CN101268198A - 用于核酸提取和鉴定的方法 - Google Patents

用于核酸提取和鉴定的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101268198A
CN101268198A CNA2006800029535A CN200680002953A CN101268198A CN 101268198 A CN101268198 A CN 101268198A CN A2006800029535 A CNA2006800029535 A CN A2006800029535A CN 200680002953 A CN200680002953 A CN 200680002953A CN 101268198 A CN101268198 A CN 101268198A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
lysate
nucleic acid
virus
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800029535A
Other languages
English (en)
Inventor
沃尔弗拉姆·H.E.·普尔法
艾尔弗雷德·M·普林斯
李敦勋
琳达·安德勒斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New York Blood Center Inc
Original Assignee
New York Blood Center Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New York Blood Center Inc filed Critical New York Blood Center Inc
Publication of CN101268198A publication Critical patent/CN101268198A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法。所述样品包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒。该方法包括将含去垢剂的裂解液加入样品中以裂解细胞或病毒形成裂解物、将醇加入所述裂解物中以聚集或沉淀核酸、以及通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物－醇混合物中纯化核酸。

Description

用于核酸提取和鉴定的方法
本申请要求于2005年1月21日提交的系列号为60/645,905的美国临时申请的优先权，将其说明书的全部内容以引用方式结合于此以供参考。
背景技术
公共***门越来越需要高灵敏度的病毒、细菌、真菌、寄生虫或细胞基因测定法。用于筛查(例如：血液供给、蚊子体内的虫媒病毒)、监控(例如：鸟群中的西尼罗病毒)、水分析、感染的诊断、基于基因的诊断(例如：血友病、乳癌易感性、癌细胞)等的高通量样品处理，将会非常有益。
血液供给污染致病病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲肝、乙肝或丙肝病毒、细小病毒、巨细胞病毒和EB病毒(非洲淋巴细胞瘤病毒)以及细菌感染如莱姆病，已经成为一个越来越严重的问题。美国食品与药物管理局以及其它部门的普遍意见是：除了血清学试验外，所有血液均应利用聚合酶链式反应(PCR)分析进行筛查，或者最终用PCR代替血清学试验。现在认为，筛查血液的传染性病毒，每年将能防止至少一百个输血相关的乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和HIV病例的发生。
直到最近，血清学试验仍然是筛查血液所选择的方法。这些试验检测血液中抗体的存在情况，其中抗体针对病毒试剂、病毒抗原、细菌试剂、细菌抗原等而升高。血清学筛查试验的缺陷在于：如果机体还没有发动抗体反应，则不能检测感染。
例如，血清学试验常常无法检测在感染的早期阶段检测被感染个体。另外，表现为低免疫反应的个体一般携带少量病毒。通常，小量病毒不能刺激抗体产生。这种病毒的一个实例是HIV。由于血清学试验的这些以及其它实用局限性，因此现在需要无论个体处于哪个感染阶段均可检测感染的方法。
分离血浆中存在的核酸随后进行PCR扩增，能够在缺乏抗体的情况下检测致病体。致病体的检测对于确保血液供给无可传染病原体非常关键。
医疗单位中筛查血液以及相关生物材料，通常是大规模进行的。血液中心每一天通常检测多达1000或更多单位的血液。利用目前可用的技术每天从1000份样品中制备分离出来的核酸，需要相当量的时间、劳力和试剂。因此，由于技术局限性，通常不进行大规模的个体样品核酸检测。
现在，如果在筛查和监测应用中采用核酸试验，也是用于样品混合物中。遗憾的是，混合样品降低了试验的灵敏度，如果混合样品检测为阳性，则延误了最终的诊断。
提取DNA或RNA用于检测通常涉及到采用两种不同的提取方法。一种方法仅适用于DNA提取；另一种方法则仅适用于RNA提取。采用DNA提取方法得到很少量RNA，反之亦然。因此，直到最近，血液筛查仍需要一种方法分离DNA，而需要另一种方法分离RNA。
因此，需要一种可以高灵敏度提取及纯化DNA和RNA的简单、有效而可信的方法，这样一种方法对于筛查血液供给特别有用。该方法对于多种其它应用也非常有益，例如基于基因的诊断、传染病的监测(例如鸟群中的西尼罗病毒、蚊群中的疟疾)、水分析等。
发明内容
本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法，满足了上述需要。所述方法包括：获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；以及通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定样品中病原体的方法。所述方法包括：获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸；以及分析该核酸，以鉴定病原体。
在另外一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定水样中的生物污染物的方法。所述方法包括：获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的水样；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸；以及分析该核酸，以鉴定污染物。
在进一步的实施例中，本发明提供了一种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法。所述方法包括：获得包含细胞的生物样品；将含去垢剂的裂解液加入该样品中，从而裂解细胞或病毒并形成裂解物；向该裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化核酸；以及分析该核酸，以鉴定遗传疾病。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包括含去垢剂的裂解液以及玻璃纤维滤器。
附图说明
图1：PEG对病毒检测的影响。以104.5个WNV基因组当量(GE)/ml刺激正常人血浆，并加入不同浓度的PEG8000。将2.0mlPEG-血浆混合并离心。沉淀和上清液各200μl用于提取和定量RT-PCR。
图2：PEG对病毒检测的影响。提取未浓缩和经PEG浓缩的血浆各200μl，并进行PCR。与0％PEG相比，在3％PEG时可检测到大约10倍以上的RNA。
