CN101289659B - 一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海洋微藻Δ6脂肪酸去饱和酶、其编码基因及应用。本发明的Δ6脂肪酸去饱和酶具有序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明的Δ6脂肪酸去饱和酶可以有效地催化Linoleic Acid(LA，18:2Δ9，12)生成γ-Linolenic Acid(GLA，18:3Δ6，9，12)，以及催化α-Linolenic Acid(ALA，18:3Δ9，12，15)生成Stearidnoic Acid(SDA，18:4Δ6，9，12，15)。

Description

一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微藻-微拟球藻的Δ6脂肪酸去饱和酶、其编码基因及应用。

背景技术

脂肪酸是具有碳氢链的单羧酸，在许多生物学过程中起着重要作用。脂肪酸较少以游离的形式存在，而是被脂化进各种主要的脂质成分中，如磷脂和三酰甘油。脂肪酸主要分为两类：饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，后者又分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，其碳氢链中分别含有一个或多个顺式双键(C＝C)。

不饱和键的生成需要脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase)催化。脂肪酸去饱和酶存在于几乎所有植物、动物和微生物中，可将脂肪酸链中的C-C单键转化为C＝C双健。根据其引入双键的位置不同，可以将去饱和酶分为Δ5、Δ6、Δ9、Δ12等，它们分别在脂肪酸链由羧基碳开始的第5、6、9、12位碳原子处引入双键。在脂肪酸链的羧基碳和第9位碳原子间加双键的酶又被称为前端去饱和酶(front-enddesaturase)，主要包括Δ4、Δ5、Δ6、Δ8去饱和酶。人及其它哺乳动物缺乏Δ12(ω6)和Δ15(ω3)去饱和酶，不能生成亚油酸(linoleic acid，LA；18:2Δ9，12)和α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA；18:3Δ9，12，15)，必须从食物中补充。高等植物由于缺乏前端去饱和酶，一般只能合成到亚油酸和亚麻酸，不能继续合成更长链的多不饱和脂肪酸。而某些微生物，特别是真菌、海洋微藻等则具有合成长链多不饱和脂肪酸(long chainpolyunsaturated fatty acids，LCPUFAs)所需的所有去饱和酶，能够从头合成LCPUFAs且含量丰富(Sayanova and Napier，2004)。

LCPUFAs是指含有20或22个碳原子及4-6个甲烯基间隔的顺式双键的脂肪酸(Abbadi et al.，2004)，包括AA(arachidonic acid，20:4Δ5，8，11，14)、EPA(eicosapentaenoic acid，20:5Δ5，8，11，14，17)和DHA(docosapentaenoic acid，22:6Δ4，7，10，13，16，19)(俗称“脑黄金”)等。根据脂肪酸链中最后一个双键距离甲基端碳原子的距离可将LCPUFAs分为n6系列和n3系列。AA属于n6 LCPUFAs，EPA和DHA属于n3 LCPUFAs。研究表明，LCPUFAs对人类健康有着非常重要的影响。AA和EPA是哺乳动物细胞膜的组分，也是生成***素、白三烯和血栓素等激素的前体(Funk，2001)；EPA在凝血、免疫和抗炎症等各种生理反应中起重要作用(Simopoulos，2002)；DHA对胎儿神经***的形成至关重要(Uauy et al.，2001)，还影响着视网膜视紫红质的活性(Giusto et al.，2000)，并与某些疾病如关节炎、动脉硬化、抑郁症的预防和治疗有关(Horrocks and Yeo，1999；Marszalek and Lodish，2005)。

AA、EPA和DHA在生物体内由LA和ALA经一系列去饱和及延伸反应生成。首先LA和ALA在Δ6去饱和酶作用下分别生成GLA(18:3Δ6，9，12)和SDA(18:4Δ6，9，12，15)；然后经Δ6延伸反应生成DGLA(20:3Δ8，11，14)和ETA(20:4Δ8，11，14，17)；再由Δ5去饱和酶作用生成AA(20:4Δ5，8，11，14)和EPA(20:5Δ5，8，11，14，17)；EPA又可经过两条途径进一步生成DHA。虽然人体可以将外源LA和ALA转化为AA、EPA和DHA，但是合成效率极低，远远不能满足需要，在日常饮食中摄入充足的LCPUFAs(特别是EPA和DHA)就显得尤为重要。

