诱导B细胞中产生IgM至产生IgG抗体的转换，产生长寿B细胞记忆——任何接种的目标[Bachmann等，(1997)Ann.Rev.Immunol.15：235-270]。病毒结构甚至与自身免疫疾病中抗抗体的产生有相关性，并作为对病原体自然反应的一部分[见Fehr等，(1997)J.Exp.Med.185：1785-1792]。因此，病毒颗粒上有序和重复排列的抗原为高度免疫原性的，因为其可直接激活B细胞。
除强的B细胞反应之外，病毒颗粒也诱导细胞毒性T细胞反应(免疫***的另一个重要武器)。细胞毒性T细胞对清除非细胞病变病毒如HIV或乙肝病毒和消灭肿瘤是特别重要的。细胞毒性T细胞不识别天然抗原，但识别其与MHC类别I分子相关的降解产物[Townsend等，(1989)Ann.Rev.Immunol.7：601-624]。巨噬细胞和树突状细胞能吸收和处理外源性病毒颗粒(而不是其溶解的、分离的成份)，将产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞，使其活化和增殖[Kovacsovics-Bankowski等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：4942-4946；Bachmann等，(1996)Eur.J.Immunol.26：2595-2600]。
一些新疫苗策略利用病毒固有的免疫原性。这些方法中的一些集中于病毒颗粒的微粒特性；例如见Harding等，(1994)J.Immunol.153：4925-33，其中公开了包含抗原包衣乳胶珠的疫苗；Kovacsovics-Bankowski等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：4942-4946，其中公开了包含氧化铁珠和抗原的疫苗；美国专利第5,334,394号(Kossovsky等)，其中公开了以抗原包衣的颗粒；美国专利第5,871,747号(Gengoux-Sedlik)，其中公开了表面载有一个或多个以共价键结合于其上的多肽的合成多聚体颗粒；用非共价键包衣的颗粒，其中至少部分覆盖此颗粒表面，至少一种生物学活性成份与所述包衣的颗粒连接(见，例如，WO 94/15585)。
病毒样颗粒(VLP)为由一种或多种类型的多个多肽分子以有序的和几何规则方式构建的结构。由于包含不止一种分子，VLP可称为超分子。VLP无病毒基因组，因此无感染性。VLP可通过异源表达大量生产，并可容易地纯化。VLP的几何形状通常类似源(source)病毒颗粒的几何形状，因此对如下讨论的多数情况而言，几何形状有二十面体或伪二十面体对称。VLP因其结构特性、容易大规模制备和纯化，以及其无感染性特性，已在疫苗生产领域得以开发应用。
VLP的实例包含以下病毒的衣壳或核衣壳多肽的自组装：乙肝病毒[WO 92/11291，Ulrich，等，(1998)Virus Res.50：141-182]、风疹病毒[Warnes，等，(1995)Gene 160：173-178]、辛德毕斯病毒[Tellinghuisen等，(1999)J.Virol.73：5309-5319]、丙肝病毒[Baumbert(1998)J.Virol.72：3827-3836]、轮状病毒[美国专利第5,071,651号，Sahara，等和第5,374,426号，Sahara等]、***病毒[Twomey，等，(1995)疫苗13：1603-1610]、诺瓦克病毒[Jiang等，Science(1990)250：1580-1583；Matsui等，J.Clin.Invest.(1991)87：1456-1461]、逆转录病毒[WO96/30523；美国专利第6,602,705号，Barnett等]、反转录转座子(retrotransposons)[例如，Ty polypeptide pl，in Al-Khayat等，(1999)J.Mol.Biol.292：65-73和美国专利第6,060,064号，Adams等]和人类***状瘤病毒[WO 98/15631]。植物感染病毒衣壳多肽也在体外和体内自组装形成VLP[见，例如，马铃薯Y病毒，Jagadish等，(1991)J.Gen.Virol.72：1543-1550；紫花苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic)，Yusibov等，(1996)J.Gen.Virol.77：567-573]。病毒颗粒结构亚单位和其同源VLP下文称为“衣壳”多肽。
有许多衣壳多肽自组装形成非普通病毒粒子结构的结构的实例。例如，轮状病毒[Lepault等，(2001)EMBO J.20：1498-1507]、***瘤病毒属和多瘤病毒[Schwartz等，(2000)Virology.268：461-470]衣壳多肽各自形成各种颗粒和管形结构，一些衣壳多肽甚至组装成有序的二维阵列，依赖于组装条件[Lane(1981)Handbook of Plant virus Infectionsand Comparative Diagnosis，ed.Kurstak，E.(Elsevier/North-Holland，Amsterdam)pages 334-376]。然而，这些组装均显示了衣壳多肽的排列中的几何学规律，易于使用X射线衍射分析、电子显微镜和其它方法观察。尽管这些病毒衣壳多肽的组装体通常包含超过约30个亚单位，但也有得自负链RNA病毒的更小的VLP组装体。环形VLP已被描述为包含大约9拷贝的流感A病毒核衣壳蛋白[Portela(2002)J.Gen.Virol.83：723-734]，环形的VLP包含10±1个拷贝狂犬病毒(rabies)核蛋白已描述于Iseni(2002)J.Gen.Virol.19：2909-2919。有义RNA烟草花叶病毒衣壳多肽自组装形成VLP，该VLP为两层圆盘结构(disks)，包含34个拷贝的衣壳多肽(每层17个拷贝)。[Bhyravbhatla(1998)Biophys.J.74：604-615]。
异源表位与衣壳多肽融合使VLP带有那些如上描述和本领域已知的表位。展示表位的其它多聚超分子结构也被公开，其目的同样是用作疫苗。例如，WO 00/69907中Hill等公开了使用侣伴蛋白七聚体(chaperonin heptamers)和双七聚体(double heptamers)，例如大肠杆菌的GroES和GroEL和同源物作为蛋白骨架，其中可***异源多肽。该***提供了另一超分子结构以多价递呈(presentation)***的多肽，但未公开或提示除天然亚单位相互作用和排列外的高级结构和稳定化特征。
杆形(Rod-shaped)病毒(例如，烟草花叶病毒)、可弯曲的(flexuous)病毒(例如，马铃薯X和Y病毒；埃博拉病毒)和可弯曲的病毒亚结构(例如，HIV、流感A和狂犬病病毒核衣壳)为螺旋的；它们均为辐射对称。因此几何规则组装体和结构不论球形还是二十面体均涵盖于术语“病毒样颗粒”(VLP)中。实际上，管形结构，与二十面结构类似，已被Ghosh等证明在体内是有效的和保护性的免疫原，(2002)Virology 302：383-392。
全长病毒-衍生的衣壳多肽通常结合存在于表达衣壳多肽的细胞中的核酸。这反映衣壳多肽的自然生物学功能，即与病毒基因组相结合，包装并递送病毒基因组。自组装后，包含未改变的衣壳多肽的VLP，通常包含存在于表达衣壳多肽的细胞内的核酸，包括衣壳多肽信使RNA以及其它分子核酸[见例如，Iseni等，(1998)J.Gen.Virol.，79：2909-2919；Krol等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.96：13650-13655；和Yu等，(2001)J.Virol.75：2753-2764]。
当VLP用作疫苗时，核酸结合是不需要的(与用作基因传递***相反，如美国专利第5,869,287号，Price等)，因为不希望引入外来DNA或RNA至被免疫的动物或人。通常会携带这种外来核酸，并存在随之而来的异源表达。
核酸结合通常与衣壳多肽的不连续碎片相关，可除去不连续碎片得到减少的或基本无核酸结合的衣壳多肽，[例如，Choi等，(2000)Virology 270：377-385]。然而，在一些情况下，除去衣壳多肽的核酸结合域导致颗粒不稳定或妨碍颗粒组装，因为核心-核酸相互作用促进颗粒稳定性[Schmitz等，(1998)Virology 248：323-331；一般而言，见Harrison(2001)″Principles of Virus Structure(病毒结构的原理)″in Fields′Virology，第4版。Lippincot，[Philadelphia]第53-86页，和其参考文献]。实际上，核酸对病毒颗粒的结构上的贡献是规定性的而不是个别性的，因此在不存在核酸的情况下通常需要补偿性特征来稳定VLP。
为展示免疫原性表位而设计的VLP是本领域已知的，已从多种类型病毒的结构多肽设计出了多种VLP，包括感染细菌(噬菌体)、植物和动物的病毒，包括感染人类的病毒。Wolf等在WO 96/30523中描述了使用HIV-1的改变的pr55Gag作为非感染性反转录病毒样颗粒载体用于呈递(presentation)免疫学重要的表位。Nagesha等已开发了用作表位载体的嵌杯样病毒(1999)Arch.Virol.144：2429-2439。Porta等综述了得自植物感染病毒用作表位载体的用途，见(1998)Rev.Med.Virol.8：25-41。Brown等(2002)Intervirology 45：371-380描述了细菌感染病毒作为表位载体的用途。示例性肽表位的非封闭性列表提供于下文的表1。
然而，这种工程化的或改变的衣壳多肽自组装能力会有所降低[见例如，Schmitz等，Virology(1998)248：323-331]。当用电子显微镜分析时，由内部带有***(片段)的嵌合乙肝病毒(HB)衣壳多肽组成的VLP，其通常的结构有序性低于缺少***的异源表位的VLP[Schδdel等(1994)J.Exp.Med.，180：1037-1046]。在一些情况下，异源表位与C末端截短的HB衣壳多肽的连接有显著的去稳定化作用：杂合的VLP不能在衣壳多肽表达后回收[Schodel等(1994)Infect.Immunol.，62：1669-1676]。因此，许多工程化的HB VLP如此不稳定，以至不能形成，纯化时裂解甚至不可回收或显示非常差的稳定性特征，使其疫苗开发存在问题。这种不稳定性也被Fehr等用噬菌体Q-beta加以证明[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95：9477-9481]。因此，阻止颗粒组装的具体表位***也阻止***表位的免疫原性识别，增强疫苗设计中VLP的稳定性的重要性。
Ulrich等，Adv.Virus Res.，vol.50(1998)Academic Press，(纽约)第141-182页报导了C-末端截短和***外来序列的乙型肝炎衣壳多肽(HBc)的颗粒稳定性缺失。结果是，促进或重建VLP稳定性，而放弃全长衣壳多肽的核酸结合能力并允许结合异源表位，这种结构特征将在疫苗开发中大有益处。这通过示例性抗原传输***很好理解，该***使用乙型肝炎和其它肝炎病毒的衣壳多肽。同样在此论文中，Ulrich等提到3个使用这些嵌合体于人类疫苗中潜在的、待解决的问题。第一个潜在的问题是不慎将嵌合疫苗中核酸转移至接种宿主。第二潜在的问题是先前存在的免疫性对HB的干扰。第三个潜在的问题涉及也可经受长期储存的完整嵌合颗粒的重复制备要求。
Pumpens等，(1995)Intervirology，38：63-74报导了形成自C-末端截短的HB衣壳多肽的VLP比形成自全长蛋白的VLP不稳定。当用电子显微镜分析时，C-末端截短的HBc嵌合体(HBc序列包含***)的结构有序性通常比缺乏异源表位的颗粒的差[Schodel等，(1994)J.Exp.Med.，180：1037-1046]。在一些情况下，***异源表位至C-末端截短的HBc颗粒有显著的去稳定作用，使杂合颗粒不能在异源表达后回收[Schodel等(1994)Infect.Immunol.，62：1669-1676]。因此，许多嵌合HBc颗粒如此不稳定，以至于在纯化时分离成不可收回或显示非常差的稳定性特征，使其在疫苗开发中存在问题。
稳定性降低通常认为是工程VLP用作疫苗的主要障碍，解决方法也进行了探索。例如，Peabody(1997)Arch.Biochem.Biophys.347：85-92显示了带有***肽的噬菌体MS2衣壳多肽的自组装是有缺陷的。然而，在该具体情况下，随着两个修饰的衣壳多肽通过基因工程改造(并因此，共价地)连在一起而使自组装得以恢复，融合两个这样的修饰衣壳多肽稳定二聚体衣壳内相互作用。由于VLP结构和蛋白相互作用的多样性，这种方法未被推广；不是所有VLP具有二聚体结构，因此要求的衣壳多肽间相互作用会被这种蛋白-蛋白融合破坏。甚至当从二聚体构建VLP时，这种头至尾的共价结合造成的结构限制可妨碍正确的组装。
自结合肽序列存在于所谓的亮氨酸拉链蛋白。示例性的亮氨酸拉链序列存在于已知的GCN4、jun、fos、c-Myc、Max和C/EBP蛋白中。这些序列中，GCN4序列研究的较为深入，研究表明其形成平行二聚体，然而GCN4的突变体已显示形成平行二聚体、三聚体和四聚体[Harbury等，(1993)Science，262：1401-1407]。这些肽，通过其自组装，已被用于功能性替换天然的自身相互作用蛋白区域和/或蛋白间相互作用。
在一种情况下，鉴别了高度保守的细胞质区域在离子通道组装中的作用，因为其被亮氨酸拉链功能性置换[Zerangue等，(2000)Pro.Nat.Acad.Sci.97：3591-3595]。在另一种情况下，亮氨酸拉链肽在HIVp55(gag)结构多聚蛋白的缺失变体中，可取代与核衣壳及其与衣壳蛋白的相互作用相关的组装活性；也就是说，取代由内部核衣壳蛋白组织的使外部核衣壳蛋白有序的相互作用[见，例如，Accola等，(2002)J.Virol.74：5395-5402和Zhang等，(1998)J。Virol.72：1782-1789]。最近，辛德毕斯病毒核衣壳蛋白的N-末端螺旋区域被肝病毒中的二聚体-形成而不是三聚体-形成亮氨酸拉链功能性替换。[Perera等，(2003)J.Virol.77：8345-8353]。
所有上述报导使用亮氨酸拉链作为功能性定义所替换区域活性的工具。这些论文既未公开或表明使用自结合肽如上所述来稳定VLP，也未公开或表明经这种方法稳定的VLP可用于表位传输和/或免疫接种。
使用其它自结合肽来生成相对小的人工超分子结构也是本领域已知的。因此，
Figure A20068004052700131
等在WO 98/56906中公开了产生携带衍生自四粘联蛋白蛋白家族的结构元件的融合多肽的三聚体的***。此***产生稳定的同源-或异源-二聚体和三聚体，但不产生更高级的结构。另外，四粘联蛋白三聚化区域富含赖氨酸，可加强而不是减少核酸结合。
WO 96/37621中，Pack等公开了哺乳动物p53、血小板因子4、COMP或组蛋白衍生的多聚化区域产生新的具有通用结构(功能域1)-(多聚化域)-(功能域2)的融合多肽的同源-和异源-四聚体和五聚体的用途。然而，此出版物未说明用多聚化区域稳定高级结构或预先存在结构的用途。另外，这些结构(除COMP外)有抗-平行排列，即，多个多聚化域在多聚体中相互呈头-尾关系排列。
WO 02/74795中，De Filette等公开了包含与流感抗原多肽融合的亮氨酸拉链自组装域的重组、多价流感疫苗。其中，衍生自天然低聚蛋白复合物抗原与寡聚化域融合。未提示此寡聚化域有稳定源蛋白复合物或任何高级超分子结构(例如VLP)，或结构大于所讨论的四聚体的作用。相反地，寡聚化区域据称能够推动寡聚化并控制寡聚化程度。每个其它本文讨论的公开出版物的情况也是如此。
另一示例性自结合肽为流感A病毒M2蛋白。流感A病毒M2蛋白是小的离子通道蛋白，在膜表面自聚合成同源-四聚体。四聚体通过非必需的分子间二硫键而稳定，该键在位置17和19的半胱氨酸间形成[Holsinger等，(1991)Virology 183：32-43]。尽管发现当结合至VLP或自结合肽时，M2蛋白的此区域在各种重组流感疫苗中可用作抗原[见例如Neirynck等，(1999)Nat.Med.，5(10)：1157-1163和WO99/07839，和WO 02/74795，De Filette等和其引用]，但先前未见报导其有利于稳定VLP，并且相当出人意料的是，这种稳定化不需要相应于位置17和19之间的二硫键。
自结合肽不需从已知或天然蛋白衍生，相反可以是首次得到鉴别的(de novo)。[Zhang等，(1999)Curr.Biol.9：417-420]。当引入合适的金属离子时，自组装肽也可设计成能在溶液中组装。[Ghadiri等，(1992)J.Am.Chem.Soc.114：4000-4002]。例如，具使用单字母表示的序列的N-乙酰化的(在下列序列中标为“Ac-″)肽
Ac-G-L-A-Q-K-L-L-E-A-L-Q-K-A-L-A-CONH2
(SEQ ID No：1)
在合适的金属离子存在时，自组装形成平行的四-螺旋。N-乙酰化肽的序列为
Ac-G-E-L-A-E-Q-K-L-E-Q-A-L-Q-K-L-A-CONH2
(SEQ ID No：2)
自组装形成平行的三-螺旋[美国专利第5,408,036号(Ghadiri)]。
其它本领域已知的自结合肽可依据其具体特性选择，包括期望的免疫原性、源微生物、优选多聚体状态和结合强度。例如，当将疫苗(或存在其它连接的表位)给予人类时，人类蛋白的自结合肽能使对自结合肽的免疫反应最小化。
如下文所公开的，本发明提供一种解决VLP衍生疫苗相关问题的方法，并提供的这种疫苗基本不含偶然发生的核酸结合和不稳定性，同时保留VLP使用上的优点，例如生产的简便和灵活性、佐剂-样免疫原性增强作用。
发明简述
超分子组装体例如病毒样颗粒(VLP)的稳定性，和由此而来的材料的用途，例如作为疫苗，可通过将自结合肽加入到病毒蛋白(多肽)链亚单位中而得到很大程度的改善。这种解决VLP不稳定性的方法是通用的，可用于稳定各种衍生自感染动物、植物、真菌和细菌的病毒的VLP。
精心设计的稳定化方法也对稳定其它大的、重复的和对称的超分子组装体有用。可稳定化的非病毒VLP(超分子组装体)的实例包括真核生物和原核生物的已知的丙酮酸脱氢酶的60亚单位二十面酶复合体[Lessard等(1998)EMBO J.258：491-501；Stoops等(1997)J.Biol.Chem.272：5757-5764；Wagenknecht等(1991)J.Biol.Chem.266：24650-24656]和原核生物的2，4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶。[Fischer等(2003)Eur.J.Biochem.270：1025-1032；Mortl等(1996)J.Biol Chem.271：33201-33207]。与病毒衍生的VLP一样，这些二十面颗粒对疫苗或其它免疫原中表位呈递和传输有用。
本文中各种语法形式的短语“超分子组装体″用来涵盖所有病毒相关(或衍生的)VLP；即，由病毒基因组或人工改变的病毒基因组编码的VLP，和相似的非病毒来源的颗粒。术语“VLP”通常用于形成自病毒基因或人工改变的病毒基因的颗粒，但也交互用于超分子组装体，因为其较为常见并易于使用。
本发明精心设计的嵌合超分子组装体(或VLP)包含多个多肽亚单位，该亚单位包含连接的自组装肽序列。因此，精心设计的嵌合体包含(i)第一多肽部分，自组装形成包含至少约9亚单位的有序、重复、超分子结构，共价连接于(ii)第二肽部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的异源肽。第二部分肽，当未如此共价连接于第一部分，自组装形成平行多聚体，如下文所讨论。精心设计的嵌合多肽形成的颗粒比形成自第一多肽的颗粒更稳定，该第一多肽除缺少共价连接的第二多肽部分自结合肽序列外，序列的其他部分相同。其稳定性可使用分析型分子排阻色谱法洗脱测定。精心设计的嵌合超分子组装体(VLP)通过免疫接种哺乳动物宿主优选地诱导对一种或多种超分子组装体多肽序列(融合于异源多肽超分子组装体的多肽序列或连接的半抗原)的免疫原性。
更准确地说，本发明精心设计的超分子组装体包含嵌合多肽，其本身包含：(i)第一多肽部分，自组装形成包含至少约9多肽亚单位的有序、重复、超分子结构，和(ii)共价连接的第二肽部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的多肽(即优选对第一部分多肽异源的)。第二部分肽，(a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，(b)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或(c)为自组装的流感A M2多肽的细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域。因此，在优选的实施方案中，第二部分肽定义为(a)或(b)或(c)之一。第二部分肽特别优选如(a)和(c)中所定义。当以有效量给予哺乳动物时，嵌合多肽优选引发对一种或多种VLP多肽序列(对VLP多肽序列或连接的半抗原异源的多肽)的免疫反应。
在一个优选的实施方案中，本发明精心设计的嵌合多肽包含：(i)第一部分，具有全部或部分病毒衣壳蛋白的序列，或为病毒衣壳蛋白(如下文所定义)的衍生物，共价连接于(ii)第二部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽。第二部分的肽，(a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，(b)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或(c)为自组装的流感A M2多肽的细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域。当以有效量给予宿主动物时，嵌合多肽优选引发免疫反应。在一些实施方案中，第一部分衍生自或相似于病毒的衣壳多肽，病毒选自感染动物病毒、感染植物病毒、感染真菌病毒和感染细菌病毒。
在一些实施方案中，发明包含接头残基、异源表位或两者都包含于第一多肽部分的嵌合多肽。在另一实施方案中，发明涉及自嵌合多肽形成的有序的、自组装超分子颗粒。
附图简述
在构成本公开一部分的图形中，
图1，显示在图1A和图1B两个组图中提供了6个已公开序列(来自6个病毒的哺乳动物HBc蛋白)的序列比对。第一人类病毒序列(SEQID NO：3)为ayw亚型，由Galibert等公开于(1983)Nature，281：646-650；第二人类病毒序列(SEQ ID NO：4)，为adw亚型，由Ono等公开于(1983)Nucleic Acids Res.，11(6)：1747-1757；第三个人类病毒序列(SEQ IDNO：5)，为adw2亚型，由Valenzuela等公开于Animal Virus Genetics，Field等，eds.，Academic Press，New York(1980)第57-70页；第四个人类病毒序列(SEQ ID NO：6)，为adyw亚型，公开于Pasek等(1979)Nature，282：575-579；第五个序列(SEQ ID NO：7)，为woodchuck病毒，公开于Galibert等(1982)J.Virol.，41：51-65；第六个哺乳动物序列(SEQ ID NO：8)，为ground squirrel，公开于Seeger等(1984)J.Virol.，51：367-375。
图2图示使用了编码一种流感A M2外部区域(位置2-24)版本的DNA，在该外部区域中半胱氨酸突变为丝氨酸(CV-1895，V7.M2e(2C＞2S)(SEQ ID NO：9)，该DNA克隆入位于工程的、截短的包含前149HBc残基的HBc基因(HBc149)的C-末端的EcoRI和HindIII位点。
图3显示命名为CV-1048的颗粒的分析型分子排阻色谱法洗脱特征图。组装的颗粒的洗脱体积为约8mL，其中低级结构洗脱于后续峰。样品于20mM磷酸钠、pH 6.8和0.02％叠氮化纳中在Superose6 HR(Pharmacia)上运行。在280nm的吸光度见纵坐标，体积(mL)见横坐标。
