CN101289502A - 一种植物耐低温蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐低温蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低温蛋白活性的蛋白质。本发明的耐低温蛋白的编码基因可转入植物中提高植物抗冻性。该基因对于植物耐冷(冻)分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义，并为改良作物的耐冷性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种植物耐低温蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐低温蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

低温胁迫是水稻生产中常见的非生物胁迫。据统计，全世界有1500万公顷以上的稻作受到低温威胁，仅我国在灾年中平均每年将损失稻谷约50-100亿公斤，给人们生产生活带来严重危害。植物遭遇低温胁迫和缺磷时，均会影响细胞的生长和***，使分蘖分枝减少，生长缓慢，植株矮小甚至死亡，严重影响植物生长和发育。因此在水稻中挖掘同时与耐低温和响应低磷胁迫相关的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。

已有一些研究表明含有SPX(SYG1/Pho81/XPR1)结构域的基因参与磷的信号转导和调节途径。SPX是约180个氨基酸长，存在于3种已知蛋白(SYG1、Pho81和XPR1)N末端的一个结构域，其名称来源于这三种蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人(Spain，B.H.，Koo，D.，Ramakrishnan，M.，Dzudzor，B.and Colicelli，J.(1995)Truncatedforms of a novel yeast protein suppress the lethality of a G protein alpha subunit deficiencyby interacting with the beta subunit.J Biol Chem，270，25435-25444)研究发现酵母SYG1的N末端可与G-蛋白结合从而抑制交配信息素(mating pheromone)的信号转导；在磷饥饿条件下，有报导CDK抑制子Pho81可抑制PHO80-PHO85及Pcl7-Pho85复合体的酶活性(Lee，M.，O′Regan，S.，Moreau，J.L.，Johnson，A.L.，Johnston，L.H.and Goding，C.R.(2000)Regulation of the Pcl7-Pho85 cyclin-cdk complex by Pho81.Mol Microbiol，38，411-422)；Poleg等人(1996)(Poleg，Y.，Aramayo，R.，Kang，S.，Hall，J.G.andMetzenberg，R.L.(1996)NUC-2，a component of the phosphate-regulated signaltransduction pathway in Neurospora crassa，is an ankyrin repeat protein.Mol Gen Genet，252，709-716)在真菌Neurospora crassa中发现，与PHO81结构相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在并参与磷转运的调节途径。2002年，Hamburger等人(Hamburger，D.，Rezzonico，E.，MacDonald-Comber Petetot，J.，Somerville，C.and Poirier，Y.(2002)Identification and characterization of the Arabidopsis PHO1 gene involved in phosphateloading to the xylem.Plant Cell，14，889-902)在拟南芥中亦发现一类SPX基因，即PHO1(具有SPX结构域和EXS结构域)基因和PHO1类似蛋白，它们可参与磷由根到茎的运输，并在根的微管束细胞中特异表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐低温蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物耐低温蛋白，名称为OsSPX3，来源于稻属水稻(Oryza sativaL.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低温功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列3所示的蛋白序列由277个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-159位氨基酸残基为SPX蛋白结构域。

为了使(a)中的OsSPX3分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的OsSPX3便于纯化，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsSPX3可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的OsSPX3的编码基因可通过将序列表中序列1或序列2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物耐低温蛋白的编码基因(OsSPX3)也属于本发明的保护范围。

上述植物耐低温蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列2的DNA序列；

2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列2是由834个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列2的5′端第1-834位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质。

上述植物耐低温蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列1是由1993个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5′端第1-237位核苷酸序列为第一个外显子，自序列表中序列1的5′端第328-478位核苷酸序列为第二个外显子，自序列表中序列1的5′端第1548-1993位核苷酸序列为第三个外显子；自序列表中序列1的5′端第238-327位核苷酸序列为第一个内含子，自序列表中序列1的5′端第479-1547位核苷酸序列为第二个内含子。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有上述植物耐低温蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了上述植物耐低温蛋白编码基因在提高植物耐冻性中的应用。

所述提高植物耐冻性的方法是将上述的植物耐低温蛋白编码基因通过植物表达载体转入植物中，筛选得到耐冻性提高的植物。

上述植物表达载体可为pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是番茄、拟南芥、烟草、棉花等双子叶植物；优选为水稻、烟草。

使用OsSPX3构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明编码提高烟草抗冻性的基因OsSPX3的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻细胞或组织培育成植株。