当前EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。此外，环境污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。因此，寻找更为持续、稳定的EPA和DHA来源已成为当务之急(Tononet al.，2002；Domergue et al.，2005a)。虽然现已开发出商业化的海藻油和真菌油，但是其较低的产量和较高的提取成本限制了这类资源的大规模应用。考虑到植物油的提取工艺非常成熟，许多研究者已经将目光转向植物的代谢工程，探索如何利用已有的前端去饱和酶及延伸酶基因在高等植物特别是油料作物中构建LCPUFAs合成通路，使之成为稳定、廉价的LCPUFAs来源。目前该领域已取得突破性研究进展，使转基因植物作为“绿色细胞工厂”生产EPA、DHA成为现实(Truksa etal.，2006)。

Δ6去饱和酶能催化Linoleic Acid(18:2Δ9，12)生成γ-Linolenic Acid(18:3Δ6，9，12)，以及催化α-Linolenic Acid(18:3Δ9，12，15)生成Stearidnoic Acid(18:4Δ6，9，12，15)，是EPA及其后DHA生成的关键酶。现在已从动物、植物、真菌及海洋微藻中克隆出Δ6去饱和酶基因并进行了功能鉴定。如Cohoon等在翼叶山牵牛(Thunberia alata)种子胚乳中检出Δ6 acyl-ACP去饱和酶，意味着脂肪酸的第1个双键也可能在Δ6位产生(Cohoon et al.，1994)。Domergue等从海洋微藻Ostreococcus tauri的中克隆得到一个酰基-CoA Δ6去饱和酶，该酶能够催化与CoA连接的LA和ALA生成GLA和SDA(Domergue et al.，2005)。但目前可以有效利用于转基因植物的商业化应用的Δ6去饱和酶数量不多，选择范围狭小，因此继续克隆并筛选具有较高底物专一性和催化活性的Δ6去饱和酶是当前的研究热点之一。

已知微拟球藻富含EPA，最高含量可达到总脂肪酸的30％以上，Δ6去饱和酶作为EPA合成的关键酶可能具有较高酶活。但目前未见有关微拟球藻Δ6去饱和酶的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微拟球藻Δ6去饱和酶基因、其编码蛋白及应用。

本发明所述微拟球藻Δ6去饱和酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；本发明还包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。

本发明的Δ6去饱和酶基因长1425bp，编码474个氨基酸。在GenBank中进行同源搜索，未发现与该基因相同的序列报道，为一新基因。

本发明的基因可以通过如下方式获得：以微拟球藻总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用下列引物进行扩增，Forward Primer：5’-ATGGGACGCGGTGGCGAGCGG-3’Reverse Primer：5’-TTACATGGCGGGGAAATCGGCC-3’扩增的条件是：94℃预变性3min，以94℃30s、56℃30s、72℃1.5min反应30个循环，72℃延伸15min，4℃保存。

本发明还包括含有上述基因的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。

本发明Δ6去饱和酶具有前端去饱和酶所特有的N端细胞色素b₅结构域和3个组氨酸簇(176-180、215-219、413-417)。

本发明的Δ6去饱和酶可以有效地催化有效地催化Linoleic Acid(18:2Δ9，12)生成γ-Linolenic Acid(18:3Δ6，9，12)，以及催化α-LinolenicAcid(18:3Δ9，12，15)生成Stearidnoic Acid(18:4Δ6，9，12，15)。

本发明的DNA序列能够应用于包括动物、植物、微生物在内的任一表达体系，使转基因细胞生成LCPUFAs。例如，在油料作物亚麻(Linum sp.)、油菜(Brassica sp.)、大豆(Glycine and Sola sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、橄榄(Olea sp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacca)和花生(Arachis sp.)的植株和种子中表达该基因及Δ5去饱和酶、Δ6延伸酶等基因，能够使上述植物生成EPA、DHA，具有极高的商业开发价值。而EPA、DHA又可作为保健品或药物用于疾病的预防和治疗，如糖尿病、癌症、炎症反应和心血管疾病等。