图4显示了CV-1895颗粒如图3显示的分析型分子排阻色谱法洗脱特征图。此处，稳定化的颗粒洗脱时间为约7分钟，基本未观察到低级结构。
图5，根据美国专利第6,231,864号，示例说明了反应方案(方案1)，该方案显示两个反应序列：(I)使用磺基-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷1-甲酸酯(磺基-SMCC)形成活化的载体来将半抗原悬挂(pendent)连接于病毒样颗粒(VLP)，然后(II)将巯基-结尾的(半胱氨酸-结尾的)半抗原连接于活化的载体而形成缀合颗粒。VLP被描述为有单个悬挂氨基的盒子(为了清楚地说明该图)，而巯基-结尾的半抗原则被描述为末端为SH基团的链。
本发明具有一些好处和优点。
本发明的一个好处是自嵌合衣壳多肽(包含自结合肽部分)形成的病毒样颗粒比缺少自结合肽部分的相似序列的颗粒在含水组合物中的储存稳定性更高。
本发明的某些实施方案的优点是，一些嵌合衣壳多肽表现出天然病毒样颗粒的自组装特征，并且表现出非常强烈的的倾向，即基本不出现核酸与那些天然病毒样颗粒间的结合。因为二十面体酶复合体不适于包被病毒基因组，所以衍生自二十面酶复合体亚单位的VLP不需要特别修饰就缺少与核酸的结合力。
本发明的用途通过能够形成至少二聚体-、三聚体-和五聚体-自结合肽而增强。二十面病毒和VLP有2-、3-和5-倍(fold)对称性，因此VLP稳定化可通过增强2-倍(二聚体)、3-倍(三聚体)和/或5-倍(五聚体)衣壳多肽相互作用而优化。四聚体有2-倍对称性，六聚体有2-和3-倍对称性。然而，不希望被理论束缚，2-、3-和5-倍对称性的二十面体提供给本领域技术人员稳定2-、3-或5-倍衣壳多肽内相互作用的选择，反之亦然。非限制性的自结合肽示例列表提供于下文表2中。
本发明的另一个好处是形成自嵌合衣壳多肽的病毒样颗粒可显示出极好的B细胞和T细胞免疫原性。
本发明VLP的另一个优点是制备收率高于缺少自结合肽部分的相似颗粒。
发明的另一个好处是带有连接的表位的精心设计VLP比缺少自结合肽部分的相似缀合物通常更有免疫原性。这种增强的免疫原性归因于稳定化的颗粒在作为免疫原导入动物后长时间内保持其微粒特性。
发明的另一个优点是可使用衍生自大范围病毒的衣壳多肽。发明的另一个优点为自结合肽部分与VLP序列的连接提供了解决VLP稳定性问题的通用方法。
本发明的另外的好处和优点在如下公开中对本领域技术人员是显而易见的。
定义
表位 表位定义为通常通过结合于抗体的互补位或结合于T细胞受体从而可以被免疫识别的物质，包括小分子例如在免疫学领域一般称为半抗原(例如，二硝基苯酚，药物例如烟碱或***)的小分子，以及B-细胞表位、T-细胞表位、抗原、抗原决定簇、单克隆抗体结合位点、肽、低聚糖、核酸和其它本领域已知的化学和生物学实体。表位不同于衣壳多肽和自结合肽。
嵌合多肽 嵌合多肽为不会自然发生的多肽，通常包括一个或多个连接部分例如其它多肽、肽、接头残基或部分，和/或其它分子。本文中多数情况下该术语指多肽，所述多肽包含通过共价键连接的第一和第二多肽部分。本文中多数情况下该术语进一步指一种来源(source)或遗传背景(genetic heritage)的多肽通过肽键连接至另一个来源或遗传背景的多肽，该肽键通过基因工程蛋白编码序列表达。然而如其它地方提及的，本领域技术人员可以利用现有技术在体外完全通过非生物化学全合成或部分合成来合成嵌合多肽。
VLP VLP为病毒样颗粒的缩写，指有序的、重复的通过自组装形成的超分子结构和复合物，通常为病毒衣壳多肽。在一些情况下，VLP不是得自病毒衣壳多肽；即，无病毒衣壳蛋白氨基酸序列，但是得自(有其序列)另一自组装多肽例如丙酮酸脱氢酶E2多肽和2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽。VLP可以包含也可以不包含任何核酸成份。得自病毒衣壳多肽的VLP包含至少9个衣壳多肽。得自其它自组装多肽的VLP包含至少约30个亚单位。VLP形态包括二十面体、二十面或类似-二十面对称的颗粒、球形的、管形的和丝状的结构，和平面排列。与天然病毒一样，VLP显示至少一些区域带有2-倍、3-倍、5-倍或放射对称。可通过多种技术容易地观察这种局部或整体对称，包括X射线衍射和电子显微镜(无论是否有另外的影像分析)。VLP，如此处所定义，明确包括不类似于最终衍生衣壳多肽的病毒或颗粒的形态学和组装体。
衣壳多肽 衣壳多肽为多肽，显示出能够自组装形成VLP。本文精心设计的衣壳多肽可为病毒颗粒的天然多肽亚单位、非病毒颗粒多肽亚单位(如下讨论的)，或非天然衍生物。病毒颗粒的结构性蛋白亚单位和其同源VLP包含衣壳多肽。衣壳多肽可包括另外的部分例如自结合肽、接头序列或表位，因此也为嵌合多肽。衣壳多肽不同于和相对异源于表位和自结合肽。当连接至异源表位时，衣壳多肽自身优选不引发免疫反应，但是也可以引发(but may nevertheless do so)。术语”衣壳多肽″的含义中明确包括天然和人工的病毒颗粒结构蛋白类似物和衍生物。衣壳多肽包括本领域已知的肽如核壳体蛋白和核心蛋白。衣壳多肽不仅指存在于源病毒或VLP的多肽。衣壳多肽明确包括其它不是病毒来源的自组装多肽，例如丙酮酸脱氢酶酶复合体的E2亚单位，和2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽，每种均形成包含60个亚单位的二十面对称颗粒。
衍生的衣壳多肽有至少约80％氨基酸序列相同于病毒衣壳多肽序列。不同的是，当与一种或多种天然衣壳多肽同源区域(从其衍生出衍生物)比较时，精心设计的衣壳多肽可至多有约20％氨基酸残基发生取代。当序列在N-或C-末端为截短的，或包含一个或多个另外的残基或序列中的存在缺失，这些区域不计入取代百分比中，因为序列改变与天然衣壳多肽无同源序列。
自组装 在衣壳多肽和VLP中，自组装指在体内或体外，有或无人工干扰时，从衣壳多肽(或类似物)开始的病毒粒子或VLP组装。自组装也指从其它不是病毒来源(例如2，4-二氧四氢蝶啶合酶和丙酮酸脱氢酶酶复合体的E2亚单位)的形成颗粒的嵌合多肽形成有序、重复、超分子结构的组装。在自结合肽(下文讨论的)中，自组装指单个嵌合多肽在溶液中结合成多聚体，或当存在于溶液中时，形成至少约9个多肽亚单位的聚合体。嵌合多肽一般自组装为球状亚单位实体，拥有单个二级和三级蛋白结构并一起形成包含至少9个亚单位的微粒实体。
自结合肽 自结合肽连接于衣壳多肽，通过肽间相互作用来稳定颗粒内多肽相互作用。自结合肽包括这样的肽：当以N-乙酰化肽形式存在，在pH 7.0，浓度约10mmol/L的PBS水溶液中自发地聚在一起形成平行多聚体的肽；当存在于浓度至少10μmol/L溶液中，存在5-倍摩尔过量的可接受多价金属离子时，自组装形成平行多聚体的肽，和本公开中确定的能稳定VLP的约16至约24个氨基酸残基的流感M2蛋白细胞外域。自结合肽不同于并且相对异源于嵌合多肽和表位，尽管肽可包含一个或多个表位且被包含于嵌合多肽序列中。自结合肽优选不引发免疫反应，但是也可以引发。本文精心设计的自结合肽形成包含少于9个单元的平行多聚体，通常含有其作为多聚体会具有的结构，无论是二级和/或三级结构。另外，自结合肽相互结合而不形成肽间共价键。
病毒 术语“病毒”和病毒的分类学的使用依据第七次国际病毒 分类学委员会报告，van Regenmortel，M.H.V.ed.(San Diego)学术会议2000。这样一来，不存在细胞外相对部分或水平转移性的物质就明确包括于其中，同理，噬菌体也包括于其中(例如，酿酒酵母的Ty 1反转录转座子和L-A病毒，各自在体内形成颗粒，颗粒从不离开细胞感染其它个体细胞，但从母体转移至子代)。
残基和氨基酸残基 术语“残基”与短语氨基酸残基交换使用。所有本文确定的氨基酸残基为天然的或L-构型，除非特别指明为D-型。与标准多肽命名法一致，[J.Biol.Chem.，243：3557-59(1969)]，氨基酸残基的简写见下列对照表。
Figure A20068004052700221
稳定性 当用于指超分子组装体(包括VLP)，稳定性指颗粒的结构和生物化学完整性。稳定性可直接测量，例如，通过分析型分子排阻色谱然后分析所得洗脱曲线特征、电子显微镜、天然和非天然凝胶电泳技术加各种检测方法学(包括染色和免疫检测、速率区带离心、核酸酶保护测定法(测定壳体化核酸超分子组装体(VLP))、光散射，或其它本领域已知的生物物理和生物化学技术。
本发明的超分子组装体(VLP)是稳定化的，当超分子组装体(VLP)制剂中未组装的嵌合衣壳多肽的量减少至少约25％时(相对于其它部分相同的超分子组装体(VLP)制剂(作为整个嵌合多肽的分数)中的缺少连接的自结合肽的未组装衣壳多肽的量)。使用分析型分子排阻色谱，例如，未装配的衣壳多肽以慢速洗脱多肽的曲线下面积除以快速和慢速洗脱多肽两者的曲线下面积之和来测量。出现以下情况的时候，则认为该制剂是稳定化的超分子组装体：未组装嵌合衣壳多肽(带有连接的自结合肽)占第一超分子组装体(VLP)制剂总体的比例比第二超分子组装体(VLP)制剂(除衣壳多肽缺少连接的自结合肽外，其它与第一相同)小至少约25％。大多数分析技术可对未组装衣壳多肽占超分子组装体(VLP)制剂总体的比例得出相同的定量结果。
类似物 如本文所用，肽或多肽类似物指与对照肽或多肽至少约50％相同的肽或多肽。类似物也指与对照肽或多肽类似的物质。核酸序列类似物编码肽或多肽，该肽或多肽至少约50％相同于对照核酸序列编码的肽或多肽。照这样，考虑到已知的基因编码冗余，类似物核酸不需有50％或更多序列相同于对照核酸，也不需除编码区域外有任何相似性。
发明详述
本发明提供由嵌合多肽组成的超分子组装体，所述嵌合多肽具有两个部分：第一部分和共价连接的第二部分。不管第二部分是否存在，第一部分都会自组装成颗粒。第二部分包含长度约15至约80个氨基酸残基，优选约15至约35个残基的自结合肽序列。该肽a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，b)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或c)是流感A M2多肽的自组装胞外域，条件是M2肽第二部分不存在于作为第一多肽部分的HBc的N末端。嵌合多肽形成的有组织重复超分子结构比只从所述第一部分形成的结构更加稳定。
也就是说，所精心设计的嵌合多肽所形成的颗粒，比在序列上其它方面相同但缺乏共价连接的自结合第二肽序列的多肽(即只有第一部分的序列的多肽)所形成的颗粒更加稳定(在本文别处定义)。在一些实施方案中，嵌合多肽基本上没有核酸结合特性，而在其它实施方案中，嵌合多肽能结合核酸。嵌合多肽或超分子组装体(VLP)可包括一个或多个连接的异源表位(半抗原或融合多肽序列)。
为撰写方便起见，下文使用首字母缩略词VLP代表超分子组装体，除非用词上下文表明指的是一种或多种具体的病毒相关VLP。
所公开的稳定化VLP和带有连接的异源表位的稳定化VLP，可作为疫苗或免疫原用于抗体生产或用于T细胞激活或同时用于这两方面。本发明还通过将异源表位连接到具有自结合肽成分的衣壳多肽，来提供稳定化、有序、重复表位排列。
在一个优选的实施方案中，本发明提供包含第一部分和第二自结合肽部分这两个部分的嵌合多肽组合物，所述第一部分能自组装成具有至少约9个多肽亚单位的有组织重复多肽超分子结构，其中这些部分通过至少一个共价键连接。在本发明的一些优选实施方案中，所述两个部分通过肽键连接。在这些实施方案中的一些中，嵌合多聚蛋白的第一部分与第二部分的肽键连接是这样发生的：将编码第一部分的核苷酸框内融合到编码第二部分的核苷酸，然后将所得的多核苷酸在宿主细胞中表达，从而在宿主细胞中表达时形成融合多肽。
在其它实施方案中，所述两个部分通过双功能连接剂作用于接头残基如赖氨酸和半胱氨酸而连接。合适的双功能试剂包括SMCC、MBS和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)等，它们在Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL的2001-2002商品目录中提到。双功能试剂通常包含能通过胺基团形成键的基团和能形成二硫键或硫醚键的基团。
巯基可以以N末端和/或C末端Cys残基形式来提供，或者通过使氨基官能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或者3-(3-二硫吡啶基)丙酸或S-乙酰硫代乙醇酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来提供。在与S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)反应后，用例如羟胺使SATA脱乙酰化产生游离-SH基团。在需要游离氨基的情况下，可通过遗传工程、蛋白质连接或其它方法来提供赖氨酸。α-氨基酸之外的氨基酸如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和ε-己酸也可用作接头。
在一个优选的实施方案中，嵌合多肽的第二自结合肽部分连接到第一部分的N末端或C末端。在又一个优选的实施方案中，这样使自结合肽连接到第一部分的N末端或C末端：将适当的核酸序列进行遗传融合并共表达，使得嵌合多肽作为第一部分和第二部分的融合体表达，第一部分和第二部分通过肽键共价连接。在另一个优选的实施方案中，第一部分在其N末端或C末端处或附近提供有适于连接自结合肽的接头残基。
应指出的是，“第一部分”和“第二部分”的说法只是出于方便起见。因此，在精心设计的嵌合多肽中，“第二部分”自结合肽可位于“第一部分”多肽前面，即在“第一部分”的N末端。
在另一个实施方案中，嵌合多肽第一部分包含完整或截短形式的病毒衣壳多肽。在一些实施方案中，不计异源表位或异源表位的接头，所存在的第一部分的氨基酸残基序列与病毒衣壳多肽有大于约50％、优选大于约75％、更优选大于约90％、最优选大于约95％的同一性。因此，在第一部分包含病毒蛋白序列如乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白的残基1-149的情况下，第一部分中存在的序列与病毒序列有100％同一性。但是，残基1-149代表HBc的截短版本，因为缺少了残基150-183。能自组装成含有至少约9个多肽亚单位和显示上述与病毒衣壳多肽序列等位基因的同一性百分数的有组织重复超分子结构的第一部分，在本文中定义为病毒衣壳类似多肽序列。
在本发明的更多优选实施方案中，嵌合多肽的第一部分是病毒衣壳多肽或病毒衣壳多肽的类似物，所述病毒可以是感染动物的病毒、感染植物的病毒、感染真菌的病毒或感染细菌的病毒。在优选的实施方案中，能形成VLP的病毒衣壳多肽是以下病毒科的成员的衣壳多肽或其类似物：小RNA病毒科(Picornaviridae)、嵌杯样病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、***瘤病毒科(Papillomaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、***多空病毒科(Parpovaviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、罗达病毒科(Nodaviridae)、四病毒科(Tetraviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、丝形病毒科(Inoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、微病毒科(Microviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)和球状真菌病毒科(Totiviridae)。在其它优选的实施方案中，能形成VLP的病毒衣壳多肽是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯x病毒属(Potexvirus)或芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)病毒的成员的衣壳多肽或者这种病毒的衣壳的类似物。
在其它优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分包含二十面酶复合物的能自组装、能形成二十面体的多肽。在一些优选的方面，第一部分包含丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚单位。在其它优选的方面，第一部分包含2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽。就上述病毒衣壳氨基酸残基序列而言，在一些方面，第一部分包含二十面酶复合物多肽的类似物，且不计异源表位或异源表位的接头，第一部分的氨基酸序列与二十面酶复合物亚单位多肽有大于约50％、优选大于约75％、更优选大于约90％、最优选大于约95％的同一性。
在一些优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分基本上没有核酸结合特性。这里，在一些实施方案中，嵌合多肽的第一部分基本上没有核酸结合特性且包含第一连接位点，带有第二连接位点的表位可通过一个或多个共价或非共价键连接到该第一连接位点。其它实施方案可包括能结合核酸且还包含供表位连接的第一连接位点的嵌合多肽。被结合的核酸通常是在用以表达该蛋白质的生物体的细胞中原始存在的寡聚和/或多聚DNA和RNA物质。
是存在核酸结合还是基本上没有核酸结合，可容易地通过比较嵌合颗粒在水溶液中于280和260nm处测量时的吸光度(即280/260吸光度比)进行确定。被结合核酸在260nm处显示某个吸光度，在280nm处显示校对较低的吸光度，而没有结合核酸的蛋白质在260nm处吸光度相对较低，在280nm吸光度相对较高。
因此，在残基位置150-183(或150-185)含有一些或所有富精氨酸序列的、能结合核酸的示例性重组表达嵌合乙型肝炎核心或衣壳(HBc)颗粒，显示出约0.8的280nm处吸光度与260nm处吸光度之比(280∶260吸光度比)，而没有天然HBc的富精氨酸核酸结合区域的类似颗粒，如所含精氨酸残基或所含赖氨酸残基或所含相互靠近的精氨酸和赖氨酸残基少于四个的颗粒，或者从其天然或嵌合序列在大约HBc残基位置140至位置149终止的单体多肽嵌合分子组装而成的HBc颗粒，显示出约1.2至约1.6的280∶260吸光度比。HBc多肽和从HBc自组装的颗粒在本文中常常作示例性使用。
本发明的基本上没有核酸结合特性的嵌合颗粒，显示出约1.2至约1.7、更通常约1.4至约1.6的280∶260吸光度比。
一个优选的实施方案精心设计了包含这样的多肽的稳定化VLP，该多肽的第一部分是如上所述的病毒衣壳多肽或其类似物，这个第一部分连接到包含异源自结合肽的第二部分。在另一个优选的实施方案中，本发明精心设计了这样的嵌合多肽的稳定化VLP，该多肽包含的第一部分是包含可连接上表位的接头残基的病毒衣壳多肽或其类似物，第二部分包含异源自结合肽。在又一个优选的实施方案中，本发明是包含这样的嵌合多肽的稳定化VLP，该多肽的第一部分是连接有异源表位的病毒衣壳多肽或其类似物，第二部分包含异源自结合肽。
再一个优选的实施方案精心设计了这样的稳定化VLP，其第一部分包含在约氨基酸139至约位置165、优选至约156、更优选至约149(从N末端算起)发生截短的HBc多肽，第二部分包含上文所述的和下文作更详细描述的自结合肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，VLP第一部分包含或就是以下病毒的衣壳多肽的类似物：MS2噬菌体、JC病毒、Ty1反转录转座子、HIV、禽兽棚病毒(flock house virus)、松皇蛾Ω病毒、雀麦花叶病毒、番茄丛矮病毒、芜菁皱病毒、HPV 16、诺瓦克病毒、B19病毒、马铃薯X病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、Physalis mottle病毒、fd噬菌体、phiX174噬菌体、轮状病毒、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒、呼肠孤病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、流感A病毒、腺病毒、L-A病毒和脊髓灰质炎病毒。
示例性和优选的能形成VLP的重组嵌合体包含长度最长为约570个氨基酸残基的乙型肝炎核酸(HBc)蛋白分子，该蛋白分子(a)含有HBc分子的N末端150个氨基酸残基中的至少约135个残基组成的序列，所述残基包括肽键结合的异源表位或供连接HBc免疫显性环中存在的缀合表位的异源接头残基，或者N末端150个HBc氨基酸残基中的至少约135个残基组成的序列，(b)含有长度为约15个至约35个氨基酸残基的C末端自结合序列，和(c)含有从HBc位置135至HBc C末端的至少5个氨基酸残基的序列。该自结合序列a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，b)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或c)是流感AM2多肽的自组装胞外域。该嵌合分子含有不超过10％的HBc序列中的保守置换氨基酸残基。所述颗粒比从缺乏C末端自结合序列的但其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更加稳定。所述颗粒优选自组装成基本上不会结合核酸的颗粒。
本发明特别排除其中含0、1或2个半胱氨酸残基的M2多肽第二部分存在于HBc第一部分多肽的N末端的嵌合体。另一方面，特别优选所含HBc第一部分的C末端连接有含0、1或2个半胱氨酸的M2第二部分的嵌合体。
在其它实施方案中，嵌合多肽的第一部分是丙酮酸脱氢酶复合体的能自组装的E1多肽或其类似物，或者是能自组装的2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽或其类似物。
自结合肽
所精心设计的嵌合多肽的第二自结合肽部分是长度约15至约80个氨基酸、更优选约15至约35个氨基酸的序列。嵌合多肽的第二自结合肽部分当以N-乙酰化肽形式存在，在pH 7.0、浓度约10毫摩尔/升的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体。在另一个优选的实施方案中，自结合肽当以N-乙酰化肽形式存在且提供有适当的金属离子时，会形成平行多聚体。在又一个优选的实施方案中，自结合肽是流感AM2蛋白的N末端约24个氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，嵌合多肽的第二自结合肽部分包含GCN4-p1[O′Shea等，(1989)Science 243：538-542]亮氨酸拉链肽。在另一个实施方案中，自结合肽部分包含工程改造的(engineered)亮氨酸拉链肽GCN4-II、GCN4-IL、GCN4-LI、GCN4-LV、GCM4-VL或GCN4-LL。[Harbury等，(1993)Science 262：1401-1407]。在另一个优选的实施方案中，自结合肽是软骨寡聚基质蛋白质(COMP)的五聚化肽。[Ozbek.(2002)EMBO J.21(22)，5960-5968]。在另一个优选的实施方案中，自结合肽是四臂粘联蛋白的右手螺旋四聚自结合序列。[Stetefeld(2000)Nat.Struc.Biol.7：772-776]。
在另一个方面，自结合肽衍自人蛋白质序列。因此，例证性地说，自结合肽是选自Mad、Max、c-Myc、N-Myc、Li-Myc、AF4和USF的人蛋白质序列的亮氨酸拉链。[Canne等，(1995)J.Am.Chem.Soc.117：2998和Blackwood等，(1991)Science 251：1211-1217]。
例证性的第二部分自结合肽的示例性氨基酸残基序列在下表I中列出，同时列出的还有它们各自的肽名称、序列编号和引文。
表I
自结合肽
Figure A20068004052700311
Figure A20068004052700321
1.O′Shea et al.(1989)Science 243：538-542.
2.Canne et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.117：2998.