图3.血浆中WNV在4℃的稳定性。对从WNV样品提取的RNA进行终点RT-PCR，其中WNV样品4℃保存0、7或14天。结果以4个重复样品的平均相对荧光单位(RTU)+/-标准偏差来表示。
具体实施方式
本发明基于本申请发明人的一个惊人发现，即一种快速高效的从既包含DNA又包含RNA的样品中同时(即利用一种方法)提取DNA和RNA的方法。本申请的发明人意外地发现：通过用去垢剂裂解样品、通过加入醇聚集或沉淀存在的任何核酸，以及通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物中分离核酸，DNA和RNA均能从样品中分离，即纯化。
所述提取和纯化过程适于自动化。提取的核酸适用于核酸扩增技术，如PCR(聚合酶链式反应)或者RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)。
提取核酸
在一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的方法。所述核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
用于从样品中提取核酸的方法的第一步是获得包含细胞或病毒的样品。任何包含细胞或病毒的样品均可根据本发明的方法而采用。包含细胞或病毒的样品的实例包括但不限于生物样品和含水(aqueous)非生物样品。
任何包含细胞或病毒的生物样品均适用于本发明的方法。在本文中使用的生物样品包括例如体液、组织和细胞。生物样品的一些具体实例包括但不限于：血液、血浆、尿、唾液、***分泌物、脑脊液、血清、上皮细胞、免疫细胞、口腔刮取物、宫颈组织刮取物等。
所述生物样品可利用本领域中技术人员已知的任何方法而获得。恰当的方法包括例如静脉的静脉穿刺以获得血液样品以及颊细胞刮取以获得口腔样品。
所述样品可以包含细胞。该细胞可以是本领域中技术人员已知的任何细胞。在本文中使用的术语“细胞”包括单独的细胞或者作为组织一部分的细胞。细胞可以存在于体液中。除了其它细胞，单独的细胞还包括上文提及的细胞(例如，上皮细胞、免疫细胞等)。
术语“细胞”还包括微生物整体或部分。该微生物通常是致病性的(即引起疾病)，但也可以是非致病性的。微生物的实例包括细菌、寄生虫、真菌、藻类等等。
所述细菌可以是本领域技术人员已知的任何细菌。细菌的一些实例包括疏螺旋体种、钩螺旋体种、分枝杆菌种等。
寄生虫是一种生物，在另一种生物体表或体内生长、进食并定居(sheltered)，同时常常对其宿主的存活具有有害作用。来自本领域技术人员已知的任何寄生虫的核酸均可以按照本发明的方法提取。寄生虫的一些实例包括血吸虫种、利什曼原虫种、毛滴虫种、合胞体种(例如疟疾)、弓形虫种、隐孢子虫种以及内阿米巴种等。
真菌是缺乏叶绿素和脉管组织的真核生物，存在形式通常从单细胞到整个枝状菌丝体不等。本领域技术人员已知的任何真菌均可根据本发明的方法而采用。真菌的一些实例包括霉菌和酵母(例如念珠菌种、酵母菌种等)。
藻类通常是水生真核光合生物。藻类可以为本领域技术人员已知的任何藻类。藻类的实例包括但不限于蓝细菌。
此外，所述样品还可包含病毒。来自本领域技术人员已知的任何病毒的核酸均可按照本发明的方法提取。这样的病毒包括DNA病毒和RNA病毒。
DNA病毒的实例包括痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、肝DNA病毒属(例如乙肝病毒)和细小病毒(例如B19细小病毒)。RNA病毒的实例包括微小RNA病毒(例如甲肝病毒)、卡利希病毒、批膜病毒、黄病毒属(例如丙肝病毒和西尼罗病毒)、冠状病毒、呼肠病毒、杆状病毒、纤丝病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒和逆转录病毒(例如人类免疫缺陷病毒)。
所述样品可以来自任何生物，或者如果该生物为合适的较小尺寸则样品可以是整个生物。合适的生物的实例包括微生物以及组织体液，后者来自于哺乳动物、鸟类、水生动物(例如鱼)或节肢动物(例如脾、蚊等)，以及真菌。微生物包括上面描述的那些。
所述哺乳动物可以是本领域技术人员已知的任何哺乳动物。哺乳动物包括例如人、狒狒以及其它灵长类、还包括宠物动物如狗和猫、实验动物例如大鼠和小鼠、以及农场动物如马、羊和牛。
在一个具体实施方式中，所述样品是怀疑污染了细胞和/或病毒的含水非生物样品。该样品可以获得自例如饮用水以及水体(例如湖、溪、河、海等)。从水样中的细胞或病毒提取核酸对于检测例如饮用水的污染物非常有用，如下文论及的。
本领域的技术人员将理解从不同类型的样品中提取核酸可能需要不同类型的样品制备方法，以制备可用于本发明方法中的样品。合适的制备技术的一些实例包括加入不同类型的缓冲***、溶液等。
另一种恰当的制备技术包括从样品中去除细胞。例如，为了制备血清样品，通常但非必须将细胞从样品中去除，例如从全血样品中去除。可以利用本领域技术人员已知的任何方法将细胞从样品中去除。例如，离心或过滤可用来制备无细胞样品。例如，通常通过离心去除细胞组分而从凝固的血液中获得血清。除了在血液中加入抗凝剂之外，通常以与血清类似的方式获得血浆。
在另一个具体实施方式中，可选的，该方法进一步包括浓缩样品中细胞或病毒的步骤。本领域技术人员已知的任何浓缩方法均可采用。恰当的浓缩方法包括但不限于应用聚乙二醇。
通常，用于本方法中的恰当浓缩部分依赖于样品的性质。浓缩方法可能例如依赖于样品中是否包含细胞、病毒还是二者都包含；依赖于细胞类型；等。
在第一个具体实施方式中，用聚乙二醇浓缩样品，包括含病毒样品。聚乙二醇的任何聚合物均可用于本发明的方法中。例如，聚乙二醇具有的最小分子量可以为约120，优选约5,000，较优选7,000。聚乙二醇的最大分子量可以为约10,000，优选约9,500，较优选约9,000。可以结合上述任何最小值和最大值，为聚乙二醇提供一个恰当的范围。优选的，聚乙二醇具有约8,000的分子量。
在第二个具体实施方式中，硫酸铵用来浓缩细胞或病毒。本发明的方法中所用的硫酸铵的恰当浓度可以为，例如，在约5％和约50％v/v之间。
在第三个具体实施方式中，离心和/或超速离心用来浓缩样品中的细胞或病毒。恰当的离心条件(例如时间、速度、温度等)可以由本领域的技术人员确定。典型的，离心用于浓缩细胞，而超速离心通常用于浓缩病毒。
本方法的第二步中，通过将含去垢剂的裂解液加入样品中而形成裂解物。该裂解液以足以裂解细胞或病毒的量加入。如在本文中使用的，“裂解”通常指细胞或病毒结构组分(例如病毒被膜和衣壳、细胞膜、凝固的蛋白等)的物理-化学性破坏。
在本发明方法中可用的裂解液包含能够溶解脂质的去垢剂。去垢剂包括但不限于十二烷基硫酸钠(即月桂基硫酸钠)、磷酸三正丁酯(tri-N-butylphosphate)、Brij-35、辛基β-葡萄糖苷、辛基β-葡糖硫吡喃苷等。
利用本领域技术人员已知的任何方法，使裂解液与样品接触。典型的，该裂解液与样品一起孵育足够的时间和温度以破坏细胞和/或病毒。通常，将裂解液(通过移液管)移入样品中。本领域的技术人员可以很容易确定恰当的孵育条件(例如时间、温度等)。通常在4℃和90℃之间的温度下，将样品与裂解液一起孵育至少1分钟或多分钟，需要或无需振荡。振荡的实例包括但不限于摇动、搅拌、震动、涡旋或任何其它类型的机械混合。
裂解液中去垢剂的浓度将依赖于多种因素，如去垢剂的强度、孵育条件等。例如去垢剂的浓度通常从约0.1％至约10％v/v不等。
在一个具体实施方式中，该裂解液进一步包括蛋白酶。典型的，蛋白酶用于消化蛋白。对于含细胞或病毒(其中核酸与蛋白相结合)的样品，蛋白酶在本发明方法中特别有用。这种病毒的一个实例是乙肝病毒。
任何本领域技术人员已知的蛋白酶均可采用。恰当的蛋白酶的实例包括蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。裂解液中蛋白酶的最小量通常约0.1mg/ml，优选约0.4mg/ml，较优选约0.7mg/ml。裂解液中蛋白酶的最大量通常约10mg/ml，优选约7mg/ml，较优选约5mg/ml。可以结合任何上述最小量和最大量，为蛋白酶提供一个范围。通常，裂解液包含约1mg/ml蛋白酶。
