CN101305097A - 提高植物转化效率的载体和方法 - Google Patents

Abstract

提供了改善了的细菌介导的植物转化的方法和组分。该方法通常可使植物转化具有减少的载体骨架整合及高频率的低拷贝转化事件。描述了可得到这些结果的载体及其使用方法。

Description

提高植物转化效率的载体和方法

本申请要求于2005年9月6日提交的美国临时申请No.60/714,501的优先权，其全部内容作为参考并入本申请中。

1.发明领域

本发明主要涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及改善了的用于植物基因转化的方法以及用于实现该转化方法的组合物。

2.背景技术

用土壤杆菌介导的方法来转化植物细胞涉及将植物细胞及组织暴露在含有特定DNA质粒的土壤杆菌细胞悬浮液中。对这些质粒进行了专门的构建使其含有可在植物细胞中表达的转基因(参见，例如，USNo.5,034,322)。更常见地，一个或多个转基因是阳性选择标记转基因，可使植物细胞在存在诸如抗生素或除草剂这样的阳性选择化合物时生长。可对这些细胞进行进一步操作使其再生成完整的可繁殖的植物。

通过土壤杆菌介导的转化方法将转基因转入植物的方法通常涉及其中整合了至少一种转基因的基因元件，并可将这些基因元件转入植物基因组的T-DNA(转移DNA)。典型地，转基因构建于DNA质粒载体中，并且两翼通常是土壤杆菌Ti质粒的右边缘(right border)DNA区(RB)和左边缘(left border)DNA区(LB)。在土壤杆菌介导的转化过程中，DNA质粒在左右边缘区通过内切酶VirD2的作用产生缺刻。在缺刻之间的被称为T链的单链DNA从土壤杆菌细胞转入到植物细胞中。相应的T-DNA区的序列被***到植物基因组中。

T-DNA整合入植物基因组中通常于RB处开始，直至T-DNA末端的LB处。不过，内切酶有时候并不在两个边缘都产生缺刻。当这种情况发生时，***到植物基因组中的T-DNA通常含有某些或者全部质粒载体DNA。这种现象被称为“边缘连读(border read-through)”。通常优选地，只有位于左右边缘区之间的转基因(T-DNA)才会被转入植物基因组中，而其它相邻的质粒载体DNA(载体骨架)不会转入。载体骨架DNA含有多种质粒维持元件，包括例如，复制起点、细菌选择标记基因、以及其它在表达商品化作物产品的期望性状时不需要表达的DNA片段。

有很多办法可用来筛选转基因作物植物基因组中的质粒骨架DNA。诸如聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹分析之类的方法是最为常用的，其用来鉴定外源载体骨架DNA。对于大规模筛选工作而言，这些方法既耗时又昂贵。含有载体骨架DNA的转基因植物通常不是商品化所优选的。此外，含有超过两种转基因的转基因植物在商品化开发中通常几乎没有价值。从不具有商业潜力的植物细胞培养物中再生植物会耗费大量的工作。

因此，如果能够开发出可显著降低转基因植物基因组中载体骨架DNA的发生率和/或增加低拷贝转化事件频率的方法及组合物，这将会有非常大的收益。如果更多的转基因植物不含载体骨架DNA并且绝大多数植物只含有一或两个拷贝的转基因，则只需生产很少的转基因植物，这可极大增加转基因植物生产的效率。

发明概述

根据本发明的一个方面，提供了用于提高诸如土壤杆菌介导的植物转化之类的、细菌介导的植物细胞转化事件质量的构建体和方法。本发明的优势在于提供了更低频率的载体骨架DNA——即非T-DNA区的转化事件，并可增加有1或2个拷贝的T-DNA的T-DNA转化事件频率。

本发明还提供用于转化植物的DNA构建体，其包括i)至少一个T-DNA边缘区域；ii)至少一个与边缘区相邻的异源转基因；iii)用作细菌选择标记的编码区；及iv)至少一个DNA节段，其含有顺式和/反式元件或者用于在细菌转化的植物细胞中维持低拷贝的DNA构建体的复制起点的元件。

在本发明特定的实施方案中，用于在植物转化用(具有植物细胞转化能力的)细菌细胞中维持低拷贝的DNA构建体的复制起点元件包括repA(譬如SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：38)、repB(譬如SEQID NO：33或SEQ ID NO：39)、repC(譬如SEQ ID NO：34或SEQ IDNO：40)、igs1(譬如SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：41)、igs2(譬如SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：42)中的一种或多种。构建体也可选择性地包括回文序列，例如，SEQ ID NO：37中16bp的回文序列。这些元件彼此间可按顺式或反式方式来排列。

在某些实施方案中，单T-DNA边缘区定义为右边缘区(RB)或左边缘(LB)区。此外，在特定实施方案中，RB和/或LB序列包含SEQ ID NO：43或者SEQ ID NO：44。在具体的实施方案中，当异源转基因在转化的植物细胞中表达时，可使细胞或由该细胞衍生的植物呈现某种农艺学表型。在进一步的实施方案中，细菌选择标记的编码区是选自卡那霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或零霉素抗性基因的抗生素抗性基因。

在某些实施方案中，复制起点包含选自SEQ ID NOs：1、2、3或4的repABC序列。在一个实施方案中，至少一种DNA节段包括复制基因repA、repB和repC。在某些实施方案中，至少一种DNA节段包括基因间序列1(igs1)和基因间序列2(igs2)。在某些实施方案中，至少一种DNA节段包括16个碱基对的回文序列。在其它实施方案中，DNA节段包括所有在土壤杆菌或其它具有植物细胞转化能力的细菌细胞中维持低拷贝数(每个细胞1-3拷贝)所必须的repABC序列。含有repABC的构建体以及它们的使用方法在下文进行更详细的描述。

本发明的DNA构建体可转入任何细胞，例如，诸如具有植物细胞转化能力的细菌。这类细菌在本领域是已知的，例如，可以属于以下物种：土壤杆菌(Agrobacterium spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、中间根瘤菌(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)。优选地，这类细胞可以属于土壤杆菌。本发明的DNA构建体可进一步包括一个或多个用于在大肠杆菌中维持构建体拷贝数的复制起点。在某些实施方案中，用于在大肠杆菌中维持构建体拷贝数的复制起点是来源于pBR322和pUC中的至少一种。

本发明还涉及含有本发明DNA构建体、并可用于转化植物细胞的植物细胞转化用细菌。在某些实施方案中，植物细胞转化用细菌选自土壤杆菌、根瘤菌、中华根瘤菌、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌或慢生根瘤菌。

本发明还涉及用于转化植物细胞的方法，包括：使本发明的植物细胞转化用细菌与至少一个初始(first)植物细胞接触；并至少选择用至少一个异源转基因所转化的植物细胞。在某些实施方案中，植物细胞是大豆、油菜、玉米或棉花植物细胞。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括由植物细胞再生植株。

本发明还涉及生产食品、饲料或工业产品的方法，包括：获得本发明的植物或其部分；并由该植物或其部分制备食品、饲料或工业产品。

本发明还包括用本发明的DNA构建体遗传转化植物，以及降低由非T-DNA载体区转化植物的频率的方法。在某些实施方案中，用非T-DNA区所转化植物的频率可定义为低于或等于约20％。在某些实施方案中，该频率低于或等于约15％，在某些实施方案中低于约10％，在某些实施方案中低于或等于约8％或5％。在本发明方法的某些实施方案中，所获得的单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率高于或等于约70％或75％。在某些情况下，该频率可以增高到高于或等于约80％或85％，在某些实施方案中，高于约90％或95％。

除了全长的oriRi外，本发明包含含有oriRi突变体及变异体的植物转化载体，当用于本发明时它们保留了与全长序列基本上相似的功能。例如，申请人已经鉴定出如SEQ ID NO：3所示的截短序列，它适用于本发明。本领域的技术人员可很容易在oriRi序列中生成其它转变、缺失、替代等，并利用本发明的方法对功能活性进行筛选。因此，本发明也包含这类变异体和突变体。

本发明的其它特征及有益效果一方面可通过下文描述来阐明，一方面通过描述可以显而易见，或者可通过实施本发明来领会。可通过后附的权利要求中所述的要素及其组合来了解并实现本发明的特色及有益效果。

应理解无论是前述的一般性描述还是下文的详细描述均只是用来示例和说明，并不是对本发明进行限制。

后附的说明书附图作为说明书的一部分阐述了本发明的不同实施方案，结合相关描述用于阐述本发明的原理。

除非另外定义，本文所用的所有技术及科学术语均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。此处本发明描述中所用的术语只是用于描述特定的实施方案，而并非试图限制本发明。在本发明描述及附加的权利要求中，除非在上下文其它处有明确说明，否则单数形式的“a”“an”和“the”也意味着包括其复数形式。

附图的简要描述

图1所示的是用于构建转化大豆的pMON83882和转化玉米的pMON97352的、具有5.6Kb oriRi片段的基本载体——pMON83856的质粒图谱。

图2所示的是作为示例用于大豆转化的具有5.6Kb oriRi片段和5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)选择标记基因以及目的uidA(gus)基因的试验载体——pMON83882的质粒图谱。

图3所示的是用于构建pMON83937的、具有4.2Kb oriRi片段的基本载体——pMON83934的质粒图谱。

图4所示的是作为示例用于大豆转化的、具有4.2Kb oriRi片段和CP4选择标记基因以及GOI(gus)的试验载体——pMON83937的质粒图谱。

图5所示的是作为示例用于玉米转化的、具有5.6Kb oriRi片段和CP4选择标记基因以及GOI(gus)的试验载体——pMON97352的质粒图谱。

图6所示的是用作玉米转化对照的pMON92726的质粒图谱。它含有与pMON97352除复制起点外都相同的基因结构。其中oriV替代了oriRi。

图7所示的是用作大豆转化对照的双T-DNA转化载体——pMON87488的质粒图谱。其中oriV替代了oriRi。

图8所示的是作为示例用于大豆转化的、具有4.3Kb oriRi片段和CP4选择标记基因以及GOI(gus)的双T-DNA转化试验载体——pMON96001的质粒图谱。

图9所示的是作为示例用于大豆转化的具有5.6Kb oriRi片段和CP4选择标记基因以及GOI(gus)的双T-DNA转化试验载体——pMON96010的质粒图谱。

图10所示的是玉米中复制起点的类型对于转化效率的影响。误差线表示95％置信区间；*表示在oriRi(pMON97352)和oriV(pMON92726)之间存在显著性差异。

图11所示的是在玉米转化中复制起点的类型对骨架序列转移的影响。误差线表示95％置信区间；*表示在oriRi(pMON97352)和oriV(pMON92726)之间存在显著性差异。oriRi/oriV、RB和LB表示所用骨架探针的类型。

图12所示的是在玉米转化中复制起点的类型对转基因质量的影响。误差线表示95％置信区间。0、1、2、3+表示拷贝数。

图13所示的是含来自豆根瘤菌(Rhizobium etli)CFN42 p42b质粒的repABC复制起点及用于大豆的CP4 EPSPS选择标记基因的pMON96951的质粒图谱。

发明详述

现在将参照附图通过具体实施方案详细描述本发明。应理解的是，本发明可表现为不同的形式，并非为下述提供的具体实施方案所限制。更确切地说，这些具体实施方案仅是解释性的，其目的是使本领域的技术人员充分理解本发明的范围。

本发明部分涉及对复制中的repABC复制起点的发现，譬如来自发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)pRi的“oriRi”或“oriPRi”，其在诸如土壤杆菌这样的细菌中保持1-3个拷贝，可用于植物转化载体中并可提供很高的所需的转化事件。本发明的载体可以，例如，显著降低转移非T-DNA区——即载体骨架DNA的转化事件的频率，并且可以，例如，显著提高单拷贝或双拷贝T-DNA——即转化事件中目的基因的数目。现有技术中并没有教导或者暗示使用oriRi来实现这些未预料到的转化结果。本发明的载体和方法改良了制备转基因作物植物中的转化事件。

在本文用法中，转基因作物植物含有外源多核苷酸分子或者***到作物植物细胞基因组中的异源转基因。作物植物细胞包括但并不限定于植物细胞，并进一步包括培养物悬浮液、胚、分生组织区、愈伤组织、叶片、根、芽、配子体、孢子体、胚珠、花粉和小孢子、种子以及果实。“外源的”或者“异源的”是指来源于待转入所述核酸分子的植物细胞之外的多核苷酸分子。外源多核苷酸分子可具有天然的或非天然的核苷酸序列。本领域的技术人员知道外源多核苷酸分子可以是来源于任何其它生物的不同种，或来自待导入所述多核苷酸分子的植物之外的植物种的异源分子，也可以是来源于与待导入的植物相同的植物种的多核苷酸分子。

当外源多核苷酸(异源转基因)在转化植物细胞中表达时，可使细胞或者来源于该细胞的转化植物呈现某种农艺学性状。这些目的基因(GOI)给作物植物提供了有益的农艺学性状，例如，包括但并不限定于下述遗传元件：除草剂抗性(US5,633,435；US5,463,175)、增加的产量(US5,716,837)、昆虫控制(US6,063,597、US6,063,756、US6,093,695、US5,942,664、US6,110,464)、真菌病害抗性(US5,516,671、US5,773,696、US6,121,436和US6,316,407以及US6,506,962)、病毒抗性(US5,304,730和US6,013,864)、线虫抗性(US6,228,992)、细菌病害抗性(US5,516,671)、淀粉产量(US5,750,876和US6,476,295)、改良油类的产量(US6,444,876)、高油类产量(US5,608,149和US6,476,295)、改良的脂肪酸含量(US6,537,750)、高蛋白产量(US6,380,466)、果实成熟(US5,512,466)、增强的动物和人类营养(US5,985,605和US6,171,640)、生物多聚物(US5,958,745和US 2003/0028917)、环境胁迫抗性(US6,072,103)、药物肽(US6,080,560)、改良的加工性状(US6,476,295)、改良的可消化性(US6,531,648)、低棉子糖(US6,166,292)、工业酶产量(US5,543,576)、改良的风味(US6,011,199)、固氮作用(US5,229,114)、杂合种子产量(US5,689,041)、及生物染料生产(US5,998,700)的基因元件，上述的基因元件和转基因作为参考并入本申请。

本发明提供了用于生产转基因作物植物的植物重组DNA构建体。可使用本领域技术人员所熟知的方法来制备本发明的作物植物重组DNA构建体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术及体内基因重组。这些技术在Sambrook et al.(1989)中有所描述。利用这些方法生成的外源多核苷酸分子可以通过诸如土壤杆菌这样的植物转化用细菌或通过植物转化领域中技术人员已知的其它方法来转入作物植物细胞中。向植物中转入基因可使用不同的细菌物种，如Broothaertset al.(2005)和美国临时申请60800872中所述的那些，其作为参考并入本申请。本发明的重组DNA构建体可使用苜蓿中华根瘤菌、根瘤菌、百脉根中间根瘤菌、或其它能够转化植物细胞的细菌通过转化转入作物植物细胞中。