本发明的耐低温蛋白的编码基因可转入植物中提高植物抗冻性。该基因对于植物耐冷(冻)分子机制的研究，植物抗逆性品种的选育具有重要的理论及实际意义，并为改良作物的耐冷性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为水稻OsSPX3基因在低温处理条件下与正常条件下(对照)的表达量比较。

图2为水稻OsSPX3的植物表达载体(pCOU OsSPX3)的构建图(图中A)和转pCOU OsSPX3烟草的RT-PCR鉴定。

图3为转pCOU OsSPX3烟草在不同温度下的表型分析。

图4为转pCOU OsSPX3烟草在不同温度下的生理指标(包括离子渗透、脯氨酸含量、蔗糖含量和磷含量)的变化。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。

实施例1、水稻SPX基因在低温处理条件下的表达特征检测

通过芯片数据挖掘，在水稻基因组序列中发现一个预测的PHO1亚家族不同的另一类只具有SPX结构域而无EXS结构域的SPX基因，定位于第10号染色体从12,757,421bp到12,760,157bp，其NCBI定位号为NP_001064515，NCBI基因号(GENEID)为：Os10g0392600，TIGR号为LOC_Os10g25310。

利用实时定量RT-PCR的方法对上述预测的基因在冷处理条件下的表达谱进行验证。依据NCBI的基因组数据库的信息设计实时定量RT-PCR引物，正向引物Os-s10F：5’-tcgccggacatggaaaggat-3’；反向引物Os-s10R：5’-cggcggcagcgagaacc-3’。

以日本晴为材料，按照下述方法进行实时定量RT-PCR：将发芽约1周，芽长约5mm的日本晴幼苗置于4-5℃进行低温处理，处理时间为6h，12h，24h，48h后，利用TRIZOL试剂提取RNA，以正常生长条件下的幼苗为对照。以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，以Os-s6F和Os-s6R为引物，进行实时定量RT-PCR检测。实时定量RT-PCR检测内标基因选用水稻中的18s rRNA基因，引物序列为：18S-F：5′-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3′；18S-R：5′-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3′。

反应体系为：4μl cDNA模板(2ng/μl)，4.5μl SYBR Green Master Mix，1μl特异引物，0.5μl ddH₂O。

扩增程序如下(利用MJ Research公司生产的检测***)：95℃ 5min，1个循环，95℃ 30s，60℃ 30s，读板(read plate)，85℃ 1s读板(read plate)，共40个循环，72℃ 2min，65℃-95℃每隔0.2℃作溶解曲线。上述实验设3个重复。

结果如图1所示，结果表明，上述水稻SPX基因在低温处理6h，12h，24h和48h后，表达量持续增高，说明此基因确实为冷诱导基因。图1的纵坐标表示的是低温处理水稻SPX基因表达量与正常条件下水稻SPX基因表达量的比。

实施例2、水稻SPX基因及其编码蛋白的获得及其功能验证

一、水稻SPX基因及其编码蛋白的获得

设计实施例1所述水稻SPX基因的全长cDNA序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶BglII和KpnI识别位点及保护碱基，引物序列如下：CDS-PF：5’-CGGGGTACCCCGATGAAGTTTGGGAAGAGGCTGAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)；CDS-PR：5’-CGAGATCTCGTTAGGCATAAAAAAACTGTAAACTTGGAAT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BglII识别位点及保护碱基)。利用TRIZOL试剂提取日本晴低温处理12h(4℃)的芽期植株的RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，在引物CDS-PF和引物CDS-PR的引导下，用常规PCR法扩增水稻SPX基因的cDNA序列，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到834bp的DNA片段，将该片段进行测序，结果表明，PCR扩增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为OsSPX3。序列表中序列2的核苷酸序列是由834个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列2的5′端第1-834位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质。将该蛋白命名为OsSPX3。序列表中序列3所示的蛋白序列共有277氨基酸，自氨基端(N端)第1-159位氨基酸残基为SPX蛋白结构域。通过序列比对，与TIGR水稻基因组数据库进行比较，确认其定位号为LOC_Os10g25310，与实施例1中所预测的基因相一致，其基因组基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序列1的5′端第1-237位核苷酸序列为第一个外显子，自序列表中序列1的5′端第328-478位核苷酸序列为第二个外显子，自序列表中序列1的5′端第1548-1993位核苷酸序列为第三个外显子；自序列表中序列1的5′端第238-327位核苷酸序列为第一个内含子，自序列表中序列1的5′端第479-1547位核苷酸序列为第二个内含子。