裂解物形成后，用于提取核酸的方法中下一步是将醇特别是水溶性醇加入裂解物中。本领域技术人员已知的任何醇均可按照本发明的方法而使用。醇的实例包括但不限于乙醇、异丙醇等。另一个有用醇的实例是甲醇。将醇加入裂解物中，通常引起核酸从溶液中聚集或沉淀。
加入裂解物中的醇的浓度和量，可以为足以聚集或沉淀核酸的任何浓度或量。这些浓度和量可以很容易由本领域的技术人员确定。
醇的实际量将根据本领域中熟知的多个因素而变动，例如所利用的特定醇、待加入醇的浓度、裂解物溶液的体积以及待裂解样品的类型和制备方法。加入裂解物中的醇可以为100％醇，或者醇与水的溶液，如50％、70％或95％的醇溶液。例如，对于100％醇，所加入醇的量为裂解物溶液体积的约1/10至约2倍，最适为裂解物溶液体积的约一半。
用于提取核酸的方法中最后一步包括从裂解物-醇混合物中纯化核酸。通过玻璃纤维滤器过滤混合物而将核酸从该裂解物-醇混合物的非核酸部分分离而纯化核酸。这些滤器是用硼硅玻璃制造的微型纤维滤器。该玻璃纤维滤器提供高流速和高结合能力。恰当的玻璃纤维滤器包括例如可从Whatman，Clifton，NJ购得的GF/F型。
玻璃纤维滤器的最小孔径大小为约0.4μm，优选约0.6μm。最大孔径大小为约1.2μm，优选约1.0μm，较优选约0.8μm。可以结合上述任何最小值和最大值，为滤器孔径大小提供一个恰当的范围。优选的，孔径大小为约0.7μm。
容许该裂解物-醇混合物通过滤器。通过应用压力可促进裂解物-醇混合物的流动。例如，在滤器下方提供负压的设备或者在滤器上方提供正压的设备，可以用来提供必要的压力辅助醇溶液通过滤器。
该过滤步骤可以例如利用安装于多头抽真空装置中的多孔过滤板。该过滤板利用本发明方法中的玻璃纤维滤器作为其过滤构件。适于应用的过滤板可以购得。例如，GF/F型96孔玻璃纤维过滤板可从Whatman，Clifton，NJ购得。包含多于或少于96孔的板也合适，而且可以依据使用者的需要而制备并使用。
经设计用来容纳多孔过滤板的多头抽真空装置可以购得，且常规用来处理多个样品。例如，可以采用Millipore提供的多头抽真空装置。放置该多孔过滤板使其“坐”于多头装置的板支架上，其边缘围以密封垫圈。
采用多孔板例如96或386孔板，可同时处理多个样品。当这种板固定于多头抽真空装置时，样品可同时流过所有的孔，从而可同时处理多个样品。因此，本发明的方法适合于利用实验室机器人技术(robotics)的自动化操作。
例如，可以利用自动液体处理***结合真空单元吸引样品同时通过每个孔而处理样品。当例如需要迅速处理多个样品的筛查时，如血液筛查或遗传筛查，则核酸提取自动化的能力是一个有价值的优势。
可用来辅助裂解物-醇混合物流过或通过玻璃纤维滤器的其它压力包括采用来自过滤板顶部的正压、离心或重力。多孔板可以与特别设计的离心***一起使用(利用板转子)以同时处理多个样品。
通过玻璃纤维滤器过滤混合物而将核酸从该裂解物-醇混合物纯化后，可选的，将结合于玻璃纤维滤器的核酸用洗涤缓冲液进行洗涤。可采用加压设备辅助该洗涤缓冲液流过或通过玻璃纤维滤器。可替代的，真空、离心或重力可用来辅助该洗涤缓冲液流过或通过滤器。
洗涤缓冲液可以是本领域技术人员已知的任何核酸洗涤缓冲液。优选的洗涤缓冲液是包含约10％至约100％乙醇的溶液，最适约50％至约70％乙醇。该洗涤缓冲液进一步包括约10mM至约1000mM NaCl、10mM Tris-HCL和2mM EDTA，最适为100mMEDTA。本领域技术人员已知的其它盐类、缓冲液、鳌合剂以及醇也是合适的。洗涤缓冲液通常通过结合的核酸至少一次，通常为两次或多次。结合核酸的洗涤次数依赖于多个因素例如裂解物-醇混合物的组成和体积。
可选的，可将含有该结合核酸的玻璃纤维滤器干燥。可通过本领域技术人员已知的任何方法干燥玻璃纤维滤器。例如可通过在某温度(通常低于90℃)下加热而干燥滤器，通常需1分钟或多分钟。选择的干燥条件应不至于破坏核酸或使其变性。其它用于干燥滤器的方法包括但不限于空气干燥、采用干燥器等。
干燥后，可通过使恰当的洗脱液通过滤器而将核酸从滤器上洗脱下来。该洗脱液优选具有较低的离子强度。因此，洗脱液中盐和其它离子化合物的浓度保持在最小值。这种洗脱液的一个实例是无核酸酶的水，可选的包含约0.01％至2.00％的Tween 20，最适为约0.02％至约0.1％的Tween 20。
核酸可以洗脱入多孔收集板中，而收集板置于多孔过滤板(上文已阐述)下方并固定于真空或加压多头装置，在这样一个位置，以便可收集通过滤器的流体样品。多孔收集板可以购得，例如由Becton Dickinsonand Company(Franklin Lakes，N.J.)出售的名称为Microtest.RTM的96孔板。可替代的，可采用组织培养板。
所述收集板具有的孔通常与多孔过滤板的孔相匹配，且其安装在在过滤板的下方，处于可以收集通过玻璃纤维滤器的核酸的位置。这些板，过滤板和收集板，均以联锁叠加(interlockingsuperposition)的方式安装在在多头抽真空装置内。
收集板很容易购得。然而，正如上述论及的96孔过滤板，收集板也可依据使用者的需要适合具有较多或较少孔或者较大或较小体积。
提取的核酸可以在例如下面描述的方法中使用。
本申请的发明人意外的发现上述提取方法能高效分离DNA和RNA。其它标准测定法通常需要一种方法高效分离DNA，另一种独立的方法高效分离RNA。
鉴定样品中的病原体
在一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定样品中病原体的方法。该方法中第一步是从样品中的细胞或病毒提取核酸。该核酸可以按照上述提取方法提取。
一旦核酸从样品中提取出来，该鉴定病原体的方法中下一步就是分析该核酸。核酸可以通过本领域熟练技术人员已知的任何方法进行分析。
核酸通常用于核酸扩增和/或其它标准分析技术。利用例如PCR或RT-PCR方法的核酸扩增***为本领域的熟练技术人员已知。核酸扩增技术的综述以及将这些技术应用于病原体诊断的阐述，参见例                                                      如Dieffenbach et al.，PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1995)and Clewley，The Polymerase Chain Reaction(PCR)for Human Viral Diagnosis，CRC Press，Boca Raton，FLa.，Chapter 5(1995).
利用PCR方法的核酸扩增***已经自动化。如上文论及的，声明的发明中用于核酸提取的方法也可以自动化。核酸提取和纯化的自动化结合核酸扩增技术的自动化，使得这些方法可以用来在短时间内筛查大量样品如血液的病原体(例如病毒、细菌、真菌或寄生虫等)，这些病原体可能存在于样品中，即使是以极低的水平。
核酸扩增产物(扩增子)以及因此核酸从其起源的病原体的身份可以例如通过杂交技术而确定。通常，杂交技术采用寡核苷酸探针，其互补于已知核酸序列且与其独特杂交。该寡核苷酸探针可以是RNA或DNA分子。
可以采用任何用于分析寡核苷酸探针与核酸杂交的方法。例如，Southern杂交技术(Southern blotting)是这种技术的一个特别熟知的实例。该Southern blot技术涉及到用限制性核酸内切酶切割核酸扩增子、通过凝胶电泳分离切割的片段、用特异的寡核苷酸探针探测以及检测杂交的存在情况。其它相关方法为本领域中的技术人员已知，参见Sambrook et a1.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor(1989).
