CN101284142A - 大气压冷等离子体消毒方法 - Google Patents

Abstract

大气压冷等离子体消毒方法属于等离子体应用技术领域，其特征在于，含有以下几个步骤：对被消毒物所处的空间进行预消毒；选用大气压冷等离子体的种类及确定其工作条件；在所选用的大气压等离子体的放电区或者射流区放入被消毒物进行消毒。所述大气压冷等离子体是大气压辉光放电冷等离子体、大气压电晕放电冷等离子体、大气压介质阻挡放电冷等离子体以及大气压电阻性阻挡放电冷等离子体中的任何一种，本发明具有对人体和环境无害、消毒效率高、放电气体可选用的种类多等优点。

Description

大气压冷等离子体消毒方法

技术领域

本发明涉及医疗及公共卫生领域中的消毒灭菌方法，以及等离子体应用技术领域。

背景技术

消毒过程是指将大量存在于待处理物体内、外表面的致病微生物、病毒或蛋白质降到规定的存活率或致病率以下。消毒方法是指消毒过程中使用的方法，这些方法必须在有效地杀死各种微生物的同时，不危及被消毒物体和周围环境。目前已有的医疗和外科器械的消毒方法或多或少地存在着消毒效率低、危及被消毒物体、操作复杂、成本及维持费用高的缺点。

在医疗卫生领域，消毒通常通过高压灭菌器来实现，这种方法不但耗费能量，而且灭菌消毒时间长，操作不方便。对某些畏热、不能耐高压的医疗器械如口镜、胃镜、肠镜、气管镜、玻璃器皿、塑料制品、胶管等，该方法不能使用。并且这种方法很难彻底杀死某些菌类和病毒，如乙肝病毒、芽孢等。因此近年来注意力被转移到在低温下可以实现消毒的方法上。

低温消毒方法有使用化学物质消毒(如过氧化氢、环氧乙烷等)、辐射(如紫外照射、放射线照射等)、冷等离子体处理等。前两种方法不可避免地会对操作人员、被处理物体及周围环境造成危害，因此在医疗和外科器械消毒中只能被有限度地使用，而冷等离子体消毒方法则克服了这些缺点并以其独特的杀灭率高等优点在近些年来得到了迅速发展。

等离子体是物质的第四态，是由大量的分子、原子、离子和电子等粒子组成的体系，由于正粒子和负粒子带电量相等，因此宏观上呈现电中性。冷等离子体是一种非平衡等离子体，其中性粒子和带电重粒子的温度很低(通常略高于室温)，但电子温度很高(通常在万度量级)，且活性粒子能量高，因此能够在低温时保持足够高的化学活性。研究发现，等离子体中大量存在的活性粒子能够作用于微生物的细胞壁、细胞质以及遗传物质，使其在短时间内死亡，在消毒领域具有广阔的应用前景。

目前与等离子体有关的消毒方法可以分为等离子体辅助消毒和基于等离子体的消毒两种消毒方法。等离子体辅助消毒方法中主要消毒过程是依靠其它方法来完成的，等离子体只起辅助作用。在公开号为CN 1450917 A、名称为“等离子体消毒装置”的发明中，发明人提出了在低气压下先用过氧化氢预处理约30分钟，然后再用过氧化氢等离子体彻底处理的消毒方法即是等离子体辅助消毒方法，其主要消毒过程是由过氧化氢完成的。该方法的缺点在于处理时间长(发明的公开文档中指出一次消毒时间通常在80分钟左右)，而且会对某些处理材料产生腐蚀效果。在公开号为CN 1317670 A、名称为“冷等离子体协同空气特效净化层的消毒净化方法和装置”的发明中，消毒过程主要是由催化剂和负离子产生器组成的空气特效净化层完成的。基于等离子体的消毒方法是指用于消毒的介质本身不具有消毒功能(如氦气、空气等)，消毒过程主要是由气体电离所形成的等离子体来完成的。

