CN101271089B - 一种鉴定肉苁蓉属植物品种的方法 - Google Patents

Abstract

“尿囊素在肉苁蓉属植物品种鉴定中的应用及其降血脂新用途”运用大孔吸附树脂和颗粒活性炭吸附分离技术，从肉苁蓉中提取分离得尿囊素和含有尿囊素的组份，经理化数据和光谱数据分析，确定了它的化学结构。这是肉苁蓉属植物中首次发现的成分，由于管花肉苁蓉中不含此成分，所以可用作管花肉苁蓉与其它肉苁蓉的特征鉴别；同时运用分子生物学的酵母双杂交***实验，确定了尿囊素具用降血脂的新医疗用途。

Description

一种鉴定肉苁蓉属植物品种的方法

本申请是申请号为200510072549.2发明专利的分案申请。原申请的发明创造名称为“从肉苁蓉中制备尿囊素和尿囊素提取物以及它们的应用”，申请日为2005年5月12日。 

技术领域

本发明涉及一种中草药化学成分的提取分离和结构鉴定技术；并涉及天然尿囊素或尿囊素提取物在护肤、降血脂等方面的医学用途；本发明还可应用于肉苁蓉中管花肉苁蓉粉末与其它肉苁蓉粉末定性区别。 

背景技术

近一、二十年来，国内外有关肉苁蓉的化学成分的报道已有上百篇之多，仅从荒漠肉苁蓉中分得的化合物数量就达69个(刘国钧主编.肉苁蓉及其人工种植.中国劳动社会保障出版社，2003.120)，在其它品种的肉苁蓉中也分离得到40多个化合物。其中大部分成份与荒漠肉苁蓉一致，相关的报道可见KobayashiH，et al.ChemPharm.Bull.1984，32(5)；1984，32(8)；1985，33(9)；1987，35(8)等文献。通过文献查新，在肉苁蓉属植物已报道的化合物中，未见尿囊素的报道，所以从肉苁蓉中分离得到的尿囊素是肉苁蓉属中首次发现的化合物。 

尿囊素(Allantoin)，也称脲基海因(Ureidehydantoin)。它有滋润皮肤的作用，可增加皮肤角质细胞粘合质的吸湿能力，由于能吸收较多的水分，使角质蛋白分散、鳞屑松懈、脱落，从而皮肤变得光滑柔软。此外还具有局麻作用，对不良刺激起到缓和作用，并有促进皮肤创伤愈合作用。临床上用于皮肤干燥皲裂、皮肤溃疡、手部皮炎等，也可口服用于胃及十二指肠溃疡。个别文献报道它还具有缓解癌性腹水的作用。 

未见尿囊素有降血脂作用的报道。 

目前临床上用的尿囊素均为人工合成品，以纯天然提取得到的尿囊素或含有尿囊素的提取物尚未在化妆品或皮肤病治疗剂中应用。从人工栽培的盐生肉苁蓉中尿囊素的含量测定值大约为0.5～0.8％左右。 

发明内容

本发明内容包括用大孔树脂和活性炭吸附分离天然尿囊素或含尿囊素提取物的方法；所得尿囊素的理化性质和结构确认；含有天然尿囊素提取物高级护肤霜的制备；尿囊素的降血脂作用；尿囊素在肉苁蓉属植物化学分类学上的应用。下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述。但不以此限制本发明。 

具体实施方式

实施例1：以肉苁蓉为原料制备尿囊素提取物或尿囊素 

盐生肉苁蓉Cistanche salsa(C.A.Mey)G.Beck 160g，分别以10倍、8倍量水加热80℃条件下提取2次，合并提取液，减压浓缩至稠膏状(50℃密度约为1.1g/ml)，加乙醇至含醇量60％，静置过夜，醇液浓缩，加水溶解。水液通过大孔吸附树脂SP₈₂₅柱(体积约500ml)，以3倍柱床体积水洗脱，收集其中含尿囊素的流份，再通过颗粒活性炭(约300g)，先以3倍柱床体积的水洗脱，再用3倍柱床体积30％乙醇洗脱，收集含尿囊素的流份，减压浓缩至稠膏，再经冷冻干燥得尿囊素提取物，用乙醇重结晶可得无色结晶状尿囊素。 