本发明包括用于土壤杆菌介导的植物转化的、植物转化载体。本发明的载体通常是质粒，但是oriRi复制起点可被来自repABC家族的其它复制起点所替代，用于在土壤杆菌中维持极低的拷贝数(每细胞1-3个拷贝)。此外，没有土壤杆菌-维持用复制起点的载体能够通过T-DNA上的、可整合到根癌土壤杆菌中的Ti质粒、发根土壤杆菌中的Ri质粒、或经同源重组整合到土壤杆菌染色体上的序列从而在土壤杆菌中得到维持。这可产生与减少非T-DNA***相同的效果，并增加低拷贝数转化事件，因为染色体、Ti或Ri质粒均以单拷贝形式存在。当根瘤菌或非土壤杆菌用于植物转化时，含有GOI的T-DNA可以整合到染色体上，或者整合到宿主细菌的repABC质粒上，可产生与使用土壤杆菌相同的效果。

本发明的载体含有土壤杆菌Ti质粒的右边缘或者左边缘区中的至少一个。载体也可含有至少一对边缘区域。载体可包括4对边缘区域，但载体通常只含有1或2对。

本发明的载体可以进一步含有用于在细菌宿主中维持存在的选择标记的编码区。选择标记的编码区包括可赋予壮观霉素或链霉素抗性的、编码Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)的Spec/Strp、或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。其它抗性标记包括羧苄青霉素、氨苄青霉素及卡那霉素抗性基因。本领域的技术人员公知其它抗性基因也可用于本发明。

本发明的载体也可包含用作植物选择标记基因的编码区，典型地，它位于T-DNA中，可使用相应的试剂来选择转化的植物细胞。植物选择标记可提供针对阳性选择化合物的抗性，例如，抗生素抗性(譬如，卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如，包括但并不限定于：草甘膦、麦草畏草胺磷、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂及异噁唑草酮除草剂)。编码涉及除草剂耐受性的蛋白的多核苷酸分子在本领域是已知的，其包括但并不限定于编码：a)赋予对草甘膦耐受性的：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；US5,627,061、US5,633,435、US6,040,497、US5,094,945、WO04074443和WO04009761)、草甘膦氧化还原酶(GOX；US5,463,175)、草甘膦脱羧酶(WO05003362和US申请20040177399)、及草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT；US20030083480)等；b)赋予对诸如麦草畏这样的植物生长素样除草剂：耐受性的麦草畏单加氧酶(DMO，由ddmC编码)(US申请20030115626、20030135879；Herman et al.，2005)；c)赋予对草丁磷或草胺磷耐受性的草丁磷乙酰转移酶(bar)(US5,646,024、US5,561,236、欧洲专利275,957、US5,276,268、US5,637,489、US5,273,894)；d)赋予对2，2-二氯丙酸(茅草枯)耐受性的2，2-二氯丙酸脱卤素酶(WO9927116)；e)赋予对诸如磺酰脲、咪唑啉酮、***并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸盐(pyrimidyloxybenzoates)及稻瘟酞这样乙酰乳酸合酶抑制剂耐受性的乙酰羟基酸合酶或乙酰乳酸合酶(US6,225,105；US5,767,366；US4,761,373；US5,633,437；US6,613,963；US5,013,659；US5,141,870；US5,378,824；US5,605,011)；f)赋予对溴苯腈耐受性的卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Bxn)(WO8704181A1；US4,810,648；WO8900193A)；g)赋予对环己二酮(稀禾定)及芳氧基苯氧基丙酸盐(氟吡甲禾灵)耐受性的修饰的乙酰辅酶A羧化酶(US6,414,222)；h)赋予对磺酰胺类除草剂耐受性的二氢叶酸合酶(sulI)(US5,597,717；US5,633,444；US5,719,046)；i)赋予对三嗪除草剂耐受性的32kD的光***II多肽(psbA)(Hirschberg et al.，1983)；j)赋予对5-甲基色氨酸耐受性的氨基苯甲酸盐合酶(US4,581,847)；k)赋予对氨乙基半胱氨酸耐受性的二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)(WO8911789)；l)赋予对诸如达草减这样的哒嗪酮类除草剂耐受性的八氢番茄红素去饱和酶(crtI)(日本06343473)；m)赋予对诸如异噁唑草酮这样的环丙基异噁唑耐受性的羟苯基丙酮酸加双氧酶(WO 9638567；US6,268,549)；n)赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂耐受性的修饰的原卟啉原氧化酶I(protox)(US5,939,602)；以及o)赋予对含芳氧基链烷酸盐基团的除草剂耐受性的芳氧基链烷酸盐加双氧酶(AAD-1)(WO05107437)的多核苷酸分子。这些除草剂的实施例包括含苯基的植物生长素(譬如2，4-D和2，4-滴丙酸)、吡啶基氧基植物生长素(譬如氟草烟和绿草定)、芳氧基苯氧基丙酸盐(AOPP)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂(譬如氟吡甲禾灵、精喹禾灵和二氯苯氧基苯氧基丙酸)、以及5-取代的苯氧基乙酸盐原卟啉原氧化酶IX抑制剂(譬如吡草醚和氟烯草酸)。

除了植物选择标记外，在某些实施方案中需使用报告基因。在某些情况下，报告基因可以与选择标记一起或不一起使用。报告基因是典型地不存在于受体生物或组织中、并且编码可引发某些表型改变或酶的性状的蛋白基因。在Wising et al.(1988)中提供了这些基因的实施例，作为参考并入本文中。优选的报告基因包括大肠杆菌uidA基因座的β葡糖醛酸酶(GUS)、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自生物发光水母维多利亚多管水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白、基来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶基因。可在上述基因导入到受体细胞后的适当时间进行检测报告基因表达的实验。优选地，这类实验均如Jefferson et al.(1987)所述使用大肠杆菌uidA基因座编码的β葡糖苷酸酶(GUS)的基因来鉴定转化细胞，本文中用GUS来指示。

在某些实施方案中，本发明的载体包含一个用于在大肠杆菌中维持其存在的复制起点。这些复制起点可以来源于，例如，pBR322或者pUC。这种复制起点的一个实施例是ColE1。本发明的载体可以包括任何可在大肠杆菌中维持至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或者更多个质粒拷贝的复制起点。在某些实施方案中，ori在大肠杆菌中可维持更高拷贝数(譬如，多于5、10、15、20、25或30，在某些进一步的实施方案中，多于10、15、20、25或30)。这些高拷贝数载体使得扩增用于转化的DNA的量更为容易。因此，在某些实施方案中，本发明包括含有可在大肠杆菌中提供高拷贝数的ori的载体，以及第二ori，譬如属于repABC家族的ori——例如oriRi，它在土壤杆菌中维持极低的拷贝数，例如1-3个。

本发明的载体也包括至少一个含有顺式和/或反式元件的DNA节段，这些元件对于在诸如土壤杆菌这样的植物转化细菌中的拷贝质粒的维持(1-3个拷贝)是必要且足够的。优选地，这种至少一个DNA节段含有来自repABC家族的复制起点。此外，这种至少一个DNA节段可以包括发根土壤杆菌的Ri质粒复制起点(oriRi)和/或来自豆根瘤菌的质粒p42b的repABC起点。更进一步地，repABC家族优选地含有复制基因repA、repB和repC。这种至少一个节段也可以含有基因间区域序列——igs1和igs2。更进一步地，这种至少一个DNA节段可在repC后包括16-bp的回文序列。

在本文用法中，“repABC”质粒的“复制起点”，即质粒利用这些序列在细胞中复制并分配，可以定义为含有repA(譬如，来自发根土壤杆菌中pRi的SEQ ID NO：32；来自豆根瘤菌中p42b的SEQ IDNO：38)、repB(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQ ID NO：SEQ ID NO：33；来自豆根瘤菌中p42b的SEQ ID NO：39)、repC(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQ ID NO：SEQ ID NO：34；来自豆根瘤菌中p42b的SEQ IDNO：40)、igs1(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQ ID NO：35；来自豆根瘤菌中p42b的SEQ ID NO：41)、igs2(譬如，来自发根土壤杆菌的SEQ ID NO：36；来自豆根瘤菌中p42b的SEQ ID NO：42)，并可以选择性地含有回文序列(譬如，SEQ ID NO：37)。在其它实施方案中，复制起点可含有在植物细胞转化用细菌细胞中维持低拷贝数(例如，1到约3个拷贝)所必需的那些序列。这些repABC复制起点的实施例可在SEQ ID NOs：1-4中、在发根土壤杆菌中pRi质粒的oriRi中、在豆根瘤菌的p42b质粒中、以及其它来源中找到。

在一个实施方案中，上述至少一个节段如SEQ ID NO：1所示。在其它实施方案中，这种至少一个节段主要上由下列序列所组成：如SEQ ID NO：2所示的pMON83882碱基中5618个bp(633-6250)的oriRi。在另一个实施方案中，这种至少一个节段含有和/或主要由如SEQ ID NO：3中所示的序列组成。在另外一个实施方案中，这种至少一个节段可以是如SEQ ID NO：4所示的来自豆根瘤菌的p42b的repABC。

那些与本文所定义的任意核酸或多肽序列有着特定程度的相似性的序列也包含在本文所定义的任意核酸或多肽序列定义内。例如，应注意到本文虽然给出了明确的核酸序列，但可在不偏离本发明范畴的情况下对所述序列进行修饰。具体地，与本文给出的核酸序列基本上一致的核酸序列可用于本发明。如果一个初始的核酸序列与其它核酸序列(或其互补链)进行优化比对(在比对窗口中适当的核苷酸***或者缺失总数低于参考序列的20％)时，在至少有200个核苷酸位点——优选地为至少300个核苷酸位点、更优选地为至少400个核苷酸位点、最优选地是覆盖第一个核酸全长的比对窗口中，它们有至少约75％的核苷酸序列同一性，优选地为至少约80％的同一性，更优选地为至少约85％、86％、87％、88％或89％的同一性、最优选地为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，则第一个核酸序列与参考核酸序列表现出“基本上同一的”。可以根据Pearson and Lipman(1988)的相似性方法对在比对窗口中所比对的序列进行优化比对；优选地可通过用计算机来执行Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics ComputerGroup，Madison，WI中的这些算法来进行。参考核酸可以是全长分子或者更长分子的一部分。

或者，如果两个核酸可以在严谨杂交条件下彼此杂交则它们具有实质上的同一性。术语“严谨杂交条件”定义为试验序列可特异性与靶序列杂交而不会同非靶序列杂交的条件，可根据经验来确定。术语“严谨条件”就其功能而言定义为与通过特定杂交程序的一个核酸探针与靶核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)的杂交有关(参见，例如Sambrook et al.，1989，在9.52-9.55，Sambrook et al.，1989在9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa，1984；及Wetmur and Davidson，1968)。适合用于DNA杂交的严谨条件为，例如，约45℃的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后于50℃用0.2×SSC清洗。这类方法的细节对于本领域的技术人员而言是已知的，可在包括但并不限定于CurrentProtocols in Molecular Biology(1989)这样的实验室手册中找到。在某些实施方案中，可通过将清洗改变成50℃、约2.0×SSC而使用更低的严谨条件。此外，清洗步骤中的温度可以从低严谨条件时的室温——约22℃，增加到更高严谨条件时的约65℃。温度和盐均可变化，或者温度与盐浓度中的一个保持恒定，而改变其它变量。例如，对于高严谨度而言，使用DNA或RNA探针或引物的杂交可于65℃在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s、100μg/mL非特异DNA(譬如，超声破碎的鲑鱼精DNA)中进行，然后于65℃在0.5×SSC、0.5％SDS条件下清洗。

如果一个核酸分子与另一个核酸分子表现出完全的互补性，则说它们“互补”。在本文用法中，当一个分子中的每个核苷酸均与其它分子中的核苷酸互补时，则说分子表现出“完全的互补性”。如果两个分子彼此杂交后具有足够的稳定性可使它们在至少是常规的“低严谨度”条件下彼此保持退火，则说这两个分子“最低程度上互补”。类似地，它们彼此杂交后具有足够的稳定性可使它们在常规的“高严谨度”条件下彼此保持退火，则说分子是“互补的”。可以预料到，只要探针或引物与靶序列结合的特异性仍有保留，诸如更低杂交和/或清洗温度这样的低严谨度杂交条件可用于鉴定具有更低程度序列相似性的相关序列。因此，可使用本发明的核苷酸序列，它们可与互补的延展DNA片段选择性地形成双螺旋分子。通过杂交来检测DNA片段对于本领域的技术人员而言是周知的，因此依赖于预设好的用法，人们期望使用不同的杂交条件来获得程度不同的探针对靶序列的选择性，所选择的方法依赖于所期望的结果。在Sambrook，et al.(1989)中由Haymes et al.(1985)描述了常规的严谨条件。

本发明中DNA构建体可以通过合适的土壤杆菌介导的植物转化方法引入到所需植物宿主的基因组中。通过根癌土壤杆菌介导的转化来转化植物的方法包括：Fraley et al.，(1985)和Rogers et al.，(1987)。通过使用基因工程改造过的属于土壤杆菌属的土壤细菌可实现土壤杆菌介导的转化。有几个土壤杆菌物种可介导称为“T-DNA”的特定DNA的转移，T-DNA经基因工程改造后可携带任意所需的DNA片段进入到许多植物物种中。推进T-DNA介导的发病机理的主要事件是导入致病基因，然后进一步发展并转入T链。其可参阅许多综述文章(Ream，1989；Howard and Citovsky，1990；Kado，1991；Winans，1992；Zambryski，1992；Gelvin，1993；Binns and Howitz，1994；Hooykaas andBeijersbergen，1994；Lessl and Lanka，1994；Zupan and Zambryski，1995)。诸如苜蓿中华根瘤菌，根瘤菌、百脉根中间根瘤菌这样的非土壤杆菌物种，也可用于使用本发明的DNA构建体来转移基因(Broothaerts et al.，2005以及美国临时申请60/800,872，作为参考并入本文中)。也可使用其它将DNA导入细胞的方法。这些方法对于本领域的技术人员而言是周知的，并可包括诸如显微注射、电穿孔及基因枪法这样的化学方法及物理方法。

