CN101287837A - 昆虫细胞中生产的改进的aav载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在昆虫细胞中生产腺伴随病毒载体。因此，所述昆虫细胞包括编码腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白的第一核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子为非ATG的亚最佳起始密码子。所述昆虫细胞还包括：一个第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包括至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；一个第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包括与用于昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列；和，一个第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包括与用于昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。本发明还涉及病毒衣壳蛋白比例改变的腺伴随病毒载体，所述病毒衣壳蛋白比例的改变增强了病毒颗粒的感染性。
Description
技术领域
本发明涉及在昆虫细胞中生产腺伴随病毒，以及涉及病毒衣壳蛋白比例改变的腺伴随病毒，所述病毒衣壳蛋白的比例改变增强了感染性。
背景技术
腺伴随病毒(AAV)可能被认为是用于人类基因治疗的最有前景的病毒载体之一。AAV能够有效感染***的以及非***的人类细胞，AAV病毒基因组可整合到宿主细胞基因组中的单一染色***点，并且，最为重要的是，尽管AAV存在于许多人的体内，但它并不与任何疾病相关。由于这些优点，于是在血友病B、恶性黑色素瘤、囊性纤维化病和其他疾病的基因治疗临床试验中正在对重组腺伴随病毒(rAAV)进行评估。
维持AAV体外复制的宿主细胞均来自哺乳动物细胞类型。因此，基因治疗中使用的rAAV绝大多数都是产生于哺乳动物细胞系，例如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系(参见例如，US 6,156,303、US 5,387,484、US 5,741,683、US 5,691,176、US5,688,676、US 20020081721、WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947)。通常通过提供DNA质粒在这类哺乳动物细胞培养***中产生rAAV载体，所述DNA质粒包含其侧翼连有如下基因的治疗基因：AAV复制起点(末端反向重复序列或ITR)、AAV复制蛋白Rep78、Rep68、Rep 52和Rep40的基因以及病毒体或结构蛋白VP1、VP2和VP3的基因。此外，含有腺病毒早期基因(E2A、E4ORF6、VARNA)的质粒被用来增强AAV基因的表达和增加载体产量(参见例如，Grimm et al.，1998，Hum.Gene Ther.9：2745-2760)。然而，在大多数的上述哺乳动物细胞培养***中，每个细胞产生的AAV颗粒数约为104个颗粒(Clark，2002，Kidney Int.61(Suppl.1)：9-15中进行了综述)。而一个临床研究可能需要1015个以上的rAAV颗粒。为产生该数目的rAAV颗粒，可能需要用近1011个培养的人类293细胞——相当于5,000瓶175-cm2培养瓶的细胞——进行转染和培养，这就意味着要转染高达1011个293细胞。因此，已经证明了用哺乳动物细胞培养***大规模生产rAAV以获得临床试验材料是个难题。商业规模的生产则更加不可行。此外，一直存在的一个风险是，哺乳动物细胞培养中生产的临床用载体可能会被哺乳动物宿主细胞中存在的不良物质(或许是致病物质)污染。
为克服哺乳动物生产***中的这些问题，最近开发了使用昆虫的AAV生产***(Urabe et al.，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943；US 20030148506和US 20040197895)。为了在昆虫细胞中由杆状病毒表达***生产AAV，有必要进行一些修饰，因为，AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)在哺乳动物细胞中的正确化学计量的表达有赖于以下两方面的结合：第一，两个剪接受***点的交替使用；第二，不能由昆虫细胞精确产生的VP2的ACG起始密码子的亚最佳使用。三种衣壳蛋白的正确化学计量对于AAV颗粒的感染性十分重要。已知，所含VP1量较少的AAV颗粒感染性较弱，VP1具有磷脂酶A2活性，该活性对感染性有作用(Girod et al.，2002J.Gen.Virol.83：973-8)。
因此，为了表达三种衣壳蛋白，Urabe等人(2002，见上文)采用了一种转录为单个多顺反信使的构建体，所述信使能够表达全部三种VP蛋白而不需剪接。为了产生正确化学计量的三种衣壳蛋白，赋予VP1阅读框(利用核糖体扫描法观察到的首个起始密码子)亚最佳起始密码子ACG，并且优化了该密码子附近的序列。据Urabe等人(2002，见上文)报道，通过对昆虫细胞的核糖体扫描得出三种衣壳蛋白的计量与野生型AAV接近。
然而，本发明的发明人发现，与例如哺乳动物293细胞产生的常规AAV载体相比，VP1杆状病毒***中产生的AAV载体仍以相对VP2的欠佳水平表达，这使得在小鼠的体内和体外研究中其感染性减弱。因此，仍然需要一种感染性增强的rAAV载体的基于杆状病毒的生产***。
发明内容
定义
本文所用术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件在功能关系上的连接。当将一种核酸被置于与另一核酸序列具有功能关系的位置时，该核酸就被“可操作地连接”。例如，如果一个转录调控序列影响一个编码序列的转录，则它与该编码序列就是可操作地连接的。可操作地连接意为被连接的DNA序列通常为连续的，并且当有必要连接两个蛋白质编码区域时，该序列是连续的并且处于正确的阅读框内。
“表达控制序列”是指调控与其可操作地连接的核苷酸序列表达的核酸序列。当一段表达控制序列控制和调节一段核苷酸序列的转录和/或翻译时，该表达控制序列与该核苷酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括启动子、增强子、内核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”意在最低限度地包括一种其存在是被设计用来影响表达的序列，并且，还可包括其他有利的组成部分。例如，前导序列和融合伴侣序列(fusion partner sequence)即为表达控制序列。该术语还可包括可除去序列中的框内以及框外的不想要的潜在起始密码子的核酸序列设计。它还可包括可除去不想要的潜在剪接位点的核酸序列设计。它包括指导添加多聚腺苷酸尾的序列或多腺苷酸化序列(pA)，多聚腺苷酸尾是mRNA 3’末端的一长串腺嘌呤残基，该序列被称为多聚腺苷酸序列。它还可被设计用于增加mRNA的稳定性。影响转录和翻译稳定性的表达控制序列例如启动子，以及实现翻译的序列例如Kozak序列，为昆虫细胞内的已知序列。表达控制序列可具有调节与其可操作地连接的核苷酸序列的性质，使得可实现较低的表达水平或者较高的表达水平。
本文所用术语“启动子”或“转录调控序列”是指具有控制一个或多个编码序列转录的作用的核酸片段，它位于该编码序列的转录起始位点的转录方向上游，并且可通过存在的DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列来进行结构性识别，所述其他DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的可直接或间接起到调节启动子转录量作用的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子为在多数生理或发育条件下在多数组织中都具有活性的启动子。“可诱导”启动子为例如通过使用化学诱导物来进行生理或发育调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定的组织或细胞中具有活性。