寡核苷酸探针的长度并不关键，只要其能够杂交于靶分子即可。该寡核苷酸应该包含至少6个核苷酸。不存在寡核苷酸探针长度的上限，然而，较长探针制备比较困难，而且需要较长的杂交时间。因此，探针不应长于必要的长度。一般，寡核苷酸探针应包含不多于50个的核苷酸，优选不多于40个核苷酸，较优选不多于30个核苷酸。
这种探针可以按照本领域已知的方法可检测性的进行标记，例如放射标记、酶、生色基团、荧光基团等。检测到标记物则表明寡核苷酸探针与核酸杂交。因此，检测到标记物则表明样品含有该寡核苷酸特异的特殊病原体，从而鉴定样品中的病原体。
可替代的，不能检测到特异于特殊病原体的特定寡核苷酸表明该样品中不包含可检测量的寡核苷酸特异的特殊病原体核酸。
分析核酸的另一个途径是采用常规或通用的分子信标。这种方法例如由Tyagi和Kramer(Nature Biotechnology 14，303-308，1996)描述过，Andrus和Nichols也在美国专利申请公开No.20040053284中描述过，其被转让给纽约血液中心(New York Blood Center，NewYork，N.Y)。
简要的说，分子信标是单链的寡核苷酸杂交探针，形成茎和环结构。所述环具有互补于靶序列的探针序列。所述茎则通过探针序列两侧每一侧上互补的臂序列退火形成。典型的，荧光基团共价连接于一个臂的末端，而淬灭剂共价连接于另一个臂的末端。当游离存在于溶液中时，由于茎-环结构以及荧光基团的淬灭，分子信标不发出荧光。然而，当分子信标杂交于包含靶序列的核酸时，发生构象改变使其发出荧光。
分子信标探针可用任何适于核酸(例如PCR扩增产物)检测的方式进行变更。变更的探针包括例如在第6,037,130号美国专利中描述的“波长移位”分子信标探针。特别的，这些变更的探针具有基础的分子信标探针结构，即一个环；两个茎；位于一个末端上的淬灭剂以及一个位于另一个末端上与淬灭剂相对的报告基团，通常是荧光基团。该报告基团称为“采集报告基团”。探针的变更即该探针包括经过该“采集报告基团”的几个核苷酸延伸。该延伸终止于另一个连接于“发射报告基团”的核苷酸，通常是另一个荧光基团。在存在靶核酸分子时，淬灭剂从报告基团上分离。在这种开放构象下，“采集报告基团”吸收来自刺激源的能量，但将显著部分的能量(在某些结构下为绝大部分能量)转移至“发射报告基团”，其接收转移来的能量并发出其较长的特征性波长。
分子信标通常对探针与靶序列之间的小量核苷酸错配敏感(Tyagi et al.，1998，Nat.Biotechnol.，16：49-53).可以变更分子信标技术，使其可用于检测例如甚至高度变异的病毒种。例如，Andrus和Nichols的序列号10/399,843的美国专利申请(美国专利申请公开案No.20040053284，其被转让给纽约血液中心(New York BloodCenter，New York，N.Y)描述了正向和反向引物的应用，所述引物在靶序列上“面对面”排列(即两个引物的杂交位点之间不存在***性空隙)。分子信标探针设计为跨越两个引物的结合处而不对称的杂交。存在核苷酸错配的情况下，PCR引物能够杂交于靶序列并启动扩增。由于引物的“面对面”构象，扩增的PCR产物与分子信标探针有一定的核苷酸序列同一性。
因此，例如可以开发通用信标RT-PCR测定法检测高度变异株，包括例如hiv-1的全部重要基因型如O群以及HCV的全部亚型。用于检测高度变异病毒的恰当通用信标RT-PCR测定法实例在序列号10/399,843的美国专利申请(美国专利申请公开No.20040053284)中有所描述。
在一个优选的具体实施方式中，采用多重PCR。在该测定法中，PCR混合物包含针对多种病原体核酸的引物和探针。通常在该分析中使用单一荧光基团。因此，检测到阳性信号表明存在病原体中的任何一个。
通过例如对待检测病原体中每一个进行单独的PCR反应或者通过标记扩增子并使扩增子杂交于不同的包埋靶点，可以确定所检测到的特定病原体的身份。所述靶点可以包埋于例如硝化纤维膜、DNA芯片、微珠等。
还可以采用其它基于PCR的方法分析核酸来鉴定样品中的病原体。这些方法的实例包括凝胶分析、
Figure A20068000295300211
等。
鉴定含水(水溶性)非生物样品中的污染物
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于鉴定怀疑包含或已知包含细胞、病毒、或既包含细胞有包含病毒的含水(水溶性)非生物(即：水)样品中的污染物。从而可检测水(例如饮用水、湖等)中的生物污染物以确保饮用或娱乐(例如游泳)用水的安全性。所述生物污染物可以包括细胞或病毒。水中生物污染物的实例包括细菌(例如大肠埃希杆菌、粪便大肠菌等)、藻类(例如蓝-绿藻、蓝细菌等)、真菌(瓶霉菌属sp、外瓶霉属sp以及支顶孢属sp.)、寄生虫(例如隐孢子虫属、利什曼原虫、肠兰伯鞭毛虫、阿米巴、鞭毛虫等)以及病毒。
该方法中的第一步是从样品中的细胞或病毒提取核酸。核酸按照上述提取方法进行提取。
为了鉴定污染物，可以利用例如本领域熟练技术人员已知的基于PCR的方法来分析核酸。恰当的分析方法包括上文描述的那些方法。
鉴定遗传疾病
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法。该方法中的第一步是从样品中的细胞提取核酸。核酸按照上述提取方法进行提取。优选的，细胞来自于哺乳动物，通常是人。
为了鉴定遗传疾病，可以利用例如本领域熟练技术人员已知的基于PCR的方法来分析核酸。恰当的分析方法包括上文描述的方法。
可以按照本发明的方法鉴定任何遗传疾病。遗传疾病的实例包括但不限于血友病、链状细胞性贫血、唐氏综合征、癌症、癌症易感性(例如测定BRCA1基因)、家族黑蒙性痴呆(tay-sachs)、囊性纤维病、脑性麻痹、马凡综合症等。
试剂盒
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中提取核酸的试剂盒。该试剂盒包括裂解液以及玻璃纤维滤器。所述裂解液包含去垢剂。可选的，该试剂盒含有下列物质中的一种或多种：醇、蛋白酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液以及容器(例如试管、多孔板等)。
所述裂解液、去垢剂、玻璃纤维滤器、醇、蛋白酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液以及容器上文已经加以阐述。
实施例
实施例1：材料
从纽约国家***(the New York State Department of Health)获得西尼罗病毒，并在Vero细胞中培养。通过常规噬菌斑测定法来确定传染性病毒颗粒的数量(Beaty et al，Arboviruses，p.797-856.In N.J.Schmidt，and R.W.Emmons(ed.)，Diagnostic procedures for viral，rickettsial and chalmydial infections.American Public Health Association，Washington.D.C.1989)。通过定量RT-PCR确定病毒基因组当量的数值，利用WNV RNA定量仪QWN702(BBI Diagnostics，WestBridgewater，MA)作为定量标准。
纽约血液中心提供HBV感染的血浆以及来自慢性HCV感染献血者的血浆。HIV储存物(原种，原液)是来自HIV感染的人周围血淋巴细胞培养物的无细胞上清液。
正常人血浆，预先测定其血源性病原体，用于阳性或加标(spiked)样品的系列稀释。
实施例2：血浆中多种病毒基因组的提取
将等分HBV、HCV、HIV和WNV样品以不同体积移入96孔的2.2ml储存板(ABgene，Surrey，KT，UK)中。用于直接提取的血浆体积从150至450μl不等。
加入优化量的蛋白酶K(Qiagen，Chatsworth，CA)以及AL裂解缓冲液(Qiagen，Chatsworth，CA)并简单混合。除了其它成分之外，AL裂解缓冲液还包含去垢剂以及胍盐。将储存板在振荡水浴中58℃孵育25分钟后，将预定量的无水乙醇(表1)与裂解物轻柔混合。将上述制备物转移入0.7μm玻璃纤维滤器板(GF/F，Whatman，Clifton，NJ)中，并在-450mmHg真空中过滤。依据该裂解制备物的总体积，转移在1至3个移液步骤中完成。随后，将负载的过滤板在同一真空装置中用AW2洗涤缓冲液(Qiagen，Chatsworth，CA)进行洗涤。洗涤液体积以及洗涤重复(次数)依赖于初始样品体积(表1)。洗涤后，给予过滤板-350mmHg真空达10分钟，去除残留的洗涤液。随后，无真空时，将板在室温放置10分钟，以实现最后的空气干燥。通过65-100μl含0.05％吐温20的无核酸酶水的-350mmHg真空过滤，将纯化的核酸洗脱入U形底的96孔板或PCR板中。
表1：用GF/F法提取不同体积血浆的条件
流程 I II III
  血浆   150μl   300μl   450μl
  蛋白酶K   20μl   40μl   60μl
  AL裂解缓冲液   200μl   400μl   600μl
混合，58℃孵育25分钟
  乙醇   200μl   400μl   600μl
  裂解物总体积   570μl   1140μl   1710μl
混合，转移入GF/F过滤板
在450mmHg真空过滤
  洗涤体积   600μl   1200μl   1600μl
在450mmHg真空过滤
  洗涤步骤   1   3   3
将过滤板在350mmHg真空干燥10分钟
无真空装置时将过滤板空气干燥10分钟
 洗脱  65-100μl  65-100μl   65-100μl
在350mmHg过滤1分钟之前，接触1分钟的时间
移液和过滤可以人工操作或者利用Genesis RSP150以及Genesis Workstation 200(Tecan.Maennedorf，Switzerland)自动化操作。
核酸扩增和检测可以遵循Lee等人所描述的in-housePCR反应和循环条件而实现(Stabilized viral nucleicacids in plasma as an alternative shipping method for NAT.Transfusion 42，409-413，2002).
