CN101304757A - 免疫原性较低的蛋白质-脂质复合物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供降低治疗性蛋白质，例如因子Ⅷ的免疫原性并延长其循环半衰期的组合物和方法。所述组合物包含脂质结构，例如脂质体、胶束和螺旋状结构，所述脂质结构含有带负电荷的脂质和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺。

Description

免疫原性较低的蛋白质-脂质复合物的组合物和方法
本申请要求2006年6月29日提交的美国临时申请60/695,080的优先权，该份申请的内容纳入本文作为参考。
本项工作得到国立卫生研究院的基金第R01HL-70227号的支持。政府对本发明享有一定权利。
发明领域
本发明总体上涉及降低治疗剂免疫原性的方法，更具体地说，提供降低因子VIII的免疫原性的组合物和方法。
发明背景
A型血友病是遗传性出血疾病，其特征在于缺乏因子VIII(FVIII)或其机能障碍。FVIII在凝血连锁固有途径中作为关键辅因子。用重组人FVIII(rFVIII)或血浆衍生的FVIII进行替代治疗是控制出血发作时最常用的疗法。然而，该治疗的主要并发症是约15-30％患者中会诱导抗所给予蛋白质的中和抗体[1-3]。中和抗体常靶向在体内参与磷脂结合的C2结构域。
FVIII是大的多结构域糖蛋白，由结构域A1、A2、B、A3、C1和C2构成[4、5]。***性表位作图研究显示抗-FVIII抗体主要靶向FVIII的A2(重链)、A3和C2结构域(轻链)中的确定区域[6、7]。A2结构域中的表位决定簇经作图为残基Arg484-Ile-508[8、9]。靶向该区域的抗体显示通过阻断A2结构域与因子IXa(FIXa)相互作用而抑制FVIII的活化形式(FVIIIa)[10]。A3结构域中的主要表位决定簇包含残基1811-1818，针对该区域的抗体也阻止FVIII与FIXa相互作用，从而导致辅因子活性丧失[11]。C2结构域中的表位决定簇经作图为残基2181-2312[12、13]，包括免疫显性的通用CD4+表位2191-2210、2241-2290、2291-2330[14、15]。针对C2结构域的抗体干扰FVIII与富含磷脂酰丝氨酸(PS)的血小板膜表面结合，该磷脂酰丝氨酸对于凝血连锁的放大至关重要。
由于产生了针对所给予的因子VIII的免疫应答，需要鉴定其中因子VIII的免疫原性降低，最好对循环半衰期没有不利影响的制剂。
发明概述
我们研究了使用包含带负电荷的脂质(例如磷脂，包括磷脂酰丝氨酸)和PEG衍生磷脂的脂质体和其它脂质结构是否能提高蛋白质，例如因子VIII的免疫原性。
在一个实例中，用A型血友病鼠科模型评估了与含有PS和PEG衍生PE的脂质体结合和/或掺入其中的rFVIII的免疫原性。与单用rFVIII处理的动物相比，用这些组合物处理的动物的总抗体和抑制性抗-rFVIII抗体的滴度均较低。这表示从接受本发明组合物的动物分离的脾细胞的刺激指数低于仅接受rFVIII的动物。细胞因子分析提示，在这些脂质体组合物存在时给予的rFVIII的免疫原性降低可能部分是通过降低IL-10产量来介导的。静脉内(i.v)给药后的药代动力学研究表明使用这些组合物的rFVIII的循环半衰期增加。
因此，本文提供的组合物中蛋白质的免疫原性降低但没有显著损害循环半衰期。这些组合物包含含有以下成分的脂质体和/或其它脂质结构：带负电荷的脂质、用PEG衍生的两性脂质，和蛋白质，例如FVIII。如本文所述，含有PEG的脂质体或其它脂质结构在本申请中称为“PEG化的”。还提供了制备和使用这些组合物的方法。
本文所用的缩写是：APTT，活化部分凝血激酶时间；ACD，柠檬酸葡萄糖；BPS，脑磷脂酰丝氨酸；BSA，牛血清白蛋白；DMPC，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱；DMPE-PEG2000，1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；ELISA，酶联免疫吸附测定；FVIIIa，活化的FVIII；FIXa，因子IXa；Ig，免疫球蛋白；KO，敲除；PB，磷酸缓冲液；PBA，含有白蛋白的磷酸缓冲液；PBT，含有吐温的磷酸缓冲液；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；PS，磷脂酰丝氨酸；rFVIIa，重组因子VIIIa；rFVIII，重组人因子VIII；RES，网状内皮***；TB，Tris缓冲液。
附图简述
图1：在有和没有PEG化脂质体存在下rFVIII的三级结构。获得了300-400nm的荧光发射光谱。激发单色器设定在280nm。所用的蛋白质浓度约为4μg/ml。