实施例2：尿囊素的结构确认 

由实施例1所得的结晶，mp243～245℃，易溶于水及稀醇，生物碱反应呈阳性。IR(KBr)cm^-1：3437，3344(NH₂)；3207，3062(NH)；1779，1568(C＝O)；1602，1528，1430，1183(C-N)；MS：158(M⁺)提示分子结构有偶数N；¹H-NMR(DMSO-d₆)δppm：5.25(1H，d，J＝8.1Hz，H-4)，5.76(2H，s，H-8)，6.86(1H，d，J＝8.1Hz，H-6)，8.03(1H，s，H-3)，10.51(1H，s，H-1)；¹³C-NMR(DMSO-d₆)δppm：62.6(C-4)，156.9(C-2)，157.5(C-7)，173.7(C-5)。与合成的尿囊素同时进样于HPLC仪中，其保留时间一致。结构式如下： 

实施例3：一种天然尿囊素护肤霜的配制 

配方： 

硬脂酸            Acidi Stearici              100克 

鲸蜡醇            Cetylii Alcoholis           45克 

羊毛脂            Adeps Lanae                 10克 

丙二醇            Glycolis Propylenici        150毫升 

十二烷基硫酸钠    Natrii Laurylis Sulfatis    5克 

三乙醇胺          Triaethanolamini            7克 

维生素E           Vit E                       0.5克 

天然尿囊素        Allantoin                   10克 

或尿囊素提取物    or Allantoin extract        相当于10克尿囊素的提取物 

水溶性香精        Esssenlce                   适量 

去离子水加至      Aquae                       加至1000克 

制法： 

1.取硬脂酸、鲸蜡醇、羊毛脂、维生素E置于适当的容器中加热70～80℃； 

2.取丙二醇、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、水溶性香精及水另一适当容器中加热70～80℃。二液等温后，将油液以缓缓细流加入水液中，随加随搅至凝固即得； 

用途：护肤防裂，缓解皮肤老化。 

实施例4：尿囊素在肉苁蓉属植物化学分类学上的应用 

肉苁蓉属植物主要包括管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉和荒漠肉苁蓉。其中管花肉苁蓉占药材市场的一半以上，日本厚生省已明文规定管花肉苁蓉列入日本的植物健康食品范围之内。应用下面方法可区别管花肉苁蓉与其它肉苁蓉。 

方法：分别取管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉(或荒漠肉苁蓉)粉末各0.2克，置25ml量瓶中，加20％甲醇适量超声提取30分钟，加20％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。另取尿囊素对照品1mg，置10ml量瓶中，加20％甲醇溶解并添加至刻度，作为对照品溶液。照高效液相色谱(《中国药典》2005年版一部，附录(VID)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(本实验使用Symmetry ShieldR_P8色谱柱4.6mm×150mm，5μm)，乙腈-水(1∶99)为流动相，检测波长224nm，流速0.5ml/min，柱温25℃，分别精密吸取供试溶液与对照溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。盐生肉苁蓉(或荒漠肉苁蓉)的HPLC色谱图中，在与对照品尿囊素色谱相应的位置上，显示保留时间相同的色谱峰，而管花肉苁蓉供试品的HPLC色谱图中，无尿囊素对照品峰，提示不含尿囊素的肉苁蓉可能为管花肉苁蓉。 