术语“基本上相同”、“基本相同”或“基本上类似”或“基本类似”意为，当两个肽序列或两个核苷酸序列在例如用缺省参数通过GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时，它们至少共有某一百分比的序列同一性，所述序列同一性如说明书其他部分所定义。GAP采用Needleman和Wunsch全序列比对算法对两个全长序列进行比对，并使匹配数最大，使空位数最小。通常采用GAP缺省参数，其空位生成罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)以及空位延长罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。针对核苷酸，采用的缺省计分矩阵为nwsgapdna，针对蛋白质采用的缺省计分矩阵为Blosum62(Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。当RNA序列被认为与DNA序列基本类似或具有一定程度的序列同一性时，可认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)相当于RNA序列中的尿嘧啶(U)，这一点已经很清楚。可以利用计算机程序通过序列比对和计分来确定序列同一性百分比，所述计算机程序例如GCG Wisconsin Package，版本10.3(购自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA)或Windows开放源码软件Emboss(现行版本2.7.1-07)。或者，还可通过检索数据库例如FASTA、BLAST等来确定相似性或同一性百分比。
具体实施方式
本发明涉及动物细小病毒——特别是依赖病毒例如感染性人类或猿猴AAV——和其组成部分(例如动物细小病毒基因组)用于在哺乳动物细胞中诱导和/或表达核酸的载体的用途。具体而言，本发明涉及用昆虫细胞生产细小病毒载体时对这类病毒载体感染性的改进。
细小病毒科的病毒为小DNA动物病毒。细小病毒科可分为两个亚科：细小病毒亚科(Parvovirinae)，该亚科感染脊椎动物；浓核病病毒亚科(Densovirinae)，该亚科感染昆虫。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒，并且包括依赖病毒属。从依赖病毒属的属名就可推知，依赖病毒属的成员独特性在于，它们通常需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒一起共感染来在细胞培养物中进行生产性感染。依赖病毒属包括AAV——AAV通常感染人类(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)——和感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、犬、马和羊腺伴随病毒)。细小病毒和其他细小病毒科成员相关的进一步信息在Kenneth I.Berns，″Parvoviridae：TheViruses and Their Replication，″Fields Virology，第69章(3d Ed.1996)中有记载。为方便起见，本文将参照AAV对本发明进行进一步举例说明和描述。但应理解的是，本发明并不限于AAV，本发明同样可应用于其他细小病毒。
所有已知的AAV血清型的基因组结构都非常相似。AAV基因组是长度小于约5000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。末端反向重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白质和结构(VP)蛋白质独特的编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白质可形成衣壳。末端145nt自身互补，并排布成可形成能量稳定的分子内螺旋的结构，所述螺旋形成T形发夹结构。这些发夹结构起到病毒DNA复制起点的作用，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。Rep基因编码Rep蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68由p5启动子起动转录，Rep 52和Rep40由p19启动子起动转录。cap基因编码VP蛋白质VP1、VP2和VP3。cap基因由p40启动子起动转录。
一方面，本发明涉及一段包括含编码动物细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的可译框架的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子为非ATG且非ACG的亚最佳起始密码子。本文中的亚最佳应理解为该密码子在相同环境下比常用的ATG密码子启动翻译的效率低。优选地，AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子选自ACG、TTG、GTG和CTG，更优选地，AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子选自TTG、GTG和CTG，最优选地，AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子为CTG。动物细小病毒优选为依赖病毒，更优选为人或猿腺伴随病毒(AAV)。
在一个包括含编码动物细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的可译框架的核苷酸序列中，当AAV VP1衣壳蛋白的翻译起始密码子为TTG或GTG起始密码子时，病毒体的VP1∶VP2蛋白量比率近乎相等，即为等摩尔，而如果起始密码子为CTG，则病毒体的VP1蛋白量比VP2的量高。如果起始密码子为ACG，则病毒体的VP1蛋白量比VP2低。病毒体的感染性随病毒体的VP1与VP2的比率的增大而增加。
本发明用于表达AAV衣壳蛋白的优选核苷酸序列为包括一个位于编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的起始密码子上游的表达控制序列的核苷酸序列，所述表达控制序列包括九核苷酸序列SEQ.ID NO：7或与SEQ.ID NO：7基本上同源的核苷酸序列。与SEQ.ID NO：7核苷酸序列基本上一致且将有助于增加VP1表达的序列为例如与九核苷酸序列SEQ.ID NO：7具有至少60％、70％、80％或90％同一性的序列。
本发明表达AAV衣壳蛋白的更优选核苷酸序列为包括一个位于编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的起始密码子附近的表达控制序列的核苷酸序列，所述表达控制序列包括Kozak共有序列。本文所定义的Kozak共有序列为GCCRCC(NNN)G(SEQ.ID NO：8)，其中R为嘌呤(即A或G)，并且其中(NNN)代表本文上述定义的任何亚最佳起始密码子。优选地，在本发明的核苷酸序列的Kozak共有序列中，R为G。因此，包括Kozak共有序列的本发明表达AAV衣壳蛋白的核苷酸序列优选地选自：GCCACC(ACG)G、GCCGCC(ACG)G、GCCACC(TTG)G、GCCGCC(TTG)G、GCCACC(GTG)G、GCCGCC(GTG)G、GCCACC(CTG)G和GCCGCC(CTG)G；更优选地，包括Kozak共有序列的该核苷酸序列选自GCCACC(CTG)G和GCCGCC(CTG)G；最优选地，包括Kozak共有序列的核苷酸序列为GCCGCC(CTG)G。此处，括号中的核苷酸表示VP1蛋白质的起始密码子的位置。