植物细胞再生技术依赖于控制好组织培养物生长培养基中特定的植物生长素，也典型地依赖于与所需核苷酸序列一起导入的生物杀灭剂和/或除草剂标记。对于来自豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿、大豆、苜蓿等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风草)、十字花科(Cruciferae)(甘蓝、萝卜、油菜/油菜籽等)、葫芦科(Cucurbitaceae)(各种瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、大麦、水稻、玉米等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、烟草、番茄、胡椒)、诸如向日葵这样的多种开花作物、诸如杏、腰果、胡桃及美洲山核桃这样产坚果的树木的宿主，已有具有合适流程的方法可供选择。参见，例如，Ammirato et al.(1984)；Shimamoto et al.(1989)；Fromm(1990)；Vasil et al.，(1990)；Vasil et al.(1992)；Hayashimoto(1990)；and Datta etal.(1990)。在Klee et al.(1987)中有关于这类再生技术的一般性描述。在本发明实践中通过向植物基因组中引入转基因DNA构建体的方式来转化植物的方法及组合物可包括任何众所周知的及阐释过的方法。例如，在US5,824,877、5,591,616和6,384,301中阐明了土壤杆菌介导的转化，它们作为参考并入本文中。

可通过实施本发明所生成的植物包括任何经历了转化与再生的植物，包括但并不限定于刺槐、紫花苜蓿、小茴香、苹果、杏、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆子、甜菜、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、大白菜、樱桃、芫荽叶、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、森林树木、葫芦、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、桔子、观赏植物、木瓜、香芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、波萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、榅桲、智利松、菊苣、萝卜、覆盆子、水稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、糖、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、橘子、茶、烟草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麦、山药及绿皮西葫芦。在优选的实施方案中，植物是大豆、玉米、油菜或棉花植物。在具体的实施方案中，所述植物是玉米植物。在具体的实施方案中，植物是大豆植物。在其它实施方案中，植物是棉花植物。在更进一步的实施方案中，植物是油菜植物。

本方法给出了改良后的转化效率，显著降低了用载体骨架DNA——或“非T-DNA”转化的植物的频率。在某些实施方案中，用非T-DNA转化的植物的频率低于或等于约20％。在某些实施方案中，用非T-DNA转化的植物的频率低于或等于约15％，或低于等于约10％，或低于或等于约8％或5％。此外，本发明的方法给出了非常高的单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件。例如，在某些实施方案中，使用Southern印迹测量时，单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率大于或等于约70％或75％。在某些实施方案中，使用Southern印迹测定时，该频率大于或等于约80％或85％，在某些情况下，为90％或95％。

在某些实施方案中，用非T-DNA载体区转化植物的频率比用不含诸如本发明中oriRi元件这样的repABC元件的植物转化载体所转化的同样植物变种中T-DNA的频率低约50％、40％、20％、15％、10％。在其它实施方案中，单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率比用不含诸如本发明中oriRi元件这样的repABC元件的植物转化载体所转化的同样植物变种中单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率高约50％、40％、20％、15％或10％。

因此，本发明中特定的实施方案提供了使用含有本文所示的序列在内的、诸如来自发根土壤杆菌的oriRi及来自豆根瘤菌中质粒p42b的repABC起点这样的repABC元件，降低非T-DNA载体区所转化的植物的频率的方法。本发明还涉及含有本文所示的序列在内的、诸如来自发根土壤杆菌的oriRi及来自豆根瘤菌中质粒p42b的repABC起点这样的repABC元件在增加单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件的频率中的用途。在某些实施方案中，可同时使用两种方法以实现具有更低骨架整合频率以及更高单拷贝或双拷贝T-DNA转化事件频率的转化事件。

实施例

提供下述实施例是为了更好低阐明本发明，不应以任何方式理解为限制了本发明的范畴。本领域的技术人员知道在不背离本发明思想及范畴的情况下，可对本文所述的方法及基因进行多种修饰、添加、取代、截短等。

实施例1

载体的制备

按照Sambrook et al.(1989)所述的标准流程来进行克隆步骤。使用经DraI消化从pCGN1589上切下的5.6kb的oriRi片段来替换经PshAI和BstXI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pMON67438上的oriV片段。从而生成基于oriRi的载体pMON83856(图1)。通过将来自oriV控制载体pMON67438的gus和CP4片段用AccI(平端化)/BamHI消化后***到已用PmeI/BamHI打开的pMON83856中，从而生成5.6kb的oriRi试验载体pMON83882(图2)。为了截短oriRi片段，合成了5’CACGTGTACAAGGTAGAATCCGCCTGAG 3’(oriRi 5’启动子上游；SEQ ID NO：5)和5’GTATACAGGCTCTCCTTCACGATCAAC 3’(oriRi 3’端，在repC后面；SEQ ID NO：6)，并使用高保真pfu聚合酶以pMON83856为模板进行PCR。纯化PCR产物并***到经AfeI和XhoI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pMON83930中，以替换oriV片段。然后将所获得的具有截短的oriRi的载体pMON83934(图3)通过DNA测序进行确认。为了生成具有截短的oriRi的试验载体pMON83937(图4)，使用KpnI打开pMON83934，用T4DNA聚合酶补平，随后经BamHI消化；然后将来自oriV控制载体pMON67438的gus和Cp4片段用AccI消化，用T4 DNA聚合酶补平，之后进一步用BamHI消化。将两个片段用T4 DNA连接酶连接后形成pMON83937。

为了构建玉米转化载体pMON97352(图5)，将两个寡聚物5′-AGCTTGGGCCCCTCGAGGCTAGCACTAGTG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GATCCACTAGTGCTAGCCTCGAGGGGCCCA-3′(SEQ ID NO：8)退火合成含有SpeI和PspOMI位点的连接物序列，***到经BamHI和HindIII消化的pMON83856中。用SpeI和PspOMI打开所获得的中间oriRi载体，与经NotI和SpeI消化从pMON92726(图6)上切下的CP4及gus表达盒连接(参见图5，pMON97352)。使用oriV亲代载体pMON992726作为对照载体与玉米oriRi试验载体pMON97352进行比较。

为了构建oriV 2T对照载体pMON87488(图7)，从pMON51676上切下章鱼碱右边缘，用T4 DNA聚合酶补平后***到经SalI/SpeI打开、T4 DNA聚合酶补平并用CIP处理的pMON87485中。为了生成oriV 2T载体——pMON96001(图8)和pMON96010(图9)，用AfeI和XhoI除去pMON87488上的oriV，将载体用T4 DNA聚合酶补平，然后***通过用PmlI和BstZ17I消化pMON83934从pMON83934获得的4.2kb的oriRi复制子，生成pMON96001。***通过用DraI消化获得的来自pCGN1589的5.6kb的oriRi复制子以生成pMON96010。

实施例2

大豆作物转化

可使用本领域已知的多种方法通过土壤杆菌介导的转化来转化大豆细胞并将细胞再生成完整的可繁殖的植株。一种用于大豆转化的方法(譬如，US6,384,301和7,002,058)使用了器官形成方法。

将本发明所述的DNA构建体(譬如，如图2中充分所示的质粒pMON83882、如图4中充分所示的质粒pMON83937)转化到无害的土壤杆菌菌株ABI中。将两个oriV对照载体——pMON67438和pMON83898(GOI相同但方向不同)也转入到土壤杆菌细胞中。前述的双T-DNA构建体以及各自的对照也用来转化大豆。DNA构建体通过电穿孔方式转入土壤杆菌中。在含50mg/l(对于oriRi载体)或75mg/l(对于oriV载体)壮观霉素及50mg/l卡那霉素的LB培养基上挑取单克隆，并在20-50ml含有相同选择物的液体LB培养基中于摇床上以200rpm温育。通过来自10ml培养物的少量制备的质粒的限制性内切酶消化来鉴定土壤杆菌中的质粒。剩余的液体培养基与甘油混合，终浓度为20％，分装后作为菌种培养物保藏在-80℃。

为了制备用于转化的土壤杆菌接种物，将0.25-1ml冷冻的菌种培养物接种到含有相同上述抗生素选择物的250或500ml LB培养基中，于26℃-28℃、200rpm振荡培养过夜至中对数生长期。在分光光度计上测定OD₆₆₀约0.3时将培养物离心，并直接悬浮在接种培养基(INO培养基)中。

按照描述(譬如，US7,002,058)使用大豆栽培种A3525来进行土壤杆菌介导的转化。将大豆种子于室温下在BGM培养基中生长少于14小时，然后利用如US申请20050005321中所述的机器从大豆成熟种子中切下分生组织外植体。为了分批超声裂解，将约100个PLANTCON盖子中的外植体与20ml INO培养基中的土壤杆菌悬浮液混合，然后在W-113Sonicator上超声20秒。对于大批超声裂解，将约1000个PLANTCON盖子中的外植体与100ml INO培养基中的土壤杆菌悬浮液混合，然后超声20秒。超声后，在同一个PLANTCON中的外植体于23℃、16/8小时光照/黑暗周期的条件下共培养2-4天。然后将外植体转移到含75μM草甘膦的WPM选择培养基表面。每个PLANTCON含有约50个外植体。2周后，将外植体与***到培养基中的初生胚根再次转移到75μM草甘膦固体WPM培养基上，每个PLANTCON含有约25个外植体。将接种6-10周后获得的具有完全延展的三片叶子的幼芽定植在含有0.1mg/l IAA和25μM草甘膦选择物的BRM培养基中。将生根的幼苗转移到温室中至成熟。大豆转化中所用的多种培养基详细列于下面表1中。

上述转化和再生方法可使植物明显降低出现载体骨架DNA。此外，减少***的T-DNA的拷贝数也使植物获得额外收益。通过这种方法生成的植物是本发明的一个方面。

通过本领域已知的植物转化与组织培养方法可转化其它双子叶植物细胞。在本领域，使用土壤杆菌介导的方法来转移本发明的质粒的T-DNA是众所周知的。例如棉花(US5,004,863、5,159,135、5,518,908、5,846,797和6,624,344，作为参考并入本文中)和芸苔(US5,750,871)。

实施例3

玉米作物转化

将两个含有相同的均在水稻肌动蛋白启动子控制下的植物选择标记基因CP4和gus基因盒的载体(图5)——pMON97352(oriRi，在土壤杆菌中单拷贝)和pMON92726(oriV，在土壤杆菌中多拷贝作为对照)，电穿孔转入根癌土壤杆菌菌株ABI中以用于玉米转化。将甘油储液中的、含有载体的土壤杆菌在添加了抗生素(均为活性成分)卡那霉素(40mg/L)、壮观霉素(31mg/L)、链霉素(38mg/L)和氯霉素(25mg/L)的固体LB培养基上划线，然后于28℃培养2天。在用土壤杆菌接种玉米未成熟胚前两天，从土壤杆菌平皿上挑取一个克隆或者一小环土壤杆菌，接种在250mL烧瓶内的25mL添加了62mg/L壮观霉素及40mg/L卡那霉素的液体LB培养基中。将烧瓶置于摇床上于27-28℃以约150-200rpm过夜。然后在同样的液体培养基中将土壤杆菌培养物进行稀释(1到5)，并放回摇床。几个小时后，在接种前一天，于3500rpm、15分钟离心土壤杆菌细胞。将细菌细胞沉淀重悬在含200μM乙酰丁香酮和50mg/L壮观霉素及25mg/L卡那霉素的诱导培养基中，调整细胞在OD₆₆₀的密度为0.2。然后将细菌细胞培养物(每个250mL烧瓶50mL)放回摇床并培养过夜。在接种日的早晨，将细菌细胞离心并用添加了200μM乙酰丁香酮的液体1/2MS VI培养基(表2)清洗。再一次离心后，将细菌细胞沉淀物重悬在添加了200μM乙酰丁香酮(表2)的1/2MS PL培养基(表2)中，调整细胞在OD₆₆₀的密度为1.0以进行接种。

试剂均为商品，可从许多厂商(参见，例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)购买。

在本研究中使用的是玉米谱系LH244(US6,252,148)。收集含有未成熟胚的穗并在使用前于4℃冷藏保存。从表面灭菌的穗上分离未成熟的胚，直接置于微离心管中已制备好的土壤杆菌细胞悬浮液中，温育5到20分钟。用细头的灭菌的移液管吸除土壤杆菌细胞悬浮液后，将未成熟的胚转移到共培养培养基上(表2)。于黑暗培养箱中培养胚(23℃)约24小时。

共培养后，将胚转移到添加了500mg/L羧苄青霉素和0.1mM草甘膦的改良的MS培养基上(诱导MS，表2)，于30℃生长2星期，然后在黑暗培养间于27-28℃再生长1周。然后将所有的愈伤组织小块分别转移到第一种再生培养基上——与上述相同的培养基，只是2，4-D和毒莠定被替换为3.5mg/L BAP(MS/6BA，表2)，并且羧苄青霉素的水平下调为250mg/L。将培养物移到光周期为16小时光照/8小时黑暗及27℃的培养间中。5-7天后，将愈伤组织小块转移到第二种再生培养基(MSOD，表2)上。在另外两周后，将已经具有再生的芽的愈伤组织小块转移到Phytatrays的同样不含激素的培养基中以进一步生长。将具有一个或多个健康根的再生植物(R0)移到温室内泥炭罐中的土壤里。7到10天后，将它们移植到12英寸的罐中并移到条件适于普通玉米植物生长的暖房中。植株可以自花授粉或与野生型植株杂交。

实施例4

对骨架DNA及拷贝数的分子分析

A.用单T-DNA构建体转化大豆

从使用本发明的DNA质粒转化的、在暖房中生长的植物上所采集的组织样品中提取DNA。利用分析DNA的PCR方法使用repA正向引物5-ACAAGGTAGAATCCGCCTGAG-3′(Xd487b；SEQ ID NO：11)和repA反向引物5-TTCAACTCTGGCATCTCAGAC-3′(Xd488；SEQ ID NO：12)来检验oriRi序列用作载体骨架的指示物。该DNA与LB相邻，并且在从再生植物所提取的DNA中有其存在表明发生了越过LB的载体序列的转移。可通过许多方法，例如CTAB法(Rogers et al.，1985)或DNAeasy 96Plant Kit(Cat.#69181，Qiagen Inc.，Valencia，Calif.)按照所附的使用说明从植物组织中分离DNA。

(PE Applied Biosystems，FosterCity，Calif.)是一种检测及鉴定DNA序列存在的方法，可根据厂商提供的手册来完全理解它。在所述方法中使用DNA引物分子(SEQ IDNO：11和12)来鉴定来自植物提取物的oriRi DNA。本领域中的技术人员可改进条件与仪器以获得相同的结果。