3.Blackwood et al.(1991)Science 251：1211-1217.
4.Harbury et al.(1993)Science 262：1401-1407.
5.Ghadiri et al.，(1992)J.Am.Chem.Soc.114：4000-4002.
6)Stetcfeld(2000)Nat.Struc.Biol.7：772-776.
7)Ozbek.(2002)EMBO J.21(22)，5960-5968.
8)Newton(1994)Genomics 24：435-439.
9)本公开说明书
在本发明的一些实施方案中，第一部分包含有第一连接位点，该第一连接位点供连接具有至少一个第二连接位点的异源表位。第一和第二连接位点通过至少一个共价或非共价键结合在一起。因此，表位和嵌合多肽通过第一和第二连接位点的结合而连接在一起。例如，可使生物素结合序列(下文提到)与第一部分共表达成融合多肽。可将连接到生物素的异源表位与从融合多肽形成的稳定化VLP混合在一起，使得生物素连接的表位结合到VLP的生物素结合序列。
第一连接位点可以是适于与上述双功能连接剂反应的接头残基，第二连接位点也可以适于与相同的双功能连接剂反应。第二连接位点可包含相同或不同的接头残基，如赖氨酸或半胱氨酸残基、半抗原或其它免疫原的游离氨基或游离巯基。作为第一部分的一部分存在的第一连接位点在图5的方案1中显示，同时显示的还有存在于异源表位上的第二连接位点。另参见美国专利6,231,864。
在本发明的另一个实施方案中，第一部分包括供异源表位连接的第一连接位点，该表位适于通过非共价相互作用连接到某表位上的第二连接位点。实例包括这样的嵌合多肽，其包含工程改造的位点如赖氨酸或半胱氨酸残基作为第一连接位点，该第一连接位点能与生物素或诸如3-(马来酰亚胺丙酰)生物素的化合物反应形成生物素化第一多肽部分，该嵌合多肽还包含具有连接的亲和素、链霉亲和素或中性低分子量亲和素类似物(如在Marttila等，(2000年2月)FEBS Lett.467(1)：31-36中所公开并被称为NeutraLiteTM亲和素)作为第二连接位点的表位。在其它实施方案中，连接是通过本领域公知的配体/受体相互作用进行的。
在本发明的一些优选实施方案中，表位是异源于VLP的氨基酸残基序列。通常存在于人或动物病原体或癌蛋白的例证性序列，在所精心设计的稳定化VLP的嵌合多肽中，在长度短于表位所在的天然蛋白质的序列中存在。这种本身没有免疫原性、但一旦连接到载体蛋白如所精心设计的稳定化VLP时变成具有免疫原性的缩短肽序列和其它小分子，被称为半抗原。示例性的异源序列可含有最多约245个异源于(外来于)VLP的氨基酸残基。
在某些实施方案中，表位包含存在于选自以下的病原体的氨基酸残基序列：依波拉(Ebola)病毒、HIV-1、HIV-2、***病毒(FMDV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感A病毒、人***瘤病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)。在一些其它实施方案中，表位是衍自癌抗原的肽。
在其它实施方案中，表位是寡糖、脂多糖、脂蛋白、糖蛋白或蛋白聚糖半抗原。例证性的B细胞和T细胞肽表位在以下表A和B中列出，同时列出的是从中获得该序列的基因的普通名称，所公布的表位的文献或专利引文以及SEQ ID NO。这些肽表位可融合到第一部分多肽的序列中，或者如上所述可作为单独键接的半抗原表位存在。糖半抗原在下文论述。
表A
B细胞表位
Figure A20068004052700351
Figure A20068004052700361
Figure A20068004052700371
Figure A20068004052700381
Figure A20068004052700391
Figure A20068004052700421
Figure A20068004052700431
所公开的表位的引文在以下表B中提供。
对于SEQ ID NO：72的流感A M2多肽序列X1X2X3X4X5X6X7X8TX10X11RX13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24：
残基X1至X8不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数大于它直至为8的带下标X残基也存在，
X10存在，为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸，
X11存在，为异亮氨酸或苏氨酸，
X13存在，为天冬酰胺或丝氨酸，
X14存在，为谷氨酸或甘氨酸，
残基X15和X16存在或不存在，当存在时分别为色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，
残基X17和X19存在或不存在，当存在时独立为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
残基X18存在或不存在，当存在时为精氨酸或赖氨酸，
残基X20至X24不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为天冬酰胺或丝氨酸、天冬氨酸或甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数小于它直至为15的带下标X残基也存在。
类似地，在优选的上述SEQ ID NO：70流感A M2序列中：
残基X1至X8不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数大于它直至为8的带下标X残基也存在，
残基X15和X16存在或不存在，当存在时分别为色氨酸和甘氨酸，
残基X17和X19存在或不存在，当存在时独立为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
残基X18存在或不存在，当存在时为精氨酸，
残基X20至X24不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数小于它直至为15的带下标X残基也存在。
表B
T细胞表位
Figure A20068004052700451
Figure A20068004052700461
Figure A20068004052700471
*带下划线的C(C)不是来自天然序列。
引文：
1.EPO 786 521A.
2.WO 98/07320.
3.US No.5,639,854.
4.US No.4,544,500.
5.EPO 399001 B1.
6.Bockenstedt et al.(1996)J.Immunol.，157，12：5496.
7.Zhong et al.(1996)Eur.J.Immunol.，26，11：2749.
8.Brumeanu et al.(1996)Immunotechnology，2，2：85.
9.Hill et al.(1997)Infect.Immun.，65，11：4476.
10.EPO 432 220 B1.
11.WO 98/06851.
12.Kelly et al.(1997)Clin.Exp.Immunol.，110，2：285.
13.Kahn et al.(1997)J.Immunol.，159，9：4444.
14.WO 97/18475.
15.Ohta et al.(1997)Int.Arch.Allergy Immunol.，114，1：15.
16.Staffileno et al.(1990)Arch.Oral Biol.，35：Suppl.47S.
17.Saron et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，7：3314.
18.Corthesy et al.(1996)J.Biol.Chem.，271，52：33670.
19.Bastien et al.(1997)Virol.，234，1：118.
20.Yang et al.(1997)Vaccine，15，4：377.
21.Lotter et al.(1997)J.Exp.Med.，185，10：1793.
22.Nara et al.(1997)Vaccine 15，1：79.
23.U.S.No.4,886,782.
24.Zavala et al.(1985)Science，228：1436.
25.Schodel et al.(1994)J.Exper.Med.，180：1037.
26.Calvo-Calle et al.(1997)J.Immunol.159，3：1362.
27.Qari et al.(1992)Mol.Biochem.Parasitol.，55(1-2)：105.
28.Qari et al.(1993)Lancet，341(8848)：780.
29.Neirynck et al.(Oct 1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163.
30.Thompson et al.(1994)Eur.J.Biochem.，226(3)：751-764.
31.Wilson et al.(2000)Science，287：1664-1666.
32.Brown etal.(1993)J.Virol.，67(5)：2887-2893.
33.U.S.No.4,886,663.
34.Schenk et al.(Jul 8，1999)Nature，400(6740)：116-117.
35.Slepushkin et al.(1995)Vacoine，13(15)：1399-1402.
36.Brett et al.，(1991)J.Immunol.，147(3)：984-991.
37.Neurath et al.，(1986)F.Brown et al.eds.，Vaccines 85，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.185-189.
38.Kent et al.，(1987)F.Brown et al.eds.，Vaccines 86，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.365-369.
39.Milich et al.，(1987)F.Brown et al.eds.，Vaccines 86，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.377-382.
40.Thornton et al.，(1987)F.Brown et al.eds.，Vaccines 87，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.77-80.
41.Milich et al.，(1987)F.Brown et al.eds.，Vaccines 87，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.50-55.
42.Little et al.，(1996)Microbiology 142：707-715.
43.Provided by Dr.Peter Hotez，George Washington University.
44.Morgan et al.，(2000)Nature 408：982-985.
45.U.S.Patent No.4,882,145.
46.Alexander et al.，(1994)Immunity 1：751-761.
47.Muyanga et al.，(2001)Arch.Virol.146(9)：1667-1679.
48.U.S.Patent No.6,171,591.
49.U.S.Patent No.6,060,064.
50.U.S.Patent No.6,110,466.
另一种有用的T细胞表位是称为PADRE表位的合成序列(参见Sette等的美国专利6,413,517)。一种示例性的表位是Alexander等，(1994)Immunity，5：751-761所公开的表位，其具有序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO：275)。
在某些实施方案中，表位包含半抗原性小药物分子及其衍生物或类似物。在一些实施方案中，表位是滥用药物或者滥用药物的类似物或衍生物，如尼古丁、乙醇、***、***、***、芬太尼、甲基芬太尼、***、甲基***、苯环利定、哌甲酯和亚甲基二氧基甲基***。示例性的这种物质是美国专利6,383,490中描述的***类似物，它们适用于共价连接到免疫原性载体。
在其它实施方案中，表位是糖。例证性的糖化合物包括NTHi或M.cat.的脂寡糖(LOS)[Sun等，(2000)Vaccine 2000，18(13)：1264-1272和Jiao等，(2002)Infect.Immun.，70(11)：5982-5989]。LOS由疏水性脂质A部分和亲水性核心寡糖部分组成，是革兰氏阴性细菌的外膜的主要成分之一。去毒的LOS(dLOS)分子是de-O-酰基化的或de-N-酰基化的，或者这两种情况都是，且按Hochstein(1990)Clinical application of the Limulus amoebocyte lysate test，R.B.Prior(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，第38-49页中的描述进行鲎变形细胞溶解物(LAL)测定发现，该分子所显示的内毒性(endotoxicity)比起始LOS减少约100至约10,000倍。
本领域公知有许多方法可将载体蛋白偶联到多肽。可在寡糖或相对较小的多糖的还原端上[Anderson(1983)Infect.Immun.，39：233-238；Jennings等，(1981)J.Immunol.，127：1011-1018；Poren等，(1985)Mol.Immunol.，22：907-919]或末端上[Anderson等，(1986)J.Immunol.，137：118-1186；Beuvery等，(1986)Dev.Bio.Scand.，65：197-204]制备醛基，该醛基可通过还原性胺化连接到载体蛋白。另外，用高碘酸盐离子对各邻近羟基进行氧化，然后用硼氢化氰对胺进行还原性烷基化，这对于在其免疫原性环中加入了能提供ε-胺的赖氨酸残基的那些HBc嵌合分子来说特别有用。
大的多糖可通过末端活化[Anderson等，(1986)J.Immunol.，137：1181-1186]或通过对多糖链上的几个官能团的随机活化[Chu等，(1983)Infect.Immun.，40：245-256；Gordon的美国专利4,619,828(1986)；Marburg的美国专利4,882,317(1989)]进行缀合。对多糖链上的几个官能团的随机活化，可因多糖链上的随机连键而产生高度交联的缀合物。多糖与载体蛋白的最佳比例取决于具体的多糖、载体蛋白和所用的缀合物。
有关将糖缀合到载体蛋白的方法的详细综述可在以下文献中找到：Dick等，Contributions to Microbiology和Immunology，第10卷，Cruse等(编辑)，(S.Karger：1989)，第48-114页；Jennings等，Neoglycoconjugates：Preparation和Applications，Lee等(编辑)，(Academic Press：1994)，第325-371页；Aplin等，(1981)CRC Crit.Rev. Biochem.，10：259-306和Stowell等，(1980)Adv.Carbohydr.Chem. Biochem.，37：225-281。
碳水化合物本身可通过本领域公知的方法合成，例如通过Witte等，(1997)J.Am.Chem.Soc.，119：2114-2118描述的酶促糖蛋白合成法来合成。
在以下各段节内容中论述到几种作为寡糖实例的合成、半合成和天然寡糖，这些寡糖是所精心设计的用于制备本发明HBc缀合物的半抗原。
适合制备用于治疗b型流感嗜血杆菌(H.ib)的疫苗的寡糖半抗原由2-20个D-核糖-D-核糖醇-磷酸(I，见下)、D-核糖醇-磷酸-D-核糖(II，见下)或磷酸-D-核糖-D-核糖醇(III，见下)重复单元所组成。Eduard C.Beuvery等，EP-O 276 516-B1。
Figure A20068004052700501
美国专利4,220,717还公开了b型流感嗜血杆菌的多聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)半抗原。
Peterson等，(1998)Infect.Immun.，66(8)：3848-3855公开了三糖半抗原αKdo(2→8)αKdo(2→4)αKdo，该半抗原能提供针对Chlamydiapneumoniae的保护作用。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)是从咽炎到致命性肺炎的人呼吸道感染的原因。Kdo是3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸()。
Andersson等的EP-O 126043-A1公开了可用于治疗、预防或诊断肺炎链球菌(Streptococci pneumoniae)所引起的细菌感染的糖。一类有用的糖是衍自二糖GlcNAcβ1→3Gal。上述Andersson等还报道说Galβ1→4GlcNAcβ1-3Galβ1→4Glc-Cer这一新乳糖四酰神经酰胺(neolactotetraosylceramide)是有用的。
McKenney等，(1999)Science，284：1523-1527公开了聚-N-琥珀酰β1→βGlcN(PNSG)这种多糖，它能提供针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的保护作用。金黄色葡萄球菌是包括心内膜炎、骨髓炎(osetemylitis)、化脓性关节炎(septic arthritis)、肺炎和脓肿在内的社区获得性感染的共因。
欧洲专利0 157 899-B1公开了肺炎球菌多糖的分离，该多糖可用于本发明。下表列出了能产生在本发明中可用作半抗原的荚膜多糖的肺炎球菌培养物类型。
多糖半抗原来源
  丹麦式命名法   美国命名法   1978 ATCC目录号
  1   1   6301
  2   2   6302
  3   3   6303
  4   4   6304
  5   5
  6A   6   6306
  6B   26   6326
  7F   51   10351
  8   8   6308
  9N   9   6309
  9V   68
  10A   34
  11A   43
  12F   12   6312
  14   14   6314
  15B   54
  17F   17
  18C   56   10356
  19A   57
  19F   19   6319
  20   20   6320
  22F   22
  23F   23   6323
  25   25   6325
  33F   70
卡他莫拉(布拉汉)菌(Moraxella)(Branhamella)catarrhalis)据报道是儿童中耳炎和窦炎及成人下呼吸道感染的原因。该细菌的脂寡糖表面抗原(LOS)的脂质A部分在3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸-葡糖胺连键处被切割。将切割产物用温和的碱或肼处理除去酯连接的脂肪酸，同时保持酰胺连接的脂肪酸，以产生来自卡他莫拉(布拉汉)菌的去毒脂寡糖(dLOS)。该dLOS直到它连接到蛋白载体时才有免疫原性。Xin-XingGu等，(1998)Infect.Immun.，66(5)：1891-1897。
B组链球菌(GBS)是人类脓毒病、脑膜炎和相关神经疾病的原因。荚膜多糖特异性抗体已知能保护婴儿免受感染。Jennings等的美国专利5,795,580。GBS II型荚膜多糖的重复单元是：→4)-β-D-GlcpNAc-(1→3)-[β-D-Galp(1→6)]-β-D-Galp(1→4)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→2)-[α-D-NeupNAc(2→3)]-β-D-Galp-(1→，其中括弧括住部分是连接到紧接的非括弧括住亚单位的支链。GBS V型荚膜多糖的重复单元是：
→4)-[α-D-NeupNAc-(2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→6)]-α-D-Glcp-(1→4)-[β-D-Glcp-(1→3)]-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→。
Brade的欧洲专利申请EU-0641568-A1公开了从沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)和鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)获得梯子样带型抗原的方法。
Slovin等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.SA.A.，96(10)：5710-5715报道了连接到KLH的合成寡糖globo H作为用于制备抗***癌疫苗的载体的用途。类似地，Helling等，(1995年7月)Cancer Res.，55：2783-2788报道了KLH连接的GM2在治疗黑素瘤患者的疫苗中的用途。后一疫苗是这样制备的：用臭氧切割GM2的神经酰胺双键，引入醛基并还原性烷基化到KLH上。类似的程序可用于所精心设计的嵌合颗粒。
存在于其它肿瘤细胞及正常细胞如黑素瘤、成神经细胞瘤和健康脑细胞的表面上的鞘脂寡糖部分如红细胞糖苷脂和神经节苷脂，在本发明中同样可用作半抗原。红细胞糖苷脂globo H的寡糖部分具有以下结构：
Fucα-(1→2)-Galβ(1→3)-GalNAcβ-(1→3)-Galα-(1→4)-Galβ-(1→4)Glc，而神经节苷脂的糖部分GM2、Gm1和GD1a分别具有以下结构：
GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc；
Galβ-(1→3)-GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc和NeuAc-(2→3)-Galβ-(1→3)-GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc。
美国专利4,356,170公开了有用的多糖的制备，将多糖还原然后氧化形成具有末端醛基的化合物，后者可还原性胺化到载体蛋白如破伤风类毒素和白喉类毒素的游离胺基团上，发生或不发生显著的交联。示例性的有用细菌多糖包括β-溶血性链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎双球菌、肺炎双球菌和大肠杆菌)E.coli)多糖。可以不将颗粒进行还原性胺化，而是将接头臂(linker arm)如ε-氨基C2-C8烷基羧酸提供的接头臂还原性胺化到多糖上，然后用水溶性碳二亚胺连接到颗粒。
另外有用的既非B细胞表位也非T细胞表位的序列能结合得生物素，并可表达成能自组装成VLP的嵌合多肽的一部分。美国专利6,380,364中公开了两个这种序列：GGGCSWAPPFKASC(SEQ ID NO：276)和GGGRGEFTGTYITAVT(SEQ ID NO：277)。这两个序列可类似地与前述的能形成VLP的多肽一起共表达成融合多肽。
本发明又一个优选的实施方案是使VLP稳定化的方法。VLP是这样稳定化的：将自结合肽第二部分通过共价键连接到自组装多肽第一部分。在一些实施方案中，连接是通过肽键来进行。在一些实施方案中，肽键进行的连接是通过将编码自结合肽部分的DNA遗传融合到自组装多肽第二部分的DNA编码序列来实现。在某些实施方案中，第一部分和第二部分例如通过双功能连接剂或通过蛋白质连接(protein ligation)在体外进行连接。本发明的又一个实施方案是使可通过一个或多个共价或非共价键连接上异源表位的VLP稳定化的方法。
本领域技术人员认识到，稳定化的VLP会在医学领域之外的技术中具有用途。本领域技术人员认识到，结合到稳定化VLP的表位也会在医学领域之外的技术中具有用途。参见例如Mao等，Proc.Nat.Acad.Sci.(2003)100：6946-51。另参见Wang(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：459-62，在该文献中工程改造的病毒颗粒被描述为“可寻址纳米尺度结构单元(addressable nanoscale building blocks)”。
本领域技术人员认识到，在生物***中来进行本发明的生产(例如通过编码本发明嵌合多肽的重组DNA表达该多肽的一个或多个部分，该DNA存在于对宿主来说适当的表达载体中，该载体引入到适当的宿主细胞中(在本文别处描述))，这只是产生嵌合多肽的任何或所有部分、稳定性肽和/或表位的一种方式，且只为方便起见在下文实施例中使用。可采用体外蛋白质连接和其它本领域公知的化学技术，来完全从体外合成的多肽和其它前体通过共价键构建本发明多肽和VLP。[有关多亚单位聚蛋白的半合成方法参见例如Muir等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.，95：6705-6710；总合成方法参见例如Canne等，(1995)J. Am.Chew.Soc.，117：2998-3004]。
本领域技术人员还清楚，有一些实施方案将不可能在体内或在所有细胞类型中构建。例如，如Carerra等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.，98：1988-1992所教导，在体外将小分子连接到嵌合多肽的接头残基上。
本领域技术人员会认识到，上述的将表位共价和非共价连接到嵌合衣壳多肽的第一部分的具体实例，只出于示例性说明目的，还有许多其它连接方法是本领域公知的，这些方法容易适用于在体内或体外进行这种连接。
编码所精心设计的嵌合多肽或嵌合多肽的一部分(“嵌合类似物”)的类似核酸(DNA或RNA)序列，也精心设计为属本发明的一部分。嵌合类似核酸序列或其互补核酸序列所编码的氨基酸残基序列，与嵌合多肽的第一部分有至少50％、更优选70％、甚至更优选80％、还甚至更优选至少90％、最优选至少95％同一性。这种DNA或RNA在本文中称为编码病毒衣壳多肽或自组装多肽(包括但不限于以下实施例所列举的多肽)的核酸的序列的“类似物”，或者称为“类似序列”。编码类似序列的核酸在合适的转染和表达时，也产生所精心设计的嵌合多肽的第一部分。
可以利用遗传密码的简并性来编码嵌合多肽的第一部分，这样可避免与例如基因组病毒衣壳多肽基因或编码相同氨基酸序列或其互补序列的基因片段的基本上同一性(substantial identity)。因此，有用的类似DNA序列并不需要能例如与病毒衣壳多肽编码序列的核苷酸序列或其互补序列在中严格条件下杂交，但仍能提供所精心设计的嵌合分子；也就是说，有许多核酸序列可编码相同的多肽。出于这些原因和下述原因，最适当的相似性量度标准是氨基酸序列之间而不是核酸序列之间的相似性。
不同的宿主生物具有不同的密码子偏好性，也就是说，它们优先使用特定的密码子来编码特定的氨基酸残基。这种密码子偏好性是公知的，编码所需的嵌合序列的DNA序列可例如用体外诱变加以变更，使得当要表达多肽时宿主偏好的密码子得到利用。这种变更是本领域的常规操作，因为优化的编码序列能导致要从特定表达宿主表达的蛋白质的数量和质量更高。
本发明还精心设计了包含载体、外源核酸区段(例如DNA区段或序列)、启动子的重组核酸分子如DNA分子，该载体操作性连接到该外源核酸区段，该外源核酸区段确定了编码上述所精心设计的嵌合多肽的一部分的基因，该启动子适合于指导该基因在相容宿主生物中的表达。更具体的说，本发明还精心设计了这样的重组DNA分子，其所包含的载体含有启动子和DNA区段，该启动子***作性连接到该DNA区段，指导所精心设计的嵌合多肽的一部分在宿主生物细胞中的表达，该DNA区段确定了嵌合多肽的第一部分的基因或与所精心设计的嵌合多肽有至少50％氨基酸同一性的DNA变体。
还精心设计到这样的重组DNA分子，其所包含的载体含有启动子和DNA区段，该启动子***作性连接到该DNA区段，控制嵌合多肽部分在宿主生物细胞中的表达，该DNA区段是编码第一部分的氨基酸残基序列的类似核酸序列，该氨基酸残基序列与所精心设计的嵌合多肽的序列的第一部分有至少50％、更优选70％、更优选80％、更优选90％、最优选至少95％同一性。该重组DNA分子在合适地进行宿主细胞转染和表达时，能提供所精心设计的嵌合分子。
应指出的是，本发明第一多肽部分的一些实施方案包括异源表位氨基酸残基或序列和/或接头残基或序列。这些异源序列和/或它们的编码核酸序列和/或和/或它们的互补序列，并不纳入在上述序列同一性百分数和比较中。同样，从嵌合多肽的第一部分截短以消除核酸结合特性的序列(相对于例如最终衍生它的病毒衣壳多肽，例如N末端或C末端序列)，也不纳入同一性计算和比较中。因此，只有存在于嵌合分子的第一部分的碱基或残基，而不计异源接头和/或表位，才纳入同一性百分数计算和比较中并与所比对的核酸或氨基酸残基序列进行比较。
例证性的乙型肝炎病毒衍生VLP的基因的编码序列，在图1的SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中例示。分离的核酸区段，优选DNA序列及其变体和类似物，可通过体外诱变进行制备，这是本领域公知的，在Current Protocols In Molecular Biology，Ausabel等(编辑)，JohnWiley & Sons(New York：1987)第8.1.1-8.1.6页中也有论述，它是在基因的起始ATG密码子处开始，在每个基因的终止密码子处或紧接的下游处结束。因此，可将所需的限制位点工程加入在起始密码子处或其上游以及终止密码子处或其下游，使得其它基因可得以制备、切除和分离。然后使用本领域公知的方法，在技术上可以做到几乎任何一组核酸序列的乙醇融合和/或操作性连接(operational linkage)。