附图说明

图1是本发明Δ6脂肪酸去饱和酶催化(18:2Δ9，12)生成(18:3Δ6，9，12)的气象色谱分析结果，其中1-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，1-B为加入LA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，1-C为加入LA底物的转pYND6质粒的谱峰图，1-D为标准品对照；

图2是微拟球藻Δ6脂肪酸去饱和酶催化(18:3Δ9，12，15)生成(18:4Δ6，9，12，15)的气象色谱分析结果，其中2-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，2-B为加入ALA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，2-C为加入ALA底物的转pYND6质粒的谱峰图，2-D为标准品对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进-步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1Δ6饱和酶基因的获得

具体步骤包括：

1、微拟球藻的培养

1)微拟球藻Nannochloropsis.oculata(Droop)Hibberd购自澳大利亚CSIRO微藻种质库(CSIRO Collection of Living Microalgae)，为纯种培养，编号为CS-179

2)培养用海水为青岛近海自然海水，海水经脱脂棉过滤，100℃煮沸3min。250ml三角烧瓶及移液管等均在用前高压灭菌(121℃，15min)。

3)配制f/2母液并灭菌。

4)按1∶1000(v/v)的比例向消毒海水中加入f/2母液，按1∶10(v/v)的比例接入藻种，置于光照培养箱中不充气培养，每天摇瓶数次。具体培养条件见表1。

表1微拟球藻的培养条件

f/2母液配制

1.基本元素：

NaNO3             78.4g+1L DDW(双蒸水)；

NaSiO3·9H2O      10g+1L DDW

NaH2PO4           4.4g+1L DDW

上述试剂高压灭菌(121℃，15分钟)，每1000ml培养液中各加入1ml。

2.微量元素：

ZnSO4·4H2O       2.3g

MnCl2·4H2O       17.8g

CuSO4·5H2O       1g

Na2MoO4·2H2O     0.73g

CoCl2·6H2O       1.2g

Na2EDTA           5g

上述试剂溶于100mlDDW中，取1ml混合液加入1L DDW中，另加4.3克Na2EDTA，配好的微量元素母液与剩余的混合液一起高压灭菌后储存。使用时每1000ml培养液中加入1ml微量元素母液。

3.Fe元素

FeC6H5O7·5H2O    39g+100ml DDW

取10ml加入1L DDW中作为母液，与剩余的溶液一起高压灭菌储存。使用时每1000ml培养液中加入1ml母液。Fe也可以与微量元素母液配在一起，也是加10ml。

4.维生素

VB12              0.5mg

VB1               100mg

VH                0.5mg

棕色试剂瓶装1L DDW高压灭菌，降至室温后加入上述维生素，4℃储存。使用时每1000ml培养液中加入1ml维生素母液。

4)每天观察藻的生长情况，微拟球藻正常生长时藻液黄绿色，藻体可较长时间悬浮于培养基中，定期进行传代培养，传代的同时进行镜检，观察有无藻体粘连或敌害生物污染。

2、mRNA提取

mRNA提取利用TR1zol试剂(Invitrogen，Cat.No.15596-026)裂解，结合使用RANprep Plant Kit(TIANGEN，Cat.No.DP402-02)。进行RNA纯化，详细过程见试剂使用说明书。

3、文库构建

1)cDNA制备：

利用SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech，Cat.No.634902)，制备cDNA，详细过程见试剂使用说明书。

2)cDNA分段回收、连接：

①取200μl二次扩增的均一化cDNA产物电泳，分别回收0.5-1.0kb，1.0-1.5kb，1.5-2.0kb和＞2.0kb的目的片段；

②载体和感受态使用Promega公司的

Vector Systems和JM109(Cat.#3610)；

③载体和***片段以约1∶3的比例连接(T4DNA ligase)。

3)热激转化

①取4μL连接产物，加入100μL感受态细胞中，混匀，冰上预冷20min；

②42℃热激45s；

③冰上冷却2min后，加0.9ml SOC液体培养基；

④70rpm，37℃，复苏60min；

⑤取5μL菌液涂LB(Ampr)平板，X-Gal、IPTG筛选，37℃培养16小时。

4)cDNA文库测序

从平板上随机挑取单克隆，LB培养，PCR检测后送联合基因科技(集团)有限公司(www.chinagenenet.com)测序。

5)将测序结果在GenBank中进行Blastx比对，发现一个序列与海链藻，三角褐指藻等微藻的Δ6去饱和酶基因具有很高的相似性，初步确认为微拟球藻Δ6去饱和酶基因3’序列。

