CN101269076A - β-甲氧基丙烯酸酯类化合物作为新型STAT3抑制剂的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有STAT3抑制剂活性的通式I所示化合物、其异构体，及含有他们的药物组合物在预防或治疗恶性肿瘤、艾滋病和炎症，及终止意外妊娠等中的应用，或作为用于研究肿瘤生长、增殖、分化和凋亡，及STAT3相关信号转导通路的工具药的应用。

Description

β-甲氧基丙烯酸酯类化合物作为新型STAT3抑制剂的医药用途

技术领域

本发明涉及具有STAT3抑制剂活性的β-甲氧基丙烯酸酯、其异构体，及含有他们的药物组合物在预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及终止意外妊娠等中的应用，或作为用于研究肿瘤生长、增殖、分化和凋亡，及STAT3相关信号转导通路的工具药的应用。

背景技术

β-甲氧基丙烯酸酯是一类新型杀菌剂，主要用于农业(如谷物、水果和蔬菜等)杀真菌。最早为天然产物，如嗜球果伞素类最简单的是嗜球果伞素A(Strobilurin)。之后，相继出现化学合成品，如密菌酯(Azoxystrobin)和啶氧菌酯(Picoxystrobin)，及嘧螨酯(Fluacrypyrim，FAPM)等。其中，嘧螨酯FAPM为杀螨剂和杀线虫剂，主要用于蔬菜和水果。

β-甲氧基丙烯酸酯是主要的Q₀抑制型杀菌剂。通过与细胞色素b的Q₀位点结合，阻断细胞色素b和细胞色素c1间的电子转移及质子跨膜转移，从而抑制线粒体呼吸作用，阻断ATP合成，结果导致能量循环中止，进而起到广谱杀菌作用。

此外，也有报道苯基-β-甲氧基丙烯酸酯具有抗疟作用。

信号转导与转录活化因子(STATs)是一类因对多种细胞因子和生长因子应答所活化的后期胞浆转录因子家族。STATs的活化依赖于酪氨酸磷酸化，后者通过二分子STAT间的磷酸化酪氨酸与Src同源结构域2(SH2)相互作用引起STAT二聚体化，进而转位到细胞核，在此与靶基因的同感启动子序列结合，并活化其转录。其靶基因包括细胞周期调节因子(如细胞周期素D1与3、p19、p21和p27，及c-myc)、抗凋亡基因(如存活素、Bcl-2、Bcl-x1、TIMP1和Mcl-1)、促血管生成因子(MMPs和VEGF)及其它。目前已鉴定的STATs有7种：STAT1-4、5a、5b和6。研究表明，正常细胞的STAT酪氨酸磷酸化是暂时的，持续约半小时到数小时。但是，许多癌衍化细胞系或原发肿瘤中，STAT蛋白(告别是STAT3)持久地磷酸化。活化的STAT3能引起非死亡细胞分化，具有癌原性作用，还涉及癌细胞侵润中病灶粘附和化学致癌中原始成瘤。而在肿瘤衍化细胞中，通过应用反义核酸、小干扰RNA(siRNA)、STAT3负性决定簇，和/或阻滞酪氨酸激酶(TK)，及肽、肽模拟物或小分子的STAT3抑制剂来抑制STAT3活性，则可导致这些细胞的生长抑制和凋亡。因此，STAT3介导的信号转导通路的活化对细胞的生长与存活非常重要；阻断STAT3信号通路可成功导致肿瘤细胞生长抑制和凋亡。STAT3是一个发展新型癌症治疗的诱人的分子靶标[Curr Cancer DrugTargets，2007，7(1)：91-107；Nat Med，2005，11(6)：595-6]。基因敲除和小分子抑制剂研究表明，抑制STAT3信号转导的抗癌策略的优点在于：抑制STAT3信号通路可多种抗肿瘤免疫活性-树突状细胞、T细胞、NK细胞和嗜中性细胞的活性显著增强，引起T细胞依赖的和NK细胞依赖的对已恶化的肿瘤抑制作用和肿瘤退化(Nat Med，2005，11：1314-21)；产生多药(如紫杉醇和铂剂等)抗性的肿瘤常伴有IL6表达明显升高和磷酸化STAT3表达显著增大，肿瘤的多药抗性(MDR)与免疫介导的细胞因子(特别是IL6)旁分泌活化STAT3信号通路相关，阻断STAT3信号通路可逆转肿瘤对紫杉醇等化疗药物多药抗性(ClinCancer Res，2006，12(17)：5055-63)。还有研究表明，抑制子宫内膜STAT3的活化可抑制受精卵的着床，可发展非甾体避孕药[Proc Natl Acad Sci USA(PNAS)，2005，102(24)：8585-90]。此外，抑制STAT3信号通路也可能成为炎症和HIV的预防与治疗的有效策略[Curr Cancer Drug Targets，2007，7(1)：91-107]。总之，STAT3抑制剂可发展成为广谱抗癌药、非甾体事后避孕药、消炎药、和抗爱滋病药等。因此，研究与开发具有STAT3抑制剂活性的小分子药物是十分重要的。