本领域公知，只要存在所需的核酸(例如DNA序列)(包括起始和终止信号)，在这个核酸区段的任一端通常可存在另外的碱基对，而这个区段仍可用来表达蛋白质。这当然假定了该区段中没有操作性连接着具有以下作用的DNA序列：抑制表达，能表达会消耗所需的表达产物的另外产物，能表达会消耗由所需酶产生的所需反应产物的产物，或者能以别的方式干扰该DNA区段的基因的表达或功能。
因此，只要DNA区段没有这种干扰性DNA序列，本发明的DNA区段长度可为说500至约100,000个碱基对，包括载体序列在内。重组DNA分子特别是表达载体的最大大小，主要受制于方便性和一旦复制和表达所需的所有最小DNA序列都存在时宿主细胞所能容纳的载体大小。最小表达载体及其大小是公知的。长DNA区段和大载体不优选但可使用。
编码前述嵌合多肽部分或其类似物的DNA区段，可完全通过非生物化学技术，例如Matteucci等，(1981)J.Am.Chem.Soc.，103：3185的磷酸三酯方法进行合成，这一点有提到。当然，通过化学法合成遗传序列，可简单地通过用适当的碱基置换编码天然氨基酸残基序列的碱基，作出任何所需的修饰。但是，优选的是包括前述序列的DNA区段。
所精心设计的嵌合多肽可在多种转化宿主***中产生(表达)，主要是在宿主细胞中表达，但也精心设计到在无细胞体外***中的表达。这些宿主细胞***包括但不限于微生物如转化有重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体的细菌；转化有酵母表达载体的酵母；转染有病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒；alpha病毒、杆状病毒、fd)或者转化有细菌表达载体(例如Ti质粒)的植物、动物或细菌细胞***；或者适当转化的动物细胞***如CHO、VERO或COS细胞。同样下文提到，本发明既不受所采用的宿主细胞***的限制或限定，也不受控制和指导表达的遗传元件的性质的限制或限定。
含有编码例如HB衣壳多肽的基因的DNA区段，优选从含有该基因的重组DNA分子(质粒载体)获得。能够指导这种基因的表达从而导致该序列的转录(以及对于本文所述的编码多肽来说其随后的翻译)的载体，在本文中称为“表达载体”。
表达载体含有包括启动子在内的表达控制元件。将嵌合多肽部分的编码序列操作性连接到表达载体，以让启动子序列指导嵌合多肽部分的编码基因的RNA聚合酶结合和表达。可用于表达多肽编码序列的启动子是诱导型型启动子、病毒启动子、组成型启动子(Poszkowski等，(1989)EMBO J.，3：2719和Odell等，(1985)Nature，313：810对此有描述)，以及暂时调节性启动子、空间调节性启动子和时空调节性启动子(Chua等，(1989)Science，244：174-181对此有描述)。
一种优选的用于原核生物细胞如大肠杆菌的启动子，是可被外源供应的萘啶酸诱导的Rec 7启动子。更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(可获自Promega Corp.，Madison，WI)，其可被外源供应的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。还更优选的启动子即tac启动子存在于这里载体pKK223-3，它也可被外源供应的IPTG诱导。使用约25至约100μM IPTG进行诱导，可成功地在多株大肠杆菌株如XL-1、TB1、BL21和BLR中表达pKK223-3质粒。出人意料的是，已发现浓度约25至约50μM IPTG在2L摇瓶和发酵罐中能提供最佳结果。在其它细胞类型和生物中进行表达，可能需要本领域公知的其它启动子和遗传调节元件。
已开发出多种方法来通过互补粘性末端或平端将DNA操作性连接到载体。例如，可将互补均聚序列段(complementary homopolymertract)加到待***到载体DNA中的DNA区段。然后将载体和DNA区段通过互补均聚尾(complementary homopolymeric tail)之间的氢键进行连接，以形成重组DNA分子。
或者如前所述，可使用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头，将DNA区段连接到表达载体。合成的接头是这样连接到平端DNA区段：将平端DNA区段与大大过量的合成接头分子，在能够催化平端DNA分子的连接的酶如噬菌体T4DNA连接酶的存在下进行温育。因此，反应的产物是在其末端携带有合成接头序列的DNA区段。然后将这些DNA区段用适当的限制性内切核酸酶切割，并连接到已用能产生与合成接头末端相容的末端的酶进行过切割的表达载体中。含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可从多个来源市售获得，包括New England BioLabs，Beverly，MA。
所需的DNA区段也可用PCR技术获得，其中的正向引物和反向引物含有在扩增后可切割的所需限制位点，使得基因能***到载体中。或者，可将PCR产物直接克隆到含有T突出端的载体(PromegaCorp.，A3600，Madison，WI)中，这是本领域公知的。
本领域公知，几乎任何所需的遗传序列都可通过体外合成、PCR扩增和操作、定点诱变或它们的组合或者本领域公知的其它技术来产生。实际上，完全合成的定制遗传构建物可市售获得(例如获自Aptagen、Herndon、VA USA、Sigma-Genosys The Woodlands、TX USA、GenScript Corp.Edison，NJ USA及许多其它供应商)。此外，不同的宿主生物(除了上述密码子偏好性外)还使用各不相同的遗传序列来控制和指导基因表达，因此精心设计到编码本发明嵌合多肽或其部分的表达载体能适应于多种可能的宿主生物中的一种或多种，它们仍落入要求权力的本发明的范围内。
考虑到遗传密码简并性、各生物之间各不相同的密码子偏好性、完全定制的遗传构建物的市售可获得性、从遗传构建物表达蛋白质的***的多样性以及其它天然和非天然来源的遗传变异这些方面的组合，可以看出，两个多肽或其编码基因之间的相似性的最具功能意义的决定因素，是受编码氨基酸序列而不是编码它们的核酸。
接种物和疫苗
在本发明的又一个实施方案中，将HBc嵌合颗粒或HBc嵌合颗粒与半抗原的缀合物作为接种物(inoculum)或疫苗的免疫原，用于人患者或合适的动物宿主如黑猩猩、小鼠、大鼠、马、绵羊等。接种物能诱导B细胞或T细胞应答(刺激)，如能与免疫原性表位或半抗原发生免疫反应的抗体的产生或者T细胞激活，而疫苗能通过B细胞或T细胞应答中的一种或两种提供针对从中已衍生了免疫原的物质的保护作用。
T细胞激活可通过多种技术进行测量。在平常实践中，给宿主动物接种上所精心设计的HBc嵌合颗粒疫苗或接种物，之后收集外周血单核细胞(PMBC)。然后将这些PMBC在体外在T细胞免疫原存在下培养约3-5天的时间。然后测定所培养的PMBC的细胞因子如IL-2、GM-CSF或IFN-γ的增殖或分泌情况。T细胞激活的测定是本领域公知都参见例如美国专利5,478,726及其中引述的技术。
以抗体组成物(antibody formation)为例，所精心设计的接种物或疫苗包含免疫有效量的HBc嵌合颗粒或嵌合颗粒缀合物，该颗粒或缀合物溶于或分散于药物可接受的稀释组合物，该组合物通常还含有水。接种物当给予需要进行免疫或者需要在其体内诱导抗体的宿主动物如哺乳动物(例如小鼠、狗、山羊、绵羊、马、牛、猴、猿或人)或者鸟类(例如鸡、火鸡、鸭或鹅)时，能诱导产生能与遗传连接的或缀合的(悬挂连接的)半抗原发生免疫反应的抗体。这些抗体还优选能结合B细胞免疫原的蛋白质或糖。
每次免疫所用的重组HBc嵌合免疫原的量称为免疫有效量，该量如下所述依重组HBc嵌合免疫原、所免疫患者和疫苗中佐剂的存在等因素而定可在很大范围内变动。疫苗和接种物的免疫有效量能分别提供前述的保护作用和抗体活性。
疫苗和接种物通常含有约1微克至约1毫克/次接种(单位剂量)的重组HBc嵌合免疫原浓度，优选约10微克至约50毫克/单位剂量。术语“单位剂量”在本发明的疫苗或接种物上，是指适合作为单元剂量用于动物的物理上分立的单位，每个单位含有预定量的活性物质及与其结合的所需稀释剂(即载体或介质)，该预定量经计算能单独地或共同地产生所需的免疫原性作用。
疫苗或接种物通常是这样从回收的重组HBc嵌合免疫原制备：将免疫原优选以颗粒形式分散于生理上可耐受(可接受)的稀释介质如水、盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、乙酸缓冲盐水(ABS)、林格溶液等中，形成含水组合物。稀释介质也可包括油质材料如花生油、角鲨烷或角鲨烯，下文有论述。
含有蛋白质材料作为活性成分的的接种物和疫苗的制备也是本领域公知的。通常，这种接种物或疫苗制备成液体溶液剂或混悬剂形式的胃肠外药；也可制备成适合于在临注射时溶于或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可进行乳化，这是特别优选的。
往往将在免疫原性上有活性的成分与药物可接受的且与该活性成分相容的赋形剂混合在一起。合适的赋形剂有例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，接种物或疫苗可含有少量的能增强组合物的免疫原性效率的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂。
所精心设计的疫苗或接种物优选还包含佐剂。用于本发明疫苗和接种物的合适佐剂，包括能够增强抗体对嵌合体中所含B细胞表位的应答的那些佐剂，以及能够增强细胞介导的对嵌合体中所含T细胞表位的应答的那些表位。佐剂是本领域公知的(参见例如Vaccine Design- The Subunit和Adjuvant Approach，1995，Pharmaceutical Biotechnology，第6卷，Powell、M.F.和Newman，M.J.(编辑)，Plenum Press，New York和London，ISBN 0-306-44867-X)。
示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA，不用于人类)、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷和明矾[等AlhydrogelTM(Superfos，丹麦)]，它们是本领域公知的材料，可从几个来源市售获得。
优选的用于本发明免疫原的佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物盐或磷酸盐)。特别优选的用于本发明的的佐剂是氢氧化铝凝胶如AlhydrogelTM于请氧化铝凝胶，将嵌合蛋白与这种佐剂混合，使得每剂量存在50-800微克的铝，优选存在400-600微克的铝。另一种特别优选的佐剂是磷酸铝，可从丹麦Superfos Biosector公司获得，商标为Adju-PhosTM。原始(primary)磷酸铝颗粒具有片状形态，直径约50至约100nm，在产品中最终颗粒大小为约0.5至约10μ。磷酸钙纳米颗粒(CAP)是Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)正在开发的一种佐剂。可将目的免疫原包被到颗粒的外面，或者包埋在颗粒的内部(encapsulated inside on the inside)([He等，(Nov.2000年11月)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6)：899-903]。
另一种特别优选的用于本发明免疫原的佐剂是乳液。所精心设计的乳液可以是水包油型乳液或油包水型乳液。除了免疫原性嵌合蛋白外，这种乳液还包含角鲨烯、角鲨烷、花生油等这些公知的油相和分散剂。优选非离子型分散剂，这种材料包括脱水山梨糖醇和二缩甘露醇的单-和二-C12-C24-脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。含有免疫原的乳液作为乳剂给药。
优选地，这种乳液是包含角鲨烯和二缩甘露醇单油酸酯的油包水型乳液(ArlacelTM A)，其任选包含角鲨烷，用水相中的嵌合蛋白乳化。这种乳液的公知实例包括MontanideTM ISA-720和MontanideTM ISA703(Seppic，Castres，法国)，它们每一个据认为都同时含有角鲨烯和角鲨烷，其中角鲨烯在每一个中都占主要，但在MontanideTM ISA 703较少些。最优选使用MontanideTM ISA-720，且使用7：3(w/w)的油-水比。其它优选的水包油型乳液佐剂包括WO 95/17210和EP 0 399 843中描述的那些佐剂。
本发明还精心设计到使用小分子佐剂。可用于本发明的一类小分子佐剂是美国专利4,539,205、4,643,992、5,011,828和5,093,318中描述的7-取代-8-氧代-或8-硫代-鸟苷衍生物。在这些物质当中，特别优选的是7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)。该分子已证实能特别有效地诱导抗原(免疫原)特异性应答。
优选的有用佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)、3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)，这是Ribi Immunochem，Hamilton，Montana制造的公知佐剂。该佐剂含有三种从细菌提取的成分：单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)，它们包含在2％角鲨烯/Tween 80
Figure A20068004052700631
乳液中。这个佐剂可通过GB 2122204B中教导的方法制备。3-de-O-酰基化单磷酰脂质A的优选形式是直径小于0.2μm的小粒径乳液形式(EP 0 689 454 B1)。最优选的是MPL的合成单糖类似物，其称为氨基烷基葡糖酰胺4-磷酸，AGP，例如以标号RC-529出售{2-[(R)-3-十四烷酰氧基-氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰基-氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基-十四烷酰氧基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙铵盐}。RC-529可获自CorixaCorp.，在角鲨烯乳液中以标号RC-529SE出售，在含水制剂(aqueousformulation)中以标号RC-529AF出售(参见美国专利4,987,237和6,113,918)。这些佐剂可单独使用或者一种或多种其它佐剂如AlhydrogelTM组合使用。
更多的精心设计佐剂包括含有一重或多重CpG核苷酸基序(motif)的合成寡核苷酸佐剂，其可获自Coley Pharmaceutical Group。可获自Aquila Biopharmaceuticals，Inc.的标号QS21的佐剂，是衍自南美洲树种智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)树皮的一种具有佐剂活性的免疫活性皂苷流分(等QuilTM A)，其生产方法在美国专利5,057,540中公开；智利皂荚树皂苷的半合成和合成衍生物也有用，例如美国专利5,977,081和6,080,725描述的那些皂苷。可获自Chiron Corp.的标号为MF59的佐剂，在美国专利5,709,879和6,086,901中有描述。
还精心设计了胞壁酰二肽佐剂，其包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[CGP 11637，称为去甲-MDP]和N-乙酰胞壁-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)乙胺[(CGP)1983A，称为MTP-PE]。所谓的胞壁酰二肽类似物在美国专利4,767,842中描述。
优选的佐剂组合物包括3D-MPL和QS21的组合(EP 0 671 948B1)、包含3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210、PCT/EP98/05714)、与其它载体配制在一起的3D-MPL(EP 0 689 454B 1)、配制在含胆固醇的脂质体中的QS21(WO 96/33739)或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555)。可获自SKB(现Glaxo-SmithKline)的SBAS2(现ASO2)在水包油型乳液中含QS21和MPL。另外的佐剂包括WO 99/52549中描述的那些佐剂和聚氧乙烯醚的非颗粒性悬浮剂(英国专利申请9807805.8)。
佐剂以佐剂量(adjuvant amount)使用，该量可随佐剂、哺乳动物和重组HBc嵌合免疫原而异。典型的量可从约1μg至约1mg/次免疫的范围变动。本领域技术人员知道，可容易地确定出适当的浓度或量。
接种物和疫苗在常规上是通过注射(例如皮下注射或肌肉内注射)进行胃肠外给药。适合于其它给药方式的另外制剂包括栓剂，在有些情况下是口服制剂。还精心设计到使用Neirynck等，(1999)Nature Med.，5(10)：1157-1163中述及的接种用鼻腔喷雾剂。对于栓剂，传统的粘结剂和载体可包括例如聚烷撑乙二醇或甘油三酯；这种栓剂可从含有0.5％-10％、优选1-2％的活性成分的混合物形成。口服制剂包含诸如以下的常用赋形剂：药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
接种物或疫苗组合物呈溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，含有免疫有效量的HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物(优选为颗粒形式)作为活性成分。在典型的组合物中，免疫有效量的优选HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物颗粒如前所述为约1μg至约1mg活性成分/剂量，更优选约5μg至约50μg活性成分/剂量。
疫苗通常配制成供胃肠外给药。示例性的免疫是以皮下(SC)、肌肉内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)方式进行。但是，还精心设计到口服和鼻内途径的疫苗接种。
HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒缀合物可以以中性形式或盐形式配制到疫苗中。药物可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质或半抗原的游离氨基形成)，是用无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等来形成。与游离羧基所成的盐也可衍自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
在又一个实施方案中，精心设计到这样的疫苗或接种物，其中将编码所精心设计的HBc嵌合体的基因转染到适当减毒的肠道细菌如伤寒沙门菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合菌或大肠杆菌(E.coli)中。示例性的减毒或无毒伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合菌，在前文提供的引文中有论述。这些疫苗和接种物特别精心设计用于抗击以下疾病：通过鼻腔、肠道和生殖道黏膜感染或传播的疾病如流感，酵母(如黑曲霉和假丝酵母)疾病，病毒(如脊髓灰质炎病毒、***病毒、甲型肝炎病毒)疾病，细菌(如霍乱菌、沙门氏菌和大肠杆菌)疾病，对于这些疾病除了要产生全身IgG应答外还需要黏膜IgA应答，或者不需要前一应答而需要后一应答。
肠道细菌可进行冻干，与干燥的药物可接受稀释剂混合，制备成片剂或胶囊剂，以供宿主动物摄取、用药或服用，这些是常用的固体药物。另外，这些细菌性疫苗的含水制剂适用于通过口服、皮内、直肠内或***内给药进行黏膜免疫。
用含有所精心设计嵌合分子颗粒的植物物质进行的口服免疫，可通过简易地摄取转基因植物组织如根(例如胡萝卜)或种子(如大米或玉米)来实现。在这种情况下，口腔和胃肠道中的水分提供通常所用的免疫用含水介质，而周围的植物组织则提供药物可接受的稀释剂。
接种物或疫苗以与剂型相适应的方式给药，给药量为治疗有效和能产生免疫原性的量。要给予的数量取决于待治疗受试者、受试者免疫***合成抗体的能力和所需的保护作用程度。所需给予的活性成分的精确量根据主治医师的判断来决定，每个受试者个体各不相同。但是，合适的剂量范围大约是每个个体几十微克活性成分。合适的初次给药和强化(booster shot)注射方案也是可变的，但通常是初次给药后间隔一定时间(数周或数月)再进行注射或其它给药。
哺乳动物一旦免疫后使其维持一段时间，该时间足以让重组HBc嵌合免疫原诱导产生足够滴度的能结合目的抗原(如对于疟疾疫苗，为子孢子)的抗体。为产生示例性的抗子孢子抗体的维持时间，通常持续约3至约12个月的时间，且可包括强化注射或者疫苗的再次免疫给药。如果需要，还精心设计到在第一次免疫后24周至5年的时间进行第三次免疫。特别精心设计到，一旦达到了保护水平滴度的抗体，被接种哺乳动物优选通过以约1至约5年的间隔时间进行定期强化免疫，来保持在该抗体滴度水平上或附近。
抗子孢子抗体(在疟疾疫苗的情况中)或其它抗体的产生，可便利的这样进行确证：从被免疫哺乳动物获得到血浆或血清样品，通过下文描述的ELISA测定或通过本领域公知的其它免疫测定如蛋白质印迹，测定其中的抗体结合适当的抗原如合成的环子孢子免疫显性抗原[等本文所用的恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白肽(NANP)5]的能力。
要指出的是，诱导出的抗体如抗CS抗体或抗流感抗体可用公知的技术从被接种宿主哺乳动物的血液分离出来，然后重构(reconstituted)成第二疫苗供进行被动免疫，这是本领域公知的。有类似的技术用于对人类进行γ-球蛋白免疫。例如，可将来自一个或多个被免疫宿主的抗血清在硫酸铵水溶液(通常40-50％饱和)沉淀，然后将沉淀的抗体用亲和层析法进行层析纯化，其中(NANP)5或流感M2多肽用作抗原固定化在层析柱上。因此，例如可将接种物用于马或山羊体内诱导产生抗疟疾抗体，该抗体再用于另一种动物如人类体内进行被动免疫。
本发明的另一个实施方案是在动物宿主体内诱导产生抗体、活化的T细胞或这两者的方法，所述方法包括用接种物接种所述动物宿主的步骤。用于这个方法的接种物包含免疫原性产生量的上述HBc嵌合颗粒或HBc嵌合颗粒缀合物，该颗粒或颗粒缀合物溶于或分散于药物可接受的稀释剂。使动物宿主保持足以让抗体或活化的T细胞得到诱导(可通过公知的方法测定)的一段时间，该时间通常需要数周至数月(同样是公知的)。精心设计了在这个维持时间中进行多次这种免疫。
实施例
以下实施例只以示例方式给出，不应被认为是对本发明的限制。可以不偏离本发明的精神和范围，对这个技术作出许多变化。免疫学和重组DNA方法在本公开内容中可能没有明确进行描述，但这些方法完全在本领域技术人员的技能范围内。本文和其它文献引述的参考文献明确地整体包括在本文中。
实施例1：用M2胞外域构建稳定化HBc多肽VLP
为说明流感病毒M2蛋白的N末端区域以非共价方式使乙型肝炎病毒核心样颗粒稳定的能力，将M2e的胞外域融合到C末端截短的HBc多肽的C末端。为确保不是固有的半胱氨酸残基促成稳定化，使用了其中半胱氨酸突变成丝氨酸的M2(位置2-24)版本(CV-1895，V7.M2e(2C＞2S)。为构建表达载体V7.M2e(2C＞2S)，将一对寡核苷酸退火并***到表达载体V7(见下)中，载体V7在HB衣壳多肽基因的氨基酸V149之后接受***。这在图2中示意显示。
因此，构建了新的载体，以使自结合肽能够融合到HBc嵌合体的C末端。在HBC缬氨酸149和HindIII位点之间***独特的EcoRI和SacI限制位点，以促进合成的dsDNA定向***到EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点中。使用以下所示一对PCR引物来扩增HBc149基因，该基因在氨基末端有NcoI限制位点，在羧基末端有EcoRI、SacI和HindIII位点。将PCR反应的产物(479bp)用NcoI和HindIII消化并克隆到pKK223-3N中，以形成载体V7。
为***自结合肽，将质粒(V7)用EcoRI和HindIII(或EcoRI和SacI)消化，将具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接到V7中。对于所有的V7构建物，天然HBc(缬氨酸149)的最后一个氨基酸和***的自结合肽的第一个氨基酸，被形成EcoRI限制位点的核苷酸所编码的甘氨酸-异亮氨酸二肽序列隔开。对于在EcoRI/SacI***的表位，在终止密码子之前、自结合肽之后，有由SacI位点提供的另外的谷氨酸-亮氨酸残基。以下同样用下划线表示限制位点。
HBc149/NcoI-F
5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA    SEQ ID NO：278
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5′-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG
            SEQ ID NO：279
以下以单字母代码显示M2肽C末端***物的序列，该序列编码颗粒CV-1895[M2(2-24/C17S，C19S)]的DNA序列。
I  S  L  L  T  E  V  E  T  P  I  R  N  E  W
AATTTCTCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATTCGTAACGAATGGG
    AGAGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAAGCATTGCTTACCC
G  S  R  S  N  D  S  S  D  E  L    SEQ ID NO：29
GTAGCCGCTCTAATGATAGCTCTGACGAGCT    SEQ ID NO：280
CATCGGCGAGATTACTATCGAGACTGC        SEQ ID NO：281
实施例2：稳定化HB衣壳多肽VLP的分析
进行了颗粒的表达和纯化后，用分析型尺寸排阻层析法分析其保持颗粒状形态的能力。当用这种方式分析时，无C末端稳定化颗粒(例如CV-1048)以颗粒状和非颗粒状物质的混合物的形式存在。
CV-1895颗粒的类似分析揭示它们是作为均一颗粒结构洗脱出来(图4)。这些数据表明，M2e(2-24，C17S，C19S)序列当存在时与HBc的C末端融合，形成能使颗粒结构稳定化的分子间相互作用。这些数据进一步表明，分子间稳定化是在M2位置17和19的半胱氨酸残基不存在的情况下出现的。
实施例3：用GCN4-p1亮氨酸拉链构建稳定化HBc多肽VLP
为研究酵母GCN4转录调节子的亮氨酸拉链结构域以非共价方式使乙型肝炎衣壳多肽颗粒稳定化能力，将衍自GCN4蛋白的、在溶液中能同时形成二聚体和三聚体的修饰亮氨酸拉链GNC4-VL用基因工程法融合到C末端截短的HBc颗粒的C末端。按照实施例1的构建表达载体的方法，将编码GCN4-VL的合成寡核苷酸退火并***到表达载体V7中，载体V7在HB衣壳多肽基因的氨基酸V149之后接受***。以这种方式连接到HB衣壳的肽具有以下序列：
RVKQLEDKVEELLSKVYHLENEVARLKKLVGER
                    SEQ ID NO：282
所获得的颗粒经分析型大小排阻层析法分析比原始CV-1048VLP更加稳定，基本上不发生核酸结合。
实施例4：具有N末端含赖氨酸接头突出端的稳定化HBc VLP
按照Clarke等，EP0385610的教导，将表位连接到适当修饰的HBc多肽VLP的N末端赖氨酸残基，例如，将CV-1895工程改造成在HBc衣壳多肽N末端具有另外的氨基酸残基。N末端突出端中可存在一个以上赖氨酸残基。这种工程改造的衣壳多肽在C末端具有稳定性肽，例如在实施例1中的流感A的M2蛋白的胞外自组装肽。
这里使用了FMDV 01和A12亚型的表位。这些是VP1衣壳蛋白的大约氨基酸残基142至大约160。这些序列可重复两次。例如，有用的表位是：
FMDV O1
(FMDV O1 VP1 AA 137-162)-(FMDV O1 VP1 AA 137-162)-Cys；
以单字母代码表示，这个序列是：
NRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTLPTSNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTLPTSC
                             SEQ ID NO：283；
FMDV A12，
(FMDV A12 VP1 AA 137-162)-(FMDV A12 VP1 AA 137-162)-Cys：
以单字母代码表示，这个序列是：
YSASGSGVRGDLGSLAPRVARQLPASYSASGSGVRGDLGSLAPRVARQLPASC
                             SEQ ID NO：284
FMDV表位的更短免疫原性序列可以被呈递，也可以被重复。有用的更小的肽是：
(FMDV O1 VP1 AA 145-150)-(FMDV O1 VP1 AA 145-160)-Cys；
RGDLQVRGDLQVLAQKVARTLPC；
                        SEQ ID NO：285
和
(FMDV O1 VP1 AA 145-150)-(FMDV O1 VP1 AA 145-150)-(FMDV O1 VP1 AA 145-160)-Cys：
RGDLQVRGDLQVRGDLQVLAQKVARTLPC
                        SEQ ID NO：286.