图2A和2B：在没有和有含DMPC∶BPS(70∶30)的PEG化脂质体存在下给予rFVIII后，6周结束时血友病小鼠中的(A)总抗-FVIII抗体滴度和(B)抑制性抗-rFVIII抗体。各点表示接受治疗的各小鼠的数值，水平线(horizontal bar)描述了总抗体和抑制性滴度的平均值。为进行比较，还显示了在非PEG化DMPC∶BPS脂质体存在下给予rFVIII后获得的数据。血液样品在第四次注射2周后获得。通过ELISA测定总抗-FVIII抗体滴度，通过贝塞斯达试验(Bethesda Assay)测定抑制性滴度。如实施例所述进行统计学分析。
图3A和3B：两次皮下给予2μg rFVIII、未PEG化的脂质体-rFVIII、PEG化的脂质体-rFVIII或不含PS的脂质体-rFVIII后，血友病小鼠对携带多种免疫显性表位的完整rFVIII(100ng/孔(3A)或1000ng/孔(3B))的CD4+T-细胞增殖应答，以刺激指数表示。实施例描述了刺激指数的计算和统计学分析。各点表示各小鼠的数值，水平线描述了刺激指数的平均值。
图4：抗原攻击小鼠的CD4+T-细胞分泌的IL-10，所述小鼠经皮下给予两剂2gμ游离rFVIII或PEG化脂质体-rFVIII。用rFVIII(1000ng/孔)攻击富含CD4+的T-细胞。各点表示各小鼠的数值，水平线描述了培养液中分泌的IL-10平均水平。如实施例所述进行统计学分析。
图5：给予rFVIII、PEG化或未PEG化的脂质体-rFVIII后，血友病小鼠中的血浆rFVIII活性与时间分布。
图6：在没有和有各种脂质组合物的PEG化脂质体存在下给予rFVIII后，6周结束时血友病小鼠中的抑制性抗-rFVIII抗体。各点表示接受治疗的各小鼠的数值，水平线描述了总抗体和抑制性滴度的平均值。血液样品在第四次注射后2周获得。通过贝塞斯达试验测定抑制性滴度。如实施例所述进行统计学分析。
图7：本发明的一些脂质体组合物的实例和它们脂质体的大小、蛋白质结合效率(protein association efficiency)以及免疫原性。
发明描述
本发明提供rFVIII制剂。这些制剂包含含有带负电荷的脂质，例如PS或PA的脂质体和/或其它脂质结构(例如，胶束或螺旋状结构(cochleate))。这些脂质体还包含用PEG衍生的第一两性脂质(例如，PE)和第二两性脂质，例如PC、PE(未用PEG衍生)或PG。除了带负电荷的脂质，胶束可包含PC和/或未PEG衍生的PE。除了带负电荷的脂质，螺旋状结构还可包含PC。
与游离因子VIII相比，本发明组合物中的因子VIII的免疫原性较低，循环半衰期较长。具体地说，本发明提供的脂质-rFVIII制品中免疫显性表位得到屏蔽。由于免疫原性低并且循环半衰期较长，可以降低该蛋白质的给药频率。
本发明组合物包含脂质结构，所述脂质结构含有带负电荷的脂质、PEG衍生的两性脂质。因子VIII或其它蛋白质或多肽可与这些结构结合(即，表面吸附)或掺入其中。认为蛋白质与带负电荷的脂质，例如PS或PA结合。
两性脂质的例子是PC、PE和PG。带负电荷的脂质的例子是PS和PA。可用PEG衍生的脂质的例子是PE。应该注意PE本身和/或用PEG衍生后可用于这些脂质结构中。
在一个实施方式中，所述蛋白质是FVIII。体内数据由A型血友病鼠科体现。这些数据表明给予含有PEG化的脂质体-rFVIII的PS能降低该蛋白质的免疫原性并增加rFVIII的t1/2。
对于本发明的脂质体，带负电荷脂质的含量是30-50摩尔％。两性脂质的含量是50-70摩尔％。用PEG衍生的PE在1-15摩尔％之间。这些脂质体还任选含有0-30摩尔％的胆固醇。在一个实施方式中，PC与PS之比为50∶50-90∶10。在一个实施方式中，该比值是70∶30。可用未PEG衍生的PE替换最多20％的PS或PC。
本发明的磷脂有两条酰基链。与甘油骨架相连的酰基链长度为12-22个碳原子不等。与甘油基骨架相连的两条酰基链可以相同或不同。酰基链可以是饱和或不饱和的。表1A和1B显示了12-22个碳原子的饱和与不饱和酰基链的一些非限制性例子。
表1
  标志   通用名   学名   结构
  12:0   月桂酸   十二烷酸   CH3(CH2)10COOH
  14:0   肉豆蔻酸   十四烷酸   CH3(CH2)12COOH
  16:0   棕榈酸   十六烷酸   CH3(CH2)14COOH
  18:0   硬脂酸   十八烷酸   CH3(CH2)16COOH
  20:0   花生酸   二十烷酸   CH3(CH2)18COOH
  22:0   山萮酸   二十二烷酸   CH3(CH2)20COOH
表1B
  标志   通用名   学名  结构
  18:1   油酸   9-十八碳烯酸  CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7COOH
  16:1   棕榈油酸   9-十六碳烯酸  CH3(CH2)5CH＝CH(CH2)7COOH
  18:2   亚油酸   9，12-十八碳二烯酸  CH3(CH2)4(CH＝CHCH2)2(CH2)6COOH
  20:4   花生四稀酸   5，8，11，14-二十碳四烯酸  CH3(CH2)4(CH＝CHCH2)4(CH2)2COOH