本发明表达AAV衣壳蛋白的核苷酸序列还优选地包括至少一种对编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的修饰，选自：核苷酸第12位的G，核苷酸第21位的A和核苷酸第24位的C。本领域技术人员应知晓如何消除用于翻译其他血清型VP1的可能的错误起始位点，也应知晓如何消除昆虫细胞中可能被识别的推定剪接位点。用来在昆虫细胞中正确表达的野生型AAV序列的各种修饰可通过应用熟知的基因工程技术(例如Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York所述)来实现。可增加VP和病毒体产量或具有其他所需作用的对VP编码区域的各种其他修饰是本领域技术人员已知的，所述其他所需作用例如趋向性改变或病毒体抗原性减弱。这些修饰也在本发明的范围之内。
本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列优选地与用于在昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接。这些表达控制序列应至少包括昆虫细胞内的活性启动子。可以使用本领域技术人员已知的在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术实施本发明。例如在下述文献中描述了用于在昆虫细胞内进行分子工程和多肽表达的方法：Summers and Smith.1986.A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect CultureProcedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.；Luckow.1991.In Prokop et al.，Cloning and Expression of Heterologous Genesin Insect Cells withBaculovirus Vectors′Recombinant DNA Technology and Applications，97-152；King，L.A.and R.D.Possee，1992，The baculovirusexpression system，Chapman and Hall，United Kingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，Baculovirus ExpressionVectors：A Laboratory Manual，New York；W.H.Freeman andRichardson，C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols，Methods in Molecular Biology，volume 39；US 4,745,051；US2003148506和WO 03/074714。用于转录编码AAV衣壳蛋白的本发明核苷酸序列的特别合适的启动子为例如多角体启动子。但昆虫细胞内其他有活性的启动子在本领域是已知的，例如p10、p35或IE-1启动子以及上述参考文献中描述的其他启动子。
优选地，用于在昆虫细胞中表达AAV衣壳蛋白的核酸构建体为昆虫细胞相容性载体。“昆虫细胞相容性载体”或“载体”应理解为能生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸。示例性的生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。任何载体都可使用，只要它是昆虫细胞相容性的即可。载体可整合到昆虫细胞基因组中，但载体不需要在昆虫细胞内永久存在；瞬时游离型载体也被包括在内。可通过任何已知手段引入载体，例如通过对细胞的化学处理、电穿孔或感染。在一个优选的实施方案中，该载体为一种杆状病毒、一种病毒载体或一种质粒。在一个更优选的实施方案中，该载体为一种杆状病毒即该构建体为一种杆状病毒载体。杆状病毒载体和使用该载体的方法在上述关于昆虫细胞分子工程的参考文献中有描述。
本发明的另一方面涉及一种含有上文定义的本发明核酸构建体的昆虫细胞。可根据本发明使用允许AAV复制并且可维持培养的任何昆虫细胞。例如，所用细胞系可来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、果蝇细胞系或蚊细胞系，例如白纹伊蚊来源的细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系为来自对杆状病毒感染敏感的昆虫物种的细胞，包括例如Invitogen的Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn 368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5和High Five。
本发明的优选的昆虫细胞还包括：(a)一个第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包括至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；(b)一个第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包括与用于在昆虫内细胞表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列；和(c)一个第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包括与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。
在本发明的上下文中，“至少一个AAV ITR核苷酸序列”应被理解为表示回文序列，包括多为互补的、对称排列的、也被称为“A”、“B”和“C”区域的序列。ITR起到复制起始位点的作用，复制起始位点在复制中具有“顺式”作用，即为反式作用复制蛋白(Rep 78或Rep 68)的识别位点，所述反式作用复制蛋白可识别回文序列和回文序列内部的特定序列。ITR序列对称性的一个例外是ITR的“D”区域。该区域是单一的(在一个ITR内无互补部分)。单链DNA的切割发生在A和D区域的接合处。新的DNA合成即从该区域开始。D区域通常位于回文序列的一侧，并且指导核酸复制步骤的方向。在哺乳动物中复制的AAV通常具有两个ITR序列。然而，可对ITR进行改造，使其结合位点在A区域的两条链上，并且对称地在回文序列每侧均分布一个D区域。在双链环状DNA模板(例如质粒)上，Rep78辅助的或Rep68辅助的核酸复制为双向进行的，单个ITR即可满足环状载体的AAV复制。因此，在本发明的上下文中可以使用一个ITR核苷酸序列。但优选地使用两个或偶数个规则的ITR。最优选地，使用两个ITR序列。考虑到病毒载体的安全性，因此需要构建一种不能在初始引入细胞后进一步增殖的病毒载体。如US2003148506中所述，通过使用具有嵌合ITR的rAAV可以提供这种限制载体在受体内进行不想要的增殖的安全机制。