N末端接头突出端可具有任何适当的长度，条件是具有该突出端的HBc能自组装成核心样颗粒，另一条件是该接头突出端中的赖氨酸残基暴露出来可供进行偶联。如果需要，接头突出端可最长达100个氨基酸残基或更长。短接头突出端可最长达60个氨基酸残基，例如最长达40、20、10或5个氨基酸残基。
一个合适的突出端包含I型脊髓灰质炎病毒(PV1)株如Sabin或Mahoney株的VP1衣壳蛋白的残基95-102，例如95-104：
Sabin PV1 VP1 95-102：SASTKNKD
          SEQ ID NO：287；
Sabin PV1 VP1 95-104：SASTKNKDKL
          SEQ ID NO：288
Mahoney PV1 VP1 95-102：PASTTNKD；
          SEQ ID NO：289
Mahoney PV1 VP1 95-104：PASTTNKDKL
          SEQ ID NO：290
如Clarke EP0385610所教导，在HB衣壳多聚蛋白的任何N末端突出端中，通常前十四个N末端残基当中应有至少一个赖氨酸残基。为选择多肽用于进行偶联，选择具有这样的N末端突出端的HBc多肽是适当的，该N末端突出端在靠近其N末端处包含赖氨酸残基。而且，N末端突出端可以是亲水性的。
可通过标准的遗传工程技术，获得其N末端接头突出端包含这些序列中的一个或任何其它掺入赖氨酸残基的序列的修饰HB衣壳多肽。
实施例5：将异源表位化学连接到带有N末端含赖氨酸接头突出端的稳定化HBc VLP
缀合物通过将表位偶联到修饰HBc VLP来制备，所述偶联是通过在修饰HB衣壳VLP的N末端接头突出端氨基酸残基当中存在的赖氨酸残基的侧链氨基来进行。这个偶联通常是这样实现的：使修饰HBc VLP与能够连接到氨基和连接到巯基的双功能试剂反应。然后使这样衍生化的修饰HBc VLP与表位反应，该表位如果本来不具有游离巯基，则事先对其进行了修饰使其具有巯基。
合适的双功能试剂包括SMCC、MBS和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。双功能试剂往往包含能形成肽键的基团和能形成二硫键或硫醚键的基团。
巯基可通过合成出含有半胱氨酸残基的肽来加到肽表位，该合成是通过使氨基官能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或者3-(3-二硫吡啶基)丙酸或S-乙酰硫代乙醇酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来进行。在与S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)反应后，用例如羟胺使SATA脱乙酰化产生游离-SH基团。小分子表位，包括药物，按化学领域公知的方法衍生化。
巯基修饰的HBc VLP在使用前先进行羧酰胺甲基化(carboxamidomethylated)，以阻断衍生化后在VLP上的任何未反应巯基，从而防止VLP互相交联。羧酰胺甲基化通过使衣壳多肽颗粒与碘代乙酰胺反应来实现；过量的试剂通过凝胶过滤或透析除去。或者且优选地，巯基在其加到的肽上作为半胱氨酸硫醇存在，该半胱氨酸硫醇首先与双功能交联试剂反应。这样官能化的肽经纯化后与HBc VLP的N末端赖氨酸反应。类似的化学反应在美国专利6,231,864中有教导，该反应是赖氨酸残基首先加到HBc的免疫原性环中。
在实践中，通常是将稳定化带接头HBc VLP在缓冲液如pH值约7的磷酸盐缓冲液中提供。加入摩尔过量的溶于惰性溶剂的双功能试剂，该溶剂例如非质子有机溶剂如二甲基甲酰胺。于是发生HB衣壳VLP的衍生化。将过量的双功能试剂例如通过过滤除去。然后加入过量的待偶联到HB衣壳VLP的表位。于是发生偶联，将所得的由表位连接到修饰HB衣壳VLP组成的缀合物例如通过过滤进行回收。优选的是首先将肽表位衍生化，然后使过量的该衍生化的肽表位与稳定化VLP反应。
实施例6：将自结合肽化学连接到HB衣壳多肽的N末端或C末端
按照Clarke，EP0385610的方法和前面实施例所详述的方法，将在N末端或C末端带有1-6个另外的赖氨酸的、没有稳定性肽的HB衣壳多肽，例如CV-1048和其它多肽的衍生物，化学偶联到自结合肽。如在实施例1中，用分析型大小排阻层析法发现，所得的带N偶联或C偶联自结合肽的VLP比由未修饰CV-1048或其它HB衣壳多肽组成的VLP更加稳定。
实施例7：将FMDV VP1残基141-160加上C末端Cys残基组成的肽偶联到稳定化带N末端接头突出端的HB衣壳VLP
将例如以上实施例4所述的稳定化带合适N末端接头突出端的HB衣壳VLP，在两个连续蔗糖梯度上进行纯化，以5mg/ml的浓度在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中通过Sephadex
Figure A20068004052700741
G100柱。这些在10mM磷酸盐缓冲液中浓度为2mg/ml的修饰HB衣壳多肽是这样进行衍生化的：加入1/20体积的溶于干的二甲基甲酰胺的SMCC(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)，使得SMCC在VLP样品中的最终浓度相对于衣壳多肽为50倍摩尔过量。
在室温下30分钟后，将SMCC在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中过滤通过Sephadex
Figure A20068004052700742
G100进行除去。将刚溶解的、具有序列PNLRGDLQVLAQKVARTLPC(SEQ ID NO：291)的体外合成FMDV141-160Cys以1/10体积加入，以提供相对于衍生化的HBc多肽10倍摩尔过量的肽。在室温下搅拌2小时后，通过Sephadex
Figure A20068004052700743
G200过滤将未偶联的肽与这样衍生化的VLP分离。回收连接有肽的稳定化HB衣壳VLP。经分析型凝胶过滤层析法测定，这些VLP比基于CV-1048的同样加工的缺乏自结合肽的VLP更加稳定。
实施例8：将HRV2肽偶联到稳定化HB衣壳VLP
按照实施例7所述的程序，将包含NIm-II表位和具有序列
VKAETRLNPDLQPTC    SEQ ID NO：292
的HRV2肽偶联到带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳多肽VLP。回收连接有肽的VLP。如前所讨论，用分析型大小排阻层析法测定发现，这些VLP比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。
实施例9：HbsAg B细胞表位与带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP的偶联
按实施例7所述，将实施例4的带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP用等摩尔的SMCC在DMF中进行衍生化。通过实施例7的方法，将刚合成的、包含来自preS蛋白的HBsAg B细胞表位残基132-145加额外的C末端Cys的、具有序列
QDPRVRGLYFPAGGC    SEQ ID NO：293
的肽，与刚进行SMCC衍生化的带N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP进行反应。用分析型大小排阻层析法测定发现，包含自结合肽如亮氨酸拉链肽的VLP，比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。
实施例10：衍自噬菌体MS2的衣壳多肽的稳定化VLP
噬菌体MS2是光滑病毒科(Leviviridae)中的能感染细菌的成员。如Mastico(1993)J.Gen.Virol.，74：541-548和Brown(2002)Intervirology，45：371-380所教导，对RNA噬菌体MS2的衣壳蛋白的质粒表达载体进行修饰，以在衣壳蛋白基因当中在对应于残基15和16之间的位点引入独特的KpnI限制位点。在这个位点***编码肽的DNA寡核苷酸，可以生产出被表达为位于外部的发夹(exterior-locatedhairpin)的中央部分的、具有外来肽序列的嵌合MS2衣壳蛋白。还在3′末端用基因工程法引入编码衣壳多肽的C末端的独特限制位点。在这个位点***编码肽的DNA寡核苷酸，可以生产出独立于任何***的异源表位的带有C末端自结合肽的嵌合MS2衣壳蛋白。
在本实施例中，将编码人***状瘤病毒16的L1蛋白(对应于具有序列
PNDTFIVSTNPNTVTSSTPI
                    SEQ ID NO：294
的蛋白质)的表位的寡核苷酸***到MS2衣壳多肽编码序列中的KpnI位点中。
缺乏自结合肽的含表位衣壳多肽在大肠杆菌中自组装成基本上无RNA的VLP，其在提取后可容易地解开和重新组装。
将编码GCN4蛋白(GCN4-p1)的野生型亮氨酸拉链肽(具有序列RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER
                SEQ ID NO：295)
的寡核苷酸，***到用基因工程法引入在衣壳多肽编码序列的3′末端的位点中。这样，当在大肠杆菌中表达时，含表位的衣壳多肽的C末端融合到GCN4-p1肽。所得的VLP具有高度免疫原性，且用分析型大小排阻层析法测定发现比由缺乏自结合肽的相同融合多肽组成的VLP更加稳定。
实施例11：衍自在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisea)中表达的人多瘤病毒JC VP1的稳定化VLP
缺乏前12个氨基酸的人多瘤病毒JCV衣壳多肽(VP1)不会将宿主DNA包壳，尽管衣壳样结构的完整性得到保持。[Ou等，(2001)J.Med.Virol.64：366-73]。VP1的12个氨基末端氨基酸和16个羧基末端氨基酸对于病毒样颗粒的形成是非必需的，但VP1任一端的进一步截短会导致这一特性的丧失。[Ou等，(2001)J.Neurovirol.7：298-301]。将N末端12个氨基酸用GCN4-VL肽取代，该肽在溶液中作为N-乙酰化肽形成三聚体和二聚体；GCN4-VL亮氨酸拉链肽的序列是
RVKQLEDKVEELLSKVYHLENEVARLKKLVGER
                    SEQ ID NO：296。
所述取代是这样进行的：将编码该肽的杂交化互补寡核苷酸***到衣壳多肽编码质粒中，而不是仅仅在除去编码N末端12个氨基酸的DNA区段后使该质粒重新环化。当在酵母中从强诱导型pGAL1启动子表达时，经分析型大小排阻层析法测定发现，从嵌合衣壳多肽形成的空VLP比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。
实施例12：带有异源表位的稳定化禽兽棚病毒(Flock House Virus)VLP
按照Hall的美国专利6,171,591的方法，将表位***到罗达病毒(nodavirus)禽兽棚病毒衣壳蛋白残基205-209之间的外环中。在其它罗达病毒科(Nodaviridae)成员的每一个(如黑甲虫罗达(Black Beetle)病毒和日本库蚊罗达(Nodamura)病毒)的表面上，也发现相应的环。由于这类病毒在结构上的相似性，可以容易地进行类似的***。将N末端20个残基删除，以使其失去核酸结合能力；将编码GCN4-VL肽的合成寡核苷酸退火并***到表达载体中，以取代衣壳多肽N末端。将表达的VLP从杆状病毒表达***纯化出来，经分析型大小排阻层析法分析发现比不含自结合肽序列的在其它方面相似的VLP更加稳定。
实施例13：基于松皇蛾Ω(Nudaurelia capensis omega)病毒衣壳多肽类似物的稳定化VLP
对应于禽兽棚病毒的表位***位点的环也可见于相关的四病毒科(Tetraviridae)的表面上，因此将松皇蛾Ω病毒这种四病毒按类似于实施例13的方式进行修饰。将表位***在外环中的氨基酸残基380和381之间，该外环从衣壳多肽的Ig样结构域中的残基374延伸到残基382。[Munshi等，(1996)J.Mol.Biol.261：1-10]。来自四臂粘联蛋白(tetrabrachion)的能形成四聚体的肽[Stetefeld(2000)Nat.Struc.Biol.7：772-776]取代了Xtal结构所没有的N末端44个残基，以使VLP稳定化和减少核酸结合。用分析型大小排阻层析法测定所表达的VLP发现，从杆状病毒表达***获得的颗粒比缺乏四臂粘联蛋白(tetrabrachion)的能形成四聚体的肽的空衣壳更加稳定。
实施例14：衍自雀麦花叶病毒衣壳多肽的稳定化VLP
雀麦花叶病毒(BMV)是一种感染植物的病毒，是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的典型成员。如Price等的美国专利5,869,287所教导，当N末端25个残基被取代的BMV衣壳多肽在酵母中表达时，该取代(缺失)会消除核酸结合能力，但也会导致VLP稳定性降低。用具有序列
IFSLEQEKTRLLQQNTQLKRFIQEL  (SEQ ID NO：297).
的人AP-4蛋白亮氨酸拉链肽取代被缺失的残基，稳定性可以得到恢复，但核酸结合能力没有恢复。
实施例15：衍自芜菁皱病毒衣壳多肽的稳定化VLP
芜菁皱病毒(TCV)是豇豆花叶病毒属(comovirus)的成员。该衣壳多肽的40个N末端残基具有核酸结合能力，将其删去或者用GCN-4p1自结合亮氨酸拉链肽取代。当在酿酒酵母中在强诱导型GAL1启动子的控制下表达时，可通过用玻璃珠在VSB缓冲液[0.1M NaCl，0.1MNaOAc，10mM EDTA，pH 5.0]中进行旋涡搅拌来提取VLP。通过在pH7.2的50mM磷酸盐缓冲液中进行温育，将缺乏核酸结合域的TCV衍生VLP的稳定性与带有自结合肽的VLP的稳定性进行比较。按照实施例2进行分析型大小层析，证明自结合肽取代了N末端结构域的VLP比只进行缺失的VLP更加稳定。
实施例16：衍自人***瘤病毒16L1衣壳的稳定化VLP
人***瘤病毒16是***瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员。将自结合亮氨酸拉链肽
GCN4-VL RVKQLEDKVEELLSKVYHLENEVARLKKLVGER
(SEQ ID NO：298)
遗传融合到HPV 16L1的N末端。将表位例如HPV 16L2序列
LVEETSFIDAGAP(SEQ ID NO：299)
在残基351-355处***到免疫显性外环。已证实这种情况能增强外来肽在其存在于组装的VLP中时的免疫原性[Slupetzky等，(2001)J.Gen.Virol.82：2799-804]。使用杆状病毒表达***是因为Kirnbauer，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：12180-4发现这个***最佳。带有N末端亮氨酸拉链肽的VLP比缺乏自结合肽的相同VLP显著稳定得多，因此更具免疫原性。
实施例17：衍自诺瓦克病毒衣壳多肽的稳定化VLP
诺瓦克病毒是嵌杯样病毒科(Caliciviridae)家族的成员。衍自诺瓦克病毒衣壳多肽的VLP用杆状病毒表达***来产生。当这样产生出时，这些VLP组装成缺乏RNA的颗粒。因为残基228-530(整个外部P结构域)对于克隆形成来说是非必需的，故将它们从序列中缺失，同时用能形成二聚体的亮氨酸拉链取代N末端20个残基，以使B和C亚单位之间的相互作用稳定化。所得的缺乏P结构域的颗粒比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。
实施例18：衍自VP2人B19细小病毒主要衣壳的稳定化VLP
人B19细小病毒是细小病毒科(Parvoviridae)的成员。衍自B19VP2主要衣壳多肽的空VLP通过在昆虫细胞中在多角体启动子的控制下从杆状病毒表达载体表达VP2来产生。[Kajigaya等，(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.88：4646-4650]。将前25个氨基酸残基从N末端缺失，但不会破坏VLP自组装。[Kawase等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sri.69：6567-6571]。制备出这样的N末端缺失VP2的衍生物，其中VP2的N末端25个残基用c-Myc亮氨酸拉链自结合肽
YLSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQL  (SEQ ID NO：300).