采用分子信标技术(Tyagi and Kramer，Molecular beacons：probesthat fluoresce upon hybridization.Nature Biotechnology 14，303-308，1996)检测PCR扩增子并加以定量。引物和分子信标经设计适用于检测所有HCV、HIV和WNV的常见株。引物的靶点位于HCV和西尼罗病毒(WNV)的5’-UTR非翻译区、HIV的gag-和pol-基因以及编码HBV表面抗原的基因上。
每个热循环过程中，均在退火步骤监测光发射。序列检测v1.6.3软件程序(PE-Biosystems，Foster City，CA)通过分析由于PCR过程中模板扩增引起的循环至循环之间荧光信号的变化，并通过比较未知曲线与从系列稀释的已知合成RNA或者质粒DNA标准样品生成的曲线，确定靶模板的拷贝数。将所有的标准用EUROHEP仪(CLB，Netherlands)校准，用于确定拷贝数。
利用AL裂解缓冲液结合蛋白酶K，可以实现病毒RNA和DNA从保护性衣壳和被膜释放。评估AL裂解缓冲液中的RNA稳定性并发现可以与硫氰酸胍相比较(数据未示出)。通过真空滤过玻璃纤维膜可实现核酸捕获、洗涤和洗脱。结果在表2中示出。
表2利用GF/F流程和Qiagen试剂盒所确定的血浆病毒负荷的比较
1人正常血浆中阳性样品的稀释度。每种病毒均选择10倍系列稀释，以覆盖103和108拷贝/ml的范围。
2利用蛋白酶K/AL缓冲液裂解并通过Whatman96孔玻璃纤维过滤板过滤，提取150μl血浆(n＝8)。
3利用QiaAmp RNA试剂盒提取140μl HCV和HIV血浆。200μl HBV血浆用于QiaAmp RNA试剂盒(n＝8)。
4基因组数量通过定量实时PCR确定，并以log10拷贝数/ml表示。
5GF/F结果除以用Qiagen提取试剂盒得到的结果，以确定玻璃纤维法相比参照方法的相对提取效率。
实施例3：核酸提取的再现性
对这些定量检测结果的可重复性，包括分析内和分析间变化，进行评估。以HCV为例，表3示出了对GF/F和Qiagen提取后得到的PCR结果计算的变化系数。两种方法的分析内变化类似，然而，Qiagen法的分析间PCR结果则不一致得多。人工以及自动化提取后回收的核酸，证明是一致而可信的。
表3：GF/F提取和Qiagen提取后得到的HCV PCR结果确定的分析内和分析间变化。
Figure A20068000295300261
(1)每个变化系数均对每一组共8个值进行计算。试验由4个不同技术员利用等分的相同HCV感染血浆(在正常人血浆中1/100稀释)在不同时间完成。
实施例4：PEG对核酸回收的作用
将等分的WNV样品移入96孔的2.2ml储存板(ABgcne，Surrey，KT，UK)中，并与不同量的37％PEG 8000储存液混合。每次提取的血浆-PEG制备物总体积均为2.0ml。混合PEG与样品后，留出10-30分钟的室温接触时间，然后1500g旋转(离心)3分钟，弃去1.8ml上清而保留可见沉淀(包括一些残余液体)，从而将体积减至200μl(10X体积减少)。
加入40μl蛋白酶K(Qiagen，Chatsworth，CA)以及270μ1AL裂解缓冲液(Qiagen，Chatsworth，CA)，并混合。随后将板在水浴中孵育，58℃热消化25分钟。其后将270μl无水乙醇与该裂解物轻柔混合。将总体积780μl的提取制备物转入0.7μm玻璃纤维过滤板(glass-fiber-filter plate)中(GF/F，Whatman，Clifton，NJ)，在-450mmHg过滤。该负载的过滤板用600μl AW2洗涤缓冲液(Qiagen，Chatsworth，CA)在同一真空装置中洗涤一次。洗涤后，给予过滤板-350mmHg真空达10分钟，去除残留的洗涤液。随后，无真空时将板在室温保存10分钟，以实现最后的空气干燥。通过-350mmHg真空过滤100μl含0.05％Tween20的无核酸酶水，将纯化的核酸洗脱入U形底的96孔板中。可替代的，通过75μl含Tween-水直接滤入MicroAmp光学96孔反应板(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)中而完成洗脱。
移液和过滤可以人工操作或者利用Genesis RSP 150以及Genesis Workstation 200(Tecan，Research Triangle Park，NC)自动化操作而完成。
为了达到最大灵敏度，分别利用100μl洗脱物中的50μl或者75μl洗脱物的全部体积，进行“高体积”PCR反应。为了合成cDNA，我们加入30μl逆转录(RT)混合物(表4)。反应在42℃运行45分钟，随后是95℃2分钟。其后，加入40μl PCRmaster-mix(表3)。Taq聚合酶在95℃激活10分钟，靶cDNA在45个循环中扩增，每个循环包括三个升温(热)步骤(95℃，58℃和72℃)，每步各30秒。RT混合物以及PCR master-mix特别针对120μl的总反应体积而优化。
表4：大体积扩增的RT混合物以及PCR混合物
每个反应30μl RT混合物
  试剂   供应商   浓度   μl/样品
  M-MLV RT缓冲液DTTPCR核苷酸混合物反向引物Rnase抑制剂M-MLV逆转录酶无核酸酶的水   In vitrogenGibcoAmershamBiosclencesPromegaInvitrogenPromega   5×100mM10mM100μM4U/μl200U/μl1×   16.04.02.01.00.40.46.2
每个反应40μl PCR混合物
  试剂   供应商   浓度   μl/样品
  MgCl2正向引物分子信标TaqGold无核酸酶的水   PE AppliedBiosystemsGeneLinkPE AppliedB iosystemsPromega   25mM100μM200ng/μl5U/μl1×   3.00.11.00.535.4
采用分子信标技术(Tiyagi and Kramer，Molecular beacons：probesthat fluoresce upon hybridization，Nature Biotechnology 1996，14，303-308)来展示PCR扩增子。引物的靶点位于5’UTR区。反向引物(5’-gct ctt gcc ggg ccc tcc tg-3’)、正向引物(5’-gca cga aga tct cga tgt cta aga aac-3’)和分子信标(5’-FAM cgcacg atc tcgatg tct aag aaa cc cgtgcg DABCYL-3’)经设计适用于检测WNV的所有常见株。
ABI Prism 7700以及7900序列检测***仪器(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)用于扩增和检测。扩增产物可通过实时定量PCR或者通过PCR后定量分析而确定。对于实时PCR，序列检测v1.6.3软件程序(PE-Biosystems，Foster City，CA)通过分析由于PCR过程中模板扩增引起的循环至循环之间荧光信号的变化可确定靶模板的拷贝数。PCR后分析测定扩增前后发射的相对光单元。PCR后定量分析的截断值从阴性对照的平均信号加3个标准偏差计算得来。
将不同量的PEG8000加入血浆中以浓缩病毒或者病毒组分。对于PEG-血浆沉淀的沉积，我们选择的条件产生形状疏松、大小恒定的沉淀，其可以在裂解缓冲液中重悬。沉淀成团后，我们将体积减至200μl并处理样品。AL裂解缓冲液/蛋白酶K、乙醇沉淀、过滤、洗涤和洗脱均针对从PEG-血浆沉淀物中提取核酸而改造并优化。
分别用100μl或75μl Tween-水进行洗脱，以使纯化的RNA产量最大化。将50μl提取的核酸用于PCR反应中。
发现PEG8000是一种有效的浓缩方法，可促进人血浆样品中WNV的检测。图1表明，用3％PEG 8000浓缩的样品中确定最高量的病毒RNA。
利用优化的条件，当浓缩样品并将样品体积减至初始PEG-血浆体积的1/10时，确定可检测的RNA分子呈10倍增加(图2)。当应用于HBV阳性样品时，PEG对HBV DNA产生相似的浓缩效果。
实施例5：检测限值
为了评估检测的低限，进行血浆样品的终点滴定，该血浆样品已用培养的WNV加以刺激。之前已分别通过相对于BBI仪用定量PCR以及噬菌斑测定法确定了WNV制备物中RNA分子和传染性病毒颗粒的量。发现我们的储存病毒制备物的病毒基因组数量高于噬菌斑形成的病毒颗粒数量的740-1500倍。
为了确定WNV分析的灵敏度，对BBI储存物(Uganda，7.33×104拷贝/ml，Lot#101702C)加以稀释并检测。该BBI储存物在阴性血浆中以12.5，6.3，3.2，1.6和0.8拷贝/ml稀释。对每个稀释度的80个复制品进行检测，并用概率分析来分析，以确定95％和50％的检测限值(LOD)。
典型结果示于下面的表5、6、7和8中。
表5：FAM(WNV)
Figure A20068000295300311
孔1A-H：内对照(IC)阴性。
WNV临界值：孔2A-2D(阴性血浆)的平均值+5SD＝1197。
孔E2：WNV阳性对照，在～300拷贝/ml(估计值)。
孔F2：WNV阳性对照，在～60拷贝/ml(估计值)。
阳性WNV结果以粗体示出。
表6：利用5个WNV稀释度的灵敏度数据总结
Figure A20068000295300312
*稀释物来自于BBI原液
(Uganda，7.33×104拷贝/ml，Lot#101702C)
表7：单个概率分析(SPSS 11.5)以及这些试验的变化系数示于下面：
  LOD％检测 Expt1 Expt2 Expt3 Expt4 Expt5 均值 SD CV