从化学结构来看，目前已报道的小分子STAT3抑制剂总体可分为五大类：(1)天然产物及其衍生物，包括α，β-不饱和酮类(如姜黄素、2-环戊烯柄衍生物和cucurbitacin类)、黄酮胺衍生物(flavopiridol)、含多个酚羟基的反式1，2-二苯乙烯类(resvera-trol)、三萜类似物(如CDDO-Im、cucurbitacin I/JSI-124和cucubitacin Q)、多环酮类(如deoxytetrangomycin/STA-21)、N-高级脂肪酰高丝氨酸内酯和3-烯-2-吲哚酮类(indirubin衍生物)等；(2)3-芳基丙烯腈类(tyrphostins)，如如AG490和WP1066；(3)铂配合物如CPA-7；(4)肽模拟物(peptidomimetics)，包括三肽衍生物(如N-芳酰基-O-磷酰基酪氨酰亮氨酸)、HIV抑制剂(如nelfinavir、saquinavir和ritonavir，特别是nelfinavir)；和(5)氮杂螺环化合物如SK&F 106615[Curr Cancer Drug Targets，2007，7(1)：91-107]。此外，还有一些多环酮化合物如SD-1029，硫杂茚衍生物如stattic。从作用机制来说，STAT3抑制剂可分为五大类：(1)以STAT上游信号分子和信号通路包括EGFR、JAK、Src和c-Kit等受体激酶和非受体激酶为靶标，特别JAK2抑制剂等非特异性调节剂如AG490、WP1066和piceatannol及Src抑制剂E804等；(2)作用于STAT二聚体化及其转运入核如SD-1029和STA-21；(3)影响STAT3与靶基因DNA的结合如CPE-7和CMP-6；(4)干扰STAT3的表达；和(5)作用于STAT3的负反馈回路(J Mol Med，2007，doi 10.1007/s00109-006-0152-3)。但仍未见有β-甲氧基丙烯酸酯类STAT3抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于寻找和发现可用于恶性肿瘤靶向预防或治疗的新型STAT3抑制剂。

在本发明人进行抗肿瘤药物的研究中发现，式I所示的化合物是新型STAT3抑制剂，对多种肿瘤细胞系具有明显的抑制作用。进一步的研究表明，式I所示的化合物对肿瘤细胞周期具有显著的G₀-G₁期抑制作用，且对STAT3磷酸化具有明显的抑制作用。本发明就是基于这一发现得以完成。

本发明的第一方面涉及通式I所示的化合物、其异构体在制备可用于预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及中止意外怀孕的药物中用途，或作为用于研究肿瘤生长、增殖、分化和凋亡，及STAT3相关信号转导通路的工具药的应用，

其中：

R¹代表苯氧基、取代的苯氧、杂芳氧基、取代的杂芳氧基；苯胺基、取代的苯胺基、杂芳胺基、取代的杂芳胺基；其中所述的杂芳环为1-3选自N、O或S杂原子单环或稠环芳香烃基，每个带有取代基的基团之取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、一、二或三卤代的C_1-6烷基、氨基、C_1-6烷胺基、C_1-10烃酰氧基、C_1-10烃酰胺基、C_6-10芳酰氧基或C_6-10芳酰胺基；

R²为C₁-C₆烃基；R³为C₁-C₆烷基。

本发明的第二方面涉及药物组合物，其中含有至少一种通式I所示的化合物、其异构体及药用载体或赋形剂在制备可用于预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及中止意外怀孕的药物中用途，或作为用于研究肿瘤生长、增殖、分化和凋亡，及STAT3相关信号转导通路的工具药的应用。

