CN101271118A - 化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法 - Google Patents

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贺佑丰
刘一兵
沈德存
韩世泉
罗志福
吴明红
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Abstract

本发明涉及一种采用吖啶酯DMAE·NHS作为化学发光物质分析总甲状腺素的方法。该方法包括标准曲线的建立和样品检测。本发明以吖啶酯化合物DMAE·NHS作为化学发光物质来检测血清总甲状腺素TT4的浓度，具有分析灵敏度高、分析时间短、速度快的特点。且各种方法学指标均能满足临床需要：对TT4的最低检测限为0.56ng/ml，分析时间只需半小时，批内及批间变异系数分别为4％－5.4％和5.4－10.3％，回收率为97.6－112.2％，分析结果与商业Ciba Corning试剂盒有很好的相关性，相关方程为Y＝－3.02+0.998X，相关系数为0.962。

Description

化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法
技术领域
本发明涉及一种化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法，特别是采用吖啶酯DMAE·NHS作为化学发光物质分析总甲状腺素的方法。
背景技术
.甲状腺素(T4)是甲状腺分泌的含碘激素，作为体内氧化反应的催化剂，对人体代谢起重要的调节作用。血清总甲状腺素(TT4)的测量对于甲状腺疾病的诊断和治疗效果的评价具有重要的参考价值。
发明内容：
本发明的目的之一在于提供一种化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法，其特征在于该方法以吖啶酯DMAE·NHS作为化学发光物质，具有为：
a)标准曲线的建立：具体步骤如下：
a).DMAE·NHS标记链亲和素SA；
b).生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯标记T4-BSA；
c).固相抗体的制备；
d).血清TT4BAS-CLIA标准曲线的建立；
b)根据上述建立的标准曲线，检测出样品中血清总甲状腺素TT4的浓度。
本发明以吖啶酯化合物DMAE·NHS作为化学发光物质来检测血清总甲状腺素TT4的浓度，具有分析灵敏度高、分析时间短、速度快的特点。且各种方法学指标均能满足临床需要：对TT4的最低检测限为0.56ng/ml，分析时间只需半小时，批内及批间变异系数分别为4％-5.4％和5.4-10.3％，回收率为97.6-112.2％，分析结果与商业CibaCorning试剂盒有很好的相关性，相关方程为Y＝-3.02+0.998X，相关系数为0.962。
附图说明
图1为血清TT4BAS-CLIA标准曲线。其中纵坐标B/B0值表示：标准(或样品)的结合率，即标准孔(或样品孔)结合物的发光强度与零标准孔结合物的发光强度的比值，横坐标为血清TT4的浓度。
图2为TT4BAS-CLIA与Ciba Corning TT4CLIA的相关性曲线。其中纵坐标表示：TT4BAS-CLIA方法测得的值，横坐标表示：Ciba Corning TT4CLIA方法测得的值。
具体实施方式
主要仪器：Wallac Victor 1420 Multilabel Counter，芬兰Wallac公司；UV-VisibleSpectrophotometer，美国Varian公司；Shimaelzu LC-6A High Pressure LiquidChromatograph，日本日立公司；1290-003Delfia PlateShaker，Wallac公司。主要试剂：T4抗原，美国Sigma公司；抗T4McAb，T4-BSA，同位素所五十三室；ANS(8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Ammonium salt)，Fluka公司；水杨酸钠，分析纯，北京芳草医药化工研制公司；分析缓冲液：0.1mol/L Tris-HCI，pH8.6，含0.06％ANS，0.2％水杨酸钠，0.9％NaCI，0.1％BSA，0.05％NaN3，0.03％Tween-20，0.05％NMS。洗涤缓冲液：0.01mol/LPB，pH8.0，含0.9％NaCI，0.05％Tween-20。标记缓冲液：0.1mol/L NaHCO3，pH9.0；纯化缓冲液：0.1mol/L PB，pH7.0，含0.9％NaCI。封闭缓冲液：0.05mol/L PB，pH7.4，含0.9％NaCI，1％BSA，0.04％NaN3。包被缓冲液：0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.5。链亲和素(streptavidin，SA)，生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(Biotin-N-hydroxysuccinimide，B·NHS)，美国Sigma公司；Sephadex G-50，瑞典Pharmacia公司；BSA，Tween-20，TritonX-100，华美生物医学工程公司；NaN3，德国Merck公司。96微孔板，丹麦NuNc公司。