在公开号为CN 1093284 A和CN 1109365 A、名称均为“冷等离子体灭菌消毒装置”的两个发明专利中，发明人提出了两种使用不同放电结构的基于等离子体的消毒方法。这两种消毒方法的特点是在低气压下、使用直流冷等离子体在放电区域处理被消毒物体，其缺点在于需要真空***，从而使该设备的成本和维护费用提高、操作复杂性增加，且被消毒物体的尺寸受真空腔大小的限制；而且直流高压放电电离效率低，对被处理物体有溅射作用(如合成塑料材料)，而易在器械表面生成难以去除的沉淀物，因此不能用于精密医疗器械的消毒；另外，高压放电产生的热量不易排出装置外，会对热敏性器械造成损坏。在公开号为CN1809387 A、名称为“放电后等离子体消毒设备和方法”以及公开号为CN 101124000 A、名称为“利用由氮氢混合物形成的气态等离子体进行消毒的装置”的两个发明专利中，发明人公开了使用两种不同气体产生的低气压等离子体放电后区域处理被消毒物体的方法。发明人指出，在放电后区域(通常又称为余辉区)，等离子体末端生成的气体不再受电场的影响，对被处理物体的破坏性大大减小。但该放电后区域消毒方法也有它的缺点，如只能工作在低气压下，在高气压(如大气压)下，活性粒子由于与气体分子频繁碰撞很快被复合，经过传输管道到达被处理物体时已经没有了化学活性。而在低气压下工作必须要有真空设备，这就会带来之前所述的成本高、操作复杂等缺点。在公开号为CN1611271 A、名称为“用等离子体环境消毒空气的方法和产生等离子的设备***”的发明专利中，发明人提出了一种利用在大气压下使用空气电离产生的电晕放电等离子体对环境空气进行消毒的方法，该方法无需真空设备，因而成本大大降低，可操作性好，但是消毒的对象只限于环境空气。

本发明中提出的大气压冷等离子体消毒方法所使用的大气压冷等离子体源包括多种等离子体源，如采用水冷裸露金属电极产生的大气压辉光放电、采用涂有电介质层金属电极产生的大气压介质阻挡放电以及针状电极和平板电极之间产生的电晕放电。冷等离子体工作气体包括氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体，工作电源的频率为0～50MHz，所加电压有效值在0.1～100kV之间。所产生的大气压放电等离子体具有气体温度低、电子温度高、活性粒子浓度高等非平衡特性。由于等离子体温度低，不会对热敏性医疗器械造成热损伤，而活性粒子浓度高，则可以对细菌、病毒等微生物产生明显的致死效果，因此消毒效率高。相比于低压低温等离子体，大气压冷等离子体源由于不需要真空腔及相应的辅助输运设备，因而成本低、体积小、操作简便、安全性高。由于采用的工作气体对材料无腐蚀性，对人体和环境无害，且处理完消毒物体后的活性粒子在大气环境中很快被复合或失去活性还原成工作气体，因此具有对人体无副作用、对环境无污染等优点。

发明内容

本发明目的在于提供一种低成本的基于等离子体消毒的大气压放电冷等离子体消毒方法，相比传统的在医疗领域使用的消毒方法，该方法能够快速、高效地杀死致病微生物，对被处理的物体损伤小或无损伤，对人体和环境无任何危害。

实现本发明方法的步骤如下：

1.消毒空间预处理

对被消毒物体所处的空间进行预消毒处理，避免被消毒物体被周围空气中可能存在的病原体、微生物、病毒等感染。达到预处理要求的空间可以是无菌室或者无菌柜等。75％乙醇溶液擦拭空间表面，并用紫外灯照射(15~20)min。