本发明并不受所用载体或核酸构建体的数目的限制。例如可以使用一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多的载体来根据本发明的方法在昆虫细胞中生产AAV。如果使用六种载体，则一种载体编码AAV VP1、另一种载体编码AAV VP2、再一种载体编码AAV VP3、又一种载体编码Rep52或Rep40，而Rep78或Rep68由另一种载体编码，最后一种载体包含至少一个AAV ITR。可以使用其他载体表达例如Rep52和Rep40以及Rep78和Rep68。如果使用的载体少于六个，则所述载体可包含至少一个AAV ITR与VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40以及Rep78/Rep68编码序列的各种组合。优选地，使用两种或三种载体，如上所述，两种载体为更优选的。如果使用两种载体，优选地，该昆虫细胞包括：(a)如上所述表达AAV衣壳蛋白的第一核酸构建体，该构建体进一步包括如上(b)和(c)中定义的第三和第四核苷酸序列，该第三核苷酸序列包括与至少一种用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的Rep 52或Rep40编码序列，该第四序列包括与至少一种用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列；和(b)包括如上(a)所定义的第二核苷酸序列的第二核酸构建体，包括至少一个AAV ITR核苷酸序列。如果使用三种载体，优选地，除了表达衣壳蛋白质和表达Rep52、Rep40Rep78和Rep68蛋白质是使用单独的载体之外，使用的用于两种载体的构型相同。每个载体上的序列相互之间可采用任何顺序。例如，如果一个载体包括ITR和含编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF，则VP ORF可位于载体上使得在ITP序列间DNA复制时VP ORF既可复制或者也可不复制的位置。又例如，Rep编码序列和/或包括编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF在载体上可采用任何顺序。应理解的是，第二、第三或其他核酸构建体也优选地为昆虫细胞相容性载体，优选地为如上所述的杆状病毒载体。或者，在本发明的昆虫细胞中，一个或多个第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列以及任选的其他的核苷酸序列可稳定地整合到昆虫细胞基因组中。本领域技术人员知晓如何将一个核苷酸序列引入昆虫基因组中，并且知道如何鉴定出基因组中具有该核苷酸的细胞。例如可使用包含与该昆虫基因组区域高度同源的核苷酸序列的载体来帮助引入到基因组。将核苷酸序列引入基因组的另一种方法是利用特定的序列，例如转座子。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明昆虫细胞中存在的第二核苷酸序列(即包括至少一个AAV ITR的序列)还包括至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，借此，优选地，该编码目的基因产物的至少一个核苷酸序列被引入到昆虫细胞内产生的AAV的基因组中。优选地，至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列是在哺乳动物细胞中表达的序列。优选地，该第二核苷酸序列包括两个AAV ITR核苷酸序列，并且其中至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。优选地，编码(在哺乳动物细胞中表达的)目的基因产物的核苷酸序列如果位于两个规则的ITR之间，或者位于经两个D区域改造的ITR的任一侧，它就会被引入到该昆虫细胞内产生的AAV基因组中。
因此，本申请所定义的第二种核苷酸序列可包括用于编码至少一种在哺乳动物细胞中表达的“目的基因产物”的核苷酸序列，它所处的位置可使其引入到昆虫细胞内复制的AAV基因组中。可以引入任何核苷酸序列以用于将来在哺乳动物细胞中的表达，所述哺乳动物细胞被转染了根据本发明产生的AAV。该核苷酸序列可以例如编码一种蛋白质，可表达一种RNA干扰剂，即一种可进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RNA)。“siRNA”意为一种小干扰RNA，它是一种在哺乳动物细胞中无毒的短双链RNA(Elbashir et al.，2001，Nature 411：494-98；Caplen et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47)。在一个优选的实施方案中，第二种核苷酸可包括两个核苷酸序列，每个序列编码一种在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。这两个编码目的产物的核苷酸序列所处的位置能使其被引入昆虫细胞内复制的rAAV基因组中。
在哺乳动物细胞中表达的目的产物可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物可为多肽或RNA分子(siRNA)或其他在靶细胞中表达时可提供所需治疗作用的基因产物，所述治疗作用，例如去除不良活性例如去除受感染的细胞，或弥补遗传缺陷例如导致酶活性缺陷的遗传缺陷。治疗性多肽基因产物的实例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL，优选地LPL S447X；参见WO 01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶(UGT)、视网膜色素变性GTP酶调节子相互作用蛋白(RP-GRIP)和细胞因子或白细胞介素如IL-10。
再者，或除了作为第二基因产物之外，本申请上文定义的第二核苷酸序列可包括编码作为一种标记蛋白质的多肽的核苷酸序列，所述标记蛋白用于评价细胞转化和表达。用于此目的的合适的标记蛋白质例如有荧光蛋白GFP以及可筛选的标记基因HSV胸苷激酶(用于HAT培养基上的筛选)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于针对潮霉素B的筛选)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于针对G418的筛选)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于针对氨甲喋呤的筛选)、CD20(低亲和性神经生长因子基因)。Sambrook and Russel(2001)″Molecular Cloning：A LaboratoryManual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York中提供了这些标记基因的获得来源以及使用它们的方法。此外，如果认为有必要，本申请上文定义的第二核苷酸序列可包括编码一种可作为故障安全机制的多肽的核苷酸序列，所述机制使得可以利用经本发明rAAV转导的细胞对受试者进行治疗。这种核苷酸序列通常被称为***基因，它编码一种能将前药转化为毒性物质的蛋白质，所述毒性物质能杀死表达该蛋白的转基因细胞。这类***基因的合适实例包括，例如大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因或来自单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，对于这种情况，可用更昔洛韦作为前药来杀死受试者体内的转基因细胞(参见Clair et al.，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849)。
在另一个实施方案中，目的基因产物可以是AAV蛋白质。特别是Rep蛋白质例如Rep78或Rep68，或者其功能片段。如果编码Rep78和/或Rep68的核苷酸序列存在于本发明的rAAV基因组中并在转导了本发明的rAAV的哺乳动物细胞中表达，则该核苷酸序列可使得rAAV整合到该转导的哺乳动物细胞的基因组中。通过长期或永久表达经AAV引入到细胞中的任何其他目的基因产物，Rep78和/或Rep68在rAAV转导的或感染的哺乳动物细胞中的表达可为rAAV的某些使用提供优势。