二、水稻SPX基因及其编码蛋白的耐低温功能验证

1、水稻OsSPX3的植物表达载体(pCOU OsSPX3)的构建

将步骤一PCR扩增得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列的OsSPX3的cDNA片段，用BglII和KpnI进行双酶切，回收纯化后，将其***到植物表达载体pCambial301-UbiN(GenBank号：AF234296)多克隆位点的BglII和KpnI酶切位点之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有序列表中序列2的核苷酸序列的重组表达载体命名为pCOU OsSPX3(其结构简图如图2中A所示)。

2、转OsSPX3烟草的获得

1)转化烟草

将步骤1构建的水稻OsSPX3的植物表达载体pCOU OsSPX3用农杆菌转化法转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthinn)的外植体。具体方法为：

(1)将pCOU OsSPX3转化农杆菌得到含有pCOU OsSPX3的农杆菌，将含有pCOU OsSPX3的农杆菌接种于YEB液体培养液(100μg/ml Kan，75μg/ml Rif)中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；以10,000rpm室温离心1min，用MS盐溶液(pH7.0)重新悬浮菌体，使用时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍得到含有pCOUOsSPX3的农杆菌菌液。

(2)无菌的烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthinn)叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm²大小，得到外植体；

(3)将步骤(2)得到的外植体在步骤(1)得到的含有pCOU OsSPX3的农杆菌菌液中浸泡10min；

(4)用无菌滤纸吸干外植体材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28℃暗培养；3天后，将材料转到含有相应抗生素的MS分化培养基中进行培养；待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入MS生根培养基中诱导生根，分化得到转基因植株。

2)转基因烟草的PCR鉴定

提取步骤1)得到的转基因烟草的基因组DNA并以此为模板，在引物1：5′-ATGAAGTTTGGGAAGAGGCTGAAG-3′和引物2：5′-TTAGGCATAAAAAAACTGTAAACTTGGAAT-3′的引导下，进行PCR检测，PCR反应条件为：先94℃ 5min；然后94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2中B所示，阳性OsSPX3转基因植株可扩增出约834bp的条带。结果得到6株PCR鉴定阳性的转pCOU OsSPX3烟草T0代植株。图2中B的泳道WT为野生型烟草对照，其他的泳道为转pCOU OsSPX3烟草PCR鉴定结果，图2中B中的actin表示微丝中的肌动蛋白，在这里作为转基因检测的对照。

3、转pCOU OsSPX3烟草的耐低温功能验证

将步骤2的步骤2)PCT鉴定阳性的转pCOU OsSPX3烟草和野生型烟草(WT，Nicotiana tabacum L.cv.Xanthinn)正常(25℃，16小时昼/8小时夜周期)生长4周，然后分别置于0℃，培养24小时，然后再在-2℃冷冻处理3小时，然后再置于正常(25℃)条件进行恢复生长2天，此过程中，观察转pCOU OsSPX3烟草和野生型烟草的生长状况，同时检测了它们的离子渗透、脯氨酸含量、蔗糖含量和叶片磷含量。

生长状况结果如图3所示，结果表明，正常培养4周的时间内，转pCOU OsSPX3烟草和野生型烟草的生长情况无明显差异(图3中A)，当将它们置于0℃24小时后，野生型植株较转pCOU OsSPX3烟草植株明显萎蔫(图3中B)；当将它们再在-2℃冷冻处理3小时后，虽然野生型和转基因植株都表现出冷冻伤害，但野生型烟草植株要更加明显，所有植株几乎完全萎蔫(图3中C)；再经过两天正常条件下的恢复生长，部分转基因植株表现出生长恢复迹象，而绝大部分野生型植株无法恢复(图3中D)。图3中A、B、C、D中的WT均表示上述野生型烟草，Ubi::OsSPX3均表示转pCOU OsSPX3烟草。

与抗冷性相关的一些生理生化指标(离子渗透、脯氨酸含量、蔗糖含量、磷含量)检测结果如图4所示，结果表明转OsSPX3基因烟草较野生型烟草具有更强的抗冻性(图4)。同时，叶片磷含量的测定表明在低温条件下，转基因烟草的植株中磷含量的下降程度要大于野生型烟草(图4)，图4中A为转pCOU OsSPX3烟草的电导率检测结果；图4中B为转pCOU OsSPX3烟草的脯氨酸含量检测结果；图4中C为转pCOU OsSPX3烟草的蔗糖含量检测结果；图4中D为转pCOU OsSPX3烟草的磷含量检测结果。图4中A、B、C、D中的WT均表示上述野生型烟草，Ubi::OsSPX3均表示转pCOU OsSPX3烟草。图4中的FW表示鲜重，DW表示干重。