实施例5尿囊素的降血脂作用 

发明是通过如下方法实现的：酵母双杂交方法(yeast two-hybrid)是近年发展起来的在细胞内研究蛋白质相互作用的方法，我们选用Clontech公司得以GAL4为基础的双杂交***III为实验体系，用占大鼠HDL65％的apoAI及HDL受体SR-BI的全长cDNA构建成相应的酵母表达载体，以报告基因所表达的β-半乳糖苷酶酶活定量检测了apoAI和SR-BI间存在相互作用的强弱，如果某一化合物促进了这对蛋白的相互作用，就必定会提高报告基因的活性，即检测到报告基因活力上升就说明该化合物可能促进这对蛋白的相互作用，具有一定的降血脂作用。本发明报告以从肉苁蓉药材中提取分离得到的天然尿囊素为研究对象，从分子生物学研究角度出发，揭示它能增强apoAI与SR-BI之间的相互作用，从而提示尿囊素的降血脂功 效。 

实验方法： 

1.接种：共转化了apo-AI和SR-BI的AH109菌株或交配的二倍体菌株； 

2.培养基中分别加入待测药品，在相同条件下进行培养； 

3.测定OD₆₀₀判断药品的毒性，以不加药物组分的共转化菌株为空白对照(只有对酵母菌株生长影响不大时才能用此***进行检测)。 

4.β-半乳糖甘酶的活力检测方法： 

以硝基苯吡喃半乳糖(ONPG)为底物的液体分析法检测β-半乳糖苷酶的活力可测得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒的酵母菌表达的β-半乳糖苷酶的活力在20-80U左右。具体方法如下： 

1)在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑，在30℃摇动(250rpm)24-30h活化菌种。 

2)取出菌液20-50μl于5mlYPDA培养基混合后30℃摇动(250rpm)16-18h，此时，OD₆₀₀＝0.4-1.2。 

3)取0.5-1.5ml菌液于1.5ml离心管中，离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。 

4)再用0.1mlZ-buffer重悬细胞。 

5)在液氮中裂解5次以上。 

6)加入0.7ml Z-buffer疏基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄。 

7)在加入0.4ml 1M Na₂CO₃混匀后14000rpm离心10min。 

8)用上清比色测定OD₄₂₀值，计算β-半乳糖苷酶的活力。 

计算公式如下： 

β-半乳糖苷酶活力值^[1]＝1000×OD₄₂₀/(t×V×OD₆₀₀)t＝反应开始到溶液变黄的时间V＝0.1ml×浓缩因子  OD₆₀₀＝600nm吸光值  OD₄₂₀＝420nm吸光值 

[1]Miller，J.H.In a short course in bacterial genetics.Cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor；p74 

检测样品对报告基因β-半乳糖苷酶的影响，从而判断它对载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的影响。 

5.实验结果： 

表1  β-半乳糖苷酶活力值 

样品	浓度(mg/ml)	β-半乳糖苷酶活力值(n＝3)
			尿囊素     银杏叶片     空白	0.052     0.104    0.396     0.792	46.39±1.41     54.71±0.78    46.74±1.86     55.16±1.97    40.67±1.20

空白组样本n＝3，样品组样本n＝9，自由度v＝10 

注：空白为不加样品，加与样品相同量溶剂。 

经t检验，尿囊素组在0.052、0.104mg/ml两个浓度下，银杏叶片组在0.396、0.792mg/ml两个浓度下，分别与空白组相比，t值均大于4.587，显示尿囊素组、银杏叶片组与空白组的β-半乳糖苷酶活力值差异有统计学意义，p＜0.001(t_0.001，10＝4.587)。 

测试过程中采用携带有大鼠载脂蛋白apo-AI及清道夫受体SR-BI基因质粒的酵母菌株AH109-030613为测试菌株，在空白对照中加入了与测试样溶液等量溶剂以扣除溶剂对大鼠载脂蛋白apo-AI与清道夫受体SR-BI之间相互作用的影响。 

从表1中的β-半乳糖苷酶活力值可看出，尿囊素在浓度为0.052mg/ml、0.104mg/ml时，有增强apo-AI与SR-BI之间相互作用的效果，提示有一定的降脂作用。 

Claims (1)

1.一种鉴别肉苁蓉属植物品种的方法，以尿囊素为目标物，区别肉苁蓉属中管花肉苁蓉与其它品种。