在本发明的rAAV载体中，所述编码在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物的至少一种核苷酸序列，优选地，与至少一种哺乳动物细胞相容性表达控制序列例如启动子可操作地连接。这类启动子许多都是本领域已知的(参见Sambrook and Russel，2001，见上文)。可以使用在许多类型的细胞中广泛表达的组成型启动子，例如CMV启动子。然而，更优选可诱导的、组织特异性的、细胞类型特异性的或细胞周期特异性的启动子。例如，对于肝特异性表达，启动子可选自：α1抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、LPS(甲状腺素结合球蛋白)启动子、HCR-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子和载脂蛋白E启动子。其他实例包括用于肿瘤选择性，特别是神经细胞肿瘤选择性表达的E2F启动子(Parr et al.，1997，Nat.Med.3：1145-9)或单核血细胞使用的IL-2启动子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med；185：2101-10)。
AAV能感染多种哺乳动物细胞。参见例如Tratschin et al.，Mol.Cell Biol.，5(11)：3251-3260(1985)和Grimm et al.，Hum.Gene Ther.，10(15)：2445-2450(1999)。然而人的滑液成纤维细胞的AAV转导比同类的鼠细胞明显更为有效(Jenningsetal.，Arthritis Res，3：1(2001))，并且不同血清型AAV的细胞趋向性(tropicity)不同。参见例如Davidson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(7)：3428-3432(2000)(论述了AAV2、AAV4和AAV5间在哺乳动物CNS细胞趋向性和转导效率方面的不同)。
可在本发明用于在昆虫细胞中生产AAV的AAV序列可来自任何血清型AAV的基因组。通常，这些血清型AAV的基因组序列在氨基酸和核酸水平上显著同源，提供相同的一组基因功能，产生在物理上和功能上基本相同的病毒体，并且通过几乎相同的机制进行复制和组装。关于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性概述，参见例如GenBank登记号U89790；GenBank登记号J01901；GenBank登记号AF043303；GenBank登记号AF085716；Chlorini et al.(1997，J.Vir.71：6823-33)；Srivastava et al.(1983，J.Vir.45：555-64)；Chlorini et al.(1999，J.Vir.73：1309-1319)；Rutledge et al.(1998，J.Vir.72：309-319)；和Wu et al.(2000，J.Vir.74：8635-47)。本发明上下文中使用的AAV核苷酸序列优选地来自人或猿腺伴随病毒(AAV)血清型，更优选地来自通常感染人(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物的AAV血清型(例如血清型1和4)。
优选地，本发明上下文中使用的AAV ITR序列来自AAV1、AAV2和/或AAV4。同样，Rep52、Rep40、Rep78和/或Rep68编码序列也优选地来自AAV1、AAV2和/或AAV4。但本发明上下文中使用的编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列可取自已知42种血清型的任何一种，更优选地取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或者例如通过衣壳穿梭(shuffling)技术和AAV衣壳文库获得的新开发的AAV样颗粒。
大多数AAV血清型中的Rep和ITR序列特别保守。各种AAV血清型的Rep78蛋白质例如有89％以上都是相同的，AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6基因组水平上的总核苷酸序列同一性约为82％(Bantel-Schaal et al.，1999，J.Virol.，73(2)：939-947)。而且，已知在哺乳动物细胞的AAV颗粒生产中，许多AAV血清型的Rep序列和I TR可有效地与其他血清型的相应序列交叉互补(即功能性替换)。US2003148506报道了AAV Rep和I TR序列在昆虫细胞中也有效地与其他AAV Rep和ITR序列交叉互补。
已知AAV VP蛋白质可确定AAV病毒体的细胞趋向性。对于不同血清型AAV，VP蛋白质编码序列的保守性明显比Rep蛋白质和基因低。Rep和ITR序列可与其他血清型的相应序列交叉互补的能力使得可以产生同时包含一种血清型(例如AAV3)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(例如AAV2)的Rep和/或ITR序列的假型AAV病毒颗粒。这类假型AAV颗粒是本发明的一部分。
本发明的上下文中也可使用修饰的“AAV”序列，例如用于在昆虫细胞中生产rAAV载体。这类修饰的序列可用于替换野生型AAV ITR、Rep或VP序列，所述修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9ITR、Rep或VP具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高的核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如具有约75-99％核苷酸序列同一性的序列)的序列。
虽然AAV5在许多方面与其他AAV血清型类似，但与其他已知的人和猿血清型相比，AAV5与其他人和猿AAV血清型的差异更大。鉴于此，昆虫细胞的AAV5生产可不同于其他血清型的生产。当使用本发明的方法产生rAAV5时，优选地，包括以下核苷酸序列的一种或多种载体(通常对于一种以上的载体)：包括AAV5 ITR的核苷酸序列、包括AAV5Rep52和/或Rep40编码序列的核苷酸序列，以及包括AAV5Rep78和/或Rep68编码序列的核苷酸序列。可以根据需要对这些ITR和Rep序列进行修饰以在昆虫细胞中有效地产生rAAV5或假型rAAV5载体。例如，可修饰Rep序列的起始密码子、可修饰或消除VP剪接位点，以及/或者可修饰VP1起始密码子和附近的核苷酸，从而改善昆虫细胞中rAAV5的产生。
另一方面，本发明涉及一种AAV病毒体。优选地，该AAV病毒体在其基因组中含至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，其中该至少一种核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，并且，其中在AAV VP1、VP2和VP 3衣壳蛋白的化学计量关系中VP1的量：(a)为VP2量的至少100％、105％、110％、120％、150％、200％或400％，或者(b)为VP3量的至少8％、10％、10.5％、11％、12％、15％、20％或40％，或者(c)同时满足至少上述(a)和(b)定义的量。优选地，利用识别表位的抗体来测定VP1、VP2和VP3的量，所述表位为每个VP1、VP2和VP3共有的。本领域中可提供各种可对VP1、VP2和/或VP3的相对量进行定量的免疫测定法(参见例如Using Antibodies，E.Harlow and D.Lane，1999，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)。识别所述三种衣壳蛋白均共有的表位的合适抗体为例如鼠抗Cap B1抗体(购自德国的Progen)。
本发明的优选的AAV为其基因组中包含至少一种编码目的基因产物的核苷酸序列的病毒体，其中该至少一种核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，并且，其中该AAV病毒体包括一种其中第1位氨基酸为亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。本发明更优选的AAV病毒体具有上述定义的衣壳蛋白比例，并包括一种其中第1位氨基酸为亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。甚至更优选地，AAV病毒体可按照例如本申请下文定义的方法从上文定义的昆虫细胞中获得。