2.选择大气压放电冷等离子体的种类并设定工作参数

用于消毒的大气压放电冷等离子体为采用两个水冷裸露金属电极产生的大气压辉光放电、采用单个或两个都涂有绝缘电介质层的水冷金属电极产生的大气压介质阻挡放电、采用单个或两个都涂有电阻率很高的电阻性材料的水冷金属电极产生的大气压电阻性阻挡放电以及采用单个针状金属电极或针状金属电极阵列和单个水冷平板金属电极产生的大气压电晕放电冷等离子体中的一种。需要产生大气压辉光放电冷等离子体时，放电气体采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体，水冷裸露金属(平板型或同轴型，材料为铜、铝、不锈钢等)电极之间间距为(1~10)mm，气流量为(1~50)slpm(标准升每分钟)，外加电压有效值为(0.1~100)kV，电源频率为(0~50)MHz。需要产生大气压介质阻挡放电冷等离子体时，在单个水冷金属(平板型或同轴型，铜、铝、不锈钢等)电极朝向放电的一面或两个水冷金属电极朝向放电的两面覆盖绝缘介质，绝缘介质可以是云母、石英玻璃或聚酰亚胺。电极间距(两电极间的气体间隙)为(1~10)mm，放电气体采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体，气流量为(1~50)slpm，外加电压有效值为(1~100)kV，频率为(0~50)MHz。需要产生大气压电阻性阻挡放电冷等离子体时，在单个水冷金属(平板型或同轴型，铜、铝、不锈钢等)电极朝向放电的一面或两个电极朝向放电的两面覆盖电阻性介质，电阻介质采用高阻性材料(介质电阻值大于10⁶欧姆每厘米厚度)。电极间距(两电极间的气体间隙)为(1~50)mm，放电气体采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体，气流量为(1~50)slpm，外加电压有效值为(0.1~100)kV，频率为(0~50)MHz。需要产生大气压电晕放电冷等离子体时，针状金属(铜、铝、不锈钢等)电极或阵列与平板型水冷裸露金属(平板型，铜、铝、不锈钢等)电极间距为(1~20)mm，放电气体采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体，气流量为(1~50)slpm，外加电压有效值为(0.1~100)kV，频率为(0~50)MHz。

3.利用大气压放电冷等离子体对物体消毒

将被消毒物体置于大气压电冷等离子体的射流区或放电区进行消毒处理，处理时间从10s~20min，杀灭对象是附着在被消毒物体内外表面的微生物。

4.消毒结果检测

致病菌检测：CFU法。将消毒物体或者消毒部位浸入盛有定量灭菌后的生理盐水容器中，剧烈振荡10min，将表面残余存活的微生物洗脱至生理盐水中制备菌悬液。对菌悬液进行适当稀释，取定量涂布于固体平板培养基上进行培养数菌落数，使用的平板固体培养基为细菌完全培养基。

病毒检测：试剂盒法。

对经等离子体处理后的物体进行微生物菌落分布检测。

本发明方法的优点在于放电形式多样、放电气体种类较多，且包括廉价气体放电(如空气放电冷等离子体)，因而成本低；产生的活性粒子浓度在同类等离子体源中较高，因此消毒效率高、速度快；消毒后的粒子能够很快能复合成中性气体，对人体和环境无危害。根据被消毒物体本身的材料特性，可以放置于放电区域进行快速消毒，但物体表面可能会受到带电粒子撞击造成小的损伤，也可以放置于射流区域进行无损伤消毒，但处理时间较放置于放电区长。综合以上特点，本发明方法可在医疗器械消毒、卫生用具消毒等医疗和公共卫生领域推广使用。

附图说明

图1为大气压冷等离子体放电区消毒示意图。其中1表示工作气体入口，2表示等离子体发生器电极，3表示产生的冷等离子体的放电区，4表示被消毒物体，5表示用于放置被消毒物的托架，6表示产生的冷等离子体射流区，7表示消毒空间。

图2为大气压冷等离子体放电区消毒示意图。其中1表示工作气体入口，2表示等离子体发生器电极，3表示产生的冷等离子体的放电区，4表示被消毒物体，5表示用于放置被消毒物的托架，6表示产生的冷等离子体射流区，7表示消毒空间。

图3为本发明方法的流程图。其中第一步是对消毒空间进行预处理；第二步是选择大气压冷等离子体种类并设定工作参数；第三步是使用大气压冷等离子体对物体消毒。

具体实施方式

以下结合枯草杆菌黑色变种芽孢以及大肠杆菌的消毒实验过程详细叙述本发明的具体实施方法。实验工作按照中华人民共和国国家标准(GB15981-1995)消毒与灭菌效果的评价方法与标准以及中华人民共和国***《消毒技术规范》2002年版进行。