用对照DNA质粒(pMON67438或pMON83898)和本发明的质粒(pMON83882或pMON83937)转化从成熟种子中切离的大豆分生组织茎轴，然后再生成完整植株。分析完整植株是否存在目的基因(CP4)以及非T-DNA oriRi和oriV序列。表3给出了分析结果。

在检验的39个植株中，只有3个具有载体骨架序列，频率为7.7％。相比之下，对照质粒(oriV质粒)的载体骨架频率为21％到25％(依赖于所考虑的样本)。这一差异是相当出乎意料的。

已商品化的转基因植物的另一个重要特征是存在低***复杂性(low insert complexity)。这通常是指“低拷贝数”。如果***的拷贝数过高则很难选择后代并成功培育转基因性状。理想地，在转基因事件中只有单个拷贝的转基因。

可通过本领域已知的几种分子生物学方法来确定拷贝数。Southern印迹分析是最为常用的方法。使用

技术(Third WaveInc.Madison，WI)的方法也用来确定转基因植物中T-DNA***的拷贝数。

用对照DNA质粒(pMON67438)和本发明的质粒(pMON83882)转化大豆植物细胞，然后如上所述再生成完整的植株。用两种方法来分析所获得的转基因植株中的拷贝数：1)“Invader CP4”方法及2)Southern印迹。结果如表3所述。

表3.pRi ori载体骨架影响转化频率、拷贝数及大豆转化中的***片段。^a来自三个并列实验的混合数据。^b并列比较的植物数^c所产生的pMON67438植株的混合的植物数。

pMON	TFa	]骨架	Invader CP41拷贝	Invader CP41+2拷贝	SouthernGUS拷贝#
						83882(5.6kboriRi)	1.26％	7.7％(3/39)oriRi	41％(16/39)	79.5％(31/39)	56.4％(22/39)1拷贝33.3％(13/39)2拷贝
67438(oriV)	1.4％	21％(8/38)b25％(56/226)coriV	37％(14/38)25％(57/226)	60％(23/38)63％(142/226)	N/AN/A

使用“Invader CP4”方法，本发明的质粒——pMON83882可导致41％的单拷贝转化事件，相比之下，对照质粒pMON67438的单拷贝转化事件在使用其它实验的混合样本时仅有25％，或者在并列实验中仅为37％。将单拷贝和双拷贝事件一起考虑，pMON83882导致了79.5％的所述事件，相比之下，使用对照质粒，在并列实验中为60％，在混合样本中为63％。使用Southern印迹比较，pMON83882产生的单拷贝事件为56.4％，双拷贝事件为33.3％，合并起来就是总共约90％的单拷贝及双拷贝事件。此外，这些结果均是相当出乎预料的。

B.在大豆双T-DNA转化子中转基因拷贝数的分子分析。

为了分析oriRi对2T-DNA转化子的影响，6次并列比较了4.2kb的oriRi 2T载体pMON96001和oriV 2T载体pMON87488。5.6kb的oriRi 2T载体pMON96010也包括在这些预实验的最后两次比较实验中(表4，组A)。从采自暖房成熟种子的种子碎片中提取总DNA，并通过利用CP4探针和NOS探针的Invader技术来确定转基因拷贝数。CP 4

检测实验使用下述序列作为靶位点：5’TCGCTTTCCTTGACGCGGAGTTCTTCCA GACCGTTCAT CACGG 3’(SEQ ID NO：13)，以GTAGGTGATTGGCGTTG(SEQ ID NO：14)作为探针序列。NOS检测实验使用下述nos 3’序列作为靶位点：TGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACT(SEQ IDNO：15)，以GTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA(SEQ ID NO：16)作为NOS

探针序列。

单和/或双拷贝转化子从对照oriV载体中的35％增加到两个oriRi载体中的超过40％。在R0植株中没有标记物的植株的频率(没有标记物的事件/总R0植株)从对照oriV载体中的4.76％，在两个oriRi载体中分别增加到16.4％和18.4％。总的说来，在双oriRi 2T载体中，没有标记物的转化的频率(没有标记物的事件/最初移植的数目)与oriV 2T载体中的相比要高两倍。

用其它有着更大最初移植数目的平行实验进一步来比较oriV对照2T载体与4.2kb的oriRi 2T载体(表4，组B)。oriRi 2T载体重现了上述结果：1+2拷贝事件频率和没有标记物的频率(MF％)均增加了，并且没有标记物的转化频率比oriRi载体中的要高两倍。这些结果表明通过增加低拷贝事件以及提高没有标记物的转化频率，oriRi2T载体明显比oriV 2T载体可更加有效地产生没有标记物的植株。

表4.复制起点的类型对于2T-DNA载体转化大豆的影响。注：1)TF：转化频率＝R0植株/总外植体；2)1+2拷贝Co-T：1和/或2个拷贝的gus和CP4标记的2T-DNA共转化子。只有1-2个拷贝事件进一步用来分析种子中标记物的分离；3)MF事件：通过种子分离分析来自1+2拷贝的共转化子中的gus基因阳性、没有标记物的事件；4)MF％植株：gus阳性、没有标记物的植株/R0植株#；5)没有标记物的转化频率(MF TF)＝不连锁事件#/起始外植体#。

C.单T-DNA构建体转化的玉米中载体骨架DNA与转基因拷贝数的分子分析

为了研究oriRi复制起点对玉米转化的作用，将含有均在水稻肌动蛋白启动子控制下的gus和CP4基因的5.6kb的oriRi载体pMON97352与带有含gus和CP4基因的相同T-DNA构建体的oriV载体pMON92726进行比较。将来自栽培种LH244的玉米未成熟胚与含有oriRi或含有oriV载体的土壤杆菌同时进行温育。每个处理组均由约110个胚组成。进行了总共16个并列比较实验(side by sidecomparison experiments)。oriRi载体比oriV对照载体明显表现出更低的转化频率(图10)，对于oriRi和oriV载体平均TF分别为9.5％和16.3％。不过，oriRi和oriV载体的全部转化效率是相同的。

通过Endpoint

检验(Applied Biosystems，Foster City，CA)来确定转基因玉米植物中是否存在骨架序列——针对oriRi或oriV序列、靠近LB缺刻位点的简短通读(short read-through)3’侧翼区的LB序列以及在RB缺刻位点前的用于通读完整骨架的5’侧翼区的RB序列。oriV引物为5′AACGCCTGATTTTACGCGAG 3’(正向；SEQID NO：17)和5′CAATACCGCAGGGCACTTATC 3’(反向；SEQ ID NO：18)以及用荧光染料6-FAM在5’末端进行标记的探针CCCACAGATGATGTGGAC(SEQ ID NO：19)。oriRi引物为TGGCAAGGAATGGGTTTGAG 3’(正向；SEQ ID NO：20)和5’CTACAACTACAGGCGCTGCTTTT 3’(反向；SEQ ID NO：21)及探针6-FAM-TGGCGAAGTCTGTCC(SEQ ID NO：22)，用于检测LB缺刻位点下游621bp处的oriRi序列。RB 5’侧翼引物为5’GCCAAGGGATCTTTTTGGAAT 3’(正向；SEQ ID NO：23)和5’CCACCCAAACGTCGGAAA 3’(反向；SEQ ID NO：24)及探针6FAM-TGCTCCGTCGTCAGG(SEQ ID NO：25)，用于检测RB缺刻位点前186bp的RB侧翼。用于检测LB缺刻位点下游35bp处的LB的引物为5’GCACCCGGTGGAGCTT 3’(正向；SEQ ID NO：26)和5’TCTGCCTAACCGGCTCAGT 3’(反向；SEQ ID NO：27)以及在5’末端标记荧光染料6-FAM的探针CATGTTGGTTTCTACGCAG(SEQ ID NO：28)。根据厂商的说明书(Applied Biosystems，Foster City，CA)，约10ng DNA用于Endpoint

反应。

如图11所示，约95％的来源于oriRi载体的转基因植物是不含骨架的，这明显优于表现出约78％不合骨架频率的oriV载体对照。由于载体骨架起始于缺刻位点后的LB终止于RB缺刻位点前，在来源于植物的oriRi和。oriV载体中使用三种不同的骨架探针(LB下游、oriRi/oriV和RB上游)可揭示绝大多数转移的载体骨架含有完整的载体骨架序列。

根据厂商的说明书(Third Wave Technologies Inc.Madison，WI)使用CP4序列通过

检验来确定CP4转基因拷贝数。使用

技术(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过确定gus盒转录终止子pinII(如图5和6中的Pis 4所示)来测定gus转基因拷贝数。pinII

引物为5’ATGAAATAAAAGGATGCACACAT 3’(正向；SEQ ID NO：29)和5’ACAACTTTGATGCCCACATT 3’(反向；SEQ ID NO：30)以及在5’末端标记荧光染料6-FAM在3’末端标记MGBNFQ的探针TGACATGCTAATCAC-(SEQ ID NO：31)。

图12所示的是转基因拷贝数试验结果。oriRi载体比对照oriV载体显著地增加了单拷贝植株频率，在。oriRi载体中2或多拷贝事件的频率却降低了。用两种不同探针的和

检验给出了类似的结果。由于不含单拷贝骨架的植株在研究与开发上是最具价值的，因此在玉米中增加了单拷贝频率并降低了含有骨架事件的。oriRi载体标志着在转基因项目生产品质上的一个重大改进。

实施例5

构建含有来源于根瘤菌的repABC复制起点的植物转化载体

为了克隆来自豆根瘤菌CFN42株的repABC复制起点，从USDARhizobium Collection Center获取USDA菌株。通过PCR使用引物5’CCACGTGAGTTACGGCTGATCGACCAGAC 3’(Xd745；SEQ ID NO：9)和5’GCCTAGGACGTCAACTCCAACCGCACCGT 3’(Xd746；SEQ ID NO：10)从在菌株CFN42中发现的豆根瘤菌质粒p42b上扩增4.3kb的repABC片段，并连接到TOPO平端克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上，获得pMON96941，通过测序来进行确认。用PmlI和AvrII(在引物序列中用下划线标出)消化repABC片段，并连接到用SmaI和AvrII打开的pMON96948上。直接将连接产物转入到根癌土壤杆菌AB2(卡那霉素敏感株)感受态细胞中，涂布在含有50mg/l卡那霉素的LB平皿上。将kan抗性克隆在含有50mg/l卡那霉素的液体LB培养基中温育，并用miniprep制备质粒DNA。通过限制性消化来确认构建体。由于载体pMON96951不含有大肠杆菌复制起点，它无法在大肠杆菌内维持。

如上所述使用pMON96951(图13)来转化植物物种。通过实施例4中所述方法来分析减少了质粒骨架整合以及高频率的低拷贝转化事件的转基因事件。

通过对本文所述的说明及实践进行仔细思考，对于本领域的技术人员而言本发明的其它实施方案是显而易见的。应注意到说明和实施例只是用来作为示例，本发明的真正范畴与主旨如下面的权利要求所示。

参考文献

以下作为参考并入本文中：

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序列表

    <110>YE，XUDONG

         GILBERTSON，LARRY A.