4、5’RACE获得Δ6去饱和酶基因的5’序列

使用5’RACE试剂盒为：5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends，Version 2.0(Invitrogen，Cat.No.15590-101)。实验中各试剂如无特别说明为试剂盒自带产品，具体过程详见试剂盒使用说明书。根据3’序列设计如下设计5’RACE巢式PCR内外引物

ND(外)：5，-GTTCATGGCCACGAAGTAGAGACC-3，

ND(内)：5，-CAGTCGCGTACGAATGCCAGCAGA-3，

获得的片段，电泳后切取明显条带，T-A连接，转化，鉴定为阳性克隆的菌株送公司测序。测序鉴定一个长度约为900bp的片段为Δ6脂肪酸去饱和酶基因5’序列。

5、Δ6脂肪酸去饱和酶全基因的获得

1)根据3’和5’端序列信息，在GenBank比对查找阅读框，设计如下引物(两端带Kpn I和Sac I酶切位点)：

ND-Kpn I-F：

5′-CGGGTACCACCATGGCACGGGATGGCGAGCCGGTCG-3’

ND-Sac I-R：

5′-GCGGAGCTCTTCGCTTCCCTCCGTCCGTTTACACAG-3’

2)以构建文库时获得的cDNA产物为模版，扩增得到Δ6脂肪酸去饱和酶全基因，PCR反应体系如下：

Sterilized，distilled water    36.5μl

10×PCR buffer                 5.0μl

10mM dNTP mix                  1.0μl

ND-Kpn I-F(10μM)              1.0μl

ND-Sac I-R(10μM)              1.0μl

cDNA                           5.0μl

总体积                         _49.5μl

加入高保真DNA polymerase(5U/μl)立即混匀，如下条件进行PCR扩增：94℃，2m→(94℃，30s→55℃，30s→72℃，1m)×35cycles→72℃，7min

扩增得到了该基因的编码区，并连接入pGEM-T质粒转JM109保存，测序验证，得到Δ6去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6、根据上述测序结果，来自微拟球藻的Δ6脂肪酸去饱和酶基因长度为1425bp，编码474个氨基酸残基，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，该序列具有前端去饱和酶的特征结构域，包括N端细胞色素b5结构域和3个组氨酸簇(176-180、215-219、413-417)。

实施例2表达载体pYND6的构建及酿酒酵母的转化

1、酿酒酵母表达载体pYES2及酵母菌株INVSc1简介

实验表达载体选用pYES2质粒(Invitrogen，Cat.No.V825-20)，长5857bp，带有GAL1启动子，该启动子为诱导型，在培养基中有葡萄糖(glucose)存在时转录受到抑制，而除去葡萄糖加入半乳糖则可以诱导转录。此外，细胞还可以在棉子糖(raffinose)作为碳源的培养基中生长，棉子糖既不诱导也不抑制转录，而且诱导速度比开始以葡萄糖为碳源培养的细胞要快。

酵母菌INVSc1的基因型为MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52，表现型为His^-，Leu^-，Trp^-，Ura^-。质粒pYES2带有URA3基因，可用缺乏尿嘧啶的最小培养基筛选酵母转化子。其他详细信息参见Invitrogen的pYES2说明书。

2、表达载体pYND6的构建及阳性克隆的筛选

1)扩增培养实施例1中获得的含有pGEM-Δ6去饱和酶基因的JM109阳性菌落。

2)按照常规方法提取带有Δ6去饱和酶基因的pGEM质粒，利用相应的DNA内切酶(Kpn I/Sac I)，从***目的基因的pGEM质粒中切取基因，同时利用对应内切酶组合，将pYES2质粒切开成线型双链DNA。