具有上文定义的衣壳蛋白比例的本发明AAV病毒体的优点在于它们增强的感染性。具体而言，这种感染性随衣壳中VP1蛋白质的量与衣壳中VP2和/或VP3量的比值增加而增加。本申请中AAV病毒体的感染性应理解为表示病毒体中所含转基因的转导效率，该效率可从该转基因的表达率和该转基因的表达产物的量或活性推出。
因此，另一方面，本发明涉及一种在昆虫细胞中产生AAV的方法。优选地，该方法包括以下步骤：(a)在能够产生AAV的条件下培养上文中定义的昆虫细胞；和(b)回收AAV。培养昆虫细胞的培养条件以及在培养昆虫细胞中生产异源产物是本领域熟知的，并在例如上文引用的关于昆虫细胞的分子工程的参考文献中有描述。
优选地，该方法还包括用抗AAV抗体——优选固定化的抗体——进行AAV亲和纯化的步骤。该抗AAV抗体优选地为单克隆抗体。特别合适的抗体为例如可获自骆驼或驼马的单链camelid抗体或其片段(参见例如Muyldermans，2001，Biotechnol.74：277-302)。用于AAV亲和纯化的抗体优选地为特异性结合AAV衣壳蛋白上的表位的抗体，其中优选地，该表位为不只存在于一种AAV血清型的衣壳蛋白上的表位。例如可基于与AAV2衣壳蛋白的特异性结合来产生或筛选抗体，但同时该抗体还与AAV1、AAV3和AAV5衣壳蛋白特异性结合。
在本文件和其权利要求书中，采用其非限制性含义来使用动词“包括”和其动词变化形式表示将该词之后的内容包括其中，但并不排除未具体提及的内容。此外，通过不定冠词“一个”或“一种”提及的要素并不排除可能存在多于一个该要素的可能性，除非上下文明确要求为一个并且只有一个该要素。因此，通常不定冠词“一个”或“一种”是指“至少一个(种)”。
附图说明
图1：用含VP1衣壳蛋白的TTG或ACG起始密码子的重组杆状病毒产生的rAAV的蛋白质印迹分析。
图2：LPL总量(质量)测定：用rAAV感染微量滴定板中的HEK293细胞，所述rAAV由杆状病毒生产***和质粒生产***产生，感染复数100-25000。感染后第二天，用LPLS447X总量(质量)ELISA测量LPLS447X蛋白质。“DKFZ/Llama”(A-079-024和A-093-130/137)代表由质粒生产***产生的rAAV-LPLS447X批次。“对照”代表不表达LPLS447X但表达细菌蛋白质LacZ的rAAV-LacZ病毒批次。Baculo/Llama代表利用了具有TTG起始密码子的rBac-Cap病毒、由杆状病毒生产***产生的rAAV-LPLS447X批次。
图3：注射各批次的AAV载体后测定血浆中甘油三酯(TG)水平。给小鼠注射由杆状病毒生产***产生的rAAV(DJ17jun05)(n＝2)和由哺乳动物生产***产生的rAAV(Clin)(n＝2)。载体给药后第3、7和14天，取血样并测定空腹TG。
图4：测量血浆样品中LPLS447X的活性：给小鼠注射由杆状病毒生产***产生的rAAV(DJ17jun05)和由哺乳动物生产***产生的rAAV(C-0045)。载体给药后第14天，取血样并测定LPLS447X活性。
图5：将由杆状病毒表达***在昆虫细胞中产生的四个批次的AAV1加样到Nupage胶上以评价VP1、2、3的化学计量关系。泳道：由含VP1起始密码子CTG(泳道1)、GTG(泳道2)、ACG(泳道3)、TTG(泳道4)的杆状病毒-Cap构建体制备的AAV1批次。以质粒产生的AAV1批次(FSB-02)为对照加样(泳道5)。使用了CTG起始密码子的AAV1化学计量关系与FSB-02批次相当。
图6将各批次的AAV1-LPL以3x1012gc/kg的量注射到LPL缺陷型(-/-)小鼠肌肉中。用含有CTG起始密码子的rBac-Cap构建体制备的AAV1-LPL批次在降低甘油三酯(TG)方面的表现比其他批次明显更好。
实施例
1.材料和方法
1.1杆状病毒质粒构建
为了用单独的多顺反子mRNA表达VP1、2、3，按Urabe et al.，2002(见上文)所述设计杆状病毒-AAV-Cap构建体。简言之，将VP1的ATG起始密码子突变成ACG。将第11位的潜在ATG起始密码子转变为ACG。破坏VP1起始密码子的下游剪接受***点(在第21位和24位突变)。将突变的Cap表达盒克隆到杆状病毒表达构建体即具有BamH1/StuI限制位点的pFastBacDual(pFBDAAV1VPm11)。该质粒(pFBDAAV1VPm11)是引入VP1其他起始密码子的起始物质。为引入所述突变，按Urabe etal.(2002，见上文)使用的正向引物为
BamHI 1 11 21 24
5’cgcggatcctgttaagA C GGCTGCCGA C GGTTATCT A CC C GATTGGCTC-3’(SEQ ID NO.1)
将pFBDAAV1VPm11(Urabe et al.，2002，见上文)用作起始物质，使用以下正向引物制备表达构建体：
5’cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGA C GGTTATCT A CC C GATTGGCTC-3’(SEQ ID NO.2)
5’cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGA C GGTTATCT A CC C GATTGGCTC-3’(SEQ ID NO.3)
5’cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGA C GGTTATCT A CC C GATTGGCTC-3’(SEQ ID NO.4)
5’cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGA C GGTTATCT A CC C GATTGGCTC-3’(SEQ ID NO.5)
此外，使用两种正向引物制备构建体，在所述构建体中，ACG和CTG起始密码子分别位于优选形式的Kozak序列“GCCGCC(NNN)G”中(参见SEQ ID NO：8；并且，其中(NNN)代表亚最佳起始密码子)。
5’ccatcgggcgcggatcctggccgccACGGCTGCCGACGGTTATCTAC-3’(SEQ ID NO.9)
5’ccatcgggcgcggatcctgccgccCTGGCTGCCGACGGTTATCTAC-3’(SEQ ID NO.10)
与上述正向引物一起用于PCR反应的反向引物是针对VP1起始密码子的下游～230bp处设计的，并且该反向引物含有独特的Stu I位点(AGGCCT)。
5′-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3′
(SEQ ID NO.6)
用上述成组的正向和反向引物对进行片段的PCR扩增。用BamHI和StuI消化PCR产物后，将PCR产物亚克隆到pFBDAAV1vpm11的BamHI/StuI位点中，得到各种待检测的杆状病毒-AAV-Cap构建体。通过在荷兰莱顿的Baseclear进行的序列分析来验证DNA构建体。
1.2重组杆状病毒的产生
利用Bac-to-Bac杆状病毒表达***(Invitrogen)生产重组的杆状病毒，所述杆状病毒来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)。通过每毫升感染2×106个Sf9细胞(感染复数0.1)扩增rBac-Cap。注射第三天，离心沉淀细胞，回收含病毒的上清液。
按照Urabe et al.，2002，利用三种重组杆状病毒生产各批次的rAAV。对于本研究，一种杆状病毒含有LPLS447X转基因的表达构建体。由该转基因表达的治疗活性试剂为天然存在的人脂蛋白脂肪酶变体，即一段448个氨基酸的单链多肽。该LPLS447X变体在蛋白质C末端缺失了两个氨基酸。第二种杆状病毒含有AAV复制基因Rep 78和Rep 52的表达构建体。第三种杆状病毒含具有VP1的ACG或者TTG、CTG、GTG起始密码子的AAV1衣壳序列。
依照Grimm et al.，1998(Novel tools for production andpurification of recombinant adeno-associated virus vectors.HumGene Ther.1998Dec 10；9(18)：2745-60)生产由质粒转染***产生的哺乳动物rAAV批次。