         PETERSON，MICHAEL W

    <120>提高植物转化效率的载体和方法

    <130>MONS：124WO

    <140>未知

    <141>2006-09-06

    <150>60/714,501

    <151>2005-09-06

    <160>44

    <210>1

    <211>7299

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>1

    agatcctaca aggtagaatc cgcctgagtc gcaagggtga cttcgcctat attggacgac

60

    ggcgcgcaga gggcgacctc tttttgggtt acgattgtag gattatcact aaaacaatac

120

    atgaacatat tcaaatggca atctctctaa ggcattggaa ataaatacaa ataacagttg

180

    ggtggagttt ttcgacctga gggcgttaac cttctgttaa cctaaaagct cttgcccaaa

240

    cagcagaatc ggcgctaatt gccagcggcg gaacttttcc agtttcgcga aaaatatcgc

300

    cactggcaag gaatgggttt gagatggcga agtctgtcct aaaagcagcg cctgtagttg

360

    tagggttgac ggccttgatg gagcgtcatg ccgatgccct ctcgagccaa cttcaagcac

420

    atcatcttaa ggttttcccg ccgcattccg agaagggcat tcgaacattc gggccatcgg

480

    aggcgtccaa gctgctcggc gttggcgagt catatttacg gcagaccgcg tctgagatgc

540

    cagagttgaa tgttagcatg agcccgggtg gcaggcgaat gttctcaatt gaagatatcc

600

    atgtgattcg gaagtatatg gatcaggtcg gccgcgggaa ccggcgctac ctgccacatc

660

    gtcgaggcgg cgagcagctt caggttatct ctgtgatgaa tttcaaaggt gggtcgggta

720

    agaccaccac cgccgcgcat ctggcgcagt acctcgctat gcgcggatat cgagtcttgg

780

    ccattgatct cgatcctcaa gcgagccttt ctgcactctt tgggagccaa ccggagacgg

840

    acgttggccc gaacgaaacg ctctacggcg ctataaggta tgatgatgag caggtggcaa

900

    tcgaacgagt cgtccgaggg acttacattc ccgacctcca cctgattcct ggtaaccttg

960

    agctgatgga gtttgaacac gatacgccac gcgcgctgat gaaccgcaaa gagggcgaca

1020

    cgctctttta tggtcgcatc agccaagtaa ttgaagatat cgcggataac tatgacgtcg

1080

    tggtcatcga ctgccctccc cagcttgggt atctcacgct atccgcattg actgcggcga

1140

    cgtccattct tgtcacggtc catccgcaga tgctggatgt gatgtcgatg aaccagtttc

1200

    tggcaatgac atcgaacctt ttgcgtgaaa tcgagaatgc tggcgccaag ttcaagttta

1260

    attggatgcg ctatctgata acccgtttcg aaccgagcga cggaccacag aaccaaatgg

1320

    taggttatct gcggtcgatt tttggcgaaa atgtcctcaa ttttccgatg cttaaaacca

1380

    ccgcggtttc ggacgctggc ctgacaaacc agactctatt cgaagtggag cgtggcctgt

1440

    tcacgcgctc gacctatgat cgagccttgg aggcgatgaa cgccgtcaac gacgagatcg

1500

    aaacactgat caaaaaagca tggggtaggc ccacatgagc cggaagcaca tccttggcgt

1560

    ctcaactgac gcccctgaga cgtcgcccgc cgacaatagg acggcaaaga accgctccat

1620

    gccgctcctc ggcgtaacaa ggaaggagcg cgatccggca acgaagctca cagcgaacat

1680

    tggtaacgca ctgcgagagc aaaacgatcg tcttagccgt gccgaagaga tcgagcggcg

1740

    tctcgctgaa ggtcaggcag tgatagagtt ggatgcctcg tcaatagaac cgtctttcgt

1800

    gcaggatcgt atgcgagggg acattgacgg gctccttact tcgatccggg aacaaggaca

1860

    gcaagtccca atccttgtgc gaccgcatcc gagccagccg ggccgatatc aggttgcctt

1920

    cggccaccgc cggctacgcg ccgtttcaga actcggactt ccggtcagag cggtcgttcg

1980

    cgaactgacg gacgagcaag tggtcgtagc acagggtcag gaaaacaatg agcgcgaaga

2040

    tcttaccttc atcgaaaagg cgcgcttcgc acatcgcctg aacaggcagt tttctcgaga

2100

    gattgtcatc gccgcgatgt cgatcgacaa gagcaatttg tccaagatgc ttctgctcgt

2160

    cgacgccctc ccctctgaac tgaccgatgc tattggtgcc gctcctggtg ttggacggcc

2220

    gagttggcaa caacttgccg agctgattga gaaagtttct tcaccggccg acgtggctaa

2280

    atatgctatg tcggaggaag ttcaagcgct gccatcggca gaacgattca aggcggtgat

2340

    cgctagtctg aagcccagtc gggttgcgcg tggacttccc gaggtcatgg ccaccccaga

2400

    cggcaccaga attgcacagg tgacgcagag caaggccaaa ctggaaatca cgattgacag

2460

    gaaggcgacg cccgattttg cgaccttcgt gctcgatcat gtgccagcgc tgtatcaagc

2520

    gtaccacgct gagaaccaac ggaaacgggg agagtaaacc gcaaaagaaa agagccccct

2580

    caacgtcgcc gtcgcggaag cccttctgtc tctctagcgc gaacagaatc gcatttcctc

2640

    gaatcctcgt caagagtttt tagcgccgtt ttggtgagct gatttccttt gcctgctgaa

2700

    aggtgaaaga tgatgcagac aggaagtgta acgacgccat tcgggcggcg gccaatgacg

2760

    cttgcgcttg tgcggcgcca gacggcgctg gccgatatca aacaaggcaa gacagcggac

2820

    aagtggaagg tctttagaga cgcgtccgcg gccatggaac tacttggaat ccagtccaac

2880

    agtcttgccg tccttgatgc gctattgagc tttcacccgg aaacggagtt gcgtcaggag

2940

    gcacagctga tcgtcttccc gtcgaatgct cagcttgccc ttcgggcgca tgggatggct

3000

    ggcgcgactt tgcgtaggca catcgccatg ctcgtggagt caggcttgat cgtccggaag

3060

    gatagcgcca acggaaagcg ttacgctcgt aaggatggcg ctggtcagat cgagcgcgcg

3120

    tttggcttcg atttgtctcc gcttctcgcg cggtccgaag agctagcgat gatggcacag

3180

    caggtgatgg ccgatcgagc agcattcagg atggccaaag aaagtctgac gatttgccga

3240

    cgggacgttc ggaagctaat tacggcagct atggaagagg gagcggaggg cgactggcaa

3300

    gctgtcgagg aagtctatgt ggaacttgtg ggtagaattc cacgcgcccc gacgcttgct

3360

    gatgtagagt caattctcga agagatgtgg atgctccagg aagagataat caaccggttg

3420

    gaaattagag acaattcaga aaataatagc accaatgctg cccagagcga gcagcacata

3480

    cagaattcaa aacccgaatc cgttaatgaa cttgaacctc gctctgaaaa ggagcagggc

3540

    gctaagccga gtgaaataga ccgggcaagg agcgagccga taaaagcgtt ccccctcggg

3600

    atgatcctga aagcatgccc gaccattggc aattatgggc cgagcggtgc ggttgctagc

3660

    tggcgtgacc tcatgtcggc tgcggtggtg gttcggtcta tgctgggggt cagcccgtcg

3720

    gcttaccaag acgcgtgtga ggcaatggga ccggagaatg cggcagcagc gatggcgtgc

3780

    attttggagc gagcgaactt catcaattcg cccgggggct atctccgaga tctgacacgg

3840

    cggagcgagc tcgggaagtt ttcacttggc ccgatgataa tggcgctctt gaaggctagc

3900

    gggcagggga cgttgcggtt tggctagaat tagcgagtat ggagcaggat ggtctgtggt

3960

    cagctgacca cagacctaat aggttgaaaa catgagcgtt ttttggatga tcgacagacc

4020

    atccgattcc cggagtacca agcgtgctct gatgggagcg ataacattac tcaacaagca

4080

    cgaaggcccc atgccgatcg ttgatcgtga aggagagcct gctctacatg cggcggtatt

4140

    ttgccggccg aggcatgtag tcgcggagca ctgcctattt actgccctag gcacaaacgt

4200

    tgactcttgg atcgagctgg cagacaaagc aataacccac acagaggacg attaatggct

4260

    gacgaagaga tccagaatcc gccggacggt actgctgctg ccgaagttga gccggctgct

4320

    cctagaggta gaagagcaaa gaaagcacca gccgaaacag cccgcacggg atcgttcaaa

4380

    tccgtgaagc cgaaaacccg cggcctcagc aaccgagaaa aactggagaa gatcggtcaa

4440

    atcgaagctc aggtcgctgg cggcgcaacc ttgaaggacg ccgttaagat cgtgggtatt

4500

    tccgttcaga cctattatca atggaagaga gctgcggttc aacctgtctc acagaatccg

4560

    gccgtgtctg tttcagttga cgatgaactc ggcgagttca tccaactcga ggaggaaaat

4620

    cggcggctca gaaagctagc ttctctctga aaaattgcgc gcagaaaacg cggacttacg

4680

    caaaagactt ggaatcaact agcggccttt gggggtccct cgctaaatca acttgacgcg

4740

    catctctcaa tgaatgaatg ccttggaaaa tttccgcgca ttctgatcgt tgcgctatca

4800

    agcaatccca atcttctggc atatgaaaaa accacgaccc aaattcgtcg tcgaatataa

4860

    gacgaacagg cgacaagcca aggcccgacc aacgtcaatc tggggcaatc tgggtttgca

4920

    ggcggtgggc cgtgcggtcg cggccgacgg agtcgtgccg aagagtagtc tgccgcaagt

4980

    ccgttccgtc ctggagaagg ttgtcgcgtc caaggttacc gtcgtggtcc ctcggtgctg

5040

    ccaggttttg aggaagagct tgccgctatc gaggcggaaa accgtcgtct gaagcgcctc

5100

    ttgatcgtga agctccgtga ggagaacgac aggcttaagt tcgcgcttcg acgatttggg

5160

    ggcgcctgag cacgatgctg gcccacttgc ttcagcgggc aaacaacatg gagtggagat

5220

    ctaatgatcg cggcgcttga acatcgctag gggtcttcgg cgccgctgaa ccgtgctcca

5280

    ttttgcactc ggagacacag cctcccaaaa acctggcgcc gctcgttggt gaactcctca

5340

    acatcgagcg gatcaaggga aactggaatg acatccttcg acccgtcacg gcgatccgct

5400

    ctggccaggt ccaacctacg gccatgcccg caaagccaac ggcatttcca cgtcaagcac

5460

    attgacccac tcggctgacg gtacatcagc tggcgagctc atccggaccc agacgaactg

5520

    cgttgatctc aggccgttgc ggcagaaaac ctccatcctc gcagccgatc caacactttc

5580

    ctgtggtaat gcctatttca gatgaaacag ccttttttaa acttggcgcg tcattctgat

5640

    attatggcca cacctctacg atctagggag tgcgagaagt ggaaagaaat gaagaacccg

5700

    atttgcacac acatacctcg atgcggaata aaaatgcatc atcgcttggt gaggccctgg

5760

    atgacgatgc gatcgccaac atcgcgcatc acattgttac agacgacccg gtggaaacgt

5820

    caaaaaactt cacaaaactt aagctgatta acaaatcagt gaaacagggt ttcgaacgca

5880

    gtgcgtacgg aaaattccat cgacgcatta gccggcttgg tattgctagt aaggcgctat

5940

    atgacaacgc tgtgccgaag gaaggattcg tagaacatcc tgaatatgct ccagctctgc

6000

    aaagggatta tgcgttggca ggagagcgaa ttgaggcggt tggtggaact ttcaggttgc

6060

    aaacacctca gcggaaatcg gctcttgtag atcatatctt gagtatgccc gaaggtttcg

6120

    atcaagctca tgcccttgag tctatagccc ctcatgttgg cgatctaagc gcggaagatc

6180

    gccatcgtgt tgtgaacaaa atgctcgagc actttgccac cccgtttcaa gaaggggggc

6240

    tgccaaccga cgaaaatttt tgtggaacgt acgctttgtc caaggcgttt cctcatatgg

6300

    aagacagcct aaaagcaaag atgctggatg tggtgttaga gcatcctcac ttagccaacc

6360

    tccattggac gcagagagaa ctagttgaag ggtggcatca agaccgtgaa gctgagaagt

6420

    cagcctggcg ttccaatcaa aagccaattg tcgaggggcg acttgcagac ctcgaacgat

6480

    cgatccacag tgatatcgag gtgacaaaca ggagtgattt tgcgaggatg cgttcagcca

6540

    ggcccttgca acaagctata agcgatacgt tcgatcttgc gcgtgaggag ctcaaaagcc

6600

    gccctcgtga agggcggggt cgataattac atctattggt ctttctgccg aacctctatg

6660

    aaatccgcac gtcaaatgtg gcttttactt cccgatttca attgaagcgc taagctgaaa

6720

    atcccgtccc catttctgac ctaacggttt catcaccggg gcagggagcg gcgcttaaaa

6780

    cggtgacggc caccaccaaa ggacatgttc gctcacgcgg tgcctccgtg cttctttgca

6840

    agagcctgct tcaggctgat gatctccttc agtgcgttgg tgtgaatccg ctccaggcgt

6900

    ttcagttcgc tctccaaata ggcgttgcgc ttatccagcc tcgtccgatc ttcttccaag

6960

    ctctccattt tcactagcgc gttatggtaa ttcaaccgta actcctcaaa aaaagcacgt

7020

    tcggcgacga aatgggtttc ggaatcgagt tcaggtatgt cgccgacatg cacgacgcga

7080

    accgccttgc cggcagcggc gagccgggcg cggtaagcgc gttgaatttc cgcttgggtc

7140

    agcgcgtttg gcttgcgggg ccgcgaggaa atttgggagt aaccataacg gttatttatc

7200

    ataacgcgtt atcactggat agcatcggcg caggcggatg gcgcgcttcg ccgggtcgaa

7260

    atcaatattt ccagatcgag atggattgaa gacctgaag

7299

    <210>2

    <211>5617

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>2

    agatcctaca aggtagaatc cgcctgagtc gcaagggtga cttcgcctat attggacgac

60

    ggcgcgcaga gggcgacctc tttttgggtt acgattgtag gattatcact aaaacaatac

120

    atgaacatat tcaaatggca atctctctaa ggcattggaa ataaatacaa ataacagttg

180

    ggtggagttt ttcgacctga gggcgttaac cttctgttaa cctaaaagct cttgcccaaa

240

    cagcagaatc ggcgctaatt gccagcggcg gaacttttcc agtttcgcga aaaatatcgc

300

    cactggcaag gaatgggttt gagatggcga agtctgtcct aaaagcagcg cctgtagttg

360

    tagggttgac ggccttgatg gagcgtcatg ccgatgccct ctcgagccaa cttcaagcac

420

    atcatcttaa ggttttcccg ccgcattccg agaagggcat tcgaacattc gggccatcgg

480

    aggcgtccaa gctgctcggc gttggcgagt catatttacg gcagaccgcg tctgagatgc

540

    cagagttgaa tgttagcatg agcccgggtg gcaggcgaat gttctcaatt gaagatatcc

600

    atgtgattcg gaagtatatg gatcaggtcg gccgcgggaa ccggcgctac ctgccacatc

660

    gtcgaggcgg cgagcagctt caggttatct ctgtgatgaa tttcaaaggt gggtcgggta

720

    agaccaccac cgccgcgcat ctggcgcagt acctcgctat gcgcggatat cgagtcttgg

780

    ccattgatct cgatcctcaa gcgagccttt ctgcactctt tgggagccaa ccggagacgg

840

    acgttggccc gaacgaaacg ctctacggcg ctataaggta tgatgatgag caggtggcaa

900

    tcgaacgagt cgtccgaggg acttacattc ccgacctcca cctgattcct ggtaaccttg

960

    agctgatgga gtttgaacac gatacgccac gcgcgctgat gaaccgcaaa gagggcgaca

1020

    cgctctttta tggtcgcatc agccaagtaa ttgaagatat cgcggataac tatgacgtcg

1080

    tggtcatcga ctgccctccc cagcttgggt atctcacgct atccgcattg actgcggcga

1140

    cgtccattct tgtcacggtc catccgcaga tgctggatgt gatgtcgatg aaccagtttc

1200

    tggcaatgac atcgaacctt ttgcgtgaaa tcgagaatgc tggcgccaag ttcaagttta

1260

    attggatgcg ctatctgata acccgtttcg aaccgagcga cggaccacag aaccaaatgg

1320

    taggttatct gcggtcgatt tttggcgaaa atgtcctcaa ttttccgatg cttaaaacca

1380

    ccgcggtttc ggacgctggc ctgacaaacc agactctatt cgaagtggag cgtggcctgt

1440

    tcacgcgctc gacctatgat cgagccttgg aggcgatgaa cgccgtcaac gacgagatcg

1500

    aaacactgat caaaaaagca tggggtaggc ccacatgagc cggaagcaca tccttggcgt

1560

    ctcaactgac gcccctgaga cgtcgcccgc cgacaatagg acggcaaaga accgctccat

1620

    gccgctcctc ggcgtaacaa ggaaggagcg cgatccggca acgaagctca cagcgaacat

1680

    tggtaacgca ctgcgagagc aaaacgatcg tcttagccgt gccgaagaga tcgagcggcg

1740

    tctcgctgaa ggtcaggcag tgatagagtt ggatgcctcg tcaatagaac cgtctttcgt

1800

    gcaggatcgt atgcgagggg acattgacgg gctccttact tcgatccggg aacaaggaca

1860

    gcaagtccca atccttgtgc gaccgcatcc gagccagccg ggccgatatc aggttgcctt

1920

    cggccaccgc cggctacgcg ccgtttcaga actcggactt ccggtcagag cggtcgttcg

1980

    cgaactgacg gacgagcaag tggtcgtagc acagggtcag gaaaacaatg agcgcgaaga

2040

    tcttaccttc atcgaaaagg cgcgcttcgc acatcgcctg aacaggcagt tttctcgaga

2100

    gattgtcatc gccgcgatgt cgatcgacaa gagcaatttg tccaagatgc ttctgctcgt

2160

    cgacgccctc ccctctgaac tgaccgatgc tattggtgcc gctcctggtg ttggacggcc

2220

    gagttggcaa caacttgccg agctgattga gaaagtttct tcaccggccg acgtggctaa

2280

    atatgctatg tcggaggaag ttcaagcgct gccatcggca gaacgattca aggcggtgat

2340

    cgctagtctg aagcccagtc gggttgcgcg tggacttccc gaggtcatgg ccaccccaga

2400

    cggcaccaga attgcacagg tgacgcagag caaggccaaa ctggaaatca cgattgacag

2460

    gaaggcgacg cccgattttg cgaccttcgt gctcgatcat gtgccagcgc tgtatcaagc

2520

    gtaccacgct gagaaccaac ggaaacgggg agagtaaacc gcaaaagaaa agagccccct

2580

    caacgtcgcc gtcgcggaag cccttctgtc tctctagcgc gaacagaatc gcatttcctc

2640

    gaatcctcgt caagagtttt tagcgccgtt ttggtgagct gatttccttt gcctgctgaa

2700

    aggtgaaaga tgatgcagac aggaagtgta acgacgccat tcgggcggcg gccaatgacg

2760

    cttgcgcttg tgcggcgcca gacggcgctg gccgatatca aacaaggcaa gacagcggac

2820

    aagtggaagg tctttagaga cgcgtccgcg gccatggaac tacttggaat ccagtccaac

2880

    agtcttgccg tccttgatgc gctattgagc tttcacccgg aaacggagtt gcgtcaggag

2940

    gcacagctga tcgtcttccc gtcgaatgct cagcttgccc ttcgggcgca tgggatggct

3000

    ggcgcgactt tgcgtaggca catcgccatg ctcgtggagt caggcttgat cgtccggaag

3060

    gatagcgcca acggaaagcg ttacgctcgt aaggatggcg ctggtcagat cgagcgcgcg

3120

    tttggcttcg atttgtctcc gcttctcgcg cggtccgaag agctagcgat gatggcacag

3180

    caggtgatgg ccgatcgagc agcattcagg atggccaaag aaagtctgac gatttgccga

3240

    cgggacgttc ggaagctaat tacggcagct atggaagagg gagcggaggg cgactggcaa

3300

    gctgtcgagg aagtctatgt ggaacttgtg ggtagaattc cacgcgcccc gacgcttgct

3360

    gatgtagagt caattctcga agagatgtgg atgctccagg aagagataat caaccggttg

3420

    gaaattagag acaattcaga aaataatagc accaatgctg cccagagcga gcagcacata

3480

    cagaattcaa aacccgaatc cgttaatgaa cttgaacctc gctctgaaaa ggagcagggc

3540

    gctaagccga gtgaaataga ccgggcaagg agcgagccga taaaagcgtt ccccctcggg

3600

    atgatcctga aagcatgccc gaccattggc aattatgggc cgagcggtgc ggttgctagc

3660

    tggcgtgacc tcatgtcggc tgcggtggtg gttcggtcta tgctgggggt cagcccgtcg

3720

    gcttaccaag acgcgtgtga ggcaatggga ccggagaatg cggcagcagc gatggcgtgc

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    attttggagc gagcgaactt catcaattcg cccgggggct atctccgaga tctgacacgg