短链(6-12个碳原子)磷脂酰丝氨酸是独特的水溶性脂质，其可以胶束存在，浓度高于临界胶束浓度。短链磷脂酰丝氨酸与rFVIII相互作用，影响rFVIII的稳定性、免疫原性和药代动力学参数。PEG衍生的PE也可用于胶束中。
此外，还可制备含有带负电荷的脂质和PEG衍生PE的螺旋状结构或圆柱体。这些物质可用作药物递送***。制备螺旋状结构可用长链(12-22个碳原子)磷脂。
胶束可含有100摩尔％的PS和1-15摩尔％的PEG衍生PE。任选地，可用PC替换最多50％的PS和/或可用PE(未用PEG衍生)替换最多5％的PS。对于胶束，可用PC替换最多50％的PS和/或可用PE替换最多5％的PS。
螺旋状结构也可含有100摩尔％的PS。可用PC替换最多30摩尔％的PS。
可通过几种方法制备本发明方法的组合物。例如，在一个实施方式中，所述方法包括：制备含有PS、PC和/或PE的脂质体，将FVIII结合和/或掺入该脂质体，并将PEG衍生的PE加入结合有/掺有FVIII的脂质体中。就将PEG衍生的PE掺入脂质体而言，优选PEG衍生的PE的浓度低于CMC，从而最好能不形成胶束。形成胶束通常会减缓PEG衍生的PE掺入脂质体的进程。
在另一实施方式中，利用PC(和任选的PE)、PS和PEG衍生的PE制备脂质体，然后加入FVIII，从而将其与脂质体结合和/或掺入其中。
在另一实施方式中，可通过纳入不同量的活化PE(通过氨基、羧基或巯基活化)而掺入不同含量的PEG，掺入FVIII后，活化的PE可与活化的PEG共价连接。存在PE显示提高了FVIII与PS的结合特性。在该实施方式的改变形式中，可在PE和PEG之间使用间隔臂。合适的间隔臂具有6-12个碳原子。可利用同样长6-12个碳原子的其它间隔臂。
在另一实施方式中，脂质结构或脂质体还可包含胆固醇。对于该实施方式，在制备脂质体或其它脂质结构的步骤中加入胆固醇。
本发明脂质体(的大小)介于80-500nm之间。在一个实施方式中，这些脂质体的直径为100-200nm。蛋白质与脂质的摩尔比介于1∶1000-1∶20,000之间。螺旋状结构通常在高粘度的缓冲液中形成，其平均大小介于150-300nm之间。胶束(的大小)介于70-90nm之间。
本发明所用聚乙二醇的分子量介于700-30,000之间。PEG的有用分子量的例子是750、1000、2000、3000、5000、20000、30000Da。已知有各种用PEG衍生脂质的方法。例如，可经氰尿酰氯基团或利用羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)偶联试剂进行衍生。更多的细节见美国专利5,013,556。各种PEG衍生的PE脂质可商品化购得。例子包括但不限于DMPE-PEG、DPPE-PEG和DSPE-PEG。用PEG衍生PE通过共价键合进行。
表2(图7)给出了有用的脂质体组合物的例子以及它们的特性。
给予以下实施例是为了说明本发明。实施例不是限制性的。
实施例1
本实施例描述了含PC脂质体的制备。在该实施例中，首先将蛋白质与含PS的脂质体结合，然后加入PEG。
材料
rFVIII(巴克斯特生物科学公司(Baxter Biosciences)，卡尔斯斑(Carlsband)，加利福尼亚州)用作抗原。用于活性试验的正常凝血控制血浆和FVIII缺陷型血浆购自三合一生物技术公司(Trinity Biotech)(考威克罗(Co Wicklow)，爱尔兰)。溶解于氯仿的脑磷脂酰丝氨酸(BPS)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMPE-PEG2000)购自阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids)(阿尔巴斯特(Alabaster)，亚拉巴马州)，保存在-70℃，无需进一步纯化即可使用。无热原的无菌水购自亨利夏恩公司(Henry Schein Inc.)(梅尔维尔，纽约州)。与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig，IgM+IgG+IgA，H+L)购自南方生物技术联合公司(Southern Biotechnology Associates，Inc.)(伯明翰，亚拉巴马州)。单克隆抗体ESH 8购自美国诊断公司(American Diagnostica Inc)(格林威治，康涅狄格州)。不含IgG的牛血清白蛋白(BSA)、二乙醇胺和丙酮购自西格马公司(Sigma)(圣路易斯，密苏里州)。对硝基苯基磷酸二钠盐购自皮尔斯公司(Pierce)(罗克福德，伊利诺斯州)。1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)、RPMI-1640培养基、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和多粘菌素B均购自英杰公司(Invitrogen Corp.)，(卡尔斯斑，加利福尼亚州)。3H-胸腺嘧啶购自帕金埃尔默公司(Perkin Elmer Inc.)(波士顿，马萨诸塞州)。本项研究所用的所有其它缓冲盐均购自费舍尔科学公司(Fisher Scientific)(菲尔罗恩(Fairlawn)，新泽西州)，无需纯化即可使用。