1.3蛋白质印迹分析
用杆状病毒-Cap感染昆虫细胞。感染后第三天将细胞离心(3,000g；15min)。用0.22um Millex滤器过滤上清液。将NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)加入到上清液样品中，并将其加样至4-12％Bis-Tris胶上。在100V下进行凝胶电泳。在100V、350mA下将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜(BioRad)上1小时。通过以下步骤进行蛋白质免疫化学：用1％的marvel脱脂奶粉液封闭膜，随后与小鼠抗-Cap(B1，购自德国Progen；稀释度1∶50)和兔抗-小鼠-HRP(DAKO，稀释度1∶100)一起孵育。用Lumi-Light PLUS蛋白质印迹底物(Roche)进行化学发光染色使VP1、2和3显影。
1.4生物化学测量
如前人所述，使用放射性三油酸甘油酯乳剂底物测定人LPLS447X的活性(Nilsson-Ehle and Scholtz，1976)。用鸡IgY和小鼠5D2抗hLPL抗体采用夹心ELISA测定人LPLS447X免疫反应量(Liu et al.，2000)。利用市售试剂盒，依照制造商的操作规程测量血浆甘油三酯水平(Boehringer Mannheim，#450032)。
2.结果
2.1重组杆状病毒的构建
为了在由Urabe等人(2002，见上文)设计的杆状病毒中导入不同的其他VP1表达起始密码子，设计了一系列含有BamHI限制位点且VP1起始密码子ACG被TTG、ATT、GTG或CTG替换的上游引物。使用这些引物以及含有StuI位点的下游引物进行PCR，得到被亚克隆到pFBDVPm11(Bac-Cap)的BamHI/StuI位点中的扩增片段。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达***，将得到的杆状病毒质粒用于制备重组杆状病毒。使制得的重组杆状病毒感染昆虫细胞以产生AAV衣壳。注射后第三天，通过蛋白质印迹测定不同批次的杆状病毒的病毒蛋白质表达。从蛋白质印迹结果来看，很明显，含有表达VP1的TTG起始密码子的杆状病毒构建体所表达的该蛋白水平比先前使用ACG起始密码子时高。发现使用TTG密码子时VP1和VP2的比例为1∶1，这与所报道的野生型AAV的VP1和VP2的比例相近(图1)。
2.2各批次rAAV对培养细胞的感染
为研究来自具有TTG起始密码子的重组杆状病毒的AAV衣壳蛋白的感染性，生产了rAAV。还通过哺乳动物HEK293细胞的质粒转染产生了一批rAAV。两批rAAV的载体基因组的滴度均通过qPCR测定。使用超过该滴度的感染复数感染微量滴定板中的HEK 293细胞。感染后第二天，在感染细胞的培养基上进行转基因产物(LpLS447X)的定量测定(LpLS447X-总量(质量)测定)。该测定表明由杆状病毒产生的rAAV所生产的LPLS447X的量与由质粒产生的rAAV所生产的LPL量相近(图2)。
2.3给小鼠注射各批次rAAV
对小鼠肌内注射由杆状病毒生产***和由常规哺乳动物质粒生产***产生的各批次的rAAV，以观察体内LPLS447X蛋白质活性和空腹甘油三酯。在注射后第3天、第7天和第2周取血样并进行评价。给予病毒后的第3至7天，从注射了哺乳动物rAAV的两只小鼠和从注射了杆状病毒rAAV的一只小鼠中获得的血浆样品从混浊被变为完全澄清。从注射了杆状病毒rAAV的一只小鼠中获得的血浆仍然保持相对混浊，但脂肪水平明显降低。所有处理过小鼠的甘油三酯水平都有所降低(图3)。在第14天，哺乳动物AAV处理的和杆状病毒-(TTG)-AAV处理的小鼠TG水平均降低96％。给予病毒后第二周所取血浆样品显示出杆状病毒AAV处理的小鼠与哺乳动物AAV处理的小鼠的LPLS447X活性相似(图4)。
2.4具有不同的VP1起始密码子的各批次重组AAV的生产
使用含具有不同VP1起始密码子(CTG、GTG、TTG、ACG)的AAV-Cap1型表达单元的重组杆状病毒，在昆虫细胞中制备各rAAV1-LPL批次。纯化各病毒批次并加样到NuPage凝胶上用于评价(图5)。该凝胶显示出各种病毒的VP1、VP2和VP3蛋白间的化学计量关系。我们先针对先前在HEK293细胞上利用常规质粒转染***(pPD1，DKFZ，Heidelberg，Germany)生产的rAAV1-LPL。我们发现该***产生的VP1、VP2和VP3蛋白质间的化学计量关系并不是常规的，其中VP1的存在量高于VP2。该化学计量关系与所报道的、在wtAAV或其他哺乳动物AAV载体生产平台中观察到的VP1、VP2和VP3蛋白质间的化学计量1∶1∶10显著不同。
在杆状病毒***中，具有CTG密码子的rAAV构建体产生的病毒衣壳中VP1的量比VP2的量明显更高。在本具体实验(图5)中，通过BAC-CapGTG或BAC-Cap ACG构建体产生的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的化学计量关系在凝胶上显示出具有相近的VP1/VP2比，TTG构建体则似乎表达的VP1略少于VP2。但我们多次发现TTG和GTG构建体表现出相似的化学计量，其中VP1和VP2存在量大致相等，而ACG构建体通常造成VP1蛋白少于VP2蛋白的化学计量。CTG构建体始终造成VP1蛋白比VP2蛋白多的化学计量。
为进一步改进rAAV的生产率，我们制备了这样的构建体：在所述构建体中ACG和CTG密码子分别存在于Kozak共有序列“GCCGCC(NNN)G”(参见SEQ.ID NO：8)中，其中“(NNN)”分别表示ACG和CTG密码子的位置。利用Kozak序列后密码子为CTG的构建体在昆虫细胞中进行的AAV生产所得的AAV产量，明显高于不含Kozak序列的构建体(数据未示出)。相比之下，利用Kozak序列后密码子为ACG的构建体在昆虫细胞进行的AAV生产，并未得到更高的AAV产量(数据未示出)。
2.5给小鼠注射各批次rAAV
为验证病毒衣壳中VP1的含量是否与载体感染性相关，对纯合LPL(-/-)小鼠注射杆状病毒产生的AAV1批次和质粒产生的AAV1批次，并及时监测活性LPL表达造成的甘油三酯(TG)的降低(图6)。该结果表明，使用CTG起始密码子产生的AAV1-LPL批次不出意外地比其他AAV1批次降低TG水平更快并且更明显。但值得注意的是，虽然化学计量都相近，杆状病毒CTG突变体造成的TG水平降低比质粒产生的AAV1(用pDP1产生的)更明显。
我们已多次观察到通过CTG构建体制备的、杆状病毒产生的AAV表现更好，即与用其他亚最佳的起始密码子构建体制备的AAV相比，在体外和体内均表现出更高的感染性，特别是与具有ACG密码子的构建体相比时更加明显。我们还多次观察到用CTG构建体制备的AAV病毒体的VP1内容物所含VP1多于VP2，而其他构建体(尤其ACG)则不是这种情况。
序列表
<110>阿姆斯特丹分子治疗股份有限公司
<120>昆虫细胞中生产的改进的AAV载体
<130>P6004974PCT1
<140>P6004974PCT1
<141>2006-10-20
<150>PCT/NL2005/050018
<151>2005-10-20
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cgcggatcct gttaagacgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49
<210>2
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cgcggatcct gttaagttgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49
<210>3
<211>49
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<220>