3840

    cggagcgagc tcgggaagtt ttcacttggc ccgatgataa tggcgctctt gaaggctagc

3900

    gggcagggga cgttgcggtt tggctagaat tagcgagtat ggagcaggat ggtctgtggt

3960

    cagctgacca cagacctaat aggttgaaaa catgagcgtt ttttggatga tcgacagacc

4020

    atccgattcc cggagtacca agcgtgctct gatgggagcg ataacattac tcaacaagca

4080

    cgaaggcccc atgccgatcg ttgatcgtga aggagagcct gctctacatg cggcggtatt

4140

    ttgccggccg aggcatgtag tcgcggagca ctgcctattt actgccctag gcacaaacgt

4200

    tgactcttgg atcgagctgg cagacaaagc aataacccac acagaggacg attaatggct

4260

    gacgaagaga tccagaatcc gccggacggt actgctgctg ccgaagttga gccggctgct

4320

    cctagaggta gaagagcaaa gaaagcacca gccgaaacag cccgcacggg atcgttcaaa

4380

    tccgtgaagc cgaaaacccg cggcctcagc aaccgagaaa aactggagaa gatcggtcaa

4440

    atcgaagctc aggtcgctgg cggcgcaacc ttgaaggacg ccgttaagat cgtgggtatt

4500

    tccgttcaga cctattatca atggaagaga gctgcggttc aacctgtctc acagaatccg

4560

    gccgtgtctg tttcagttga cgatgaactc ggcgagttca tccaactcga ggaggaaaat

4620

    cggcggctca gaaagctagc ttctctctga aaaattgcgc gcagaaaacg cggacttacg

4680

    caaaagactt ggaatcaact agcggccttt gggggtccct cgctaaatca acttgacgcg

4740

    catctctcaa tgaatgaatg ccttggaaaa tttccgcgca ttctgatcgt tgcgctatca

4800

    agcaatccca atcttctggc atatgaaaaa accacgaccc aaattcgtcg tcgaatataa

4860

    gacgaacagg cgacaagcca aggcccgacc aacgtcaatc tggggcaatc tgggtttgca

4920

    ggcggtgggc cgtgcggtcg cggccgacgg agtcgtgccg aagagtagtc tgccgcaagt

4980

    ccgttccgtc ctggagaagg ttgtcgcgtc caaggttacc gtcgtggtcc ctcggtgctg

5040

    ccaggttttg aggaagagct tgccgctatc gaggcggaaa accgtcgtct gaagcgcctc

5100

    ttgatcgtga agctccgtga ggagaacgac aggcttaagt tcgcgcttcg acgatttggg

5160

    ggcgcctgag cacgatgctg gcccacttgc ttcagcgggc aaacaacatg gagtggagat

5220

    ctaatgatcg cggcgcttga acatcgctag gggtcttcgg cgccgctgaa ccgtgctcca

5280

    ttttgcactc ggagacacag cctcccaaaa acctggcgcc gctcgttggt gaactcctca

5340

    acatcgagcg gatcaaggga aactggaatg acatccttcg acccgtcacg gcgatccgct

5400

    ctggccaggt ccaacctacg gccatgcccg caaagccaac ggcatttcca cgtcaagcac

5460

    attgacccac tcggctgacg gtacatcagc tggcgagctc atccggaccc agacgaactg

5520

    cgttgatctc aggccgttgc ggcagaaaac ctccatcctc gcagccgatc caacactttc

5580

    ctgtggtaat gcctatttca gatgaaacag ccttttt

5617

    <210>3

    <211>4115

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>3

    tacaaggtag aatccgcctg agtcgcaagg gtgacttcgc ctatattgga cgacggcgcg

60

    cagagggcga cctctttttg ggttacgatt gtaggattat cactaaaaca atacatgaac

120

    atattcaaat ggcaatctct ctaaggcatt ggaaataaat acaaataaca gttgggtgga

180

    gtttttcgac ctgagggcgt taaccttctg ttaacctaaa agctcttgcc caaacagcag

240

    aatcggcgct aattgccagc ggcggaactt ttccagtttc gcgaaaaata tcgccactgg

300

    caaggaatgg gtttgagatg gcgaagtctg tcctaaaagc agcgcctgta gttgtagggt

360

    tgacggcctt gatggagcgt catgccgatg ccctctcgag ccaacttcaa gcacatcatc

420

    ttaaggtttt cccgccgcat tccgagaagg gcattcgaac attcgggcca tcggaggcgt

480

    ccaagctgct cggcgttggc gagtcatatt tacggcagac cgcgtctgag atgccagagt

540

    tgaatgttag catgagcccg ggtggcaggc gaatgttctc aattgaagat atccatgtga

600

    ttcggaagta tatggatcag gtcggccgcg ggaaccggcg ctacctgcca catcgtcgag

660

    gcggcgagca gcttcaggtt atctctgtga tgaatttcaa aggtgggtcg ggtaagacca

720

    ccaccgccgc gcatctggcg cagtacctcg ctatgcgcgg atatcgagtc ttggccattg

780

    atctcgatcc tcaagcgagc ctttctgcac tctttgggag ccaaccggag acggacgttg

840

    gcccgaacga aacgctctac ggcgctataa ggtatgatga tgagcaggtg gcaatcgaac

900

    gagtcgtccg agggacttac attcccgacc tccacctgat tcctggtaac cttgagctga

960

    tggagtttga acacgatacg ccacgcgcgc tgatgaaccg caaagagggc gacacgctct

1020

    tttatggtcg catcagccaa gtaattgaag atatcgcgga taactatgac gtcgtggtca

1080

    tcgactgccc tccccagctt gggtatctca cgctatccgc attgactgcg gcgacgtcca

1140

    ttcttgtcac ggtccatccg cagatgctgg atgtgatgtc gatgaaccag tttctggcaa

1200

    tgacatcgaa ccttttgcgt gaaatcgaga atgctggcgc caagttcaag tttaattgga

1260

    tgcgctatct gataacccgt ttcgaaccga gcgacggacc acagaaccaa atggtaggtt

1320

    atctgcggtc gatttttggc gaaaatgtcc tcaattttcc gatgcttaaa accaccgcgg

1380

    tttcggacgc tggcctgaca aaccagactc tattcgaagt ggagcgtggc ctgttcacgc

1440

    gctcgaccta tgatcgagcc ttggaggcga tgaacgccgt caacgacgag atcgaaacac

1500

    tgatcaaaaa agcatggggt aggcccacat gagccggaag cacatccttg gcgtctcaac

1560

    tgacgcccct gagacgtcgc ccgccgacaa taggacggca aagaaccgct ccatgccgct

1620

    cctcggcgta acaaggaagg agcgcgatcc ggcaacgaag ctcacagcga acattggtaa

1680

    cgcactgcga gagcaaaacg atcgtcttag ccgtgccgaa gagatcgagc ggcgtctcgc

1740

    tgaaggtcag gcagtgatag agttggatgc ctcgtcaata gaaccgtctt tcgtgcagga

1800

    tcgtatgcga ggggacattg acgggctcct tacttcgatc cgggaacaag gacagcaagt

1860

    cccaatcctt gtgcgaccgc atccgagcca gccgggccga tatcaggttg ccttcggcca

1920

    ccgccggcta cgcgccgttt cagaactcgg acttccggtc agagcggtcg ttcgcgaact

1980

    gacggacgag caagtggtcg tagcacaggg tcaggaaaac aatgagcgcg aagatcttac

2040

    cttcatcgaa aaggcgcgct tcgcacatcg cctgaacagg cagttttctc gagagattgt

2100

    catcgccgcg atgtcgatcg acaagagcaa tttgtccaag atgcttctgc tcgtcgacgc

2160

    cctcccctct gaactgaccg atgctattgg tgccgctcct ggtgttggac ggccgagttg

2220

    gcaacaactt gccgagctga ttgagaaagt ttcttcaccg gccgacgtgg ctaaatatgc

2280

    tatgtcggag gaagttcaag cgctgccatc ggcagaacga ttcaaggcgg tgatcgctag

2340

    tctgaagccc agtcgggttg cgcgtggact tcccgaggtc atggccaccc cagacggcac

2400

    cagaattgca caggtgacgc agagcaaggc caaactggaa atcacgattg acaggaaggc

2460

    gacgcccgat tttgcgacct tcgtgctcga tcatgtgcca gcgctgtatc aagcgtacca

2520

    cgctgagaac caacggaaac ggggagagta aaccgcaaaa gaaaagagcc ccctcaacgt

2580

    cgccgtcgcg gaagcccttc tgtctctcta gcgcgaacag aatcgcattt cctcgaatcc

2640

    tcgtcaagag tttttagcgc cgttttggtg agctgatttc ctttgcctgc tgaaaggtga

2700

    aagatgatgc agacaggaag tgtaacgacg ccattcgggc ggcggccaat gacgcttgcg

2760

    cttgtgcggc gccagacggc gctggccgat atcaaacaag gcaagacagc ggacaagtgg

2820

    aaggtcttta gagacgcgtc cgcggccatg gaactacttg gaatccagtc caacagtctt

2880

    gccgtccttg atgcgctatt gagctttcac ccggaaacgg agttgcgtca ggaggcacag

2940

    ctgatcgtct tcccgtcgaa tgctcagctt gcccttcggg cgcatgggat ggctggcgcg

3000

    actttgcgta ggcacatcgc catgctcgtg gagtcaggct tgatcgtccg gaaggatagc

3060

    gccaacggaa agcgttacgc tcgtaaggat ggcgctggtc agatcgagcg cgcgtttggc

3120

    ttcgatttgt ctccgcttct cgcgcggtcc gaagagctag cgatgatggc acagcaggtg

3180

    atggccgatc gagcagcatt caggatggcc aaagaaagtc tgacgatttg ccgacgggac

3240

    gttcggaagc taattacggc agctatggaa gagggagcgg agggcgactg gcaagctgtc

3300

    gaggaagtct atgtggaact tgtgggtaga attccacgcg ccccgacgct tgctgatgta

3360

    gagtcaattc tcgaagagat gtggatgctc caggaagaga taatcaaccg gttggaaatt

3420

    agagacaatt cagaaaataa tagcaccaat gctgcccaga gcgagcagca catacagaat

3480

    tcaaaacccg aatccgttaa tgaacttgaa cctcgctctg aaaaggagca gggcgctaag

3540

    ccgagtgaaa tagaccgggc aaggagcgag ccgataaaag cgttccccct cgggatgatc

3600

    ctgaaagcat gcccgaccat tggcaattat gggccgagcg gtgcggttgc tagctggcgt

3660

    gacctcatgt cggctgcggt ggtggttcgg tctatgctgg gggtcagccc gtcggcttac

3720

    caagacgcgt gtgaggcaat gggaccggag aatgcggcag cagcgatggc gtgcattttg

3780

    gagcgagcga acttcatcaa ttcgcccggg ggctatctcc gagatctgac acggcggagc

3840

    gagctcggga agttttcact tggcccgatg ataatggcgc tcttgaaggc tagcgggcag

3900

    gggacgttgc ggtttggcta gaattagcga gtatggagca ggatggtctg tggtcagctg

3960

    accacagacc taataggttg aaaacatgag cgttttttgg atgatcgaca gaccatccga

4020

    ttcccggagt accaagcgtg ctctgatggg agcgataaca ttactcaaca agcacgaagg

4080

    ccccatgccg atcgttgatc gtgaaggaga gcctg

4115

    <210>4

    <211>4304

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>4

    agttacggct gatcgaccag acccggcacc ttaccgccgc gccccgctcc atccacgcca

60

    gcgaaccgat gccttgcatc tgcgggcttg cagcaaggcg ctttgcacgc ccgacattgc

120

    gattcggatt atactgctgc tgttcccggc cggtctcgtc cgattcggcc tgtgaatgtg

180

    cgattgctgg acccgccagc ggcacgcccg gccggcgcaa gcgcttgaaa tagactggac

240

    aaccttttga taggatcttg ttaaccctat ttgccttgcc acccctccag aatcggcgct

300

    aaatgcggtt tcaaagcgcg tagagctttt aaatcgcatt ttcgagattt ccatgaatat

360

    ggcaccgcaa atagaaaaag caatttccga tgtcgaccag ctgatcatcg gtcaggcaca

420

    ggaactatcc gacaagctga agcagcatcg cctcgaaatg tttcctccgc gcgcgctaaa

480

    gggtctgcgg gaatttcagc ttgctgaagt ggcgcggttt ctcggcgtga ccagcggcta

540

    tcttcgaaat ctttcgctcg agggcaaggg tgccctcccc caggttacgc cgtctggccg

600

    ccgatcgtat acggcggagc agatggagga gatgcgtggc tttctcgagc ataatgcgcg

660

    cgccggaaca cattatgtgc gtcatcgccg cggccacgaa catctgcagg tcgttgctgt

720

    cgtcaacttc aaggggggca gcggcaagac gacgagtgcc gcgcatcttg cccagcatct

780

    cgccctgacc ggtcaccgcg tcctggccgt cgatctcgat ccgcaagcgt ctctttctgc

840

    catacacggc tttcagccgg agttcgacgt caacgaaaac gagacactct acgccgccat

900

    tcgctatgac gatcagcggc gtccgctgcg ggacattatc cggccgacca acttcccgaa

960

    ccttcatctc gtgccgggca atctcgaact gatggaattc gagcacgata cgccgcgggt

1020

    cctcgctcag ggcaaagcga gcgattatgg gcgcgtcttc tttgcccggc tggatgaggc

1080

    gctggcctcg gtcgcggatg attacgacgt cgtcatcatc gattgccctc cccagcttgg

1140

    ctttttgacc atgagcgcca tttgcggtgc gacggcggtt ctgatcaccg ttcatccgca

1200

    gatgctcgat gtcatgtcga tgtgccagtt cctgcaaatg cttggcgaag tgctgaacac

1260

    gctgaaggga gccggcggca atatgaacct cgactggctg cgttacctcg tgacccgcta

1320

    cgatccgcag gacgggccgc agacgcagat ggtcgccttc atgcgctcga tgttcaagag

1380

    ccatgtgctc accaacccga tgctgcgcag cgtcgcgatc tccgatgcgg cgatgactaa

1440

    ccagacgctg tacgaagtcg agcgaagtca gtttacccgc gcgacctatg accgcgccat

1500

    ggaggcgatg gagtcagtca acacggaaat cgtcgatctc atccataagg catggggccg

1560

    gaaatgagcg ggaagtttac tgcggtaaac cggggcaagg agctggttga tggcgcgtaa

1620

    aaatcttctg tcgggcctga tggacgattc caagaagttt actgcggtaa acaatgagga

1680