序列表

<160>3

<210>1

<211>1993

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>1

atgaagtttg ggaagaggct gaagaagcag gtggaggaga gcctcccgga gtggagggac     60

aagttcttgg cgtacaagcg cctcaagaag ctcgtcaggc tcgtctcctc ctcctccggc    120

gatgtcggcg gcggcggcgg cggcgaggcc gaattcgtgc ggctgctcga cggcgaggtc    180

gacaggatca acgccttctt cctcgagcag gaggaggagt tcgtcatacg gcagagggtc    240

tctgcattag ctatttctgc agcaaagatt tttggttttg ggaagttgag atgatgattg    300

tgagcctgcg tgcattgttc gtcgcaggag ctgcaggaga cagtggagaa ggtggccggc    360

ggcggcggtg gagggcggcg gccggcggcg gcggagatga ggagggtgag gaaggagatc    420

gtggacctgc acggggagat ggtgctgctg cttaactaca gcgccgtcaa ctacacaggt    480

ttgagtttgg tttcaaattt caaattcaaa cttaggaggt gaaaactttc agaattttcg    540

tatacgaccc gtgacaaggt tcgtacggag taattacgaa ctggtattcc caaagagatc    600

tcaattccca aatttcaaat atttcgatgg gcccgggtag agcaccatac cagggggaat    660

agttttttct ttttaaaatc tttttttttt ggcgcaaaca ggtgagcatc atttgtagta    720

gctgtgtgct taacaacttc tgatacaaca gtactcctcc gtcctaaaat aaatgcagtt    780

ttgcactatt cacattcaac gtttgaccgt tcgtcttatt taaacctttt ttatgattag    840

tatttttatt actattagat gataaaacat aaatagtact ttacgtgtga ctaaatattt    900

tcaaattttt tacaaatttt ttaaataaga cggacggtca aacattgggc acggatatcc    960

acggctacac ttattttagg acggatgtag cactaacagt gattttttga cttgaaaatt   1020

ttcttatgat ttgatcactg ttcaacttga gacttgtcgt agccgtcccc atgtgagtca   1080

acagtatctt caggctgcac attacagcca aaattttctc tacacaacaa aattcattca   1140

gtgcatttgc acagaacagt aactgcaacc taaagacaat ctgtttatcc atatagatta   1200

tagttagaca cgatgatgat ctgtttatcc acaaatatta tagactaatc gtcttcccta   1260

tcgatcggta agtgactagg ctgtgttcct tactgggttg gaacccactt tctccgcgcg   1320

aaaaacggaa cagtttatta gcacattatt aattaagtat tagctttttt aaaaaataaa   1380

ttaatttgat ttttttaaaa caactttcgt ataaaaactt ctaaaaaaat cacaccgttt   1440

agcagcgccg ataacaaagg ataagggttg ggaccatgct gaaacgaacg cagccagaga   1500

ggctgaacat ggtgatgaat tattgatgat gatctgtgaa attgcagggc tggccaagat   1560

cctgaagaaa tacgacaagc gcaccggccg cctcctccgg ctgccgttca tcgagaaggt   1620

gctccggcag ccgttcttca cgacggagct catctcgagg ctcgtccgcg actgcgaggc   1680

caccatggag gccatcttca cctcctccgt ggcgacgacg gcgatggccg gcgatcgccg   1740

gacatggaaa ggatgctccg gcgacgccgg gatggctccg atggcagacc agcagggcat   1800

cttccggaac accgtcgccg cgctggcgac gatgaaggag ctccggagcg ggagctcgac    1860

gtacgggcgg ttctcgctgc cgccgatggc ggcgccggcc tcgccggagt ccgacgtgct    1920

gcagtccatc cgatccgatc cccatctgaa agagaatgga agaattccaa gtttacagtt    1980

tttttatgcc taa                                                       1993

<210>2

<211>834

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>2

atgaagtttg ggaagaggct gaagaagcag gtggaggaga gcctcccgga gtggagggac     60

aagttcttgg cgtacaagcg cctcaagaag ctcgtcaggc tcgtctcctc ctcctccggc    120

gatgtcggcg gcggcggcgg cggcgaggcc gaattcgtgc ggctgctcga cggcgaggtc    180

gacaggatca acgccttctt cctcgagcag gaggaggagt tcgtcatacg gcagagggag    240

ctgcaggaga cagtggagaa ggtggccggc ggcggcggtg gagggcggcg gccggcggcg    300

gcggagatga ggagggtgag gaaggagatc gtggacctgc acggggagat ggtgctgctg    360

cttaactaca gcgccgtcaa ctacacaggg ctggccaaga tcctgaagaa atacgacaag    420

cgcaccggcc gcctcctccg gctgccgttc atcgagaagg tgctccggca gccgttcttc    480

acgacggagc tcatctcgag gctcgtccgc gactgcgagg ccaccatgga ggccatcttc    540

acctcctccg tggcgacgac ggcgatggcc ggcgatcgcc ggacatggaa aggatgctcc    600