一、枯草杆菌黑色变种芽孢的消毒实验过程及结果

1.实验准备

(1)生物安全II级微生物实验室。

(2)负压生物安全柜(II)。

(3)恒温培养箱。

(4)生物显微镜。

(5)压力蒸汽灭菌器。

(6)试验菌株：枯草杆菌黑色变种芽孢(军事医学科学院菌种保藏中心)。

(7)细菌培养基：营养肉汤培养基(TSB)：由1.5％(g/ml)胰蛋白胨、0.5％(g/ml)大豆蛋白胨、0.5％(g/ml)氯化钠，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，灭菌后使用。营养琼脂培养基(TSA)：由1.5％(g/ml)胰蛋白胨、0.5％(g/ml)大豆蛋白胨、0.5％(g/ml)氯化钠和1.6％(g/ml)琼脂，用蒸馏水配制而成，调节pH值为7.2±0.2，灭菌后使用。

(8)细菌稀释液：胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)。经压力蒸汽灭菌后使用。

(9)芽孢染色液：5.0％(g/ml)孔雀绿水溶液，0.5％(g/ml)沙黄水溶液。

(10)恒温水浴箱。

(11)无菌刻度吸管(1.0ml、5.0ml、10.0ml)，毛细吸管。

(12)数字可调移液器(2～40μl)及配套用一次性无菌塑料吸头。

(13)冷冻高速离心机。

(14)电动混合器。

(15)电子浊度计。

2.测试微生物的制备

(1)取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18～24h，即为第3代培养物。

(2)用5.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，置于37℃温箱内，培养5～7天。

(3)用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以芽孢染色法染色，并在生物显微镜(油镜)下进行镜检。当芽孢形成率达95％以上，可进行下一步处理。否则，可再在室温下放置2～3天，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

(4)对罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。

(5)必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。

(6)用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。

(7)将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以6000r/min速度离心10min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。

(8)将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。

(9)将芽孢液放于80℃水浴中10min(或60℃，30min)，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。

(10)芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

3.菌片的制备

(1)消毒试验中使用的菌片，是以菌液滴加于载体上制成。本方案用载体，选择大小为10mm×10mm的玻璃片。

(2)载体经压力蒸汽灭菌后，用滴染法染菌。滴染法染菌时，应将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为20μl。可用移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液。滴染菌液后，染菌载体置专用37℃恒温干燥箱内烤干(约30～40min)后再使用。

(3)每片菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，为5×10⁵～5×10⁶cfu/片。

4.等离子体消毒

(1)采用具有水冷、裸露铜电极结构的同轴型大气压射频辉光放电等离子体发生器，电源频率为13.56MHz，发生器内外电极间距为1.6mm，发生器出口安装有喷嘴，喷嘴直径为8mm。等离子体工作气体为纯氦、纯氩及氦-氧混合气体，气体种类及气流量见实验结果表1，射频电源的输入功率维持在230W左右。

(2)将菌片放置在距离等离子体发生器喷嘴出口距离为L处处理一段时间t后取出放入无菌平皿，1菌片/次，重复三次得到三个处理后的菌片。

(3)将照射后的菌片，送回微生物实验室。在无菌条件下，取出菌片。按活菌计数技术对每片上剩余的活菌，进行培养计数。

5.实验结果

表1大气压射频辉光放电等离子体消毒实验结果

从表1所给出的初步的实验结果可以看出，射频大气压辉光放电等离子体对枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭率在短时间内(如10分钟内)可以达到99.9％以上，是一种高效的消毒灭菌方法。

二、大肠杆菌的消毒实验过程及结果

1.培养基制备

本实验使用固体LB平板培养基培养大肠杆菌(LB为Luria-Bertani的英文简称)，其制作原料及方法如下：双蒸馏水950mL，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，用1mol/l NaOH调节至pH7.2，定容至1升。