取代。简单缺失VP2多肽和取代衍生物从杆状病毒载体表达后，将它们从昆虫细胞中提取出来。包含具有亮氨酸拉链的嵌合VP2多肽的VLP比包含简单缺失VP2多肽的VLP更加稳定。
实施例19：衍自辛德毕斯病毒衣壳的稳定化VLP
辛德毕斯病毒是披膜病毒科(Togaviridae)的成员。其衣壳多肽的N末端109个氨基酸残基牵涉到病毒粒子组装及核酸结合所需的衣壳多肽间相互作用。[Lin等，(2000)J.Virol.74：493-504]。为消除核酸结合和使从嵌合多肽组装的VLP稳定化，将衣壳多肽的N末端109个氨基酸用串连亮氨酸拉链自结合肽取代。在这个构建物中，***了两个自结合肽：N末端是GCN4-p1亮氨酸拉链肽，接着是五个甘氨酸的柔性接头区段，再接着是c-Myc亮氨酸拉链自结合肽。当按照Frolov[(1997)J.Virol.71：2819-2829]的方法在BHK细胞中表达时，带有取代衣壳多肽VLP的N末端109个氨基酸的双亮氨酸拉链的辛德毕斯衣壳多肽能够进行组装，而相应的N末端缺失衣壳多肽不能够进行组装。
实施例20：衍自Physalis mottle病毒衣壳的稳定化VLP
Physalis mottle病毒是芜菁黄花叶病毒属的成员。当按照Sastri[(1997)J.Mol.Biol.272：541-52]的方法在大肠杆菌在中表达缺失了N末端30个氨基酸残基的衣壳多肽时，VLP可容易地进行回收。也可以容易地从表达这样的衣壳多肽衍生物的大肠杆菌获得VLP，该衍生物中的N末端30个氨基酸残基被GCN4-VL亮氨酸拉链取代。这些VLP当从大肠杆菌提取出来时，在中性pH下比缺乏自结合肽的VLP更加稳定。
实施例21：衍自轮状病毒衣壳多肽的稳定化VLP
轮状病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)的成员。带有VP2的N末端92个氨基酸残基的大量取代的VLP可用痘苗载体在哺乳动物细胞中进行表达。这种VLP显示出核酸结合能力降低。[Charpilliene(2001)J.Biol.Chem.276：29361-29367]。为使轮状病毒VLP稳定化，将COMP五聚化结构域遗传融合到VP2的N末端至最大N末端融合体可接受的程度。当提取出来时，包含其残基1-92被COM自结合肽取代的VP2的VLP比包含缺失了残基1-92的VLP更加稳定。
实施例22：衍自烟草花叶病毒(TMV)衣壳的稳定化VLP
烟草花叶病毒(TMV)是烟草花叶病毒属的典型成员。在带有TMV基因组包装信号的RNA不存在下，TMV衣壳多肽单体在溶液中会自组装成双层中空圆盘(disk)，每个圆盘具有大约17个拷贝的衣壳多肽。氨基酸残基89-114形成暴露在这些圆盘和病毒颗粒的空芯(hollowcore)中的内环。这些残基的序列是
D TRNRI IEVENQ QSPTTAETLD ATRR  (SEQ IDNO：301)。
为使无RNA的圆盘稳定化，放入稳定性元件，使得这些元件在TMV CP圆盘的空芯当中发生相互作用。因此，将TMV L毒株的衣壳多肽(CP)工程改造成位置54和69处的赖氨酸变成甘氨酸，位置100处的谷氨酰胺(以上下划线处)变成赖氨酸充当接头位点。这样，在内环中，CP中只有一个赖氨酸。
将羧基形式的金属离子辅助自结合肽，如SEQ ID NO：1和2的那些肽，偶联到工程改造的TMV CP的内环赖氨酸接头，使得所产生的连接的工程改造TMV CP带有金属辅助自结合肽。衍生化的TMV CP在适当的金属离子存在下会自组装成双层圆盘。经分析型HPLC和离心测定发现，稳定化的双圆盘对温度和离子强度的变化的稳定性比从野生型TMV CP形成的圆盘更高。
如果需要，可将异源表位遗传改造成作为工程改造的CP的C末端突出端而存在。由于该C末端在晶体结构上是无序的，且在组装的CP的外表面上存在，该表位的结构可独立于TMV CP载体。
完全TMV L CP序列
1
msysitspsq fvflssvwad piellnvctn
31
slgnqfqtqq arttvqqqfs evwkpfpqst
61
vrfpgdvykv yrynavldpl itallgafdt
91
rnriievenq qspttaetld atrrvddatv
121
airsainnlv nelvrgtgly nqntfesmsg
151
lvwtsapas     SEQ ID NO：302
实施例23：衍自豇豆花叶病毒衣壳的稳定化VLP
豇豆花叶病毒是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)的典型成员。已证实豇豆花叶病毒的S衣壳多肽能容忍在位置22和23之间***异源肽。[Porta等，(1994)Virology 202：949-955]。对于本实施例，将来自脊髓灰质炎病毒的Sabin毒株的、对应于序列为
SASTKNKDKL(SEQ ID NO：303)
的VP1残基95-104的表位***在该位点，该***是用编码该表位和在其它情况下会丢失的S多肽残基18-22和23-26的退火互补寡核苷酸取代pMT7-FMDV-II的Nhe I/Aat II片段来进行。当CPMV S和L在昆虫细胞中表达时，获得了基本上无RNA的VLP。[Shanks(2000)J.Gen.Virol.81：3093-3097]。将具有序列
LKFRFRDIERSKRSVMVGHTATAA(SEQ ID NO：304)
的COMP肽融合到S多肽的N末端，所产生的VLP比由缺乏自结合肽的衣壳多肽组成的颗粒更加稳定。
实施例24：衍自酵母Ty1转座子衣壳的稳定化VLP
酵母Ty1转座子是假病毒科(Pseudoviridae)的成员。按照Kingsman的美国专利5,463,024的方法，将Ty1的TyA衣壳多肽进行修饰，使得具有序列
GELAEQKLEQALQKLA(SEQ ID NO：305)
的金属离子辅助可三聚化自结合肽通过遗传融合连接到衣壳多肽的羧基末端。使用了对应于残基286-381的最小颗粒形成性TyA多肽。VLP在酵母的无Ty1菌株，例如酿酒酵母MD40-4c(urd2，trp1，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15)中产生。
Ty-VLP如下进行纯化：使酵母细胞在30℃下选择性生长至密度约8x106个细胞/ml。然后通过低速离心收集细胞，在用冰预冷的水中洗涤一次，重新悬浮于TEN缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；2mM EDTA；140mM NaCl)中，浓度为1ml细胞/1升缓冲液。将细胞用玻璃珠(40目)在4℃下旋涡搅拌进行破碎，直到有超过70％的细胞破碎。将玻璃珠通过低速离心进行沉淀，然后收集上清液，通过在微量离心机中离心20分钟除去碎片。然后在4℃下以100,000g离心1小时，使Ty-VLP从上清液沉淀出来，将其在TEN缓冲液中重新悬浮过夜(约18小时)。将重新悬浮的Ty-VLP在微量离心机中4℃下离心15分钟，以除去细胞碎片，然后将上清液加样到15-45％(w/v)蔗糖梯度(在10mM Tris，pH 7.4；10nM NaCl中)，在15℃下以76,300g离心3小时。通过管的底部收集各流分，将峰流分取等分试样在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后对凝胶进行考马斯蓝染色鉴定峰流分。将峰流分在4℃下以100,000g离心1小时，以浓缩VLP。
在与适当的金属离子如Ru(III)温育后发现，带有自结合肽的VLP比缺乏自结合肽的VLP更加稳定。
实施例25：衍自丙型肝炎病毒衣壳的稳定化VLP
丙型肝炎病毒是黄病毒科(Flaviviridae)的成员。当按照Baumbert等，[(1998)J.Virol.72：3827-3836]的方法在昆虫细胞中表达时，其衣壳多肽形成VLP。向该黄病毒衣壳多肽的C末端加入能形成三聚体的自结合亮氨酸拉链肽GCN4-LL，该肽的序列为
RLKQLEDKLEELLSKLYHLENELARLKKLVGER
SEQ ID NO：306
在表达包含衣壳蛋白加自结合肽的VLP之后发现，嵌合VLP在磷酸缓冲盐水(0.9％ NaCl，50mM NaHPO4 pH 7.3)中比包含非修饰衣壳多肽的VLP更加稳定。
实施例26：衍自脊髓灰质炎病毒衣壳多肽的稳定化VLP
脊髓灰质炎病毒是小RNA病毒科(Picornaviridae)的成员。空衣壳是大多数小RNA病毒科感染的天然产物。只有衣壳前体P1和病毒蛋白酶在能使衣壳稳定化的化合物吡罗达韦的存在下一起共表达并进行纯化，才在酿酒酵母中形成具有天然抗原性的空衣壳。[Rombaut(1997)J.Gen.Virol.78：1829-1832]。向P1(其随后在体内被3CD蛋白酶切割变成VP1 thru 4)的C末端加入金属离子辅助自结合肽，该肽前面有五个甘氨酸充当柔性接头；所得的C末端添加具有序列GGGGGGLAQKLLEALQKALA(SEQ ID NO：307)。在吡罗达韦的存在下在酵母中表达嵌合多肽并从中进行纯化时，获得了带有金属离子辅助自结合肽的空脊髓灰质炎病毒衣壳。在与适当的金属离子如Ru+3一起温育后发现，相对于没有金属离子的相同VLP或者包含没有自结合肽的脊髓灰质炎病毒衣壳多肽的VLP，这些衣壳的稳定性显著增加。
实施例27：衍自麻疹病毒衣壳的稳定化VLP
麻疹病毒是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成员。按照Warnes[Gene(1995)160：173-178]的方法，在大肠杆菌中表达编码核衣壳(衣壳)多肽的麻疹病毒(MV)基因。在pTrc99c质粒中在tac启动子控制下表达完整N基因产生出正确大小(60kDa)的蛋白质，该蛋白质代表大约4％的总细胞蛋白质，能被已知的麻疹阳性人血清识别。副粘病毒核衣壳所特有的“鲱鱼鱼骨”结构，在进行了电子显微镜检查的破碎细胞中容易识别到。将编码金属离子辅助自结合肽(该肽序列为GGGGGGLAQKLLEALQKALA(SEQ ID NO：308)的基因——该基因前面是编码五个充当柔性接头的甘氨酸的核酸序列——框内连接到N基因的C末端。在大肠杆菌中表达嵌合多肽并从中进行纯化后，获得了带有金属离子辅助自结合肽的麻疹病毒衣壳。在与适当的金属离子如Ru+3一起温育后发现，相对于没有金属离子的相同VLP或者包含没有自结合肽的麻疹病毒衣壳多肽的VLP，这些衣壳的稳定性显著增加。
实施例28：衍自A型流感病毒衣壳的稳定化VLP
流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。其N末端189个氨基酸残基牵涉到RNA结合。用杆状病毒表达***在昆虫细胞中产生缺失了N末端RNA结合域的流感A核衣壳多肽，获得VLP。为使VLP稳定化，用前述的GCN4-p1亮氨酸拉链自结合肽取代N末端RNA结合域。当带有自结合肽的VLP在昆虫细胞中表达时，用于嵌合衣壳蛋白构建物的示例性表位和接头见下：
用于嵌合衣壳蛋白构建物的示例性表位和接头
表位                              参考文献
FMDV O.sub.1株的VP1的残基141-160  美国专利5,874,087
       VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO：309)
自美国专利6171591
B细胞表位
水疱性口腔炎病毒(VSV)
        Kreis(1986)EMBO J.5：931-941
G糖蛋白
        Kolodziej(1991)Meth.Enz.194：508-519
毒株：ts-045VSV印第安纳血清型
    YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO：310)
邻接B细胞和T细胞表位
牛呼吸道合胞病毒(BRSV)
        Walravens等，(1990)J.Gen Virol.71：3009-3014
F蛋白
Bourgeois等，(1991)J Gen.Virol.72：1051-1058
毒株：RB94
    DKBLLPKVNNHDCQISITIATVIEFQQ(SEQ ID NO：311)
邻接B细胞和T细胞表位
人呼吸道合胞病毒(RSV)        F蛋白
毒株：RSS-2(亚型A)
       DKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQ(SEQ ID NO：312)
邻接B细胞和T细胞表位
人呼吸道合胞病毒(RSV)        F蛋白
毒株：18537(亚型B)
    DKRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQ(SEQ ID NO：313)
T细胞表位
人呼吸道合胞病毒(RSV)，和
牛呼吸道合胞病毒(BRSV)
F蛋白
毒株：RSS-2(亚型A)(RSV)
18537(亚型B)(RSV)，和
RSS-2(亚型A)(BRSV)
        FPSDEF[100％序列保守](SEQ ID NO：314)
B细胞表位
乙型肝炎病毒(HBV)
    Neurath等，(1986)Vaccine 4：35
preS2残基132-145
    Itoh等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sex.83：9174
    QDPRVRGLYFPAGG(SEQ ID NO：315)*用以下表位制备的双嵌合体
重叠Th和CTL表位
乙型肝炎病毒(HBV)
    Franco等，(1997)J.Immunol.159：2001-2008
HbsAg残基178-204
    Greenstein等，(1992)J.Immunol.148：3970
    LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNF(SEQ ID NO：316)
自Cooper等的美国专利6,174,528
A型链球菌表位
链球菌M蛋白p145氨基酸337-356
    LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO：317)
自美国专利6,060,064
HIV-1分离物的V3环：
BH10 SNCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISG(SBQID NO：318)
HXBII SNCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISG(SEQID NO：319)
MN SNCTRPNyNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHCNISG(SEQ IDNO：320)
MAL SNCTRPGNNTRRGIHFGPGQALYTTGIVDIRRAYCTING(SEQ IDNO：321)
RF SNCTRPNNNTRKSITKGPGRVIYATGQIIGDIRAHCNIiSGS(SEQ IDNO：322)
ELI STCARPYQNTRQRTPIGLGQSLYTTRSRSIIGQAHCNISG(SEQ IDNO：323)
MAL(var)SNCTRPGNNTRRGIHFGPGQALYTTGIVDEIRRAYCNISG(SEQID NO：324)
RF(var)SNCTRPNNTRKSITKQRGPGRVLYATGQIIGDIRKAHCNSIG(SEQID NO：325)
ELI(var)STCARPYQNTRQRTPIGLGQSLYTTRGRTKIIGQAHCNISG(SEQID NO：326)
自美国专利6,110,466
HIV-1gp41的氨基酸735-752
Dagleish，A.G等，(1988)Virology 165：209-215；
Chahn，T.C.等，(1986)EMBO J.5：3065-3071
DRPEGIEEEGGERDRDRSD(SEQ ID NO：327)
人鼻病毒14的VP1的氨基酸85-99
Lomonossoff等的美国专利6,110,466
PATGIDNHREAKLD(SEQ ID NO：328)
T细胞表位
恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)LSA-I T1表位
Heal等，(2000)Vaccine 18：251-258
LTMSNVKNVSQTMFKSLLRNLGVS(SEQ ID NO：329)
在cp的G14和T15之间向M2中的***
Mastico等，1993 Intervirology 74：541-548
HA9  YPYDVPDYA(SEQ ID NO：330)
Wilson等，(1984)Cell 37：767-778
IgE  FVPFGSKTK(SEQ ID NO：331)
Stanworth等，(1990)Lancet 336：1279-1281
Mal(表面抗原)NANPNANPNANP(SEQ ID NO：332)
Greenwood等，(1991)J.Mol.Biol.220：821-827
HPV L1 PNDTFIVSTNPNTVTSSTPI(SEQ ID NO：333)
Dillner等，(1990)Int.J.Cancer 45：529-535
HPV L2 KGSPCTNVAVNPGDCPPLDL(SEQ ID NO：334)
Javaherian等，(1989)Proc.Naatl.Acad.Sci.86：6768-6772
HIV gp120 NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG(SEQ ID NO：335)
B细胞和T细胞表位
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK菌毛蛋白氨基酸82-104
Smart等，(1988)Infec.Immun.56：18-23
GTIALKPDPADGTADITLTFTM(SEQ ID NO：336)
其它***：
生物素结合肽(自美国专利6,380,364)
GGGCSWAPPFKASC(SEQ ID NO：337)
GGGRGEFTGTYITAVT(SEQ ID NO：338
本文引述的每个专利和文章通过引用结合到本文中。名词“一”包括“一个或多个”的含义。
前文的描述和实施例是示例说明而非限制本发明。本领域技术人员还可以轻而易举地做出落入本发明精神和范围内的其它变化方案。
序列表
<110>Birkett，Ashley J.
Gamson，Edward P.
<120>STABILIZED VIRUS-LIKE PARTICLES AND表位DISPLAY SYSTEMS
<130>9720/98034
<140>US 11/507,083
<141>2006-08-18
<160>338
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端乙酰化且C端为COHN2的自组装肽
<400>1
Gly Leu Ala Gln Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gln Lys Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N端乙酰化且C端为COHN2的自组装三螺旋肽
<400>2
Gly Glu Leu Ala Glu Gln Lys Leu Glu Gln Ala Leu Gln Lys Leu Ala
1               5                   10                  15
<210>3
<211>183
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>3
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>4
<211>185
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>5
<211>185
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>6
<211>183
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>6
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180
<210>7
<211>183
<212>PRT
<213>土拨鼠
<400>7
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu
    50                  55                  60
Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln
65                  70                  75                  80
Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln
            100                 105                 110
His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys
            180
<210>8
<211>217
<212>PRT
<213>地松鼠
<400>8
Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
        35                  40                  45
Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg
            100                 105                 110
Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln
        115                 120                 125
Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr
                165                 170                 175
Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
        195                 200                 205
Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys
    210                 215
<210>9
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码流感A M2外域的DNA
<400>9
aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa    60
tgatagctct gacgagct                                                  78
<210>10
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽GCN4-P1
<400>10
Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>11
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽MAX
<400>11
Tyr Gln Tyr Met Arg Lys Asn His Thr His Gln Gln Asp Ile Asp Asp
1               5                   10                  15
Leu Lys Arg Gln Asn Ala Leu Leu Glu Gln Gln Val Arg Ala Leu Glu
            20                  25                  30
Lys Ala Arg
        35
<210>12
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>12
Arg Lys Asn Asp Thr Leu Gln Gln Asp Ile Asp Asp Leu Lys Arg Gln
1               5                   10                  15
Asn Ala Leu Leu Glu Gln Gln Val Arg Ala Leu Glu Lys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>13
<21l>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>13
Tyr Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu
            20                  25                  30
<210>14
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>14
Tyr His Ser Val Gln Ala Glu Glu His Gln Leu Leu Leu Glu Lys Glu
1               5                   10                  15
Lys Leu Gln Ala Arg Gln Gln Gln Leu Leu Lys Lys Ile Glu His Ala
            20                  25                  30
<210>15
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>15
Leu Gln Ala Leu Val Gly Ala Glu Lys Arg Met Ala Thr Glu Lys Arg
1               5                   10                  15
Gln Leu Arg Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu
            20                  25                  30
<210>16
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>16
Ile Phe Ser Leu Glu Gln Glu Lys Thr Arg Leu Leu Gln Gln Asn Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Arg Phe Ile Gln Glu Leu
            20                  25
<210>17
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>17
Ile Gln Glu Leu Arg Gln Ser Asn His Gln Leu Gln Leu Asp Asn Asp
1               5                   10                  15
Val Leu Arg Gln Gln Val Glu Asp Leu Lys Asn Lys Asn Leu Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Leu Ser Glu Glu Leu Gln Gly Leu Asp
        35                  40
<210>18
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>18
Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asp Lys Ile Glu Glu Leu Leu Ser Lys Ile
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Ile Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>19
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>19
Arg Ile Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
1               5                   10                  15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>20
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>20
Arg Leu Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>21
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>21
Arg Val Lys Gln Ile Glu Asp Lys Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Val Ala Arg Ile Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>22
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>22
Arg Leu Lys Gln Val Glu Asp Lys Leu Glu Glu Val Leu Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
Tyr His Val Glu Asn Glu Leu Ala Arg Val Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>23
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>23
Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>24
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽GCN4-LL
<400>24
Arg Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Leu Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>25
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>25
Gly Leu Ala Gln Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gln Lys Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
<210>26
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>26
Gly Glu Leu Ala Glu Gln Lys Leu Glu Gln Ala Leu Gln Lys Leu Ala
1               5                   10                  15
<210>27
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽RHCC
<400>27
Gly Ser Ile Ile Asn Glu Thr Ala Asp Asp Ile Val Tyr Arg Leu Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Ile Asp Asp Arg Tyr Glu Ser Leu Lys Asn Leu Ile Thr Leu
            20                  25                  30
Arg Ala Asp Arg Leu Glu Met Ile Ile Asn Asp Asn Val Ser Thr Ile
        35                  40                  45
Leu Ala Ser Ile
    50
<210>28
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>28
Met Asp Leu Ala Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Lys Glu Ile
            20                  25                  30
Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys
        35                  40                  45
<210>29
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>29
Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Gln Asp Val Arg Asp Trp Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr
            20                  25                  30
Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys
        35                  40
<210>30
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>自结合肽
<400>30
Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu
            20                  25
<210>31
<211>15
<212>PRT
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>31
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>32
<211>35
<212>PRT
<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400>32
Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val
            20                  25                  30
Gln Gln Ala
        35
<210>33
<211>27
<212>PRT
<213>小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)
<400>33
Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala
            20                  25
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>34
Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>35
<211>42
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>35
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile
1               5                   10                  15
Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>36
<211>42
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>36
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile
1               5                   10                  15
Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>37
<211>41
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>37
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Thr Ile
            20                  25                  30
Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>38
<211>39
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>38
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Arg Arg Gly Ile His Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr Gly Ile Val Asp Ile Arg Arg
            20                  25                  30
Ala Tyr Cys Thr Ile Asn Gly
        35
<210>39
<211>41
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>39
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Arg Val Ile Tyr Ala Thr Gly Gln Ile Ile Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Arg Ala His Cys Asn Leu Ser Gly Ser
        35                  40
<210>40
<211>40
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>40
Ser Thr Cys Ala Arg Pro Tyr Gln Asn Thr Arg Gln Arg Thr Pro Ile
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Gln Ser Leu Tyr Thr Thr Arg Ser Arg Ser Ile Ile Gly
            20                  25                  30
Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>41
<211>40
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>41
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Arg Arg Gly Ile His Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr Gly Ile Val Asp Glu Ile Arg
            20                  25                  30
Arg Ala Tyr Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>42
<211>42
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>42
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gln
1               5                   10                  15
Arg Gly Pro Gly Arg Val Leu Tyr Ala Thr Gly Gln Ile Ile Gly Asp
            20                  25                  30
Ile Arg Lys Ala His Cys Asn Ser Ile Gly
        35                  40
<210>43
<211>41
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>43
Ser Thr Cys Ala Arg Pro Tyr Gln Asn Thr Arg Gln Arg Thr Pro Ile
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Gln Ser Leu Tyr Thr Thr Arg Gly Arg Thr Lys Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>44
<211>31
<212>PRT
<213>***病毒
<400>44
Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro
            20                  25                  30
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>45
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys
1               5                   10
<210>46
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>46
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
            20
<210>47
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>47
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>48
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>48
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>49
Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile
1               5                   10                  15
Glu Leu Glu
<210>50
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>50
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>51
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>51
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>52
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>52
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>53
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>53
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>54
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>54
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>55
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>55
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>56
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>56
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>57
<211>35
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>57
Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
1               5                   10                  15
Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu
            20                  25                  30
Trp Gly Ile
        35
<210>58
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>58
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>59
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>59
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>60
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>60
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>61
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>61
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>62
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>62
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
            20
<210>63
<211>46
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>63
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>64
<211>69
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>64
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
65
<210>65
<211>46
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>65
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp
        35                  40                  45
<210>66
<211>69
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>66
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro
            20                  25                  30
Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala
    50                  55                  60
Asn Asp Ser Ser Asp
    65
<210>67
<211>19
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>67
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp
<210>68
<211>38
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>68
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp
        35
<210>69
<211>57
<212>PRT
<213>流感A病毒
<400>69
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg
            20                  25                  30
Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp
        35                  40                  45
Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
    50                  55
<210>70
<211>23
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置5为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置6到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可为任何天然氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置15不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置15到19不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置15到20不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到22不存在.
<400>70
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>71
<211>47
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置5为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置6到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa在位置8为谷氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置15不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置15到19不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置15到20不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到22不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa在位置24为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置15到23不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa在位置25为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在
位置26到31不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa在位置26为亮氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置27到31不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa在位置27为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置28到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa在位置28为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置29到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa在位置29为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置30到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa在位置30为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置31不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa在位置31为谷氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Xaa在位置38为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>Xaa在位置39为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置38不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>Xaa在位置40为不存在或存在，如果存在Xaa在位置40为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置40为存在则位置38到39不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>Xaa在位置41为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa
在位置38到40不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>Xaa在位置42为不存在或存在，如果存在Xaa在位置42为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置42为存在则位置38到41不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>Xaa在位置43为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置38到42不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>Xaa在位置44为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到43不存在.
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>Xaa可为任何天然氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>Xaa在位置46为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到45不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>Xaa在位置47为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到46不存在.
<400>71
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>72
<211>70
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置5为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置6到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa在位置8为谷氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置15不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在
位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置15到19不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置15到20不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置15到22不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa在位置24为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置15到23不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa在位置25为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置26到31不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa在位置26为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置27到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa在位置27为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置28到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa在位置28为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置29到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa在位置29为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置30到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa在位置30为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置31不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa在位置31为谷氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Xaa在位置38为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>Xaa在位置39为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置38不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>Xaa在位置40为不存在或存在，如果存在Xaa在位置40为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置40为存在则位置38到39不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>Xaa在位置41为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa在位置38到40不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>Xaa在位置42为不存在或存在，如果存在Xaa在位置42为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置42为存在则位置38到41不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>Xaa在位置43为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置38到42不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>Xaa在位置44为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到43不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>Xaa在位置45为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到44不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>Xaa在位置46为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到45不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>Xaa在位置47为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到46不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>Xaa在位置48为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置49到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>Xaa在位置49为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置50到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>Xaa在位置50为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置51到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>Xaa在位置51为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置52到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>Xaa在位置52为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置53到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>Xaa在位置53为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置54不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>Xaa在位置54为谷氨酸或不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>Xaa在位置61为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>Xaa在位置62为甘氨酸或不存在.如果是甘氨酸则Xaa在位置61不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>Xaa在位置63为不存在或存在，如果存在Xaa在位置63为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置63为存在则位置61到62不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>Xaa在位置64为精氨酸或不存在.如果是精氨酸则Xaa在位置61到63不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>Xaa在位置65为不存在或存在，如果存在Xaa在位置65为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置65为存在则位置61到64不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>Xaa在位置66为天冬酰胺或不存在.如果是天冬酰胺则Xaa在位置61到65不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>Xaa在位置67为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置61到66不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>Xaa在位置68为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在
位置61到67不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>Xaa在位置69为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置61到68不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>Xaa在位置70为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置61到69不存在.