测定DMPE-PEG2000的临界胶束浓度(CMC)：
如先前所述[16]，使用荧光探针DPH测定DMPE-PEG2000的CMC。简言之，将DPH溶液(2μl，[DPH]＝30μM，丙酮配制)加入各种浓度的1mlDMPE-PEG2000中，然后在37℃温育2小时。利用装配有氙弧灯的PTI荧光计(光子技术国际公司(Photon Technology International)，劳伦斯威尔(Lawrenceville)，新泽西州)检测该分散体的荧光强度。探针的激发波长(Ex)设定在360nm，监测430nm的发射光谱(Em)。荧光强度陡然升高时分散体的浓度定义为CMC，发现其约为100μM。
制备聚乙二醇-(PEG化)PS脂质体：
PEG转移方法
将所需用量的DMPC(Tc约23℃)和BPS(Tc约6-8℃)溶解于氯仿中，使用旋转蒸发仪(布希(Buchi)-R200，费舍尔科学公司)蒸发溶剂从而在圆底烧瓶壁上形成薄膜。通干燥的氮气以除去样品中的任何残留溶剂。37℃用Tris缓冲液(TB，300mMNaCl，25mM Tris，5mM CaCl2.2H2O，pH＝7.0，用无热原的无菌水配制)再水化脂质薄膜，形成脂质体。本项研究所用脂质的摩尔比是DMPC∶BPS(70∶30摩尔％)。利用高压挤压机(米高公司(Mico，Inc.)，米德尔顿，威斯康星州)以约200-250psi的压力通过三叠(triple-stacked)200nm聚碳酸酯膜挤压脂质体几次。用0.22μm米立克斯(millex)TM-GP过滤器单位(米立波尔公司(MilliporeCorporation)，贝德福德，马萨诸塞州)无菌过滤脂质体。采用Bartlett方法[17]测定磷含量来评估脂质回收率。如先前所述[18]，利用CW 380型尼康普(Nicomp)颗粒大小分析仪(颗粒分级***公司(Particle Sizing Systems)，圣巴巴拉，加利福尼亚州)测定脂质体大小分布。通过在37℃温育并轻柔搅动约30分钟使分级的脂质体与合适用量的rFVIII结合。向DMPE-PEG2000干膜中加入蛋白质-脂质体混合物来PEG化蛋白质-脂质体混合物。应确保加入干PEG膜中的蛋白质-脂质体混合物的体积不会导致形成PEG胶束。通过MALDI-TOF证实掺入了PEG(数据未显示)。制品中PEG的最终摩尔％是总脂质的4摩尔％。所有实验的蛋白质与脂质之间的摩尔比维持在1∶10,000。为评估与PEG化脂质体结合的蛋白质含量，采用不连续葡聚糖密度梯度离心技术[19]分开游离蛋白质与和PEG化脂质体结合的蛋白质。通过单级(one-stage)APTT试验测定所结合的活性蛋白质百分比[20]。结合百分比测定为约27.6±9.6％(+S.E.M，n＝5)。制备后应立即使用这些制品。
将聚乙二醇(PEG)掺入脂质体中的理论思索
在本实施例中，先将蛋白质结合在脂质体表面再将PEG掺入脂质体中，而不是在制备脂质膜期间掺入PEG。据信，这种掺入PEG的方法会降低PEG因空间位阻而干扰蛋白质与脂质体结合能力的可能性。我们相信，以下理论考虑因素可驳斥脂质体表面存在蛋白质可能会损害PEG的***效率这种论点。
本项研究所用脂质体的平均直径是200nm。假定双层厚度是
Figure A20068002771500121
各磷脂分子所占的面积是
Figure A20068002771500122
估计每μmol磷脂的囊泡数量约为1.8×1012个囊泡。对于免疫接种研究，每只动物给予2μg蛋白质，根据所用蛋白质与脂质的摩尔过量(1∶10,000)，各只小鼠接受约71.4纳摩尔的脂质。通过电子晶体学获得的膜结合FVIII的三维结构显示，FVIII结构域具有紧凑构造(compact arrangement)，其中该蛋白质的C2结构域与磷脂相互作用[21]。根据两维图谱的晶胞大小(unitcell dimension)和平均直径为200nm的脂质体的总表面积，我们估计能挤在脂质体表面上的FVIII分子数目最多约为2400。然而，根据我们的研究中所用的蛋白质与脂质比例，已知蛋白质分子/囊泡的最大数值预计约为33，以上理论评估显示脂质体的大部分表面仍未被占据，还能用PEG包被。
实施例2
本实施例描述了实施例1所制备的脂质体的特征。
荧光光谱
利用PTI荧光计(量子大师(Quanta Master)，光子技术国际公司，劳伦斯威尔，新泽西州)获得rFVIII和与PEG化脂质体结合的rFVIII的发射光谱。样品在280nm激发，获得300-400nm的发射光谱。激发和发射光路均使用宽4nm的狭缝。蛋白质浓度约为4μg/ml，使用光路长度可变的比色皿以最大程度降低内滤效应。