    tgagccggcc cctcgcgacg agaggcagca tatcacctat aaggggattg gcgcgctcgg

1740

    tgcggtcacc cgcagcatcg atgccttggc cgccaaggcc gatgccgcca aggcgatcga

1800

    agagcagctg gcgagcggcg agacggtgat cgatctcgac ccggcgctga tcgaagattc

1860

    cttcgtgacc gaccggctgg cgcatactga cgaacagttc cgggaattag tcgaggcgat

1920

    ccgcctgcgc ggccaggatt caccgatcct tgtgcgcccg catcccgaga gggaggggcg

1980

    atatcagatc gcttttggtc atcgtcgtgc gcgggcggca aaggagctcg gccgacctgt

2040

    ccgggcggtg gtcaagagac tcgacgaccg cgaccatgtc attgcgcagg gccaggagaa

2100

    ttcgaattcg gcacgcgccg atctctcctt catcgagagg acgatgtttg ccgacaagct

2160

    cgacacgttg ggtttcgacc gggaaacgat catgtcggca ctcagcgcag acaagacgac

2220

    ggtgtccaag atgctgtcgg tcacgaagcg gattccggcc gaagtcctgg ccgcgatcgg

2280

    cgtagccaag acgactggcc gcgatcgctg gcatgatctt tcggcgaaat tcgagacgga

2340

    aaacatcgca gcccgggcga ttgagttcac cagatcggtg gagttcgaga cggccgagcc

2400

    ggacgcccgc ttcgacatgc ttgtcgcctt catcagcagg aaccaacagg cgtcgcccgc

2460

    cgccgcagtt cagcccgtgg cgcacgcctg gcagcgccgg gacggagccg tcaaagcgaa

2520

    gatcaaggat gatggaaaac agttcaccat cgcgctgaag gcggagaagg catctgcctt

2580

    tggcgcctac atcgccagca atctggatcg tctctacgag gcgttcgaga agacacagga

2640

    tttgacgaag aacggagatc aataagcaaa agaaaaggcc cccgaacgtt gccgtcgcgg

2700

    aagccctctc tgatctagac acccagagaa tcacatttcc gcgaatcata gtcaagagtc

2760

    tttggcaccg aatttggtga ggcgtgatct tttgccttga agaaggcgaa gaaaatggaa

2820

    agcggaagtg tgacacgccc ttcgggcggc ggccgatgac gtttggcatg ttggcaagtc

2880

    aggccgctgc ccgaaaaatc gagcccggcc gatcgattga taaatggaaa ctctatcgcg

2940

    ccctgtgcga ggccaggccg ctgctcggca ttacagaccg ggcgctttcc atcctgaacg

3000

    ccttgctgag cttttatccc aagggagagc tctccgagga gaacggcttg gtcgtatttc

3060

    cttcgaatac gcagctctct ctgcgcgcgc atggaatggc ggagcagacg atccgtcgcc

3120

    acctggcggc gctgatcgag gccggattgc tgatccgcaa ggacagcccg aacggcaagc

3180

    gttacgctcg caaggagcag ggcggggaga tccgtgaggc attcggcttc tcgctggcgc

3240

    cgctgcttgc gcgcgcggac gagatcgagc ggctggcggc cgagatggca gccgaacgat

3300

    tgcagctgca gcggctcaaa gagcgcctga cgctttgcag gcgcgacatc gccaagctca

3360

    tcgagatggc cgtggaagag ggcgcctctg gtgattggag cggggtccac ctgcattttc

3420

    gaggcatcgt cgaacggctg ccgcgctcgc catccttcga gaagattgcc gccgcactcg

3480

    acgaactgga actgttgcgc gaagaaatca ccaatcagtt ggaaatgcag gttaaagctc

3540

    caaatcaaag cggcaatgcc caacattctg agcggcacat acagaattca aacccacact

3600

    acactactga acttgaacca cgcttcgaaa cgaagcaggg cgcaacggtg gacgaccaat

3660

    cggaaggttg ggccgagccg agggccagaa tagcgacaca ggaggggaag ggcaggccca

3720

    tgccagctgc aaactcagcc tcggttgccg gcggcgggct caaatccttc ccgctgggcc

3780

    tggtgctgca ggcctgccca gagatcgccg cctatggacc gcagggctcg gtgggcacat

3840

    ggcgcgatct gatggcggcg gctgtcgtcg tgcgctcaat gctcggagtg agcccctcgg

3900

    cctatgaaca ggcctgcgag gtcatggggc ctgaaaatgc ggctaccgtc atagcgtgcg

3960

    tgcttgaaag ggcagggcac atcaattccg ccggtggtta cctccgtgac ctgacccgcc

4020

    gcgccgagag aggcgaattt gccatcggac cgatgttgat ggcgcttgtc cgcaccaatt

4080

    cgccaatcag aggcaagacc ggatgaaaaa tttcgtgtca tctgtccgtg gcgatctatg

4140

    gttaacgaaa ggtgacggaa ataaacaggg tgataacttc ttgttaggat attcttcctt

4200

    tgagatcatg aagttacaag atttttgatt ggcaaggcga gggaaggacc tgatcgacga

4260

    tcggccggcg ttcgctggag aaacggtgcg gttggagttg acgt

4304

    <210>5

    <211>28

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>5

    cacgtgtaca aggtagaatc cgcctgag

28

    <210>6

    <211>27

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>6

    gtatacaggc tctccttcac gatcaac

27

    <210>7

    <211>30

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>7

    agcttgggcc cctcgaggct agcactagtg

30

    <210>8

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>8

    gatccactag tgctagcctc gaggggccc

29

    <210>9

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>9

    ccacgtgagt tacggctgat cgaccagac

29

    <210>10

    <211>29

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>10

    gcctaggacg tcaactccaa ccgcaccgt

29

    <210>11

    <211>21

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>11

    acaaggtaga atccgcctga g

21

    <210>12

    <211>21

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>12

    ttcaactctg gcatctcaga c

21

    <210>13

    <211>43

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>13

    tcgctttcct tgacgcggag ttcttccaga ccgttcatca cgg

43

    <210>14

    <211>17

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>14

    gtaggtgatt ggcgttg

17

    <210>15

    <211>44

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>15

    tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gact

44

    <210>16

    <211>26

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>16

    gttatttatg agatgggttt ttatga

26

    <210>17

    <211>20

    <212>DNA

    <213>大肠杆菌

    <400>17

    aacgcctgat tttacgcgag

20

    <210>18

    <211>21

    <212>DNA

    <213>大肠杆菌

    <400>18

    caataccgca gggcacttat c

21

    <210>19

    <211>18

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>19

    cccacagatg atgtggac

18

    <210>20

    <211>20

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>20

    tggcaaggaa tgggtttgag

20

    <210>21

    <211>23

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>21

    ctacaactac aggcgctgct ttt

23

    <210>22

    <211>15

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>22

    tggcgaagtc tgtcc

15

    <210>23

    <211>21

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>23

    gccaagggat ctttttggaa t

21

    <210>24

    <211>18

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>24

    ccacccaaac gtcggaaa

18

    <210>25

    <211>15

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>25

    tgctccgtcg tcagg

15

    <210>26

    <211>16

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>26

    gcacccggtg gagctt

16

    <210>27

    <211>19

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>27

    tctgcctaac cggctcagt

19

    <210>28

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>28

    catgttggtt tctacgcag

19

    <210>29

    <211>23

    <212>DNA

    <213>马铃薯

    <400>29

    atgaaataaa aggatgcaca cat

23

    <210>30

    <211>20

    <212>DNA

    <213>马铃薯

    <400>30

    acaactttga tgcccacatt

20

    <210>31

    <211>15

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <223>人工序列描述：合成的引物

    <400>31

    tgacatgcta atcac

15

    <210>32

    <211>1215

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>32

    atggcgaagt ctgtcctaaa agcagcgcct gtagttgtag ggttgacggc cttgatggag

60

    cgtcatgccg atgccctctc gagccaactt caagcacatc atcttaaggt tttcccgccg

120

    cattccgaga agggcattcg aacattcggg ccatcggagg cgtccaagct gctcggcgtt

180

    ggcgagtcat atttacggca gaccgcgtct gagatgccag agttgaatgt tagcatgagc

240

    ccgggtggca ggcgaatgtt ctcaattgaa gatatccatg tgattcggaa gtatatggat

300

    caggtcggcc gcgggaaccg gcgctacctg ccacatcgtc gaggcggcga gcagcttcag

360

    gttatctctg tgatgaattt caaaggtggg tcgggtaaga ccaccaccgc cgcgcatctg

420

    gcgcagtacc tcgctatgcg cggatatcga gtcttggcca ttgatctcga tcctcaagcg

480

    agcctttctg cactctttgg gagccaaccg gagacggacg ttggcccgaa cgaaacgctc

540

    tacggcgcta taaggtatga tgatgagcag gtggcaatcg aacgagtcgt ccgagggact

600

    tacattcccg acctccacct gattcctggt aaccttgagc tgatggagtt tgaacacgat

660

    acgccacgcg cgctgatgaa ccgcaaagag ggcgacacgc tcttttatgg tcgcatcagc

720

    caagtaattg aagatatcgc ggataactat gacgtcgtgg tcatcgactg ccctccccag

780

    cttgggtatc tcacgctatc cgcattgact gcggcgacgt ccattcttgt cacggtccat

840

    ccgcagatgc tggatgtgat gtcgatgaac cagtttctgg caatgacatc gaaccttttg

900

    cgtgaaatcg agaatgctgg cgccaagttc aagtttaatt ggatgcgcta tctgataacc

960

    cgtttcgaac cgagcgacgg accacagaac caaatggtag gttatctgcg gtcgattttt

1020

    ggcgaaaatg tcctcaattt tccgatgctt aaaaccaccg cggtttcgga cgctggcctg

1080

    acaaaccaga ctctattcga agtggagcgt ggcctgttca cgcgctcgac ctatgatcga

1140

    gccttggagg cgatgaacgc cgtcaacgac gagatcgaaa cactgatcaa aaaagcatgg

1200

    ggtaggccca catga

1215

    <210>33

    <211>939

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>33

    atgccgctcc tcggcgtaac aaggaaggag cgcgatccgg caacgaagct cacagcgaac

60

    attggtaacg cactgcgaga gcaaaacgat cgtcttagcc gtgccgaaga gatcgagcgg

120

    cgtctcgctg aaggtcaggc agtgatagag ttggatgcct cgtcaataga accgtctttc

180

    gtgcaggatc gtatgcgagg ggacattgac gggctcctta cttcgatccg ggaacaagga

240

    cagcaagtcc caatccttgt gcgaccgcat ccgagccagc cgggccgata tcaggttgcc

300

    ttcggccacc gccggctacg cgccgtttca gaactcggac ttccggtcag agcggtcgtt

360

    cgcgaactga cggacgagca agtggtcgta gcacagggtc aggaaaacaa tgagcgcgaa

420

    gatcttacct tcatcgaaaa ggcgcgcttc gcacatcgcc tgaacaggca gttttctcga

480

    gagattgtca tcgccgcgat gtcgatcgac aagagcaatt tgtccaagat gcttctgctc

540

    gtcgacgccc tcccctctga actgaccgat gctattggtg ccgctcctgg tgttggacgg

600

    ccgagttggc aacaacttgc cgagctgatt gagaaagttt cttcaccggc cgacgtggct

660

    aaatatgcta tgtcggagga agttcaagcg ctgccatcgg cagaacgatt caaggcggtg

720

    atcgctagtc tgaagcccag tcgggttgcg cgtggacttc ccgaggtcat ggccacccca

780

    gacggcacca gaattgcaca ggtgacgcag agcaaggcca aactggaaat cacgattgac

840

    aggaaggcga cgcccgattt tgcgaccttc gtgctcgatc atgtgccagc gctgtatcaa

900

    gcgtaccacg ctgagaacca acggaaacgg ggagagtaa

939

    <210>34

    <211>1218

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>34

    atgatgcaga caggaagtgt aacgacgcca ttcgggcggc ggccaatgac gcttgcgctt

60

    gtgcggcgcc agacggcgct ggccgatatc aaacaaggca agacagcgga caagtggaag

120

    gtctttagag acgcgtccgc ggccatggaa ctacttggaa tccagtccaa cagtcttgcc

180

    gtccttgatg cgctattgag ctttcacccg gaaacggagt tgcgtcagga ggcacagctg

240

    atcgtcttcc cgtcgaatgc tcagcttgcc cttcgggcgc atgggatggc tggcgcgact