  95％   3.09*   3.36   4.07   4.06   4.18   3.75   0.49   0.13
  50％   1.92   2.13   2.33   2.08   2.64   2.22   0.28   0.12
*WNV拷贝数/ml
LOD＝检测限值
表8：从不同天在5个板上检测的每个稀释度的80个复制品计算的总体概率分析(SPSS 11.5)。
  LOD％检测 拷贝数/mL
  95％   3.79
  50％   2.22
实施例6：西尼罗病毒的特定描述
用于WNV检测的通用信标RT-PCR.引物和探针针对跨越WNV基因组中5’-非翻译区和核衣壳起始位点且长47个核苷酸的区域。用于引物设计和核苷酸编号的参照序列是Lanciotti et al报道的纽约1999-马分离株(Science 286：2333-2337，1999；Genbank AF196835)。该47个核苷酸的靶区域在所有种系1分离株(存在其Genebank序列信息)内为＞97％保守，且与WNVUganda1937(Genbank M12294)有94％的同一性。引物和探针序列如下：正向引物：5’-GCACGAAGATCTCGATGTCTAAGAAAC-3’(27mer，位置83-109；44％G/C；Tm77℃)，反向引物：5’-GCTCTTGCCGGGCCCTCCTG-3’(20mer，位置110-129；75％G/C；Tm 84℃)，分子信标探针：5’6-FAM-cgcacgATCTCGATGTCTAAGAAACCcgtgcg-DAB CYL-3’(WNV探针区域为大写字母，茎核苷酸为小写字母)。
用于1型登革热病毒内对照RNA的RT-PCR.经设计，引物扩增一个67bp区域(1型登革热RNA(参照序列Genbank AF513110)3’非编码区的10632-10698位核苷酸)。VIC标记的Taqman探针用于对照RNA PCR产物的检测，以高效区分ABI PRISM7900 HT中的IC和WNV荧光信号。引物和探针序列如下：正向引物：5’-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3’(20mer，位置10632-10652；％G/C；Tm73℃)和反向引物：5’-GCGTTCTGTGCCT-3’(13mer，位置10686-10698；52％G/C；Tm51℃)。Taqman探针5’-VIC-AGATCCTGCTGTCTCTACA-MGB-3’(19mer，位置10657-10675；47％G/C；Tm59℃)。
样品来源.对冷冻的血浆样品加以检测。该样品为来自于献血者且收集于CPDA-1抗凝剂中的全血。将其离心，然后在96孔深孔板中储存于-80℃。使用前，将储存的血浆样品4℃解冻40-48小时。研究人员发现该步骤能保留全部WNV RNA。
样品制备.在两种液体处理***(Tecan，Genesis RSP 150和Genesis Workstation 200)上进行样品提取。将400μl血浆样品从存档板自动转移一个新的96孔深孔孔板中。将4个WNV阴性对照、1个WNV阳性对照和3个内对照(IC)阴性样品自动置于该深孔板中。使用前，将内对照靶RNA与裂解缓冲液混合。提取过程中，使其以与WNV样品相同的方式经过整个处理过程。将蛋白酶K和AL裂解缓冲液与血浆样品在Genesis RSP 150上混合。
将混合物在振荡水浴中于58℃孵育。孵育后，在Genesis Workstation 200上将ETOH加入裂解物中。随后将混合物转移入96孔玻璃纤维过板中，并真空过滤使核酸结合。将滤器通过过滤连续洗涤两次，然后真空干燥以及空气干燥该滤器。WNV RNA通过用无核酸酶的水过滤进行洗脱。洗脱液直接收集入含有逆转录(RT)混合物的PCR板的相应孔中。
扩增：逆转录(RT)和PCR.将上面得到的含有RT Master Mix和洗脱样品的PCR板在Applied Biosystems Model 2700热循环仪上孵育，用于逆转录。在RT步结束时，将逆转录酶加热灭活并向每个孔中加入PCR混合物。首先加热PCR反应混合物以激活AmpliTaq gold，然后进行45轮PCR循环。
检测：荧光读数和计算.在45个PCR循环结束时，荧光光谱热循环仪(ABI PRISM 7900HT，PE-Biosystems，Foster City，CA)用于进行终点检测。WNV信号用FAM标记的探针进行检测，在522nm读数，而VIC标记的IC信号在554nm读数。如果阳性和阴性对照值落在预定的范围内，则认为运行有效。如果阳性和阴性样品在可接受范围内，则运行有效。如果内对照(VIC)RFU值超过了IC截断值，则认为单个样品的结果有效。IC截断值从IC阴性对照的平均相对荧光单位(RFU)加3SD(n＝3)计算得来。WNV反应截断值从WNV阴性对照的平均RFU加5SD(n＝4)计算得来。样品具有的RFU低于IC截断值，则将认为IC失败除非WNV PCR阳性。阳性样品是RFU大于或等于WNV截断值的样品，无论IC RFU为何值。
阳性对照试剂.WNV阳性对照WNV组织培养上清通过60℃加热1小时而灭活，在阴性人血浆中稀释(1000倍)并通过RT-PCR利用一组含有已知量WNV RNA的样品进行定量。将阳性样品调为含60个RNA拷贝/ml、迅速冷冻并将单次使用的等份保存于-80℃或更低温度。到使用那天，通过在37℃水浴中振动解冻。
内对照试剂.登革热(夏威夷株)培养上清通过60℃加热1小时而灭活、在PBS、10％阴性人血浆中稀释为107pfu/mL并分装成80μl的量，其足以用作单板或多板的内对照。将等份迅速冷冻并保存于-80℃或更低温度。到使用那天，通过在37℃水浴中振动解冻。
方法总结.通过用AL裂解缓冲液/蛋白酶K裂解液裂解病毒颗粒，对400μl血浆进行该分析。登革热病毒用作PCR内对照。裂解物随后在真空下吸收入玻璃纤维板上，在洗脱核酸用于逆转录和PCR之前，将该板洗涤并干燥。所有的移液步骤均在Tecan Genesis RFP 150和200 workstations上进行。PCR反应在ABI Model 2700热循环仪上进行。扩增的核酸在ABI 7900荧光读数仪上进行检测。除了内对照，检测对照还包括阴性对照以及含已知拷贝数RNA的WNV RNA阳性对照。利用终点计算确定WNV RNA的阳性，其中将检测样品中的荧光与阴性对照的荧光进行比较。
样品来源和制备.来自于-80℃冷冻的CPDA-1抗凝血的血浆是用于本特定研究的源材料。使用前，将样品在4℃解冻40-48小时并储存于4℃。
阳性、阴性以及内对照.对于筛查性分析，采用1个阳性对照孔，其含有相当于300WNV RNA/ml的热灭活WNV病毒。4个孔含有WNV阴性对照血浆，3个另外的孔设为IC阴性对照血浆，其将用缺乏登革热内对照靶RNA的裂解缓冲液处理。WNV的阳性截断值计算为4个WNV阴性对照的平均值+5SD。登革热内对照的阳性截断值计算为缺乏登革热病毒的3个IC阴性对照的平均值+3SD。
病毒颗粒的裂解.包含于血浆样品中的病毒颗粒通过加入蛋白酶K和AL裂解缓冲液而裂解，在58℃水浴中孵育25分钟的过程中，释放的核酸受到裂解缓冲液的保护。在即将使用前，将登革热病毒内对照加入裂解缓冲液中，作为该方法所有步骤的内对照。
WNV RNA的分离.将无水乙醇加入裂解物中，并将样品自动转入玻璃纤维过滤板中，在真空下过滤。然后用洗涤液洗涤该滤器，除去蛋白以及可能的PCR抑制剂，干燥并用无核酸酶的水直接洗脱入96孔PCR反应板中。
逆转录.将全部核酸洗脱液用于逆转录和PCR扩增。逆转录混合物包含5X第一条链缓冲液、DTT、dNTPs、RNase抑制剂、WNV反向引物(WNV R)引物、登革热反向(DR)引物以及M-MLV逆转录酶，该混合物与提取洗脱液混合，在42℃孵育45分钟，随后是95℃2分钟。
PCR扩增PCR混合物包含WNV正向(WNV F)引物、登革热反向(DF)引物和VIC标记的登革热内对照探针(DP)、MgCl2、PCR缓冲液以及Taq聚合酶(AmpliTaq gold)，将该混合物加入RT孔中。在ABI 2700热循环仪上，首先在95℃加热PCR反应混合物10分钟以激活AmpliTaq gold，然后在95℃、58℃和72℃进行45个PCR循环。
PCR产物的检测.由于对靶序列进行了简化，PCR产物结合FAM标记的WNV信标探针的环结构，从而在FAM(报告基团)与DABCYL(淬灭基团)远离之前防止其茎被杂交。该FAM在490nm脱离，在522nm读数。正如登革热内对照，VIC标记的探针在其中一个引物的下游退火，当引物延伸时VIC分子被Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性切割。靶序列扩增过程中，VIC信号随着探针释放出切割的VIC报告基团而增加。VIC在490nm脱离，在522nm读数。
实施例7：储存于4℃时血浆中WNV的稳定性
迅速冻/融之前，将系列稀释的WNV样品(1000，50，250，125，62.5GE/ml)于4℃储存0、7和14天。样品体积为每种提取物350μl，每个样品有5份重复样品。对每个样品的四份重复样品进行重复检测。利用玻璃纤维过滤板在Tecan Robotics上进行RNA提取；对WNV RNA进行终点RT-PCR。
RT-PCR的结果示于图3中，对数据的统计分析则展示于表6中。在4℃储存7到14天的样品表现出的WNV荧光信号的水平与4℃储存0天的对照样品的WNV荧光信号的水平相当(表9)。因此，储存于4℃时，WNV RNA在正常人血浆中可稳定至少14天。
表9图3中所展示数据的统计分析
天(4℃)   WNV检测平均值＊Log10 RFU t-检验＊＊
  0   1.92±0.38
  7   1.76±0.31   P＝0.06
  14   1.87±0.36   P＝0.34
*来自所有稀释物的数据回归计算为1000GE/mL(参见图3)