通过荧光光谱检测蛋白质中的三级结构变化(图1)。游离FVIII的发射光谱显示最大发射波长为333nm。与PEG化脂质体结合的蛋白质显示最大发射波长明显蓝移至325nm并且强度增加很大(数据未显示)。最大发射波长中明显的蓝移提示rFVIII的疏水性结构域可能基本上***或包裹入脂质体双层中。这和蛋白质与缺乏PEG的脂质体结合后观察到的发射光谱中的中度改变形成反差。没有PEG存在时，数据表明只有极小的构象变化，膜结合形式的大多数蛋白质处于脂质体表面。我们相信波长漂移是参与膜结合的色氨酸(Trp)残基微环境中的介电常数因脂质体表面存在PEG或PEG空间效应造成溶剂分子与Trp残基的可及性降低而改变所致。周围溶剂的介电常数改变显示能通过改变激发状态的荧光团周围的溶剂分子结构而影响荧光团的史托漂移(stoke shift)[25]。
实施例3
本实施例描述了含有PS的胶束的制备。用旋转蒸发仪蒸发溶剂从氯仿储备溶液制备含有二己酰基磷脂酰丝氨酸(DCPS)和二己酰基磷脂酰巯基乙醇(DCPSE)(摩尔比为97∶3，总脂质为5微摩尔)的脂质膜。通过旋振用1mL Tris缓冲液(5mM mM CaCl2，25mM Tris和300mM NaCl，pH＝7)重建这些膜，从而获得5mM脂质溶液。用5mM脂质溶液稀释浓缩的rFVIII储备液，37℃温育30分钟。PEG化方法类似于用活化的PEG分子PEG化预制脂质体。将活化的PEG分子(线形或支链的mPEG马来酰亚胺)偶联于磷脂首基(DCPSE)的游离巯基进行PEG化。
实施例4
本实施例描述了含有PS的螺旋状结构或圆柱体的制备。用不含Ca2+的Tris缓冲液制备含有纯脑磷脂酰丝氨酸(BPS)和二油酰基磷脂酰巯基乙醇胺(DOPSE)(摩尔比为99∶1)的100nm或略小的分级脂质体。37℃，在有分级脂质体存在下温育浓缩的rFVIII溶液30分钟来制备rFVIII-脂质体复合物。加入葡聚糖溶液(20％w/v)达到葡聚糖终浓度为5或10％w/v来增加rFVIII脂质体复合物的粘度。在溶液中掺加Ca2+离子(终浓度为5mM)并将混合物在较低的温度温育30分钟以启动螺旋状圆柱体的对照生长。将活化的PEG分子(线形或支链的mPEG马来酰亚胺)偶联于磷脂首基(DCPSE)的游离巯基进行PEG化。此外，可通过工程改造活化的PEG分子(PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG-NHS))与BPS首基上存在的游离氨基之间的共价键来PEG化纳米螺旋状圆柱体。由于PS首基上存在大大过量的氨基，非常不可能用PEG-NHS试剂直接PEG化rFVIII。
实施例5
本实施例描述了通过活化PEG技术络合rFVIII脂质体复合物与PEG。如下文所述制备DMPC∶BPS∶二油酰基磷脂酰巯基乙醇(DOPSE)脂质体(摩尔比为70∶25∶5)。将所需量的DMPC、BPS和DOPSE溶解于氯仿中。用布希-R200旋转蒸发仪(费舍尔科学公司)除去溶剂后，玻璃试管壁上形成了脂质薄膜。37℃用Tris缓冲液(TB 25mm Tris，300mM NaCl，5mM CaCl2，pH＝7.4)再水合脂质膜来制备脂质体。利用高压挤压机(立派克斯生物膜公司(LipexBiomembranes，Inc.))以约200psi的压力通过双叠(double stacked)100nm聚碳酸酯膜挤压脂质体八次。利用CW 380型尼康普大小分析仪(颗粒分级***公司)监测颗粒的大小分布。
脂质体蛋白制品
37℃，在有脂质体存在下将蛋白质温育30分钟并不时轻柔搅动使蛋白质与预制脂质体结合。所有制品中蛋白质的摩尔比维持相同(1∶10,000)。
通过工程改造DOPSE脂质的首基上存在的游离巯基与活化PEG衍生物之间的共价键进行PEG化。这种衍生物可以表示为mPEG-马来酰亚胺或支链PEG马来酰亚胺。靶向游离巯基的其它活化的PEG衍生物同样适合于在脂质体和PEG部分之间形成共价键。
该方法的优点在于蛋白质分子表面存在巯基的频率不高。因此，预计脂质极大过量(蛋白质∶脂质比例为1∶10000，其中5％的脂质是DOPSE)可降低活化PEG与rFVIII的结合并减弱其活性。
实施例6
本实施例描述了利用实施例1所述组合物进行的体内研究。一群血友病小鼠(FVIII基因的外显子16中有靶向缺失)[22]。这些研究使用相同数量的8-12周龄的成年雄性和雌性小鼠，因为它们对rFVIII显示相当的免疫应答特性[23]。
通过心脏穿刺获得血液样品，以10∶1(v/v)的比例加入柠檬酸葡萄糖(ACD，含有85mM柠檬酸钠，110mM D-葡萄糖和71mM柠檬酸)。离心分离血浆，将样品保存在-80℃待分析。按照布法罗大学研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)的准则进行所有研究。
以一周为间隔，四次皮下(s.c.)注射rFVIII或rFVIII-PEG化脂质体(2μg)，从而免疫接种FVIII敲除小鼠(n＝12)。在6周结束时获得血液样品。
抗体检测
检测抗-rFVIII总抗体