本发明再一方面涉及预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及中止意外妊娠的方法，其包括对恶性肿瘤、爱滋病和炎症患者或意外妊娠者给予有效量的式I所示的化合物、其异构体。

附图说明

图1表示实施例化合物1(FAPM)对FAPM对细胞内STAT家族、PI3/Akt及MAPK信号途径各信号分子表达水平的影响

图2代表FAPM及其3个类似物降低STAT3磷酸化的时间、剂量效应以及对STAT3下游分子的调控情况

图3表示FAPM及其类似物对白血病细胞HL-60的增殖抑制作用

图4代表FAPM对HL-60细胞周期的影响

图5表示FAPM对细胞周期G1期调控蛋白的表达的影响

具体实施方式

根据本发明，本发明中所用术语“恶性肿瘤”是指已经恶变的肿瘤，包括血液肿瘤、腺瘤和实体瘤，如白血病、淋巴癌、乳腺癌、***癌、肺癌、颈与脑癌等。

根据本发明，通式I所示的化合物，R¹优选为苯氧基、取代的苯氧、杂芳氧基、取代的杂芳氧基；苯胺基、取代的苯胺基、杂芳胺基、或取代的杂芳胺基；其中所述的杂芳环为1-3选自N、O或S杂原子单环或稠环芳香烃基，每个带有取代基的基团之取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、一、二或三卤代的C_1-6烷基、氨基、C_1-6烷胺基、C_1-10烃酰氧基、C_1-10烃酰胺基、C_6-10芳酰氧基或C_6-10芳酰胺基；

R²为甲基或乙基；R³为甲基或乙基。

根据本发明通式I所示的化合物，R¹更优选为2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基，或3，4-二氢-2-异丙氧基-4-氧-6-三氟甲基嘧啶-1-基；R²和R³均为甲基。

在本发明中的一个优选实施方案中，所述的R¹为2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基，R²和R³均为甲基，且双键的构型为反式。

根据本发明，式I化合物可以存在顺/反异构体，本发明涉及顺式形式和反式形式以及这些形式的混合物。如果需要，单一立体异构体的制备可根据常规方法拆分混合物，或通过例如立体选择合成制备。如果存在机动的氢原子，本发明也涉及式I化合物的互变异构形式。

根据本发明，式I化合物及其立体异构体在预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及中止意外妊娠等中显示优良效果。因此可作为预防或治疗恶性肿瘤，及中止意外妊娠等的药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。

本发明因此还涉及含有作为活性成份的有效剂量的至少一种式I化合物，或其药用盐和/或其立体异构体以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的式I化合物和/或其生理上可接受的盐。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将式I化合物和/或立体异构体与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的式I化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、***片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药***。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、***胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如***胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分式I化合物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分式I化合物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明式I化合物，或其异构体的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

本发明可通过下列实施例得到进一步说明，但这些实施例子不意味着对本发明的任何限制。

实施例1(E)-3-甲氧基-2-[2-(2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基)苯基]丙烯酸甲酯(化合物1，Fluacrypyrim，FAPM)的制备

(1)邻甲基苯乙酸甲酯：称取7.5g(0.05mol)邻甲基苯乙酸，溶于75mL无水甲醇，搅拌下加入0.1mL硫酸，加热回流反应2小时，然后冷却，减压回收溶剂，加入30mL二氯甲烷和20mL水，分液，水层以15mL二氯甲烷再提取一次，合并二氯甲烷溶液，水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，滤去回固体，回收溶剂，得无色液体。可直接用于下一步反应。

(2)3-羟基-2-(2-甲基苯基)-2-丙烯酸甲酯：称取2.50g(0.062mol)氢化钠，悬浮于25mL干燥四氢呋喃中，冰水冷却下及搅拌下加入20mL经无水碳酸钠干燥的甲酸甲酯，然后再滴加溶有上步制备的产物的20mL干燥四氢呋喃溶液，滴毕，使自然升温为室温，继续搅拌反应5小时，然后减压回收溶剂，冷却，以3N盐酸酸化至pH3-4，二氯甲烷提取，水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤去固体，回收溶剂，即得浅黄色液体。可直接用于下一步反应。