<400>72
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>73
<211>24
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置4为苏氨酸或脯氨酸或不存在.如果是苏氨酸或脯氨酸则Xaa在位置6到8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa在位置8为谷氨酸或天冬氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa在位置10为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa在位置11为异亮氨酸或苏氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa在位置13为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa在位置14为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置16不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸或赖氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa为位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺，丝氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘氨酸则Xaa为位置15到19不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬氨酸或甘氨酸则Xaa为位置15到20不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到22不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa在位置24为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa为位置15到23不存在.
<400>73
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>74
<211>47
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置4为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置6到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa在位置8为谷氨酸或天冬氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa在位置10为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa在位置11为异亮氨酸或苏氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa在位置13为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa在位置14为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置16不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸或赖氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa为位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺，丝氨酸或甘氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸则Xaa为位置15到19不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬氨酸或甘氨酸则Xaa为位置15到20不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到22不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa在位置24为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa为位置15到23不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa在位置25为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置26到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa在位置26为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置27到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa在位置27为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置28到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa在位置28为苏氨酸，脯氨酸或不存在.如果是苏氨酸或脯氨酸则Xaa在位置29到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa在位置29为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置30到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa在位置30为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置31不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa在位置31为谷氨酸或天冬氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>Xaa在位置33为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa在位置34为异亮氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>Xaa在位置36为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>Xaa在位置37为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Xaa在位置38为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>Xaa在位置39为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置38不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>Xaa在位置40为不存在或存在，如果存在Xaa在位置40为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置40为存在则位置38到39不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>Xaa在位置41为精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸或赖氨酸则Xaa在位置38到40不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>Xaa在位置42为不存在或存在，如果存在Xaa在位置42为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置42为存在则位置38到41不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>Xaa在位置43为天冬酰胺，丝氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸则Xaa在位置38到42不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>Xaa在位置44为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是
天冬氨酸或甘氨酸则Xaa在位置38到43不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>Xaa在位置45为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到44不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>Xaa在位置46为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到45不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>Xaa在位置47为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到46不存在.
<400>74
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
<210>75
<211>70
<212>PRT
<213>流感A病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1是甲硫氨酸或不存在.如果是甲硫氨酸则Xaa在位置2到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置3到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa在位置3为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置4到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置5到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa在位置5为苏氨酸或不存在.如果是苏氨酸则Xaa在位置6到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa在位置6为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置7到8不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa在位置7为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置8不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa在位置8为谷氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa在位置10为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa在位置11为异亮氨酸或苏氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa在位置13为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa在位置14为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa在位置15为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa在位置16为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置16不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa在位置17为不存在或存在，如果存在Xaa在位置17为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置17为存在则位置15到16不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa在位置18精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸或赖氨酸则Xaa在位置15到17不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa在位置19为不存在或存在，如果存在Xaa在位置19为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa为位置19为存在则位置15到18不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa在位置20为天冬酰胺，丝氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸则Xaa为位置15到19不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa在位置21为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬氨酸或甘氨酸则Xaa为位置15到20不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa在位置22为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到21不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa在位置23为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa为位置15到22不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa在位置24为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa为位置15到23不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa在位置25为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置26到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa在位置26为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置27到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa在位置27为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置28到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa在位置28为苏氨酸，脯氨酸或不存在.如果是苏氨酸或脯氨酸则Xaa在位置29到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa在位置29为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置30到31不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa在位置30为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置31不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa在位置31为谷氨酸或天冬氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>Xaa在位置33为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa在位置34为异亮氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>Xaa在位置36为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(37)..(37)
<223>Xaa在位置37为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Xaa在位置38为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>Xaa在位置39为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置38不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(40)..(40)
<223>Xaa在位置40为不存在of存在，如果存在Xaa在位置40为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置40为存在则位置38到39不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>Xaa在位置41为精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸or赖氨酸则Xaa在位置38到40不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>Xaa在位置42为不存在或存在，如果存在Xaa在位置42为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置42为存在则位置38到41不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>Xaa在位置43为天冬酰胺，丝氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘氨酸则Xaa在位置38到42不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(44)..(44)
<223>Xaa在位置44为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬氨酸或甘氨酸则Xaa在位置38到43不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>Xaa在位置45为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到44不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>Xaa在位置46为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置38到45不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(47)..(47)
<223>Xaa在位置47为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置38到46不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(48)..(48)
<223>Xaa在位置48为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置49到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>Xaa在位置49为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置50到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>Xaa在位置50为亮氨酸或不存在.如果是亮氨酸则Xaa在位置51到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(51)..(51)
<223>Xaa在位置51为苏氨酸，脯氨酸或不存在.如果是苏氨酸或脯氨酸则Xaa在位置52到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>Xaa在位置52为谷氨酸或不存在.如果是谷氨酸则Xaa在位置53到54不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(53)..(53)
<223>Xaa在位置53为缬氨酸或不存在.如果是缬氨酸则Xaa在位置54不为不存在.
<220>
<221>MISCFEATURE
<222>(54)..(54)
<223>Xaa在位置54为谷氨酸或天冬氨酸或不存在
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(56)..(56)
<223>Xaa在位置56为脯氨酸，亮氨酸或组氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(57)..(57)
<223>Xaa在位置57为异亮氨酸或苏氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(59)..(59)
<223>Xaa在位置59为天冬酰胺或丝氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(60)
<223>Xaa在位置60为谷氨酸或甘氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>Xaa在位置61为色氨酸或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>Xaa在位置62为甘氨酸，谷氨酸或不存在.如果是甘氨酸或谷氨酸则Xaa在位置61不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(63)..(63)
<223>Xaa在位置63为不存在of存在，如果存在Xaa在位置63为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置63为存在则位置61到62不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(64)..(64)
<223>Xaa在位置64为精氨酸，赖氨酸或不存在.如果是精氨酸or赖氨酸则Xaa在位置61到63不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>Xaa在位置65为不存在或存在，如果存在Xaa在位置65为半胱氨酸，丝氨酸或丙氨酸.如果Xaa在位置65为存在则位置61到64不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(66)..(66)
<223>Xaa在位置66为天冬酰胺，丝氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬酰胺或丝氨酸或甘氨酸则Xaa在位置61到65不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>Xaa在位置67为天冬氨酸，甘氨酸或不存在.如果是天冬氨酸或甘氨酸则Xaa在位置61到66不为不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>Xaa在位置68为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置61到67不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(69)..(69)
<223>Xaa在位置69为丝氨酸或不存在.如果是丝氨酸则Xaa在位置61到68不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>Xaa在位置70为天冬氨酸或不存在.如果是天冬氨酸则Xaa在位置61到69不存在.
<400>75
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
            20                  25                  30
Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>流感B病毒
<400>76
Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile
1               5                   10                  15
Arg
<210>77
<211>6
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>77
Met Leu Glu Pro Phe Gln
1               5
<210>78
<211>6
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>78
Met Leu Glu Pro Leu Gln
1               5
<210>79
<211>142
<212>PRT
<213>鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)
<400>79
Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala
1               5                   10                  15
Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys
            20                  25                  30
Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn
    50                  55                  60
Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser
                85                  90                  95
Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys
        115                 120                 125
Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp
    130                 135                 140
<210>80
<211>19
<212>PRT
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>80
Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe
1               5                   10                  15
Gly Gly Tyr
<210>81
<211>11
<212>PRT
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>81
Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu
1               5                   10
<210>82
<211>16
<212>PRT
<213>流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)
<400>82
Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr
1               5                   10                  15
<210>83
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)
<400>83
Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>84
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)
<400>84
Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr
            20                  25
<210>85
<211>28
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)
<400>85
Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr
            20                  25
<210>86
<211>25
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
<400>86
Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn
1               5                   10                  15
Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr
            20                  25
<210>87
<211>20
<212>PRT
<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
<400>87
Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Tyr Val
            20
<210>88
<211>21
<212>PRT
<213>克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)
<400>88
Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
Ala Thr Ala Pro Ala
            20
<210>89
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>89
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
<210>90
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>90
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
            20
<210>91
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>91
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>92
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>92
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro
            20
<210>93
<211>28
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>93
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro
            20                  25
<210>94
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>94
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val
            20
<210>95
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>95
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro
            20
<210>96
<211>24
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>96
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>97
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>97
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val
<210>98
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>98
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro
            20
<210>99
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>99
Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Pro Asn Ala
            20
<210>100
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>100
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
<210>101
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>101
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro
<210>102
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>102
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1               5                   10                  15
Asp Pro Asn Ala
            20
<210>103
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>103
Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gly
<210>104
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>104
Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro
1               5                   10                  15
Ala Gly
<210>105
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>105
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>106
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>106
Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>107
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>108
<211>18
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>108
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly
<210>109
<211>22
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>109
Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Gln Glu Gly Gly Ala Ala
            20
<210>110
<211>36
<212>PRT
<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>110
Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp
            20                  25                  30
Asp Gln Pro Gly
        35
<210>111
<211>16
<212>PRT
<213>伯格鼠疟原虫(Plasmodium berghei)
<400>111
Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn
1               5                   10                  15
<210>112
<211>24
<212>PRT
<213>约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)
<400>112
Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro
            20
<210>113
<211>15
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>113
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys
1               5                   10                  15
<210>114
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)
<400>114
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>弗氏志贺菌(Shigella flexneri)
<400>115
Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys
1               5
<210>116
<211>15
<212>PRT
<213>呼吸道合孢病毒
<400>116
Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys
1               5                   10                  15
<210>117
<211>25
<212>PRT
<213>溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)
<400>117
Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile
1               5                   10                  15
Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln
            20                  25
<210>118
<211>34
<212>PRT
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>118
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg
            20                  25                  30
Val Asp
<210>119
<211>34
<212>PRT
<213>曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)
<400>119
Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg
            20                  25                  30
Val Asp
<210>120
<211>26
<212>PRT
<213>牛抑制素
<400>120
Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala
            20                  25
<210>121
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>121
Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala
<210>122
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>122
His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val
1               5                   10                  15
Glu
<210>123
<211>17
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>123
Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ile
<210>124
<211>14
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>124
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn
1               5                   10
<210>125
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>125
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>126
<211>18
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>126
Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn
<210>127
<211>42
<212>PRT
<213>Alzheimer氏症b-淀粉样蛋白
<400>127
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
<210>128
<211>17
<212>PRT
<213>Alzheimer氏症b-淀粉样蛋白
<400>128
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu
<210>129
<211>11
<212>PRT
<213>Alzheimer氏症b-淀粉样蛋白
<400>129
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
1               5                   10
<210>130
<211>33
<212>PRT
<213>Alzheimer氏症b-淀粉样蛋白
<400>130
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly
<210>131
<211>32
<212>PRT
<213>alzheimer氏症b-淀粉样蛋白
<400>131
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
<210>132
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>132
Tyr Val Ala Val Glu Asn Gly Val Ala Lys Lys Val Ala
1               5                   10
<210>133
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>133
His Phe Val Gln Gln Thr Pro Lys Ser Gln Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>134
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>134
His Val Val Val Asn Asn Lys Val Ala Thr His Val Pro
1               5                   10
<210>135
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>135
Pro Leu Gln Asn Ile Gln Pro Gln Val Thr Lys Arg
1               5                   10
<210>136
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>136
Ala Gln Ala Ala Asn Gly Gly Ala Ala Ser Gly Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>137
Tyr Val Asp Glu Gln Ser Lys Tyr His Ala
1               5                   10
<210>138
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>138
His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Gln Pro Pro Thr Leu Val Pro
1               5                   10                  15
<210>139
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>139
Lys Pro Ser Ser Thr Asn Ala Lys Thr Gly Asn Lys Val Glu Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>140
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>140
Tyr Trp Thr Thr Val Asn Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Thr Phe Val
1               5                   10                  15
Pro
<210>141
<211>11
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>141
Tyr Val Asp Glu Lys Lys Lys Met Val His Ala
1               5                   10
<210>142
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>142
His Tyr Thr Arg Gln Asn Asn Ala Asp Val Phe Val Pro
1               5                   10
<210>143
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>143
Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Asn Asn Asn Leu Thr Leu Val Pro
1               5                   10
<210>144
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>144
Pro Pro Gln Lys Asn Gln Ser Gln Pro Val Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>145
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>145
Pro Pro Ser Lys Gly Gln Thr Gly Asn Lys Val Thr Lys Gly
1               5                   10
<210>146
<211>14
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>146
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
1               5                   10
<210>147
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>147
Gln Pro Gln Thr Ala Asn Thr Gln Gln Gly Gly Lys Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>148
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>148
Gln Pro Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>149
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>149
Gln Pro Ser Lys Ala Gln Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>150
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>150
Pro Pro Ser Ser Asn Gln Gly Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gly Asn Thr
1               5                   10                  15
Val Thr Lys Ala
            20
<210>151
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>151
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Lys Thr Gly Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>152
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>152
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Gly Thr Asn Asn Asn Gln Val Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>153
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>153
Pro Pro Ser Lys Ser Gln Pro Gly Gln Val Lys Val Thr Lys Val Thr
1               5                   10                  15
Lys Ala
<210>154
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>154
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Ser Thr Asn Gly Gln Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>155
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>155
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Ala Pro Ser Lys Ser Gln Gly Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>156
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>156
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Val Tyr Val Asp Asn Lys Val Ala Lys
1               5                   10                  15
His Val Ala
<210>157
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>157
Ser Ala Tyr Thr Pro Ala His Phe Val Gln Asn Lys Gln Asn Asn Asn
1               5                   10                  15
Pro Thr Leu Val Pro
            20
<210>158
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>158
Val Glu Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu
1               5                   10
<210>159
<211>12
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>159
Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr Pro Ala
1               5                   10
<210>160
<211>22
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>160
Gln Leu Gln Leu Thr Glu Pro Pro Ser Lys Asn Gln Ala Gln Thr Gln
1               5                   10                  15
Asn Lys Val Thr Lys Ala
            20
<210>161
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>161
Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
<210>162
<211>31
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>162
Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Glu Leu Phe Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Ser Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His
            20                  25                  30
<210>163
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>163
Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp
1               5                   10                  15
Asp Glu
<210>164
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>164
Gly Arg Asn Ala Phe Glu Leu Phe Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
Gln
<210>165
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>165
Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile Arg Thr Lys Ile
1               5                   10                  15
<210>166
<211>13
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>166
Thr Leu Val Pro Ala Val Val Gly Lys Pro Gly Ser Asp
1               5                   10
<210>167
<211>17
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>167
His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro
1               5                   10                  15
Arg
<210>168
<211>15
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>168
Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>169
<211>18
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>169
Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser
1               5                   10                  15
Gln Thr
<210>170
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>170
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>171
<211>21
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>171
Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Val Lys
            20
<210>172
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>172
Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>173
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>173
Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5
<210>174
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>174
Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>175
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>175
Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>176
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>176
Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>177
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>177
Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>178
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>178
Phe Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>179
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>179
Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>180
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>180
Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro
1               5                   10                  15
Ala
<210>181
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>181
Met Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
1               5                   10
<210>182
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>182
Met Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
1               5                   10
<210>183
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>183
Met Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
1               5
<210>184
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>184
Met Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
1               5                   10
<210>185
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>185
Met Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr
1               5
<210>186
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>186
Met Pro Gly Thr Ile Asn Ile
1               5
<210>187
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>187
Met Phe Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>188
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>188
Met Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val
1               5
<210>189
<211>18
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>189
Met Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Pro Ala
<210>190
<211>27
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>190
Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe
            20                  25
<210>191
<211>21
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>191
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1               5                   10                  15
His Gln Leu Asp Pro
            20
<210>192
<211>8
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>192
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1               5
<210>193
<211>10
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>193
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu
1               5                   10
<210>194
<211>26
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>194
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1               5                   10                  15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
            20                  25
<210>195
<211>14
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>195
Met Gln Trp Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro
1               5                   10
<210>196
<211>14
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>196
Met Gln Trp Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro
1               5                   10
<210>197
<211>6
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>197
Gln Asp Pro Arg Val Arg
1               5
<210>198
<211>13
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>198
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>199
<211>13
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>199
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>200
<211>24
<212>PRT
<213>炭疽杆菌(B.anthracis)
<400>200
Ile Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Thr Asn Gly Ile Glu Leu
            20
<210>201
<211>15
<212>PRT
<213>钩虫
<400>201
Ile Val Tyr Gln His Ser His Gly Glu Asp Arg Pro Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
<210>202
<211>11
<212>PRT
<213>水泡性口膜炎病毒
<400>202
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1               5                   10
<210>203
<211>26
<212>PRT
<213>牛呼吸道合孢病毒
<400>203
Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>204
<211>26
<212>PRT
<213>人呼吸道合孢病毒
<400>204
Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>205
<211>26
<212>PRT
<213>人呼吸道合孢病毒
<400>205
Asp Lys Arg Ieu Leu Pro Ile Val Asn Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>206
<211>6
<212>PRT
<213>人呼吸道合孢病毒
<400>206
Phe Pro Ser Asp Glu Phe
1               5
<210>207
<211>14
<212>PRT
<213>人鼻病毒
<400>207
Pro Ala Thr Gly Ile Asp Asn His Arg Glu Ala Lys Leu Asp
1               5                   10
<210>208
<211>10
<212>PRT
<213>脊髓灰质炎病毒
<400>208
Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu
1               5                   10
<210>209
<211>16
<212>PRT
<213>HIV P24
<400>209
Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>210
<211>17
<212>PRT
<213>棒状杆菌白喉毒素(CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE TOXIN)
<400>210
Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>211
<211>25
<212>PRT
<213>博氏疏螺旋体(BORRELIA BURGDORFERI)
<400>211
Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys
1               5                   10                  15
Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys
            20                  25
<210>212
<211>19
<212>PRT
<213>博氏疏螺旋体(BORRELIA BURGDORFERI)
<400>212
Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu
1               5                   10                  15
Asn Asp Cys
<210>213
<211>11
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>213
Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys
1               5                   10
<210>214
<211>10
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>214
Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys
1               5                   10
<210>215
<211>9
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>215
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys
1               5
<210>216
<211>24
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>216
Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg
1               5                   10                  15
Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys
            20
<210>217
<211>22
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>217
Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly
1               5                   10                  15
Lys Leu Ser Thr Arg Gly
            20
<210>218
<211>22
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>218
Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val
1               5                   10                  15
Tyr Ser Leu Ile Arg Pro
            20
<210>219
<211>24
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>219
Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile
1               5                   10                  15
Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn
            20
<210>220
<211>21
<212>PRT
<213>克氏锥虫(TRYPANOSOMA CRUZI)
<400>220
Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Asn Thr Cys
            20
<210>221
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)MSP1 1
<400>221
Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys
1               5                   10                  15
<210>222
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>222
Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>223
<211>18
