CN101270345A - 一株门多萨假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株门多萨假单胞菌及其应用。涉及一株门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK－01 CCTCC M 208005及利用该菌生产中长链聚羟基脂肪酸酯为3－羟基己酸、3－羟基辛酸、3－羟基癸酸、Δ7－3－羟基十六烷酸和3－羟基十八烷酸共聚物的方法。该方法是将门多萨假单胞菌NK－01 CCTCC M208005在碳源包括葡萄糖或糖蜜或其混合物的培养基中进行发酵。本方法克服了通常制备中长链聚羟基脂肪酸酯需要在碳源中加入长链脂肪酸，而容易抑制微生物生长，发酵速度慢，发酵产物产率低的不足。利用本发明的菌种和生产方法，得到高弹性、易于加工成型的新型生物可降解材料3－羟基己酸、3－羟基辛酸、3－羟基癸酸、Δ7－3－羟基十六烷酸和3－羟基十八烷酸的共聚物，而且发酵条件和过程使其大规模工业化生产成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一株门多萨假单胞菌及其应用，特别是涉及一株门多萨假单胞菌及利用该菌生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、/Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)是微生物在失去营养平衡的条件下，即富碳低磷、低氮或即富碳缺磷、缺氮，在体内积累的碳源或能源颗粒。这些高分子聚合物颗粒就是PHA。据报道已有300余种微生物能够合成和积累单体个数超过了百余种不同种类的PHA。由于PHA具有生物降解性、生物相容性、压电性等特征，已经成为生物材料研究领域的热点。
PHA含有不同长度碳链的单体侧链基团，根据单体碳原子数的不同，PHA被划分为两个大类，即：由3～5个碳原子的单体组成短链PHA(Short-chain-length Polyhydroxyalkanoate，PHAsCL)和由6～18个碳原子的单体组成中长链PHA (Medium-chain-lengthPolyhydroxyalkanoate，PHAMCL)。
PHAMCL往往以多种单体组成，使得该类聚合物拥有了独特的高分子性能。基于PHAMCL的生物降解性、疏水性和不透氧的特性，PHAMCL可以用于各种生物降解包装材料、一次性清洁用品等。在海洋相关产业、建材业和农业中，都有该类生物可降解材料很大的应用潜力。PHAMCL在生物医药方面的应用潜力更具前景。例如用做医用缝合线、药物释放载体等。在组织工程中，需要将细胞接种于骨架材料上，骨架材料不仅需要良好的生物相容性和生物降解性，而且还要诱导细胞的吸附及随后的组织生长，PHAMCL在组织工程领域就可担当此类任务。
制备中长链聚羟基脂肪酸酯PHAMCL通常需要在碳源中加入长链脂肪酸，而由于长链脂肪酸抑制微生物的正常生长，需分批加入。因此，存在工艺复杂、发酵初期生长速度慢、发酵周期长、发酵产物产率相对低的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于大规模工业化生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物的门多萨假单胞菌。
本发明提供的门多萨假单胞菌为门多萨假单胞菌NK-01。
门多萨假单胞菌NK-01，已于2008年1月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学内)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 208005。
本发明的门多萨假单胞菌自天津市西青区付村的大田土壤中分离得到，具有利用碳水化合物产酸的特性。该菌可在Luria-Bertani(LB)(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L氯化钠)培养基上生长，浅黄色，圆形菌落，边缘整齐，生长快。其16S rRNA基因的核苷酸序列长度为1454bp，在GenBank中的登录号为DQ641475。使用BLAST对NK-01菌株的16S rRNA基因和GenBank中已登录的细菌的16S rRNA基因做同源性比较，结果显示这个核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的多种细菌具有很高的同源性，且与已经报道的Pseudomonas mendocina ymp ctg68菌株的16S rRNA序列相似性最高。从GenBank里得到与门多萨假单胞菌NK-01菌株的16S rRNA基因序列相近的序列，利用DNA star软件与NK-01菌株的16S rRNA基因序列作比较后，建立了门多萨假单胞菌NK-01基于16S rRNA基因的***进化树(见说明书附图1)。
本发明的另一个目的是提供利用上述门多萨假单胞菌低成本生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物的方法。
为实现这一目的，本发明采用以下技术方案：一种生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物的方法，是将门多萨假单胞菌NK-01CCTCC M 208005在碳源包括葡萄糖或糖蜜或其混合物的培养基中进行发酵。
为了促进3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物在门多萨假单胞菌NK-01中的合成，所述培养过程中采用限制高碳低氮或高碳无氮的措施。
本发明中的培养温度为28-35℃；合适的PH值为6.0-8.0。
本发明以门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005为生产菌株，利用葡萄糖或糖蜜或其混合物为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯。本发明方法避免了长链脂肪酸作为发酵碳源抑制微生物正常生长，需要分批加入的缺点。克服了工艺复杂、发酵初期生长速度慢、发酵周期长、发酵产物产率相对低的不足。利用本发明的菌种和生产方法，得到新型生物可降解材料3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸的共聚物，具有高弹性、易于加工成型的特点，而且发酵条件和过程使其大规模工业化生产成为可能。
附图说明
图1是16S r RNA基因进化树。
图2是利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005发酵生产的中长链聚羟基脂肪酸酯的五种单体结构。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
在下面的实施例中，所用的菌种均为门多萨假单胞菌NK-01CCTCC M 208005，实施例中所用的磷酸盐缓冲液和不同培养基配方如下：
培养基1：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。
培养基2：酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，(NH4)2SO4 5g，蒸馏水1000ml。
培养基3：Na2HPO4 3.8g，KH2PO42.65g，MgSO40.2g，葡萄糖10g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O0.105g，NiCl20.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl39.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为7。