(3)(Z)-3-甲氧基-2-(2-甲基苯基)-2-丙烯酸甲酯：将上一步制备的产物溶于50mL丙酮，加入5mL硫酸二甲酯，搅拌下加入8.0g无水碳酸钾，搅拌加热回流100分钟，然后冷却，滤去固体，回收溶剂，再以45mL***提取，稀氨水洗涤，再水洗三次，无水硫酸钠干燥，滤去固体，回收溶剂，得黄色液体，可直接用于下一步反应。

(4)(E)-3-甲氧基-2-(2-溴甲基苯基)-2-丙烯酸甲酯(中间体1)：将上一步制备的产物溶于75mL干燥的四氯化碳，搅拌下加入10g N-溴代丁二酰亚胺和约0.3g偶氮二异丁腈，搅拌回流反应4小时，然后冷却，滤去固体，四氯化碳洗涤，合并，回收溶剂，冷却，加入水250mL，以二氯甲烷300mL×2提取，合并提取液，水洗一次，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，加入***-石油醚结晶，活性碳脱色，得黄色固体，10.75g，mp 94-96℃。¹H-NMR(CDCl₃，ppm)δ：3.7066(s，3H)，3.8372(s，3H)，4.4092(s，2H)，7.10-7.20(m，1H)，7.30-7.40(m，2H)，7.45-7.50(m，1H)，7.6402(s，1H)。

(5)O-异丙基异脲盐酸盐(中间体2)：称取决8.4g(0.10mol)50％氰胺水溶液，加入40mL异丙醇，在搅拌下滴加入8.3mL浓盐酸(12N，0.10mol)，加毕，立即升温到85℃，回流反应40分钟，降温到50℃以下，减压蒸干，残留物以异丙醇重结晶，不溶物滤去，析出的无色方块状晶体，得4.16g，收率30.1％，mp 94-96℃。

(6)4-羟基-2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶(中间体3)：称取1.65g(0.072mol)钠，溶于10mL无水甲醇，在搅拌及冰水冷却下滴加到溶有9.48g(0.068mol)中间体2的240mL无水乙醇溶液，滴毕，继续搅拌15分钟，然后于70℃油浴中加热，再滴加10mL三氟乙酰乙酸乙酯，滴毕，搅拌回流反应过夜(12小时以上)，减压浓缩，冷却，加入20mL水，以盐酸酸化至pH3，再以***35mL×2提取，合并，水洗，无水硫酸钠干燥，滤去固体，回收溶剂，以石油醚结晶，先得白色固体9.70g，mp 129-131℃；母液浓缩，补加石油醚，又得固体11.5g，mp 127-129℃；¹H-NMR(CDCl₃，ppm)δ：1.4066(d，J＝6.4Hz，6H)，5.30-5.50(m，1H)，6.5777(s，1H)，11.6691(br，1H)。

(7)(E)-3-甲氧基-2-[2-(2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基)苯基]丙烯酸甲酯(化合物1，Fluacrypyrim)：称取7.25g(0.033mol)中间体3和7.00g(0.051mol)无水碳酸钾，加入50mL丙酮和1.01g硫酸氢化四丁基铵，于40℃油浴中加热及搅拌下，滴加溶有9.24g(0.032mol)中间体1的20mL丙酮溶液，再升温至50℃，搅拌反应过夜。次日，冷却，滤去固体，丙酮洗涤，合并丙酮溶液，回收溶剂，然后加入水，***35mL×2提取，合并，水洗，无水硫酸钠干燥，滤去固体，回收溶剂，石油醚结晶，得浅黄色固体，先得5.50g，母液浓缩，柱层析，取第一主点，又得1.45g，共6.95g。¹H-NMR(CDCl₃，ppm)δ：1.399(d，J＝6.01Hz，6H)，3.6755(s，3H)，3.8057(s，3H)，5.25-5.32(m，1H)，5.3259(s，2H)，6.6289(s，1H)，7.18-7.21(m，1H)，7.35-7.40(m，2H)，7.48-7.51(m，1H)，7.5561(s，1H)。mp 108-110℃。