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>223
Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser Cys
<210>224
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>224
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>225
<211>19
<212>PRT
<213>间日疟原虫(P VIVAX)
<400>225
Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys
1               5                   10                  15
Ser Val Thr
<210>226
<211>20
<212>PRT
<213>P YOELII
<400>226
Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln
1               5                   10                  15
Cys Ser Val Thr
            20
<210>227
<211>16
<212>PRT
<213>表兄链球菌(STREPTOCOCCUS SOBRINUS)
<400>227
Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>228
<211>17
<212>PRT
<213>表兄链球菌(STREPTOCOCCUS SOBRINUS)
<400>228
Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu
1               5                   10                  15
Cys
<210>229
<211>16
<212>PRT
<213>淋巴细胞性脉络膜丛脑膜炎病毒(LYMPHOCYTIC CHORIOMENINGITIS VIRUS)
<400>229
Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>230
<211>16
<212>PRT
<213>破伤风杆菌(CLOSTRIDIUM TETANI)
<400>230
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys
1               5                   10                  15
<210>231
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>231
Ala Ile Trp Gln Val Glu Gln Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asp Ser
1               5                   10                  15
Gly Trp Cys
<210>232
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>232
Asn Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys
1               5                   10                  15
Arg His Cys
<210>233
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>233
His Asn Ser Gln Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg  Phe Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Cys
<210>234
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>234
Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly Leu Val Asp Asp
1               5                   10                  15
Ala Asp Cys
<210>235
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>235
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Cys
<210>236
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>236
Ala Phe Lys Tyr Ala Arg His Ala Asn Val Gly Arg Asn Ala Phe Glu
1               5                   10                  15
Leu Phe Cys
<210>237
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>237
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Cys
            20
<210>238
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>238
Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val Ala Asn Gln Cys
1               5                   10                  15
<210>239
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>239
Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
1               5                   10                  15
<210>240
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>240
Gly Arg Asn Tyr Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Arg Thr Cys
1               5                   10                  15
<210>241
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>241
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Cys
1               5                   10                  15
<210>242
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>242
His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>243
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>243
Leu Gly Arg Ile Gly Asp Asp Asp Glu Ala Lys Gly Thr Asp Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>244
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>244
Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>245
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>245
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Cys
1               5                   10                  15
<210>246
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>246
Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
1               5                   10                  15
<210>247
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>247
Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Cys
1               5                   10                  15
<210>248
<211>16
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>248
His Asp Asp Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Cys
1               5                   10                  15
<210>249
<211>27
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>249
Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser Tyr Ala His Gly Phe Asp
1               5                   10                  15
Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn Cys
        20                  25
<210>250
<211>24
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>250
Asn Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Val Gly Arg Asp Ala
1               5                   10                  15
Phe Asn Leu Phe Leu Leu Gly Cys
            20
<210>251
<211>26
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>251
Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly Ile Gly Asn Tyr Thr Gln
1               5                   10                  15
Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg Cys
            20                  25
<210>252
<211>20
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>252
Ser Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr
1               5                   10                  15
Thr Pro Ala Cys
            20
<210>253
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>253
Thr Gly Ala Asn Asn Thr Ser Thr Val Ser Asp Tyr Phe Arg Asn Arg
1               5                   10                  15
Ile Thr Cys
<210>254
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>254
Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>255
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>255
Leu Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Lys Leu Asn Asp Lys Phe Lys Pro Tyr
1               5                   10                  15
Ile Gly Cys
<210>256
<211>19
<212>PRT
<213>脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)
<400>256
Asn Gly Trp Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Glu Val Lys Phe Asp Leu Asn
1               5                   10                  15
Ser Arg Cys
<210>257
<211>21
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>257
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1               5                   10                  15
His Gln Leu Asp Pro
            20
<210>258
<211>8
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>258
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His
1               5
<210>259
<211>11
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>259
Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu His
1               5                   10
<210>260
<211>26
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>260
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1               5                   10                  15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly
            20                  25
<210>261
<211>14
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>261
Met Gln Trp Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro
1               5                   10
<210>262
<211>15
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>262
Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Leu His Gln Ala Leu Gln Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>263
<211>6
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>263
Gln Asp Pro Arg Val Arg
1               5
<210>264
<211>20
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>264
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro
20
<210>265
<211>24
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>265
Arg Asp Leu Leu Asp Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser
1               5                   10                  15
Pro Glu His Cys Ser Pro His His
            20
<210>266
<211>25
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>266
Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
1               5                   10                  15
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
20                  25
<210>267
<211>16
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>267
Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu
1               5                   10                  15
<210>268
<211>21
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>268
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1               5                   10                  15
Ile Glu Tyr Leu Val
20
<210>269
<211>32
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>269
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Val Ser Phe Gly Val
1               5                   10                  15
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
            20                  25                  30
<210>270
<211>21
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>270
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Pro Ile Leu
            20
<210>271
<211>12
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>271
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
1               5                   10
<210>272
<211>12
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>272
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1               5                   10
<210>273
<211>12
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>273
Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
1               5                   10
<210>274
<211>20
<212>PRT
<213>乙肝病毒
<400>274
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Met Thr Leu Ala
            20
<210>275
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T细胞表位
<400>275
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>276
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素结合表位
<400>276
Gly Gly Gly Cys Ser Trp Ala Pro Pro Phe Lys Ala Ser Cys
1               5                   10
<210>277
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素结合表位
<400>277
Gly Gly Gly Arg Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Ile Thr Ala Val Thr
1               5                   10                  15
<210>278
<211>24
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>278
ttgggccatg gacatcgacc ctta                                           24
<210>279
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物，含限制性内切酶位点
<400>279
cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg                       42
<210>280
<211>78
<212>DNA
<213>流感A病毒
<400>280
aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa    60
tgatagctct gacgagct                                                  78
<210>281
<211>70
<212>DNA
<213>流感A病毒
<400>281
cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg    60
ttaacagaga                                                           70
<210>282
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBC颗粒的接头
<400>282
Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>283
<211>53
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>赖氨酸接头
<400>283
Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Asn Arg Asn Ala Val Pro
            20                  25                  30
Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr
        35                  40                  45
Leu Pro Thr Ser Cys
    50
<210>284
<211>53
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>赖氨酸接头
<400>284
Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Gly Val Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala
1               5                   10                  15
Pro Arg Val Ala Arg Gln Leu Pro Ala Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Val Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Pro Arg Val Ala Arg Gln
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Cys
    50
<210>285
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FMDV表位的免疫原性序列
<400>285
Arg Gly Asp Leu Gln Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys
1               5                   10                  15
Val Ala Arg Thr Leu Pro Cys
            20
<210>286
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FMDV表位的免疫原性序列
<400>286
Arg Gly Asp Leu Gln Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Arg Gly Asp Leu
1               5                   10                  15
Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro Cys
            20                  25
<210>287
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头突出端
<400>287
Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp
1               5
<210>288
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头突出端
<400>288
Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu
1               5                   10
<210>289
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头突出端
<400>289
Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp
1               5
<210>290
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>接头突出端
<400>290
Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu
1               5                   10
<210>291
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变肽
<400>291
Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg
1               5                   10                  15
Thr Leu Pro Cys
            20
<210>292
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>NIMII表位
<400>292
Val Lys Ala Glu Thr Arg Leu Asn Pro Asp Leu Gln Pro Thr Cys
1               5                   10                  15
<210>293
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<400>293
Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Cys
1               5                   10                  15
<210>294
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV16 L1蛋白
<400>294
Pro Asn Asp Thr Phe Ile Val Ser Thr Asn Pro Asn Thr Val Thr Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Pro Ile
            20
<210>295
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亮氨酸拉链，位于GCN4蛋白
<400>295
Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>296
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GCN4-VL亮氨酸拉链
<400>296
Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>297
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人AP4亮氨酸拉链
<400>297
Ile Phe Ser Leu Glu Gln Glu Lys Thr Arg Leu Leu Gln Gln Asn Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Arg Phe Ile Gln Glu Leu
            20                  25
<210>298
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>拉链
<400>298
Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>299
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV 16 L2
<400>299
Leu Val Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro
1               5                   10
<210>300
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-MYC亮氨酸拉链
<400>300
Tyr Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu
    20                  25                  30
<210>301
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TMV 89-114
<400>301
Asp Thr Arg Asn Arg Ile Ile Glu Val Glu Asn Gln Gln Ser Pro Thr
1               5                   10                  15
Thr Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr Arg Arg
            20                  25
<210>302
<211>159
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TMV L CP
<400>302
Met Ser Tyr Ser Ile Thr Ser Pro Ser Gln Phe Val Phe Leu Ser Ser
1               5                   10                  15
Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Asn Gln Phe Gln Thr Gln Gln Ala Arg Thr Thr Val Gln Gln Gln
        35                  40                  45
Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gln Ser Thr Val Arg Phe Pro
    50                  55                  60
Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Val Leu Asp Pro Leu
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ala Phe Asp Thr Arg Asn Arg Ile Ile Glu
                85                  90                  95
Val Glu Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr
            100                 105                 110
Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn Asn
        115                 120                 125
Leu Val Asn Glu Leu Val Arg Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gln Asn Thr
    130                 135                 140
Phe Glu Ser Met Ser Gly Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser
145                 150                 155
<210>303
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>脊髓灰质炎病毒SABIN株
<400>303
Ser Ala Ser Thr Lys Asn Lys Asp Lys Leu
1               5                   10
<210>304
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>COMP肽
<400>304
Leu Lys Phe Arg Phe Arg Asp Ile Glu Arg Ser Lys Arg Ser Val Met
1               5                   10                  15
Val Gly His Thr Ala Thr Ala Ala
            20
<210>305
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>酵母TY1衣壳
<400>305
Gly Glu Leu Ala Glu Gln Lys Leu Glu Gln Ala Leu Gln Lys Leu Ala
1               5                   10                  15
<210>306
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GCN4 LL
<400>306
Arg Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu
1               5                   10                  15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Leu Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>307
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>P1的C端
<400>307
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gln Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gln
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Ala
            20
<210>308
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人字形结构
<400>308
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gln Lys Leu Leu Glu Ala Leu Gln
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Ala
            20
<210>309
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合衣壳蛋白
<400>309
Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Arg Thr Leu Pro
            20
<210>310
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合衣壳蛋白构建体片
<400>310
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1               5                   10
<210>311
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毒株RB94
<400>311
Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>312
<211>26
<212>PRT
<213>RSV
<400>312
Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>313
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RSV亚型B
<400>313
Asp Lys Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
            20                  25
<210>314
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RSS-2 BRSV
<400>314
Phe Pro Ser Asp Glu Phe
1               5
<210>315
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PRES2
<400>315
Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
1               5                   10
<210>316
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HBSAG
<400>316
Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe
            20                  25
<210>317
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>STREP M P145
<400>317
Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Glu
            20
<210>318
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>V3环HIV1
<400>318
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile
1               5                   10                  15
Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>319
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>319
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile
1               5                   10                  15
Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>320
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>320
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Thr Ile
            20                  25                  30
Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>321
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>321
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Arg Arg Gly Ile His Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr Gly Ile Val Asp Ile Arg Arg
            20                  25                  30
Ala Tyr Cys Thr Ile Asn Gly
        35
<210>322
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>322
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Arg Val Ile Tyr Ala Thr Gly Gln Ile Ile Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Arg Ala His Cys Asn Leu Ser Gly Ser
        35                  40
<210>323
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>323
Ser Thr Cys Ala Arg Pro Tyr Gln Asn Thr Arg Gln Arg Thr Pro Ile
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Gln Ser Leu Tyr Thr Thr Arg Ser Arg Ser Ile Ile Gly
            20                  25                  30
Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>324
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>324
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Gly Asn Asn Thr Arg Arg Gly Ile His Phe
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Gln Ala Leu Tyr Thr Thr Gly Ile Val Asp Glu Ile Arg
            20                  25                  30
Arg Ala Tyr Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>325
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>325
Ser Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gln
1               5                   10                  15
Arg Gly Pro Gly Arg Val Leu Tyr Ala Thr Gly Gln Ile Ile Gly Asp
            20                  25                  30
Ile Arg Lys Ala His Cys Asn Ser Ile Gly
        35                  40
<210>326
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 V3环
<400>326
Ser Thr Cys Ala Arg Pro Tyr Gln Asn Thr Arg Gln Arg Thr Pro Ile
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Gln Ser Leu Tyr Thr Thr Arg Gly Arg Thr Lys Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Gly
        35                  40
<210>327
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV1 GP41
<400>327
Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp
1               5                   10                  15
Arg Ser Asp
<210>328
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人鼻病毒14的VP1
<400>328
Pro Ala Thr Gly Ile Asp Asn His Arg Glu Ala Lys Leu Asp
1               5                   10
<210>329
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>T细胞表位恶性疟原虫(PLASMODIUM FALCIPARUM)
<400>329
Leu Thr Met Ser Asn Val Lys Asn Val Ser Gln Thr Asn Phe Lys Ser
1               5                   10                  15
Leu Leu Arg Asn Leu Gly Val Ser
            20
<210>330
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>***M2
<400>330
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1               5
<210>331
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGE
<400>331
Phe Val Phe Phe Gly Ser Lys Thr Lys
1               5
<210>332
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>MAL***M2
<400>332
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
1               5                   10
<210>333
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV L1***M2
<400>333
Pro Asn Asp Thr Phe Ile Val Ser Thr Asn Pro Asn Thr Val Thr Ser
1               5                   10                  15
Ser Thr Pro Ile
            20
<210>334
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV***M2
<400>334
Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro
1               5                   10                  15
Pro Leu Asp Leu
            20
<210>335
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HIV GP120***M2
<400>335
Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala
1               5                   10                  15
Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly
            20
<210>336
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>绿脓杆菌(PSEUDOMONAS AERUGINOSA)B和T细胞表位
<400>336
Gly Thr Ile Ala Leu Lys Pro Asp Pro Ala Asp Gly Thr Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Phe Thr Met
            20
<210>337
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素结合肽
<400>337
Gly Gly Gly Cys Ser Trp Ala Pro Pro Phe Lys Ala Ser Cys
1               5                   10
<210>338
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素结合肽
<400>338
Gly Gly Gly Arg Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Ile Thr Ala Val Thr
1               5                   10                  15

Claims (26)

1.一种嵌合多肽，该多肽包含：
a)第一多肽部分，该部分在水溶液中自组装形成具有至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，和
b)第二肽部分，该部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，所述肽
i)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，
ii)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或
iii)为流感A M2多肽的自组装细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域；
所述第一和所述第二部分通过共价键连接，且所述嵌合多肽形成的有序、重复、超分子结构比所述第一部分单独形成的结构更稳定。
2.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一和所述第二部分通过肽键连接。
3.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包括接头残基。
4.权利要求3的嵌合多肽，其中表位连接于所述接头残基。
5.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包括异源表位。
6.权利要求5的嵌合多肽，该多肽当接种至宿主动物时引发免疫反应。
7.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含丙酮酸脱氢酶酶复合体E2多肽。
8.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽。
9.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分为病毒衣壳多肽或病毒衣壳多肽类似物。
10.权利要求9的嵌合多肽，其中所述第一部分包含感染动物病毒、感染植物病毒、感染细菌病毒或感染真菌病毒的衣壳多肽或病毒衣壳多肽的类似物。
11.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含多肽的N-末端部分，所述第二部分包含所述多肽的C-末端部分。
12.权利要求10的嵌合多肽，其中所述第一部分包含乙型肝炎病毒衣壳多肽。
13.权利要求1的嵌合多肽，其中有序、重复、超分子结构是病毒样颗粒(VLP)。
14.权利要求1的多肽，其中所述第一部分包含选自以下科或属的病毒的衣壳多肽：小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、嵌杯样病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、***瘤病毒科(Papillomaviridae)、***多空病毒科(Parpovaviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、罗达病毒科(Nodaviridae)、四病毒科(Tetraviridae)、蕃茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae))、联体病毒科(Geminiviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridea)、马铃薯Y病毒科(Potyviridea)、丝形病毒科(Inoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、微病毒科(Microviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)、球状真菌病毒科(Totiviridae)、转座病毒科(Metaviridae)和蔓菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)，以及烟草花叶病毒属(tobamovirus)、蔓菁黄花叶病毒属(tymovirus)、马铃薯X病毒属(potexvirus)和南方豆花叶病毒属(sobemovirus)。
15.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含二十面酶复合体的自组装多肽亚单位。
16.一种重组嵌合乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白分子，其长度至多约570个氨基酸残基，该蛋白分子：
(a)包含HBc分子N-末端150个氨基酸残基中至少约135个残基的序列，其中包括通过肽键连接的异源表位或用于连接存在于HBc免疫显性环中缀合表位的异源接头残基；或N-末端150个HBc氨基酸残基中至少约135个残基的序列，
(b)包含长度约15-约35个残基的氨基酸残基的C-末端自结合序列，所述自结合序列当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度约10mmol的PBS水溶液中形成自组装的平行多聚体，
(c)包含从HBc位置135至HBc的C-末端的至少5氨基酸残基的序列，
所述嵌合分子(i)包含不超过10％保守取代的HBc序列中的氨基酸残基，所述颗粒比缺少所述C-末端自结合序列的但其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。
17.权利要求16的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述通过肽键连接的异源表位或用于连接缀合表位的异源接头残基为异源表位。
18.权利要求17的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述异源表位为B细胞表位。
19.权利要求18的重组HBc嵌合蛋白分子，包含通过肽键连接于HBc的氨基酸残基1-4之一的第二异源表位。
20.权利要求18的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述B细胞表位通过肽键连接在氨基酸残基76和85之间的HBc序列中的位置，并且位置76至85之间的HBc序列的至少5个残基被呈递。
21.权利要求20的重组HBc嵌合蛋白分子，其中氨基酸残基76和85之间的HBc序列被呈递，但被所述B细胞表位中断。
22.权利要求17的重组HBc嵌合蛋白分子，还包含通过肽键连接的异源T细胞表位。
23.一种稳定超分子结构的方法，该方法包括将第二自结合肽部分连接于第一多肽部分，其中所述第一多肽部分自组装形成具有至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，所述第二肽部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，并且所述第二肽
a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，
b)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或
c)为流感A M2多肽的自组装细胞外域。
24.一种稳定病毒样颗粒的方法，该方法包括：
a)通过将第二自结合肽部分共价连接于第一多肽部分来制备嵌合多肽，
其中所述第一多肽部分为病毒衣壳多肽或衍生自病毒衣壳多肽，
所述第二肽部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，所述第二肽
i)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH 7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，
ii)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或
iii)为流感A M2多肽的自组装细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域；和
b)将多个所述嵌合多肽在含水组合物中维持足够长时间，使病毒样颗粒组装成具有至少约9拷贝的所述嵌合多肽的病毒样颗粒；和
ii)回收所述病毒样颗粒，所述稳定化的病毒样颗粒比包含缺少所述连接的自结合肽的病毒衣壳多肽的病毒样颗粒更稳定。
25.一种超分子结构，该结构由权利要求1的嵌合多肽形成。
26.一种颗粒，该颗粒由权利要求16的重组嵌合乙型肝炎病毒核心蛋白分子形成。
CN2006800405270A 2005-08-31 2006-08-25 稳定化的病毒样颗粒和表位展示*** Expired - Fee Related CN101309699B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71314805P 2005-08-31 2005-08-31
US60/713,148 2005-08-31
US11/507,083 2006-08-18
US11/507,083 US20070160628A1 (en) 2005-08-31 2006-08-18 Stabilized virus-like particles and epitope display systems
PCT/US2006/033595 WO2007027640A2 (en) 2005-08-31 2006-08-25 Stabilized virus-like particles and epitope display systems

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101309699A true CN101309699A (zh) 2008-11-19
CN101309699B CN101309699B (zh) 2012-01-04

Family

ID=37809421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800405270A Expired - Fee Related CN101309699B (zh) 2005-08-31 2006-08-25 稳定化的病毒样颗粒和表位展示***

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20070160628A1 (zh)
EP (1) EP1931378A4 (zh)
JP (1) JP2009516641A (zh)
CN (1) CN101309699B (zh)
WO (1) WO2007027640A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103118709A (zh) * 2010-03-26 2013-05-22 新兴产品开发盖瑟斯堡有限公司 流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达***和应用
CN107080833A (zh) * 2009-04-10 2017-08-22 约翰·霍普金斯大学 作为广谱人类***状瘤病毒（hpv）疫苗的***状瘤病毒样颗粒（vlp）
CN107488218A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107488217A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107522777A (zh) * 2017-09-13 2017-12-29 华兰生物疫苗有限公司 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006340589B2 (en) * 2006-03-17 2012-04-19 Indian Immunologicals Ltd Chimeric tymovirus-like particles
US20080171062A1 (en) * 2006-08-16 2008-07-17 Monica Sala-Schaeffer Recombinant HBsAg virus-like particles containing polyepitopes of interest, their production and use
ITNA20080006A1 (it) * 2008-01-28 2009-07-29 Consiglio Nazionale Ricerche Proteine chimeriche capaci di formare particelle virus-like, che contengono sequenze peptidiche del beta-amiloide e la componente e2 della alfachetoacido deidrogenasi di "geobacillus stearothermophilus", utili per l'induzione di una risposta anticorp
MX2010009766A (es) 2008-03-03 2010-09-28 Univ Kansas State Ensayo de proteasa.
EP2397547A4 (en) * 2009-02-10 2012-09-05 Univ Ryukyus ACTIVE TRANSPORT, AS WELL AS AUXILIARY AND VACCINATE THEREOF
US20120321694A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-20 Daniel Larocque Compositions and uses
US9060972B2 (en) * 2010-10-30 2015-06-23 George Dacai Liu Recombinant hemagglutinin protein of influenza virus and vaccine containing the same
US9060984B2 (en) * 2010-10-30 2015-06-23 George Dacai Liu Recombinant HIV-1 envelope proteins comprising stabilizing two-cysteine mini-domains in gp41
AU2012305714A1 (en) * 2011-09-09 2014-03-27 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
WO2014046410A1 (ko) * 2012-09-20 2014-03-27 중앙대학교 산학협력단 노다바이러스의 바이러스 유사입자의 생산방법, 이를 발현하는 효모 세포주 및 이를 포함하는 백신 조성물
MA42640B1 (fr) * 2015-11-23 2021-06-30 Merial Inc Protéines de fusion de dmdv et e2 et leurs utilisations
US11058760B2 (en) 2016-04-18 2021-07-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated N-antigenic form poliovirus virus-like particles comprising thermostable mutations
KR101955928B1 (ko) * 2016-12-30 2019-03-08 경상대학교산학협력단 먹장어 유래 vlrb 단백질의 소수성 테일 도메인을 포함하는 다량체 다가 중합체
US20180221468A1 (en) * 2017-01-19 2018-08-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Haemophilus influenzae immunogen
BR112019027488A2 (pt) 2017-06-23 2020-07-07 Pathovax Llc partículas semelhantes a vírus quiméricas e usos destas como redirecionadores de respostas imunológicas antígeno-específicos
JP2022516088A (ja) 2018-12-27 2022-02-24 ヴェリミューン インコーポレイテッド コンジュゲート型ウイルス様粒子および抗腫瘍免疫リダイレクタとしてのその使用
KR20230129379A (ko) 2020-10-19 2023-09-08 버이뮨 아이엔씨. 바이러스에 영향받은 조성물 및 암 치료를 위해 이를 사용하여 기존 면역 반응을 재지향시키는 방법

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1054689B1 (en) * 1998-02-12 2003-09-10 Immune Complex, Corporation Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives
US6942866B2 (en) * 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine
US20030138769A1 (en) * 2000-08-16 2003-07-24 Birkett Ashley J. Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability
US20030175863A1 (en) * 2001-08-15 2003-09-18 Birkett Ashley J. Influenza immunogen and vaccine
US7361352B2 (en) * 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
JP4671389B2 (ja) * 2001-10-05 2011-04-13 サイトス バイオテクノロジー アーゲー アンジオテンシンペプチド−担体複合体およびその使用
US7351413B2 (en) * 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
AU2003300841B2 (en) * 2002-12-10 2008-03-20 Lorantis Ltd. Stabilized immunogenic HBc chimer particles
DE602004008582T2 (de) * 2003-02-17 2008-05-21 Peter Burkhard Peptidische nanoteilchen als arzneimittelabgabe- und antigen-display-systeme

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107080833A (zh) * 2009-04-10 2017-08-22 约翰·霍普金斯大学 作为广谱人类***状瘤病毒（hpv）疫苗的***状瘤病毒样颗粒（vlp）
CN103118709A (zh) * 2010-03-26 2013-05-22 新兴产品开发盖瑟斯堡有限公司 流感病毒基质2蛋白的胞外域、其表达***和应用
CN107488218A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107488217A (zh) * 2017-09-13 2017-12-19 华兰生物疫苗有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107522777A (zh) * 2017-09-13 2017-12-29 华兰生物疫苗有限公司 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途
CN107488218B (zh) * 2017-09-13 2021-06-01 华兰生物疫苗股份有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107522777B (zh) * 2017-09-13 2021-06-11 华兰生物疫苗股份有限公司 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN101309699B (zh) 2012-01-04
US20070160628A1 (en) 2007-07-12
WO2007027640A2 (en) 2007-03-08
EP1931378A2 (en) 2008-06-18
JP2009516641A (ja) 2009-04-23
WO2007027640A3 (en) 2007-06-14
EP1931378A4 (en) 2013-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101309699B (zh) 稳定化的病毒样颗粒和表位展示***
CN100387622C (zh) 策略性修饰的乙肝核心蛋白及其衍生物
Whitacre et al. Use of hepadnavirus core proteins as vaccine platforms
CN102245198B (zh) IgE CH3肽疫苗
AU2004216246B2 (en) Stabilized HBc chimer particles as therapeutic vaccine for chronic hepatitis
US20040223976A1 (en) Influenza virus vaccine
Peacey et al. Versatile RHDV virus‐like particles: Incorporation of antigens by genetic modification and chemical conjugation
CN101119749A (zh) 肠抑胃肽(gip)抗原阵列及其用途
JP2012056954A (ja) 安定化させた免疫原性ＨＢｃキメラ粒子
JP2012139237A (ja) 安定性が強化された免疫原性ＨＢｃキメラ粒子
CN101141979A (zh) 猫变应原融合蛋白及其用途
US20070015199A1 (en) Stabilized immunogenic HBc chimer particles
Pumpens et al. Construction of novel vaccines on the basis of the virus-like particles: Hepatitis B virus proteins as vaccine carriers
Santoni et al. Plant virus nanoparticles for vaccine applications
US20030185858A1 (en) Immunogenic HBc chimer particles stabilized with an N-terminal cysteine
CN101052414B (zh) 具有增强的稳定性的免疫原性HBc嵌合体颗粒
Neugebauer et al. Development of a vaccine marker technology: Display of B cell epitopes on the surface of recombinant polyomavirus‐like pentamers and capsoids induces peptide‐specific antibodies in piglets after vaccination
Liekniņa Virus like particles of ssRNA bacteriophages-versatile tools in vaccine development
MXPA00007859A (en) Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120104

Termination date: 20130825