内切酶反应试剂按如下配比：

nuclease-free water    15μl

10×Buffer             2μl

DNA/质粒               1μl

内切酶                 2μl

总体积                 20μl

37℃反应过夜，产物切胶回收纯化

3)载体连接

将内切酶处理后的去饱和酶基因与切好pYES2质粒以2∶1体积比混合，按如下配比混合反应液：

DNA&质粒               10μl

10×Buffer             2μl

nuclease-free water    6μl

T4 DNA Ligase          2μl

总体积                 20μl

22℃反应1h以上，取5μl反应产物热激法转入JM109，涂板挑单克隆培养，菌液PCR检验后测序验证。

由此，构建完成表达载体pYND6，将含有表达载体的大肠杆菌JM109扩增培养，并提取质粒，-20℃保存，准备酵母转化。

3、酿酒酵母感受态细胞的制备及转化。

本实验的酿酒酵母感受态细胞的制备及转化利用EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen，Catalog no.K5050-01)，具体操作过程见试剂盒使用说明书。

转化后的酵母均匀涂于SC-U-平板(平板事先30℃放置1h)，30℃恒温箱培育3d；挑取酵母单菌落培养，提取酵母的DNA，用特意引物ND-Kpn I-F和ND-Sac I-R做PCR检测，设置转空质粒的对照。PCR能够得到目的片段的表示该酵母菌为转入ND6基因的阳性克隆，可用于表达实验。

实施例3酵母菌株的诱导表达及脂肪酸分析

1.诱导表达

1)将含有重组质粒的阳性克隆及空质粒对照菌再次在SC-U(2％glucose)平板上划线，30℃培养至长出菌落；

2)挑单克隆接入3ml SC-U(2％glucose)液体培养基，30℃摇菌过夜；

3)取适量菌液离心，加入3.6mlSC-U(2％glucose)，至初始OD₆₀₀约0.2，加入400μl20％NP-40(终浓度为1％)，同时加入脂肪酸底物(LA，18:2Δ9，12和ALA，18:3Δ9，12，15)至终浓度25uM，20℃诱导72h。

2.脂肪酸提取及分析

2.1脂肪酸提取与甲酯化

1)将诱导后的菌液5000rpm，3min离心收集；

2)液氮研磨，将研磨后的干粉转入EP管中，加300μl KOH饱和的甲醇，涡旋混合后70-80℃皂化15-20min；

3)冷却后加过量1N浓度的HCl-甲醇，涡旋混匀，70-80℃甲酯化15min；

4)加适量正己烷，并淋入少量蒸馏水，分层萃取；

5)12000rpm离心5min后，小心取上层有机层，即可用于气相分析。

2.2脂肪酸的气相色谱(GC)分析

1)仪器：惠普5890 SERIES II；

载气：N₂；线速：20cm/s；分流比：10∶1

流量：2.2ml/min；汽化室温度：260℃；

程序升温：150℃(2min)→15℃/min升至200℃(0min)→2℃/min升至250℃(15min)；

检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；

2)以Cayman公司生产的各种脂肪酸甲酯化后为标准品；

3)将标准品和上述甲酯化的脂肪酸样品进行GC分析，上样量为1-2μl。

4)分析软件：SPSIII型色谱数据处理***。

3.实验结果

气相色谱分析显示，转入pYND6的酵母诱导表达后能将外源加入的脂肪酸底物Linoleic Acid(18:2Δ9，12)催化生成γ-Linolenic Acid(18:3Δ6，9，12)，以及催化α-Linolenic Acid(18:3Δ9，12，15)生成Stearidnoic Acid(18:4Δ6，9，12，15)。说明所转基因编码的蛋白的确具有Δ6脂肪酸去饱和酶的功能，确认为微拟球藻的Δ6脂肪酸去饱和酶。

气相色谱分析如图1，2所示，图1为加入LA后结果，其中1-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，1-B为加入LA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，1-C为加入LA底物的转pYND6质粒的谱峰图，1-D为标准品对照。虽然有背景峰的干扰，但还是可以明显的看到ND6基因能在酵母中得到活性表达，催化LA生成DLA，而空白对照无此功能。