实验例2(E)-3-甲氧基-2-[2-(3，4-二氢-2-异丙氧基-4-氧-6-三氟甲基嘧啶-1-基)苯基]丙烯酸甲酯(化合物2，IFAPM)的制备

(1)-(6)步同化合物1的制备，第(7)步操作基本与化合物1的相同，只是要分离的目标产品是在柱层析分离化合物1后第二(后)主点，得5.85g，mp 94-96℃。1H-NMR(CDCl3，ppm)δ：1.089(br-s，6H)，3.621(s，3H)，3.843(s，3H)，4.90(br-s，1H)，5.231(m，2H)，6.457(s，1H)，7.09-7.15(m，2H)，7.24-7.29(m，2H)，7.484(s，1H)。

下面的生物活性实验用来进一步说明本发明。

生物效应实验1FAPM对细胞内STAT家族、PI3/Akt及MAPK信号途径各信号分子表达水平的影响

图1表示了FAPM对细胞内STAT家族、PI3/Akt及MAPK信号途径各信号分子表达水平的影响。如图1a：FAPM处理24h后诱导phospho-Stat3^(tyr705)蛋白水平的剂量依赖性降低，而phospho-Stat5^(tyr694)只在高剂量FAPM处理后表达水平才有明显降低，phospho-Stat1^(tyr701)表达水平则无明显改变。另外，FAPM对p-Akt和MAPK途径的各信号分子p-ERK1/2，p-p38，p-JNK的表达水平均没有明显的影响(图1b)，结果提示FAPM可能通过特异性抑制STAT3途径发挥细胞内效应，而对PI3/Akt及MAPK途径没有作用。

生物效应实验1研究方法：Western Blotting检测方法。各剂量FAPM处理细胞24h后收集细胞，用冰冷的PBS洗一次，加入预冷的细胞裂解液(10⁶cells/50μl)。将收集的细胞裂解液在4℃冰浴45min，使细胞彻底裂解，随后12000rpm、4℃离心5min，取部分上清液，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取20ug蛋白提取液，加入等量2×SDS凝胶上样buffer混匀，煮沸5min变性蛋白，冷却后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后稳流160mA 1h将蛋白转印到硝酸纤维素膜上。然后将膜转入平皿中，5％的脱脂牛奶封闭1h，TBS/T洗3次×5min，适当比例的一抗稀释液孵育过夜，用TBS/T洗4次×5min，相应的适当比例二抗稀释液再孵育1h，TBS/T洗4次×5min，substrate孵育1min，X光片感光显影。

生物效应实验2FAPM抑制STAT3磷酸化作用的时间、剂量效应以及对STAT3下游分子的调控

图2代表了FAPM降低STAT3磷酸化的时间、剂量效应以及对STAT3下游分子的调控情况。如图2a所示：3μM FAPM在6h时就能明显诱导HL-60细胞内phospho-Stat3^(tyr705)表达降低，随着剂量的增大和处理时间的延长phospho-Stat3^(tyr705)表达水平降低更加明显，而FAPM处理并不影响STAT3总蛋白的表达。同时检测发现，FAPM的类似物没有明显降低phospho-Stat3^(tyr705)的作用(如图2b)。通过对受STAT3调控的下游基因表达进行检测发现(图2C)，FAPM处理后可诱导下游周期调控蛋白c-Myc以及CyclinD1的水平降低，但对凋亡相关蛋白BC-xL和Mcl-1的表达水平没有明显影响。结果提示：FAPM对细胞周期的调节作用可以抑制持续的STAT3激活，降低细胞内c-Myc以及CyclinD1等周期调控蛋白的表达水平；FAPM可特异性细胞内STAT3信号转导通路。

生物效应实验2研究方法：同实验1。

生物效应实验3FAPM及其类似物对白血病细胞HL-60的增殖抑制作用

如图3所示：3a图为FAPM及3个类似物IFAPM、FAPMA、HTFPMPA的结构，3b图用MTT法检测FAPM及其类似物对白血病细胞HL-60的增殖抑制作用。在各化合物不同浓度(0-48μM)处理HL-60细胞48h后，结果表明FAPM显著抑制HL-60细胞的增殖，具有剂量依赖效应，而其3个类似物对HL-60细胞的增殖抑制作用较弱，只有化合物IFAPM在高剂量时能够抑制细胞增殖。为了进一步确证上述增殖抑制效应，通过台盼蓝染色计数法观察FAPM诱导HL-60细胞增殖抑制的时间和剂量效应，如图3c：与对照相比，低剂量0.75μM FAPM处理12h就能观察到明显的增殖抑制效应，3-12μM FAPM处理后的各个时间点细胞几乎不增殖。上述结果显示化合物FAPM处理HL-60细胞后可强烈诱导时间、剂量依赖性的增殖抑制效应。