ELISA测定抗-rFVIII总抗体滴度。简言之，用碳酸盐缓冲液配制的50μl 2.5μg/ml rFVIII(0.2M，pH＝9.4)包被Nunc-Maxisorb 96孔板，4℃温育过夜。然后用含0.05％吐温20的100μl磷酸缓冲液(PB；10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4，14mM NaCl，2.7mM KCl)(PBT)洗涤各板6次。室温下用含1％牛血清白蛋白的200μl PB缓冲液(PBA)温育2小时来阻断塑料吸附表面上的非特异性蛋白质结合位点。PBT洗涤各板6次，然后加入PBA配制的50μl各种稀释度的小鼠血浆样品，37℃温育1小时。PBT洗涤各板6次，室温下用PBA配制的50μl 1∶1000稀释度的碱性磷酸酶偶联山羊抗小鼠Ig温育1小时。用PBT和二乙醇胺缓冲液(由1M二乙醇胺，0.5mM MgCl2构成)配制的100μl 1mg/ml对硝基苯基磷酸缓冲溶液洗涤各板6次。室温下温育各板30分钟，加入100μl3 N NaOH猝灭反应。用Spectramax平板读数计(分子装置公司(MolecularDevices Corporation)，桑尼维尔，加利福尼亚州)测定405nm的吸光度来检测碱性磷酸酶反应产物。如下所示表示免疫原性结果：根据用单克隆小鼠IgG抗-人FVIII抗体，与C2结构域结合的ESH8获得的吸光度值进行线性回归。最高和最低预计吸光度之间差异的一半计算为板特殊因子(specific factor)(PSF)。利用各种稀释度(1∶100-1∶40,000)的吸光度值与稀释度对数作图的线性回归计算光密度等于PSF的稀释度。如此获得的稀释度视作样品的抗体滴度。
检测抑制性抗-rFVIII抗体
采用贝塞斯达试验的奈梅亨(Nijmegen)改进方法检测抑制性(中和)抗-rFVIII抗体[24]。采用单级APTT试验检测残留的rFVIII活性[20]。一式两份检验各稀释度。一个贝塞斯达单位(BU)是能抑制50％rFVIII活性的抑制活性。通过对至少在20-80％抑制范围内的数据点进行线性回归测定50％抑制点。
T-细胞增殖研究
以一周为间隔，皮下(s.c.)注射rFVIII或PEG化脂质体-rFVIII(每次注射2μg蛋白质)来免疫接种8-12周龄的雌性血友病小鼠。对照小鼠不接受rFVIII。第二次注射3天后处死这些小鼠，收集脾脏作为T细胞来源。按照生产商的方案，利用包被了大鼠抗小鼠单克隆抗体的磁珠(戴纳生物技术公司(Dynal Biotech)，奥斯陆，挪威)除去脾细胞中的CD8+细胞，该抗体针对表达在CD8+细胞表面的Lyt2膜抗原。用含有10,000U/ml青霉素、10mg/ml链霉素、2.5mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺、0.05mM 2-巯基乙醇、2mg/ml多粘菌素B和0.5％热灭活血友病小鼠血清的完全RPMI-1640培养基将其余的细胞(2×105c细胞/200μl)与rFVIII(100ng/孔或1000ng/孔)培养在96孔平底板中。37℃培养72小时后，加入1μCi/孔的3H-胸苷(6.7Ci/毫摩尔)。16小时后，用Micromate收集器(帕卡德公司(Packard)，梅里登，康涅狄格州)收集细胞，用托普康特(TopCountTM)微板闪烁和发光计数器(帕卡德仪器公司(Packard InstrumentCompany)，梅里登，康涅狄格州)检测3H-胸苷的掺入量。治疗组由平行的3只动物构成，一式四份地检测各小鼠细胞的抗原依赖性增殖。数据表示为刺激指数(SI)，其是有抗原存在下3H-胸苷的平均掺入量与没有抗原存在下的平均掺入量的比值。该方法将各实验的数据归一化，并能比较不同时间进行的实验。
细胞因子分析
温育72小时后，收集抗原刺激T细胞的上清液，保存于-70℃待进一步分析。采用抗体捕捉ELISA(R&D***公司(R&D systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)分析上清液。检测了作为代表性Th1细胞因子的IFN-γ，也检测了作为代表性Th2细胞因子的IL-10。
药代动力学研究
27只雄性血友病小鼠(20-26g，8-12周龄)经***静脉通过单次静脉内弹丸注射接受400IU/kg的rFVIII或PEG化脂质体-rFVIII。通过心脏穿刺(n＝2-3只小鼠/时间点)在给药后0.08、0.5、1、2、4、8、16、24、36和48小时收集血液样品(约600μl)，加入ACD中。分离血浆，保存于-70℃待分析。通过产色试验(Coamatic FVIII，戴尔药业集团(DiaPharma Group)，西切斯特，俄亥俄州)分析血浆样品的蛋白质活性。然后采用WinNonlin(法萨公司(PharsightCorporation)，山景(Mountainview)，加利福尼亚州)通过非隔室分析用各时间点计算的活性估算基础药代动力学参数。
统计学分析
采用SAS公司的Analyst Application(SAS研究院公司(SAS Institute Inc.)，盖瑞，北卡罗莱纳州)或Minitab(迷你太布公司(Minitab Inc.)，州立大学，宾夕法尼亚州)通过ANOVA分析数据。采用邓恩氏事后多重比较检验(Dunnette′spost-hoc multiple comparison test)来检测明显的差异(p＜0.05)。