图2为加入ALA结果。其中2-A为转入空pYES2质粒，不加底物的谱峰图，2-B为加入ALA底物的转空pYES2质粒的谱峰图，2-C为加入ALA底物的转pYND6质粒的谱峰图，2-D为标准品对照。虽然有背景峰的干扰，但还是可以明显的看到ND6基因能在酵母中得到活性表达，催化ALA生成SDA(SDA的谱峰比背景峰明显高)，而空白对照无此功能。

n6转化效率比：

18:2Δ9，12和18:3Δ6，9，12在分析图中所占百分比分别为6.63和3.92，其转化比为：6.63+3.92

18:3Δ6，9，12/(18:2Δ9，12+18:3Δ6，9，12)

＝3.92/(6.63+3.92)＝37％

n3转化效率比：

(18:3Δ9，12，15)和(18:4Δ6，9，12，15)在分析图中所占百分比分别为7.74和5.86，其转化比为：

(18:4Δ6，9，12，15)/(18:3Δ9，12，15+18:4Δ6，9，12，15)

＝5.86/(7.74+5.86)＝43％

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序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1425

<212>DNA

<213>Nannochloropsis.oculata

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1425)

<400>1

atg gca cgg gat ggc gag ccg gtc gag acg acg gag tct ttg agc ttc    48

Met Ala Arg Asp Gly Glu Pro Val Glu Thr Thr Glu Ser Leu Ser Phe

1               5                   10                  15

acg gcc gac aag gcg ggg acc atc aag cag cgt ggg cgg aag atc aca    96

Thr Ala Asp Lys Ala Gly Thr Ile Lys Gln Arg Gly Arg Lys Ile Thr

            20                  25                  30

tgg gat gag gtg cgt cag cac aag acg cct cag gac gct tgg ctc gtg    144

Trp Asp Glu Val Arg Gln His Lys Thr Pro Gln Asp Ala Trp Leu Val

        35                  40                  45

tat agg aat aag gtc tac gac gtg tcg agc tgg caa gat cac ccc ggg    192

Tyr Arg Asn Lys Val Tyr Asp Val Ser Ser Trp Gln Asp His Pro Gly

    50                  55                  60

ggg aac gtc atc ttc act cac gcc ggc ggg gac tgc acg gat att ttc    240

Gly Asn Val Ile Phe Thr His Ala Gly Gly Asp Cys Thr Asp Ile Phe

65                  70                  75                  80

gcg gcg ttc cac cct ctt ggc gcc acc tct tat ctt gat cca ttt tac    288

Ala Ala Phe His Pro Leu Gly Ala Thr Ser Tyr Leu Asp Pro Phe Tyr

                85                  90                  95

att ggc gag ctg gag ccg cgc tcg gac aag aag ccc gca gcg cag gcg    336

Ile Gly Glu Leu Glu Pro Arg Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Gln Ala

            100                 105                 110

aac ttt gag cgc gcc tac agg gat ctc agg ggg aag ctt atc gcg ggt    384

Asn Phe Glu Arg Ala Tyr Arg Asp Leu Arg Gly Lys Leu Ile Ala Gly

        115                 120                 125

ggg ttt ttc aag gcg aat cct ttg tac tat gtc tgg aag gta gta tcg    432

Gly Phe Phe Lys Ala Asn Pro Leu Tyr Tyr Val Trp Lys Val Val Ser

    130                 135                 140

tca gtt gcc ctt gct gta ggt gcg tgg gtg ctg gtg gct tgg tcg cag    480

Ser Val Ala Leu Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Ala Trp Ser Gln

145                 150                 155                 160

aac ctg ggc gtg cag atg ctg tct gcg ttt ttg gtg gct ctg ttc tgg    528

Asn Leu Gly Val Gln Met Leu Ser Ala Phe Leu Val Ala Leu Phe Trp

                165                 170                 175

cag caa tgt ggc tgg ttg gcc cat gac ttc ctg cac cac cag gta ttt    576

Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His His Gln Val Phe

            180                 185                 190

aag aac cgt gcg ttg ggt gac ctg gcc ggc atc gtt atc ggc aat gtc    624

Lys Asn Arg Ala Leu Gly Asp Leu Ala Gly Ile Val Ile Gly Asn Val

        195                 200                 205

ttc cag ggt ttc tcc gtg gca tgg tgg aag aac aag cat aac act cac    672

Phe Gln Gly Phe Ser Val Ala Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Thr His