培养基4：Na2HPO4 3.8g，KH2PO42.65g，MgSO40.2g，葡萄糖10g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl2 7.8g，CrCl3·6H2O 0.105g，NiCl20.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl39.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为7。
培养基5：Na2HPO43.8g，KH2PO42.65g，MgSO40.2g，糖蜜20g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl27.8g，CrCl3·6H2O 0.105g，NiCl20.118g，CuSO4·5H2O0.156g，FeCl39.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为6。
培养基6：Na2HPO43.8g，KH2PO42.65g，MgSO40.2g，糖蜜10g，葡萄糖5g，NH4Cl 0.36g，微量元素液1ml/L(微量元素液：0.1MHCl 1000ml，CoCl2·6H2O 0.218g，CaCl27.8g，CrCl3·6H2O0.105g，NiCl20.118g，CuSO4·5H2O 0.156g，FeCl39.7g)，蒸馏水1000ml，调pH为8。
磷酸盐缓冲液(g/L)：Na2HPO4·12H2O 8.95g，KH2PO41.5g，pH为7.0。
实施例1、采用尼尔红(Nile Red)荧光染色法自天津市西青区付村农田土壤中分离菌种门多萨假单胞菌NK-01CCTCC M 208005：
取0-10cm的土壤，以无菌生理盐水稀释为101-108，以不同稀释度的土壤悬浊液0.5mL涂布于PHA合成菌分离培养基1，于30℃培养4-5天，菌落出现后，以ZF-2型三用紫外分析仪312nm波长照射，呈现橘红色荧光菌落者即为PHA合成菌。然后采用传统生理生化分类实验、16S rRNA基因序列分析和BIOLOG微生物分类鉴定***对菌种进行了分类鉴定。确立该菌株为门多萨假单胞菌，并命名为门多萨假单胞菌NK-01，经保藏，编号为CCTCC M208005。
实施例2、一步法发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯(高碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml培养基2，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml培养基2的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含培养基2的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基3(pH 7)，30℃，通气培养60h。发酵结束后，对菌体离心、洗涤、干燥，利用索式抽提器以氯仿为抽提液提取PHA。将抽提液浓缩后置入60倍体积的蒸馏水∶甲醇(1∶1)中，收集白色沉淀，干燥称重，计算含量，聚合物占细胞干重＞50％。利用核磁共振、傅丽叶红外光谱、气-质联用检测聚合物的单体结构为3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸。组成聚合物的五种单体结构如说明书附图2所示。
实施例3、两步法发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯(高碳无氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml培养基2，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml培养基2的500ml三角瓶中，28℃150rpm振荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。分别将不含培养基2的菌体无菌接入10瓶含有100ml培养基4(pH 7)的500ml三角瓶中，，30℃，150rpm振荡培养。60小时后结束发酵，以下步骤同实施例2。
实施例4、一步法发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯(高碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml培养基2，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml培养基2的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含培养基2的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基5(pH 6)，28℃，通气培养72h。以下步骤同实施例2。
实施例5、一步法发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯(高碳低氮条件下的发酵)
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml培养基2，以无菌牙签接入NK-01菌株的单菌落，30℃120rpm培养12h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml培养基2的500ml三角瓶中，30℃150rpm震荡培养24h。4℃，6000g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000g无菌离心12min，弃上清。将不含培养基2的菌体无菌接入可控氧搅拌式1升发酵装置中，装置内含有1升培养基6(pH 8)，35℃，通气培养60h。以下步骤同实施例2。
Claims (5)
1.一株门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005。
2.利用门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)NK-01CCTCC M 208005生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养基的碳源包括葡萄糖、糖蜜或它们的混合物。
3.根据权利要求2所述的一种生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养过程中采用高碳低氮或高碳无氮措施中的一种。
4.根据权利要求2或3所述的一种生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养温度为：28-35℃。
5.根据权利要求2或3所述的一种生产3-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸、Δ7-3-羟基十六烷酸和3-羟基十八烷酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养过程中的pH值为6.0-8.0。
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