2.菌株制备

大肠杆菌在37℃恒温条件下于固体LB平板培养基上过夜培养。

3.菌片制备

将过夜培养大肠杆菌菌液(浓度约1.5×10⁸/ml)稀释适当倍数(100至1000倍)，充分混匀后滴加20μl于菌物载片(10mm×10mm)上。

4.等离子体消毒

(1)采用具有水冷、裸露铜电极结构的同轴型大气压射频辉光放电等离子体发生器，电源频率为13.56MHz，发生器内外电极间距为1.6mm，发生器出口安装有喷嘴，喷嘴直径为8mm。等离子体工作气体为纯氦，流量为15slpm，射频电源的输入功率维持在120W左右。

(2)将菌片放置在距离等离子体发生器喷嘴出口距离为3mm处处理一段时间t后取出放入无菌平皿，1菌片/次，重复三次得到三个处理后的菌片。

(3)辐照后将载片置于灭菌后的装有2ml生理盐水的离心管中，充分振荡后取200μl涂布于LB平板，培养过夜，计数。

5.实验结果

采用如上所述的氦气大气压射频辉光放电等离子体射流处理大肠杆菌，实验结果表明，当等离子体发生器喷嘴出口距菌片的距离为3mm、作用时间为3分钟和5分钟时，每种工况下三个菌片的平均杀灭率分别为99.9％和100％。这说明射频大气压辉光放电等离子体射流对大肠杆菌在短时间内具有很好的杀灭效果。

Claims (10)

1.大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，所述方法含有以下步骤：

步骤(1)对被消毒物体所处的空间进行预消毒处理：使用75％乙醇溶液擦拭要消毒的空间的内表面，再用紫外灯照射15min～20min；

步骤(2)选择大气压放电冷等离子体，并设定工作条件：

采用平板型裸露金属电极产生大气压辉光放电冷等离子体时，放电气体采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气中的任何一种气体，或者采用上述气体经任意混合后的混合气体，电极间距为1mm～10mm，气流量为1slpm～50slpm/升·每分钟，外加电压有效值为0.1kV～100kV，频率为0Hz～50MHz；

步骤(3)把被消毒物质置于所述大气压辉光放电冷等离子体的放电区或射流区，进行10s～20min的消毒处理。

2.根据权利要求1所述的大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，采用针状金属电极与金属平板电极产生大气压电晕放电冷等离子体时，针状金属电极与金属平板电极之间的间距为1mm～20mm，气流量为1slpm～50slpm，外加电压有效值为0.1kV～100kV，频率为0Hz～50MHz。

3.根据权利要求1所述的大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，采用平板型覆盖有绝缘介质层的金属电极产生大气压介质阻挡放电冷等离子体时，两电极间的气体间隙为1mm～10mm，气流量为1slpm～50slpm，外加电压有效值为1kV～100kV，频率为0Hz～50MHz。

4.根据权利要求1所述的大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，采用平板型覆盖有电阻性材料的金属电极产生大气压电阻性阻挡放电冷等离子体时，所述的电阻性材料的电阻值沿材料厚度方向大于10⁶Ω/cm，两电极间的气体间隙为1mm～50mm，气流量为1slpm～50slpm，外加电压有效值为0.1kV～100kV，频率为0Hz～50MHz。

5.根据权利要求1所述的大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，采用同轴型裸露金属电极产生大气压辉光放电冷等离子体。

6.根据权利要求1所述的大气压冷等离子体消毒方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，金属电极材料为铜、铝以及不锈钢中的任意一种。

7.根据权利要求2所述的用于大气压冷等离子体消毒的大气压电晕放电冷等离子体，其特征在于，采用针状金属电极阵列与金属平板电极产生大气压电晕放电冷等离子体。

8.根据权利要求3所述的用于大气压冷等离子体消毒的大气压介质阻挡放电冷等离子体，其特征在于，采用同轴型覆盖有绝缘介质层的金属电极产生大气压介质阻挡放电冷等离子体。

9.根据权利要求3所述的用于大气压冷等离子体消毒的大气压介质阻挡放电冷等离子体，其特征在于，绝缘介质材料为云母、石英以及聚酰亚胺中的任意一种。

10.根据权利要求4所述的用于大气压冷等离子体消毒的大气压电阻性阻挡放电冷等离子体，其特征在于，采用同轴型覆盖有电阻性材料的金属电极产生大气压电阻性阻挡放电冷等离子体。

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