    210                 215                 220

cac gcg gtg ccc aac ctc gtc gag tcc tct ccg gac gcg caa gac gca    720

His Ala Val Pro Asn Leu Val Glu Ser Ser Pro Asp Ala Gln Asp Ala

225                 230                 235                 240

gac cct gac att gac acc atg ccc ata ctg gcc tgg tcg ctc aag atg    768

Asp Pro Asp Ile Asp Thr Met Pro Ile Leu Ala Trp Ser Leu Lys Met

                245                 250                 255

gcc gac agg gcg cag caa tac tca tgg gga ccc ttc ttt gtc agg cat    816

Ala Asp Arg Ala Gln Gln Tyr Ser Trp Gly Pro Phe Phe Val Arg His

            260                 265                 270

cag tcg ctg cta tac ttc ccc atc ctg ctc gtg gcg cgg att tca tgg    864

Gln Ser Leu Leu Tyr Phe Pro Ile Leu Leu Val Ala Arg Ile Ser Trp

        275                 280                 285

ttg atg cag tcg ttc ttg ttt gtc ttt gac tcc gtc cct gga gcg agt    912

Leu Met Gln Ser Phe Leu Phe Val Phe Asp Ser Val Pro Gly Ala Ser

    290                 295                 300

ctg tgg gca acc aag ggc gcg acg gct gag aga cag gcg atc aag aat    960

Leu Trp Ala Thr Lys Gly Ala Thr Ala Glu Arg Gln Ala Ile Lys Asn

305                 310                 315                 320

gtc ggg ttg gag aag gtg ggg ctg gtt gcg cac tac ctg tgg tac ggt    1008

Val Gly Leu Glu Lys Val Gly Leu Val Ala His Tyr Leu Trp Tyr Gly

                325                 330                 335

gcg ctg atg ctg tgc cac atg tcc ctg gcc cgc gcc ctg ctg tac ttc    1056

Ala Leu Met Leu Cys His Met Ser Leu Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Phe

            340                 345                 350

ctg ccg agc cag atg atg tgc ggg ttc ttg ctc gcg ctt gtt ttc ggg    1104

Leu Pro Ser Gln Met Met Cys Gly Phe Leu Leu Ala Leu Val Phe Gly

        355                 360                 365

ctt ggg cac aac ggc atg gat gtt tac gac gcg gac gcc cgg ccc gac    1152

Leu Gly His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asp Ala Asp Ala Arg Pro Asp

    370                 375                 380

ttc tgg aag ctg cag gtg acg acg acg agg aac gtg acg ggc tcg tgg    1200

Phe Trp Lys Leu Gln Val Thr Thr Thr Arg Asn Val Thr Gly Ser Trp

385                 390                 395                 400

ttg gtg cag tgg ttc tgt ggc ggc ctc ggc tac cag gtg gac cac cac    1248

Leu Val Gln Trp Phe Cys Gly Gly Leu Gly Tyr Gln Val Asp His His

                405                 410                 415

ctg ttc ccc atg atc ccg cgg cac cgc cta ggg aag ctc cac ggg ctc    1296

Leu Phe Pro Met Ile Pro Arg His Arg Leu Gly Lys Leu His Gly Leu

            420                 425                 430

gtg gag ggt ttc tgc aag gat cac ggg gtg aag tac cac gag acg aat    1344

Val Glu Gly Phe Cys Lys Asp His Gly Val Lys Tyr His Glu Thr Asn

        435                 440                 445

atg tgg gag ggg acc aaa gag gtg ttg gct cac ttg agc agt gtg acg    1392

Met Trp Glu Gly Thr Lys Glu Val Leu Ala His Leu Ser Ser Val Thr

    450                 455                 460

aaa gag ttc gtg gcc gat ttc gcc gct gtg taa                        1425

Lys Glu Phe Val Ala Asp Phe Ala Ala Val

465                 470

<210>2

<211>474

<212>PRT

<213>Nannochloropsis.oculata

<400>2

Met Ala Arg Asp Gly Glu Pro Val Glu Thr Thr Glu Ser Leu Ser Phe

1               5                   10                  15

Thr Ala Asp Lys Ala Gly Thr Ile Lys Gln Arg Gly Arg Lys Ile Thr

            20                  25                  30

Trp Asp Glu Val Arg Gln His Lys Thr Pro Gln Asp Ala Trp Leu Val

        35                  40                  45

Tyr Arg Asn Lys Val Tyr Asp Val Ser Ser Trp Gln Asp His Pro Gly

    50                  55                  60

Gly Asn Val Ile Phe Thr His Ala Gly Gly Asp Cys Thr Asp Ile Phe

65                  70                  75                  80

Ala Ala Phe His Pro Leu Gly Ala Thr Ser Tyr Leu Asp Pro Phe Tyr

                85                  90                  95

Ile Gly Glu Leu Glu Pro Arg Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Gln Ala