**通过斯氏T检验针对0天对照分析数据。

Claims (19)

1. 一种用于从样品中提取核酸的方法，包括：
a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；
b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；
c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；
以及
d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化所述核酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括浓缩所述样品中的细胞或病毒。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中用聚乙二醇浓缩所述细胞或病毒。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是含水样品。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含病毒。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是微生物。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解液进一步包括蛋白酶。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述去垢剂是十二烷基硫酸钠。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述去垢剂是磷酸三正丁酯。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来自哺乳动物。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来自鸟类。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来自节肢动物。
16. 一种用于鉴定样品中病原体的方法，所述方法包括：
a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的样品；
b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；
c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；
d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化所述核酸；以及
e)分析所述核酸，以鉴定所述病原体。
17. 一种用于鉴定水样中生物污染物的方法，所述方法包括：
a)获得包含细胞、病毒、或者既包含细胞又包含病毒的水样；
b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；
c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；
d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化所述核酸；以及
e)分析所述核酸，以鉴定所述污染物。
18. 一种用于鉴定哺乳动物中遗传疾病的方法，所述方法包括：
a)获得包含细胞的生物样品；
b)将含去垢剂的裂解液加入所述样品中，从而裂解所述细胞或病毒并形成裂解物；
c)向所述裂解物中加入一定量足以聚集或沉淀核酸的醇；
d)通过玻璃纤维滤器过滤混合物而从裂解物-醇混合物中纯化所述核酸；以及
e)分析所述核酸，以鉴定遗传疾病。
19. 一种用于从样品中提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)含去垢剂的裂解液以及
b)玻璃纤维滤器。
CNA2006800029535A 2005-01-21 2006-01-20 用于核酸提取和鉴定的方法 Pending CN101268198A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64590505P 2005-01-21 2005-01-21
US60/645,905 2005-01-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101268198A true CN101268198A (zh) 2008-09-17

Family

ID=36916909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800029535A Pending CN101268198A (zh) 2005-01-21 2006-01-20 用于核酸提取和鉴定的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20060240409A1 (zh)
EP (1) EP1846579A4 (zh)
JP (1) JP2008527997A (zh)
KR (1) KR20070103417A (zh)
CN (1) CN101268198A (zh)
AU (1) AU2006214698A1 (zh)
CA (1) CA2594491A1 (zh)
IL (1) IL184577A0 (zh)
MX (1) MX2007008847A (zh)
WO (1) WO2006088601A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031249A (zh) * 2010-09-14 2011-04-27 广西大学 一种简易纯化核酸的方法
CN102154519A (zh) * 2011-03-28 2011-08-17 中山大学 型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒
CN103492550A (zh) * 2011-04-27 2014-01-01 默克专利股份公司 用于裂解细胞的方法
CN108593755A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 清华大学 一种细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置
CN108884488A (zh) * 2017-03-15 2018-11-23 东洋纺株式会社 基因检测方法及基因检测试剂盒
CN111321123A (zh) * 2020-03-05 2020-06-23 北京天恩泽基因科技有限公司 一种免核酸提取的病毒保存液
CN111575244A (zh) * 2020-05-06 2020-08-25 江苏金迪克生物技术股份有限公司 一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080131955A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Method of Separating Target DNA from Mixed DNA
WO2008093002A2 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Abacus Diagnostica Oy Method for detection of presence of target polynucleotide in samples
US7732659B2 (en) * 2007-11-20 2010-06-08 Genetic Services, Inc. Injecting Drosophila embryos
US10717022B2 (en) 2012-03-14 2020-07-21 Chromologic Llc Integrated membrane device
US9933343B2 (en) * 2012-03-14 2018-04-03 Chromologic Llc Integrated membrane for preservation of biomolecules
EP2847330B1 (en) * 2012-05-09 2018-04-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Buffer for one-step dna extraction
CN105378108A (zh) * 2013-03-13 2016-03-02 雅培分子公司 用于分离核酸的***和方法
CN104450953B (zh) * 2013-09-12 2019-11-15 上海仁度生物科技有限公司 Rna恒温扩增的禽流感病毒h7n9（2013）核酸检测试剂盒
JP6893174B2 (ja) 2015-01-16 2021-06-23 タケダ ワクチン，インコーポレイテッド 粒子に含まれる逆転写酵素活性の検出

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
CA2067711C (en) * 1991-05-03 2000-08-08 Daniel Lee Woodard Solid phase extraction purification of dna
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