生物效应实验3的研究方法：细胞增殖能力检测(MTT)：通过计数将细胞浓度调至10⁵/ml，加入细胞悬液至96孔板中，将化合物FAPM、IFAPM、FAPMA、HTFPMPA设置不同浓度后分别加入96孔板细胞悬液中，并置于细胞培养箱继续培养48h，随后加入3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)染色剂再培养4-5h，用10％SDS终止反应，过夜溶解后于酶标分析仪570nm波长处测定OD值；台盼蓝染色计数：将细胞调整为5,000/cm²/60-mm培养皿，加入0.75-12μM剂量的化合物FAPM与细胞共同孵育分别培养12、24、36、48、72h，然后收集细胞悬液加入0.1％台盼蓝溶液10μl/ml，用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计算未被染色(即存活)的细胞数。重复三次求算平均值及标准差.

生物效应实验4FAPM对HL-60细胞周期的影响

如图4所示：4a图观察了从6-48h不同时间点不同剂量FAPM处理后HL-60细胞周期改变情况，从结果可以看出：低剂量FAPM(0.75μM)处理后各时间点的细胞几乎都出现少许S期升高现象，随着剂量的增加这种现象逐渐消失；从12h开始1.5-12μM的FAPM就可诱导细胞G1期升高，随着时间的增长G1期升高的效应呈现稳定不可逆的趋势，并伴随有G2/M期和S期的明显下降。但是其他几个类似物对细胞周期进展没有显著影响(图4b)。

生物效应实验4研究方法：收集FAPM及其几个类似物不同时间和剂量处理后的细胞，用PBS洗3次，1000rpm离心5min，倒去上层PBS，700μl 70％乙醇4℃固定过夜。次日1000rpm离心5min，用PBS洗一次，加入1mg/ml RNAse于37℃孵育30min，然后加propidium iodide(PI)50ug/ml，流式细胞仪上机检测。

生物效应实验5FAPM对细胞周期G1期调控蛋白的表达的影响

如图5所示：为了进一步检测G1期阻滞，用Western Blotting方法观察了细胞周期G1期调控蛋白的表达变化情况。实验中提取不同剂量FAPM(3-12μM)处理后24h HL-60全细胞蛋白，结果显示：FAPM处理细胞后诱导CyclinD1发生明显的剂量依赖性的表达水平下调，同时Rb^(ser807/811)，CyclinD3，CDK4的表达水平也明显降低，而其它蛋白包括Rb^(ser795)，CDK6以及CyclinE2蛋白的表达水平没有变化。结果提示：CyclinD1，CyclinD3，CDK4，phospho-Rb^(ser807/811)蛋白表达水平下调可能是化合物FAPM诱导细胞G1期阻滞的重要作用环节。生物效应实验5研究方法：同实验1。

Claims (4)

1. 涉及通式I所示的化合物、其异构体在制备可用于预防或治疗恶性肿瘤、爱滋病和炎症，及中止意外怀孕的药物中用途，或作为用于研究肿瘤生长、增殖、分化和凋亡，及STAT3相关信号转导通路的工具药的应用，

其中：

R¹代表苯氧基、取代的苯氧、杂芳氧基、取代的杂芳氧基；苯胺基、取代的苯胺基、杂芳胺基、取代的杂芳胺基；其中所述的杂芳环为1-3选自N、O或S杂原子单环或稠环芳香烃基，每个带有取代基的基团之取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、一、二或三卤代的C_1-6烷基、氨基、C_1-6烷胺基、C_1-10烃酰氧基、C_1-10烃酰胺基、C_6-10芳酰氧基或C_6-10芳酰胺基；R²为C₁-C₆烃基；R³为C₁-C₆烷基。

2. 如权利要求1应用，其中，所述的R₂和R₃为甲基或乙基。

3. 如权利要求1应用，其中，所述的R₂和R₃为甲基；R₁为2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基或3，4-二氢-2-异丙氧基-4-氧-6-三氟甲基嘧啶-1-基。

4. 如权利要求1应用，其中，所述的化合物为(E)-3-甲氧基-2-[2-(2-异丙氧基-6-三氟甲基嘧啶-4-氧基)苯基]丙烯酸甲酯。

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