实施例一：血清总甲状腺素TT4的检测，具体步骤如下：
一、建立标准曲线
1.DMAE·NHS标记SA：称取一定量的DMAE·NHS溶于干燥的DMF中配成浓度为6.5mmol/L的DMAE·NHS DMF溶液。称取90μgSA，置于一2ml棕色小玻璃瓶中，加入200μl标记缓冲液和10.5μl 6.5mmol/L DMAE·NHS DMF溶液，室温反应12h后，加入100μl 10g/l赖氨酸反应15min，使标记反应终止。标记物DMAE·NHS-SA与游离DMAE·NHS通过Sephadex G-50柱(1×25cm)分离，用纯化缓冲液平衡并淋洗柱子，分离过程中用色谱仪监测蛋白峰，分部收集流出液，分别测量流出液的化学发光强度和280nm处吸光度值，取发光强度高且吸光度大的部分，加入1％BSA后分装冰冻保存。
2.B·NHS标记T4-BSA：将167μl 6mg/ml T4-BSA预先在标记缓冲液中透析过夜。将经透析过后的T4-BSA置于一2ml棕色小玻璃瓶中，加入70μl 2.84mg/ml的B·NHS DMF溶液，室温下搅拌反应2.5h，加入饱和硫酸铵溶液使标记物沉淀，离心，去除上清液，加入纯化缓冲液溶解沉淀，将溶液于纯化缓冲液中透析过夜，加入1％BSA后分装保存。
3.固相抗体的制备：将抗T4McAb用包被缓冲液稀释成8μg/ml，取96微孔板，每孔加入150μl，4℃放置过夜，甩弃溶液后，用洗涤缓冲液洗板2次，每孔加入封闭缓冲液200μl，室温封闭2小时，甩弃封闭液，4℃密封保存。
4.建立血清TT4BAS-CLIA标准曲线：以分析缓冲液将T4-BSA-B·NHS和DMAE·NHS-SA分别按1∶350和1∶100稀释，取包被T4McAb的微孔板，每孔加入50μl含标准浓度的血清总甲状腺素TT4的样品，100μl T4-BSA-B·NHS稀释液，室温下振荡20min，洗板4次，每孔加入150μl DMAE·NHS-SA稀释液，室温下振荡10min，洗板6次，在发光计上测量各孔的CPS，建立血清总甲状腺素TT4的。
二、检测未知浓度血清总甲状腺素TT4的样品中血清总甲状腺素TT4的含量：以分析缓冲液将T4-BSA-B·NHS和DMAE·NHS-SA分别按1∶350和1∶100稀释，取包被T4McAb的微孔板，每孔加入50μl未知血清总甲状腺素TT4浓度的样品，100μlT4-BSA-B·NHS稀释液，室温下振荡20min，洗板4次，每孔加入150μl DMAE·NHS-SA稀释液，室温下振荡10min，洗板6次，在发光计上测量各孔的CPS，根据已建立血清总甲状腺素TT4标准曲线，即可检测出各孔样品中血清总甲状腺素TT4浓度。
实施例二：TT4BAS-CLIA方法学评价
标准曲线和分析灵敏度：参见图1，标准曲线的T4浓度范围为20～240ng/ml。B/B0值随T4浓度的增加而下降，呈现出典型的竞争抑制特征。测量20个零标准的CPS，求出标准偏差和平均值，以平均值减去2倍标准偏差，在标准曲线上查得此差值对应的T4浓度规定为TT4-BAS-CLIA的分析灵敏度，实验测得该方法的分析灵敏度为0.56ng/ml。
精密度：以低(32.8ng/ml)、中(59.3ng/ml)、高(122ng/ml)三种不同T4浓度的质控做批内(n＝10)和批间(n＝10)重复测量，求得批内变异系数分别为4.5％，8.4％和4.0％，批间变异系数分别为5.38％，10.3％，5.87％。
准确性：在已知T4浓度的血清中，加入三种不同T4标准浓度(20，80，240ng/ml)的血清，测定回收率分别为104.7％，97.6％和112.2％。
健全性：将T4浓度为61和355ng/ml的二份血清，以零血清分别按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32稀释，测量其T4浓度，由表6.1可知，T4的测量值与稀释倍数之间呈良好的线性关系，线性相关系数达0.998以上。
实施例三：与Ciba Corning TT4CLIA的相关性：以上述建立的标准的TT4BAS-CLIA对56例临床血清(17例正常人血清，30例甲亢病人，9例甲减病人血清，301医院提供，附Ciba Corning CLIA测量值)进行测量，参见图2所示，两种方法的测量值相关性良好，相关方程为Y＝-3.02+0.998X，相关系数为0.962。实验结果请参见表1。
表1.样品稀释实验结果
Figure A20071004592500061
1369。

Claims (1)

1.一种化学发光免疫法分析总甲状腺素的方法，其特征在于该方法以吖啶酯DMAE·NHS作为化学发光物质，具有为：
a.标准曲线的建立：具体步骤如下：
a).DMAE·NHS标记链亲和素SA；
b).生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯标记T4-BSA；
c).固相抗体的制备；
d).血清TT4BAS-CLIA标准曲线的建立；
b.根据上述建立的标准曲线，检测出样品中血清总甲状腺素TT4的浓度。
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