结果
图2A显示了没有和有PEG化脂质体(由DMPC和BPS构成)存在下的抗-rFVIII总抗体滴度。用PEG化脂质体-rFVIII治疗的小鼠显示抗体滴度(1123.1±189.5，±S.E.M，n＝12，p-值＜0.05)明显低于用rFVIII治疗的小鼠(13，166.7±2042.2，±S.E.M，n＝15)。这些结果表明存在PEG化脂质体减少了抗体形成。
采用贝塞斯达试验检测干扰蛋白质活性的中和抗体(即，特异性抗因子VIII的抗体)。图2B显示了6周结束时用rFVIII和PEG化脂质体-rFVIII治疗后以贝塞斯达单位(BU)表示的抑制性抗体滴度。数据表明存在PEG化脂质体的中和抗体(73.65±31.25BU/ml，±S.E.M，n＝12，p-值＜0.05)显著低于单用rFVIII的(689.7±78.1BU/ml，±S.E.M.，n＝13)。这些结果表明PEG化脂质体不仅降低了抗-FVIII总抗体的滴度，还降低了灭活该蛋白质的抗体滴度。为比较的目的，也显示了给予未PEG化PC/PS脂质体后的总抗体和抑制性滴度。数据表明存在PEG化脂质体时平均总抗体和抑制性滴度低于存在未PEG化脂质体时的滴度，虽然这些差异并非统计学差异(p＞0.05)。
为测定免疫接种PEG化脂质体-rFVIII后是否在体内刺激了FVIII特异性T-细胞，在体外评估了rFVIII攻击的T-细胞增殖应答。从接受PEG化脂质体-rFVIII治疗的小鼠分离的脾细胞的平均刺激指数低于单独接受rFVIII治疗的小鼠(图3)。数据提示，取决于小鼠是否接触过有和没有含PEG化PS的脂质体存在下的rFVIII，活化而用于克隆扩增的T-细胞克隆可能有差异。
为测定存在含PEG化PS的脂质体时rFVIII的免疫原性降低是否因IL-10分泌减少所致，用游离-或脂质体-rFVIII免疫接种动物后进行抗原刺激T-细胞的细胞因子分析。如图4所示，给予和PEG化脂质体结合的rFVIII的动物T细胞所分泌的IL-10平均水平低于单独给予rFVIII的那些小鼠的。在所有治疗组的培养基中检测到的IFN-γ水平可忽略不计(数据未显示)。总之，数据提示IL-10产量降低可能部分介导了含有PEG化PS的脂质体存在时给予的rFVIII的免疫原性降低。此外，数据提示免疫原性降低不是Th1/Th2应答极化所致。
尽管不想局限于任何具体的理论，但据信在脂质体中纳入PS有助于免疫调节。考虑到针对rFVIII的抗体应答是依赖于T-细胞的过程，含有PEG化PS的脂质体存在时rFVIII的免疫原性降低可能是rFVIII特异性T-细胞克隆的体内抑制所致。
除了降低rFVIII的免疫原性，将rFVIII与含PS的脂质体结合还可能延长rFVIII的体内循环时间，从而减少控制A型血友病所需的该蛋白质给药频率。药代动力学(PK)研究提示与单用rFVIII相比，PEG化脂质体-rFVIII的循环半衰期(t1/2)增加了约35％(表1)。治疗(组)之间的全身性接触相似(图5和表2)。
表2
非隔室分析后获得的PK参数小结
Figure A20068002771500181
*，给药后36小时，用未PEG化rFVIII复合物治疗的所有动物的rFVIII血浆水平低于检测极限。为估算PK参数，将36小时时的rFVIII血浆水平设定为等于检测极限(0.035IU/mL)。AUC表示曲线下面积；Vss是稳定状态时的分布体积；CL是清除率。
实施例6
本实施例比较性分析了所制备的含或不含带负电荷磷脂的PEG结合脂质体。如实施例5所述测定以下物质的抑制性滴度：游离rFVIII、与所制备的含PS的脂质体结合或掺入其中的FVIII和与所制备的不含PS的脂质体结合或掺入其中的rFVIII。如图6所示，与所制备的含PS的脂质体结合或掺入其中的rFVIII的抑制性抗体滴度明显低于与所制备的不含PS的脂质体结合或掺入其中的rFVIII。
本领域技术人员可优化各制品。此外，观察到含有PS的PEG化脂质体-rFVIII的免疫原性远低于单用rFVIII，这代表了开发低免疫原性制剂的明显进步。
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Claims (24)

1.一种药物组合物，其包含脂质体，含有：
a用聚乙二醇(PEG)衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)，
b.选自以下的两性脂质：磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油及它们的组合和任选的PE，
c.选自以下的带负电荷脂质：磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及它们的组合；和
d.因子VIII，