ggcgacgccg ggatggctcc gatggcagac cagcagggca tcttccggaa caccgtcgcc    660

gcgctggcga cgatgaagga gctccggagc gggagctcga cgtacgggcg gttctcgctg    720

ccgccgatgg cggcgccggc ctcgccggag tccgacgtgc tgcagtccat ccgatccgat    780

ccccatctga aagagaatgg aagaattcca agtttacagt ttttttatgc ctaa          834

<210>3

<211>277

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>3

Met Lys Phe Gly Lys Arg Leu Lys Lys Gln Val Glu Glu Ser Leu Pro

1               5                   10                  15

Glu Trp Arg Asp Lys Phe Leu Ala Tyr Lys Arg Leu Lys Lys Leu Val

            20                  25                  30

Arg Leu Val Ser Ser Ser Ser Gly Asp Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly

        35                  40                  45

Glu Ala Glu Phe Val Arg Leu Leu Asp Gly Glu Val Asp Arg Ile Asn

    50                  55                  60

Ala Phe Phe Leu Glu Gln Glu Glu Glu Phe Val Ile Arg Gln Arg Glu

65                  70                  75                  80

Leu Gln Glu Thr Val Glu Lys Val Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg

                85                  90                  95

Arg Pro Ala Ala Ala Glu Met Arg Arg Val Arg Lys Glu Ile Val Asp

            100                 105                 110

Leu His Gly Glu Met Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ser Ala Val Asn Tyr

        115                 120                 125

Thr Gly Leu Ala Lys Ile Leu Lys Lys Tyr Asp Lys Arg Thr Gly Arg

    130                 135                 140

Leu Leu Arg Leu Pro Phe Ile Glu Lys Val Leu Arg Gln Pro Phe Phe

145                 150                 155                 160

Thr Thr Glu Leu Ile Ser Arg Leu Val Arg Asp Cys Glu Ala Thr Met

                165                 170                 175

Glu Ala Ile Phe Thr Ser Ser Val Ala Thr Thr Ala Met Ala Gly Asp

            180                 185                 190

Arg Arg Thr Trp Lys Gly Cys Ser Gly Asp Ala Gly Met Ala Pro Met

        195                 200                 205

Ala Asp Gln Gln Gly Ile Phe Arg Asn Thr Val Ala Ala Leu Ala Thr

    210                 215                 220

Met Lys Glu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Arg Phe Ser Leu

225                 230                 235                 240

Pro Pro Met Ala Ala Pro Ala Ser Pro Glu Ser Asp Val Leu Gln Ser

                245                 250                 255

Ile Arg Ser Asp Pro His Leu Lys Glu Asn Gly Arg Ile Pro Ser Leu

            260                 265                 270

Gln Phe Phe Tyr Ala

        275

Claims (10)

1、一种植物耐低温蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；

2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐低温蛋白活性的蛋白质。

2、权利要求1所述的植物耐低温蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物耐低温蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述植物耐低温蛋白的基因组基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求2-4中任意一项所述的植物耐低温蛋白编码基因的重组表达载体。

6、含有权利要求2-4中任意一项所述的植物耐低温蛋白编码基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2-4中任意一项所述的物耐低温蛋白编码基因的宿主菌。

8、权利要求2-4中任意一项所述的植物耐低温蛋白编码基因在提高植物耐冻性中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述提高植物耐冻性的方法是权利要求2-4中任意一项所述的植物耐低温蛋白编码基因通过植物表达载体转入植物中，筛选得到耐冻性提高的植物。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物表达载体为pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN；所述植物为农作物，优选为水稻、烟草。

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