ATE210671T1 (de) * 1994-02-11 2001-12-15 Qiagen Gmbh Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen
DE29601618U1 (de) * 1996-01-31 1996-07-04 Invitek Gmbh Vorrichtung zur gleichzeitigen multiplen Isolierung
JP4325114B2 (ja) * 1997-12-22 2009-09-02 日立化成工業株式会社 オリゴヌクレオチド固定化ｐｃｒマイクロプレート上での直接ｒｔ−ｐｃｒ
US6548256B2 (en) * 2000-07-14 2003-04-15 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
AU2002356053A1 (en) * 2001-08-20 2003-03-03 Whatman, Inc. Dna purification and recovery from high particulate and solids samples
EP1481086A4 (en) * 2002-02-11 2007-05-23 Univ Auburn HIGH SENSITIVITY REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DETECTING NUCLEIC ACIDS
CA2501056C (en) * 2002-10-04 2012-12-11 Whatman, Inc. Methods and materials for using chemical compounds as a tool for nucleic acid storage on media of nucleic acid purification systems
US20040180445A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-16 Domanico Michael J. Methods and compositions for purification of nucleic acid from a host cell
US20050059024A1 (en) * 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
AU2004288132A1 (en) * 2003-08-12 2005-05-19 Massachusetts Institute Of Technology Sample preparation methods and devices
EP1526176A3 (en) * 2003-10-24 2005-05-11 Agilent Technologies Inc. (a Delaware Corporation) Devices and methods for isolating RNA
ITMI20040167A1 (it) * 2004-02-04 2004-05-04 Univ Padova Metodo per l'estrazione simultanea di acidi nucleici da un campione biologico

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031249A (zh) * 2010-09-14 2011-04-27 广西大学 一种简易纯化核酸的方法
CN102154519A (zh) * 2011-03-28 2011-08-17 中山大学 型通用登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒
CN103492550A (zh) * 2011-04-27 2014-01-01 默克专利股份公司 用于裂解细胞的方法
US9493736B2 (en) 2011-04-27 2016-11-15 Merck Patent Gmbh Method for lysing cells
CN108884488A (zh) * 2017-03-15 2018-11-23 东洋纺株式会社 基因检测方法及基因检测试剂盒
CN108593755A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 清华大学 一种细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置
CN111321123A (zh) * 2020-03-05 2020-06-23 北京天恩泽基因科技有限公司 一种免核酸提取的病毒保存液
CN111575244A (zh) * 2020-05-06 2020-08-25 江苏金迪克生物技术股份有限公司 一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法
CN111575244B (zh) * 2020-05-06 2021-07-23 江苏金迪克生物技术股份有限公司 一种低Vero细胞残留DNA狂犬病疫苗原液的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
MX2007008847A (es) 2008-03-13
AU2006214698A1 (en) 2006-08-24
CA2594491A1 (en) 2006-08-24
WO2006088601A2 (en) 2006-08-24
EP1846579A2 (en) 2007-10-24
JP2008527997A (ja) 2008-07-31
WO2006088601A8 (en) 2007-08-16
US20060240409A1 (en) 2006-10-26
IL184577A0 (en) 2007-10-31
KR20070103417A (ko) 2007-10-23
EP1846579A4 (en) 2008-12-24
WO2006088601A3 (en) 2007-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101268198A (zh) 用于核酸提取和鉴定的方法
ES2354020T3 (es) Nuevos cebadores y sondas para la detección del parvovirus b19.
US5958677A (en) Method for purifying viral nucleic acids
CN100487116C (zh) 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
JP4735645B2 (ja) Ｒｎａの検出法
JP5420256B2 (ja) 精製方法及びキット
JPH08508637A (ja) 酸プロテアーゼを用いた核酸の調製
US10501500B2 (en) Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines
CN109207475A (zh) 一种快速核酸提取方法
JPH06315374A (ja) 捕捉法および装置
CN102037138A (zh) 用于收集及处理dna和rna检测样品的方法、试剂盒和***
CN114080456A (zh) Rna病毒检测方法
EP3121268B1 (en) Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus
JP7188645B2 (ja) 非特異的な核酸増幅を抑制する方法
CN111254217A (zh) 诺如病毒的检测方法
JP2023024808A (ja) Ｒｎａウイルス検出方法
Singh et al. An alkaline solution simplifies nucleic acid preparation for RT-PCR and infectivity assays of viroids from crude sap and spotted membrane
US20210025012A1 (en) Method for detecting nucleic acid
JP2001078761A (ja) 核酸結合性磁性シリカ粒子担体
Sahu Tools and Techniques for Recovery, Detection, and Inactivation of Foodborne Viruses
CN117210453A (zh) 病毒核酸释放液、提取病毒核酸的试剂盒及方法
CN118176307A (zh) Rna的选择性纯化
Briones et al. Microfluidic device for rapid detection of cytomegalovirus (CMV) by sequence-specific hybridization of PCR-amplified CMV-DNA
Fujioka et al. Vulnerability to Pathogens: Phase 2 Monitoring Groundwater for Human Enteric Viruses by Culture and Genetic Probe (PCR) Methods
JPH11178571A (ja) 核酸抽出方法およびそのための試薬

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080917