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<400>3
cgcggatcct gttaagattg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49
<210>4
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<220>
<223>引物
<400>4
cgcggatcct gttaaggtgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctc 49
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<211>49
<212>DNA
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<220>
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<210>6
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>6
gtcgtaggcc ttgtcgtgct cgagggccgc 30
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<212>DNA
<213>腺伴随病毒2
<400>7
cctgttaag 9
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>r＝嘌呤＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>nnn代表亚最佳起始密码子
<400>8
gccrccnnng 10
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>9
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>正向引物
<400>10
ccatcgggcg cggatcctgc cgccctggct gccgacggtt atctac 46
Claims (20)
1.一个核苷酸序列，包括含编码腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的可译框架，其中用于翻泽AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子选自TTG、CTG和GTG。
2.权利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括一个位于编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的起始密码子上游的表达控制序列，所述表达控制序列包括九核苷酸序列SEQ.ID NO：7或与SEQ.ID NO：7基本上同源的核苷酸序列。
3.权利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括一个位于编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的起始密码子附近的表达控制序列，所述表达控制序列包括Kozak共有序列，其中所述Kozak共有序列为GCCRCC NNN G(SEQ.IDNO：8)，其中R为嘌呤并且其中NNN代表选自TTG、CTG和GTG的亚最佳起始密码子。
4.权利要求1-3任一项的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列还包括对编码AAVVP1衣壳蛋白的核苷酸序列的至少一种修饰，选自第12位核苷酸的G、第21位核苷酸A和第24位核苷酸C。
5.一种包括权利要求1-4任一项的核苷酸的核酸构建体，其中所述核苷酸序列与用于昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接。
6.权利要求5的核酸构建体，其中所述核苷酸序列与多角体启动子可操作地连接。
7.权利要求5或6的核酸构建体，其中所述构建体为昆虫细胞相容性载体，优选地为杆状病毒载体。
8.一种昆虫细胞，包括权利要求5-7任一项的核酸构建体。
9.权利要求8的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞还包括：
(a)一个第二核苷酸序列，包括至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
(b)一个第三核苷酸序列，包括与用于昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接的Rep52或Rep40编码序列；和
(c)一个第四核苷酸序列，包括与用于昆虫细胞内表达的表达控制序列可操作地连接的Rep78或Rep68编码序列。
10.权利要求9的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞包括：
(a)权利要求5-7的任一项的第一核酸构建体，其中所述第一核酸构建体进一步包括权利要求9的(b)和(c)定义的第三和第四核苷酸序列；和
(b)一种第二核酸构建体，包括权利要求9(a)定义的第二核苷酸序列。
11.权利要求10的昆虫细胞，其中所述第二核酸构建体为昆虫细胞相容性载体，优选地为杆状病毒载体。
12.权利要求9-11任一项的昆虫细胞，其中所述第二核苷酸序列进一步包括至少一个编码目的基因产物(用于哺乳动物细胞内的表达)的核苷酸序列，其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列被引入到昆虫细胞内产生的AAV的基因组中。
13.权利要求12的昆虫细胞，其中所述第二核苷酸序列包括两个AAV ITR核苷酸序列，并且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于所述两个AAV ITR核苷酸序列之间。
14.权利要求9的昆虫细胞，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列被稳定整合到昆虫细胞的基因组中。
15.一种AAV病毒体，在所述病毒体的基因组中包括至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，其中所述至少一个核苷酸序列为非天然AAV核苷酸序列，并且，其中在AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白间的化学计量关系中，VP1的量为：
(a)VP2量的至少110％；或
(b)VP3量的至少11％VP3；或
(c)VP2量的至少110％且VP3量的至少11％；并且
其中所述VP1、VP2和VP3的量通过可识别VP1、VP2和VP3的共有表位的抗体来测定。
16.一种AAV病毒体，在所述病毒体的基因组中包括至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，其中所述至少一个核苷酸序列为非天然AAV核苷酸序列，并且，其中所述AAV病毒体包括一种其第1位氨基酸为亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。
17.权利要求15的AAV病毒体，其中所述AAV病毒包括一种其第1位氨基酸为亮氨酸或缬氨酸的VP1衣壳蛋白。
18.一种在昆虫细胞中生产AAV的方法，包括步骤：(a)在能生产AAV的条件下培养权利要求9-14任一项定义的昆虫细胞；和(b)回收所述AAV。
19.权利要求18的方法，还包括利用抗AAV抗体——优选固定化的抗体——对AAV进行亲和纯化的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述抗AAV抗体为单链cameloid抗体或其片段。
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