其中因子VIII的免疫原性低于游离因子VIII的免疫原性。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，两性脂质与带负电荷的脂质之比介于50∶50-90∶10之间，PEG衍生的PE含量是1-15摩尔％。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述两性脂质是PC，所述带负电荷的脂质是PS。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，PC与PS之比是70∶30。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述两性脂质是PC和PE，所述带负电荷的脂质是PS，PC∶PS∶PE之比是80∶10∶10或70∶10∶20。
6.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，PC∶PS∶PEG衍生的PE之比是70∶30∶15。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述脂质体还包含未用PEG衍生的PE，其含量为1-10％。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述磷脂的两条酰基链各自具有12-22个碳原子，其中该两条酰基链具有相同或不同数目的碳原子。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述酰基链选自下组：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸。
10.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，还包含0.5-30摩尔％的胆固醇。
11.如权利要求所述的药物组合物，其特征在于，在所述PEG衍生PE的PEG部分和PE之间具有6-12个碳原子的间隔臂。
12.一种制备如权利要求1所述组合物的方法，包括以下步骤：
a)制备包含两性脂质和带负电荷脂质的脂质体；
b)向这些脂质体中加入因子VIII蛋白，使得该蛋白与这些脂质体结合或掺入其中；和
c)向b)中加入PEG衍生的两性脂质，从而使得1-15摩尔％的PEG与结合有/掺有蛋白的脂质体形成复合物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述两性脂质是PC，所述带负电荷的脂质是PS，PEG衍生PE。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，PC∶PS∶PE之比是70∶30∶15。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述PE选自下组：DMPE、DPPE和DSPE。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤a中制备的脂质体包含两性脂质、带负电荷的脂质和胆固醇。
17.一种制备如权利要求1所述药物组合物的方法，包括：
a)制备包含带负电荷的脂质、两性脂质和用PEG衍生的PE的脂质体；和
b)加入因子VIII，
以形成脂质体，从而使得因子VIII的免疫原性低于游离的因子VIII的免疫原性。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述带负电荷的脂质是PS，所述两性脂质是PC。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述PEG衍生的PE中的PE选自下组：DMPE、DPPE和DSPE。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤a中制备的脂质体还包含胆固醇。
21.一种制备如权利要求1所述组合物的方法，包括：
a)制备包含PC、PS和活化的PE的脂质体；
b)加入因子VIII；和
c)加入活化的PEG，从而该活化的PEG与活化的PE结合。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，含有6-12个碳原子的间隔臂与PEG或PE相连。
23.一种药物组合物，其包含胶束和/或螺旋状结构含有：
a)用PEG衍生的PE；
b)选自下组的带负电荷脂质：PS、PA和它们的组合；
c)选自下组的任选的两性脂质：PC、PE、PG和它们的组合；和
d)因子VIII，
PEG衍生PE的含量为1-15摩尔％，其中因子VIII的免疫原性低于游离的因子VIII的免疫原性。
24.一种降低所给予的因子VIII蛋白的免疫原性的方法，包括以下步骤：
制备一种制剂，其中该蛋白与包括脂质体、胶束和螺旋状结构的脂质结构结合或掺入其中，其中所述脂质结构包含带负电荷的脂质和PEG衍生的PE；
将该制剂给予患出血疾病的个体，
其中所给予的蛋白的免疫原性低于游离的因子VIII蛋白的免疫原性，其中所给予的蛋白的循环半衰期长于游离的因子VIII蛋白的循环半衰期。
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