            100                 105                 110

Asn Phe Glu Arg Ala Tyr Arg Asp Leu Arg Gly Lys Leu Ile Ala Gly

        115                 120                 125

Gly Phe Phe Lys Ala Asn Pro Leu Tyr Tyr Val Trp Lys Val Val Ser

    130                 135                 140

Ser Val Ala Leu Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Ala Trp Ser Gln

145                 150                 155                 160

Asn Leu Gly Val Gln Met Leu Ser Ala Phe Leu Val Ala Leu Phe Trp

                165                 170                 175

Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Leu His His Gln Val Phe

            180                 185                 190

Lys Asn Arg Ala Leu Gly Asp Leu Ala Gly Ile Val Ile Gly Asn Val

        195                 200                 205

Phe Gln Gly Phe Ser Val Ala Trp Trp Lys Asn Lys His Asn Thr His

    210                 215                 220

His Ala Val Pro Asn Leu Val Glu Ser Ser Pro Asp Ala Gln Asp Ala

225                 230                 235                 240

Asp Pro Asp Ile Asp Thr Met Pro Ile Leu Ala Trp Ser Leu Lys Met

                245                 250                 255

Ala Asp Arg Ala Gln Gln Tyr Ser Trp Gly Pro Phe Phe Val Arg His

            260                 265                 270

Gln Ser Leu Leu Tyr Phe Pro Ile Leu Leu Val Ala Arg Ile Ser Trp

        275                 280                 285

Leu Met Gln Ser Phe Leu Phe Val Phe Asp Ser Val Pro Gly Ala Ser

    290                 295                 300

Leu Trp Ala Thr Lys Gly Ala Thr Ala Glu Arg Gln Ala Ile Lys Asn

305                 310                 315                 320

Val Gly Leu Glu Lys Val Gly Leu Val Ala His Tyr Leu Trp Tyr Gly

                325                 330                 335

Ala Leu Met Leu Cys His Met Ser Leu Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Phe

            340                 345                 350

Leu Pro Ser Gln Met Met Cys Gly Phe Leu Leu Ala Leu Val Phe Gly

        355                 360                 365

Leu Gly His Asn Gly Met Asp Val Tyr Asp Ala Asp Ala Arg Pro Asp

    370                 375                 380

Phe Trp Lys Leu Gln Val Thr Thr Thr Arg Asn Val Thr Gly Ser Trp

385                 390                 395                 400

Leu Val Gln Trp Phe Cys Gly Gly Leu Gly Tyr Gln Val Asp His His

                405                 410                 415

Leu Phe Pro Met Ile Pro Arg His Arg Leu Gly Lys Leu His Gly Leu

            420                 425                 430

Val Glu Gly Phe Cys Lys Asp His Gly Val Lys Tyr His Glu Thr Asn

        435                 440                 445

Met Trp Glu Gly Thr Lys Glu Val Leu Ala His Leu Ser Ser Val Thr

    450                 455                 460

Lys Glu Phe Val Ala Asp Phe Ala Ala Val

465                 470

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgggacgcg gtggcgagcg g     21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttacatggcg gggaaatcgg cc    22

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gttcatggcc acgaagtaga gacc                 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cagtcgcgta cgaatgccag caga                 24

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgggtaccac catggcacgg gatggcgagc cggtcg    36

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gcggagctct tcgcttccct ccgtccgttt acacag    36

Claims (7)

1.一种海洋微藻Δ6脂肪酸去饱和酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述海洋微藻Δ6脂肪酸去饱和酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的酶在制备EPA中的应用。

7.权利要求1所述的酶在制备DHA中的应用。

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