300

    ttgcgtaggc acatcgccat gctcgtggag tcaggcttga tcgtccggaa ggatagcgcc

360

    aacggaaagc gttacgctcg taaggatggc gctggtcaga tcgagcgcgc gtttggcttc

420

    gatttgtctc cgcttctcgc gcggtccgaa gagctagcga tgatggcaca gcaggtgatg

480

    gccgatcgag cagcattcag gatggccaaa gaaagtctga cgatttgccg acgggacgtt

540

    cggaagctaa ttacggcagc tatggaagag ggagcggagg gcgactggca agctgtcgag

600

    gaagtctatg tggaacttgt gggtagaatt ccacgcgccc cgacgcttgc tgatgtagag

660

    tcaattctcg aagagatgtg gatgctccag gaagagataa tcaaccggtt ggaaattaga

720

    gacaattcag aaaataatag caccaatgct gcccagagcg agcagcacat acagaattca

780

    aaacccgaat ccgttaatga acttgaacct cgctctgaaa aggagcaggg cgctaagccg

840

    agtgaaatag accgggcaag gagcgagccg ataaaagcgt tccccctcgg gatgatcctg

900

    aaagcatgcc cgaccattgg caattatggg ccgagcggtg cggttgctag ctggcgtgac

960

    ctcatgtcgg ctgcggtggt ggttcggtct atgctggggg tcagcccgtc ggcttaccaa

1020

    gacgcgtgtg aggcaatggg accggagaat gcggcagcag cgatggcgtg cattttggag

1080

    cgagcgaact tcatcaattc gcccgggggc tatctccgag atctgacacg gcggagcgag

1140

    ctcgggaagt tttcacttgg cccgatgata atggcgctct tgaaggctag cgggcagggg

1200

    acgttgcggt ttggctag

1218

    <210>35

    <211>80

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>35

    gccggaagca catccttggc gtctcaactg acgcccctga gacgtcgccc gccgacaata

60

    ggacggcaaa gaaccgctcc

80

    <210>36

    <211>152

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>36

    accgcaaaag aaaagagccc cctcaacgtc gccgtcgcgg aagcccttct gtctctctag

60

    cgcgaacaga atcgcatttc ctcgaatcct cgtcaagagt ttttagcgcc gttttggtga

120

    gctgatttcc tttgcctgct gaaaggtgaa ag

152

    <210>37

    <211>16

    <212>DNA

    <213>发根土壤杆菌

    <400>37

    gtggtcagct gaccac

16

    <210>38

    <211>1215

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>38

    atgaatatgg caccgcaaat agaaaaagca atttccgatg tcgaccagct gatcatcggt

60

    caggcacagg aactatccga caagctgaag cagcatcgcc tcgaaatgtt tcctccgcgc

120

    gcgctaaagg gtctgcggga atttcagctt gctgaagtgg cgcggtttct cggcgtgacc

180

    agcggctatc ttcgaaatct ttcgctcgag ggcaagggtg ccctccccca ggttacgccg

240

    tctggccgcc gatcgtatac ggcggagcag atggaggaga tgcgtggctt tctcgagcat

300

    aatgcgcgcg ccggaacaca ttatgtgcgt catcgccgcg gccacgaaca tctgcaggtc

360

    gttgctgtcg tcaacttcaa ggggggcagc ggcaagacga cgagtgccgc gcatcttgcc

420

    cagcatctcg ccctgaccgg tcaccgcgtc ctggccgtcg atctcgatcc gcaagcgtct

480

    ctttctgcca tacacggctt tcagccggag ttcgacgtca acgaaaacga gacactctac

540

    gccgccattc gctatgacga tcagcggcgt ccgctgcggg acattatccg gccgaccaac

600

    ttcccgaacc ttcatctcgt gccgggcaat ctcgaactga tggaattcga gcacgatacg

660

    ccgcgggtcc tcgctcaggg caaagcgagc gattatgggc gcgtcttctt tgcccggctg

720

    gatgaggcgc tggcctcggt cgcggatgat tacgacgtcg tcatcatcga ttgccctccc

780

    cagcttggct ttttgaccat gagcgccatt tgcggtgcga cggcggttct gatcaccgtt

840

    catccgcaga tgctcgatgt catgtcgatg tgccagttcc tgcaaatgct tggcgaagtg

900

    ctgaacacgc tgaagggagc cggcggcaat atgaacctcg actggctgcg ttacctcgtg

960

    acccgctacg atccgcagga cgggccgcag acgcagatgg tcgccttcat gcgctcgatg

1020

    ttcaagagcc atgtgctcac caacccgatg ctgcgcagcg tcgcgatctc cgatgcggcg

1080

    atgactaacc agacgctgta cgaagtcgag cgaagtcagt ttacccgcgc gacctatgac

1140

    cgcgccatgg aggcgatgga gtcagtcaac acggaaatcg tcgatctcat ccataaggca

1200

    tggggccgga aatga

1215

    <210>39

    <211>1050

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>39

    atggcgcgta aaaatcttct gtcgggcctg atggacgatt ccaagaagtt tactgcggta

60

    aacaatgagg atgagccggc ccctcgcgac gagaggcagc atatcaccta taaggggatt

120

    ggcgcgctcg gtgcggtcac ccgcagcatc gatgccttgg ccgccaaggc cgatgccgcc

180

    aaggcgatcg aagagcagct ggcgagcggc gagacggtga tcgatctcga cccggcgctg

240

    atcgaagatt ccttcgtgac cgaccggctg gcgcatactg acgaacagtt ccgggaatta

300

    gtcgaggcga tccgcctgcg cggccaggat tcaccgatcc ttgtgcgccc gcatcccgag

360

    agggaggggc gatatcagat cgcttttggt catcgtcgtg cgcgggcggc aaaggagctc

420

    ggccgacctg tccgggcggt ggtcaagaga ctcgacgacc gcgaccatgt cattgcgcag

480

    ggccaggaga attcggcacg cgccgatctc tccttcatcg agaggacgat gtttgccgac

540

    aagctcgaca cgttgggttt cgaccgggaa acgatcatgt cggcactcag cgcagacaag

600

    acgacggtgt ccaagatgct gtcggtcacg aagcggattc cggccgaagt cctggccgcg

660

    atcggcgtag ccaagacgac tggccgcgat cgctggcatg atctttcggc gaaattcgag

720

    acggaaaaca tcgcagcccg ggcgattgag ttcaccagat cggtggagtt cgagacggcc

780

    gagccggacg cccgcttcga catgcttgtc gccttcatca gcaggaacca acaggcgtcg

840

    cccgccgccg cagttcagcc cgtggcgcac gcctggcagc gccgggacgg agccgtcaaa

900

    gcgaagatca aggatgatgg aaaacagttc accatcgcgc tgaaggcgga gaaggcatct

960

    gcctttggcg cctacatcgc cagcaatctg gatcgtctct acgaggcgtt cgagaagaca

1020

    caggatttga cgaagaacgg agatcaataa

1050

    <210>40

    <211>1293

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>40

    atggaaagcg gaagtgtgac gacgcccttc gggcggcggc cgatgacgtt tggcatgttg

60

    gcaagtcagg ccgctgcccg aaaaatcgag cccggccgat cgattgataa atggaaactc

120

    tatcgcgccc tgtgcgaggc caggccgctg ctcggcatta cagaccgggc gctttccatc

180

    ctgaacgcct tgctgagctt ttatcccaag ggagagctct ccgaggagaa cggcttggtc

240

    gtatttcctt cgaatacgca gctctctctg cgcgcgcatg gaatggcgga gcagacgatc

300

    cgtcgccacc tggcggcgct gatcgaggcc ggattgctga tccgcaagga cagcccgaac

360

    ggcaagcgtt acgctcgcaa ggagcagggc ggggagatcc gtgaggcatt cggcttctcg

420

    ctggcgccgc tgcttgcgcg cgcggacgag atcgagcggc tggcggccga gatggcagcc

480

    gaacgattgc agctgcagcg gctcaaagag cgcctgacgc tttgcaggcg cgacatcgcc

540

    aagctcatcg agatggccgt ggaagagggc gcctctggtg attggagcgg ggtccacctg

600

    cattttcgag gcatcgtcga acggctgccg cgctcgccat ccttcgagaa gattgccgcc

660

    gcactcgacg aactggaact gttgcgcgaa gaaatcacca atcagttgga aatgcaggtt

720

    aaagctccaa atcaaagcgg caatgcccaa cattctgagc ggcacataca gaattcaaac

780

    ccacactaca ctactgaact tgaaccacgc ttcgaaacga agcagggcgc aacggtggac

840

    gaccaatcgg aaggttgggc cgagccgagg gccagaatag cgacacagga ggggaagggc

900

    aggcccatgc cagctgcaaa ctcagcctcg gttgccggcg gcgggctcaa atccttcccg

960

    ctgggcctgg tgctgcaggc ctgcccagag atcgccgcct atggaccgca gggctcggtg

1020

    ggcacatggc gcgatctgat ggcggcggct gtcgtcgtgc gctcaatgct cggagtgagc

1080

    ccctcggcct atgaacaggc ctgcgaggtc atggggcctg aaaatgcggc taccgtcata

1140

    gcgtgcgtgc ttgaaagggc agggcacatc aattccgccg gtggttacct ccgtgacctg

1200

    acccgccgcg ccgagagagg cgaatttgcc atcggaccga tgttgatggc gcttgtccgc

1260

    accaattcgc caatcagagg caagaccgga tga

1293

    <210>41

    <211>42

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>41

    gcgggaagtt tactgcggta aaccggggca aggagctggt tg

42

    <210>42

    <211>149

    <212>DNA

    <213>豆根瘤菌

    <400>42

    gcaaaagaaa aggcccccga acgttgccgt cgcggaagcc ctctctgatc tagacaccca

60

    gagaatcaca tttccgcgaa tcatagtcaa gagtctttgg caccgaattt ggtgaggcgt

120

    gatcttttgc cttgaagaag gcgaagaaa

149

    <210>43

    <211>331

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>43

    aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc

60

    cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc

120

    gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc

180

    actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt

240

    ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc

300

    gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt t

331

    <210>44

    <211>442

    <212>DNA

    <213>根癌土壤杆菌

    <400>44

    ctcatctaag cccccatttg gacgtgaatg tagacacgtc gaaataaaga tttccgaatt

60

    agaataattt gtttattgct ttcgcctata aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat

120

    caaaatgtac tttcatttta taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa

180

    aattggtaat tactctttct ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg

240

    tagatttccc ggacatgaag ccatttacaa ttgaatatat cctgccgccg ctgccgcttt

300

    gcacccggtg gagcttgcat gttggtttct acgcagaact gagccggtta ggcagataat

360

    ttccattgag aactgagcca tgtgcacctt ccccccaaca cggtgagcga cggggcaacg

420

    gagtgatcca catgggactt tt

442

Claims (21)

1.用于转化植物的DNA构建体，含有：

i)至少一个T-DNA边缘区域；

ii)至少一个与边缘区域邻接的异源转基因；

iii)细菌选择性标记的编码区域；及

iv)至少一个DNA节段，含有在可转化至少一个初始植物细胞的细菌中维持低拷贝数DNA构建体的复制起点的顺式和/或反式元件。

2.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的至少一个T-DNA边缘区域是右侧边缘区域或左侧边缘区域。

3.如权利要求1所述的DNA构建体，其中异源转基因在转化的植物细胞中表达时可使该细胞或由该细胞衍生的转化植物呈现某种农艺学表型。

4.如权利要求1所述的DNA构建体，其中细菌选择标记的编码区包括选自卡那霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因和零霉素抗性基因的抗生素抗性基因。

5.如权利要求1所述的DNA构建体，其中复制起点包括repABC起点。

6.如权利要求5所述的DNA构建体，其中repABC起点选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4。

7.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的至少一个DNA节段含有复制起点基因repA、repB和repC。

8.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的至少一个DNA节段含有基因间序列1(igs1)和基因间序列2(igs2)。

9.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的至少一个DNA节段含有16个碱基对的回文序列。

10.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的细菌选自：土壤杆菌(Agrobacterium spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、中间根瘤菌(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌(Phyllobacterium spp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum spp.)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium spp.)。

11.如权利要求1所述的DNA构建体，其还含有至少一个维持构建体在大肠杆菌中的拷贝数的第一复制起点。

12.如权利要求11所述的DNA构建体，其中复制起点来源于pBR322和/或pUC。

13.用如权利要求1所述的DNA构建体转化的细胞。

14.如权利要求13所述的细胞，其为植物细胞。

15.如权利要求13所述的细胞，其为细菌细胞。

16.如权利要求15所述的细菌细胞，其中所述细胞可转化至少一种初始植物细胞。

17.如权利要求16所述的细菌细胞，其中细菌选自土壤杆菌、根瘤菌、中华根瘤菌、中间根瘤菌、叶杆菌、苍白杆菌和慢生根瘤菌。

18.转化植物细胞的方法，包括将如权利要求16所述的细菌细胞与至少一种初始植物细胞相接触，其中细菌细胞可转化所述的初始植物细胞；及根据是否存在至少一种通过细菌细胞引入到植物细胞中的异源转基因来筛选所述的初始细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其中植物细胞是大豆、油菜、玉米或棉花植物的细胞。

20.如权利要求18所述的方法，进一步包括从植物细胞再生出植株。

21.产生食品、饲料或工业产品的方法，包括：获得如权利要求20所述的植物或其部分，并从该植物或其部分制备食品、饲料或工业产品。

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