CN101241124A - 一种生物芯片基片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物芯片基片及其制备方法。本发明所提供的生物芯片基片是在氨基化片基表面接枝上醛基化葡聚糖的基片；所述醛基化葡聚糖是将葡聚糖的糖苷单元上的邻羟基氧化为醛基得到的。本发明的葡聚糖醛基基片作为一种高分子三维醛基基片，其键合容量大，不仅核酸固定能力得到了很大提高，点形状饱满；而且解决了普通醛基基片存在的点制高密度芯片大部分样品固定弱或固定不上的问题，提高了长时间处于点样环境(点样环境湿度大)下基片的稳定性，适合点制长时间点样的高密度芯片的点制。因此，本发明的葡聚糖醛基基片是一种性能优良的生物芯片基底材料，可广泛应用于各种生物芯片的制备上。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片基片及其制备方法。
背景技术
现今，芯片技术已经成为生命科学研究中必不可少的一部分，在表征复杂的生物过程或需要测定大量的诊断参数时，芯片大规模、高通量分析的特征使得芯片在分析基因组序列突变、基因表达谱、蛋白质间反应中而被广泛采用。
基片是芯片的基础，基片的制备在生物芯片的研制中具有举足轻重的作用。
通常，基片按分子结构分为三种：第一种，简单的硅烷化基片，如在玻片表面进行硅烷化修饰上氨基，醛基，环氧基团，巯基等，这种类型基片存在着较大的空间位阻，有较强的非特异吸附，在早期芯片研究中应用较多；第二种，玻片在简单硅烷化后再进行小分子修饰的基片，这种类型基片表面空间有所增加，一定程度上减小了非特异吸附；第三种，聚合物基片，可以分为分子没有活性基团的聚合物基片、分子含有一个活性基团的聚合物基片以及分子含有多个活性基团的聚合物基片。聚合物基片提供一个附加的表面保护层，从而减小非特异性吸附，分子含有多个活性基团的聚合物基片单位表面还提供了更多的活性位，因而导致更有效的样品固定。聚合物基片还可以分为树枝状大分子聚合物基片、滤过膜基片以及水凝胶基片。
普通醛基基片属于简单的硅烷化基片，是一种一维基片。实际应用中，普通醛基基片的固定量较低，灵敏度不高；而且在点制高密度芯片过程中存在稳定性问题，即在点样环境下(点样环境湿度大)长时间点样出现点样刚开始时点直径正常、往后绝大部分点直径越来越小的现象，也即星星点现象，导致芯片杂交后刚开始点样的区域点大小和信号正常、往后绝大部分点小至星星点以至无法提取数据，也就是常用的简单硅烷化醛基基片在长时间点样过程中存在稳定性问题，而且点样时间越长，这种问题越严重。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生物芯片基片。
本发明所提供的生物芯片基片，是在氨基化片基表面接枝上醛基化葡聚糖的基片；所述醛基化葡聚糖是将葡聚糖的糖苷单元上的邻羟基氧化为醛基得到的。
其中，所述醛基化葡聚糖用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化葡聚糖得到。葡聚糖聚合物分子结构如图1所示，经过高碘酸或水溶性高碘酸盐处理后，只是所有或部分糖苷单元上的邻羟基被打断变成两个醛基，所以醛基化后的葡聚糖聚合物分子基本骨架和长度不变，是一种所有或部分糖苷单元含有两个醛基的长链聚合物，如图2所示。
所述葡聚糖可选分子量从10000多到几十万的分子，具体可为葡聚糖T40或葡聚糖T70。
其中，氨基化片基可从商业途径得到，也可对玻片、塑料、硅片等采用现有的方法进行氨基修饰得到，如采用氨基硅烷化方法或物理吸附氨基化方法。当所述片基为玻片时，所述氨基化片基可采用如下物理吸附氨基化方法制备：将玻片用六甲基二硅氮烷进行气相沉积，然后再用含有氨基的聚硅氧烷进行处理，得到氨基化玻片。
本发明的另一个目的是提供两种制备上述生物芯片基片的方法。
本发明所提供的一种制备上述生物芯片基片的方法，是将葡聚糖醛基化后接枝到氨基化片基表面上得到生物芯片基片。
本发明所提供的制备上述生物芯片基片的另一种方法，是将葡聚糖醛基化后接枝到氨基化片基表面上后再用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化得到生物芯片基片。
其中，后一方法制备的葡聚糖醛基基片点样点直径大小可以控制，相比前一方法的点直径大小，可以相等也可以更大。这两种醛基化方法制备的葡聚糖醛基基片可以通过控制工艺条件达到相同的结果。在实际应用中，可根据需要，选择上述两种方法中的任一种方法进行制备。
其中，所述葡聚糖醛基化具体可用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化葡聚糖。
上述方法中的葡聚糖具体可为葡聚糖T70或葡聚糖T40。
其中，氨基化片基可从商业途径得到，也可对玻片、塑料、硅片等采用现有的方法进行氨基修饰得到，如采用氨基硅烷化方法或物理吸附氨基化方法。当所述片基为玻片时，所述氨基化片基可采用如下物理吸附氨基化方法制备：将玻片用六甲基二硅氮烷进行气相沉积，然后再用含有氨基的聚硅氧烷进行处理，得到氨基化玻片。
由本发明基片制得的生物芯片也属于本发明的保护范围。
本发明的葡聚糖醛基基片中，葡聚糖本身是一种高分子聚糖化合物，具有优良的生物兼容性，有非常低的非特异性吸附和自发荧光背景，使得样品检测的灵敏度有了明显提高；葡聚糖是亲水性高分子化合物，而较长的亲水连接臂有足够柔韧度，能够使通过共价或高亲和力的方式使固定于基片表面的样品分子同目标分子充分接触而结合；以它为骨架进行活性基团改性，由此制备的富含醛基的葡聚糖醛基基片，不仅生物分子固定灵敏度大大提高，信号梯度明显，而且能够较快的实现分子之间的结合而平衡。所以，作为一种高分子三维醛基基片，其键合容量大，固定量高，信号梯度明显，不仅核酸固定能力得到了很大提高，点形状饱满，而且长时间样品点制过程中样品点的形状始终保持均一，解决了普通醛基基片存在的点制高密度芯片大部分样品固定不上的问题，提高了点样环境下基片的稳定性，适合点制需长时间点样的高密度芯片。因此，本发明的葡聚糖醛基基片是一种性能优良的生物芯片基底材料，可广泛应用于各种生物芯片的制备上。
附图说明
图1为改性前的葡聚糖分子结构；
图2为葡聚糖醛基基片表面分子的结构示意图；
图3为葡聚糖醛基基片和普通醛基基片核酸样品固定能力比较扫描图；
图4为葡聚糖醛基基片和普通醛基基片核酸样品固定信号值比较柱状图；
图5为葡聚糖醛基基片和普通醛基基片点制高密度人的启动子芯片的点制效果对比图；
图6为葡聚糖醛基基片和普通醛基基片点制高密度人的启动子芯片的杂交效果对比图。
具体实施方式
本发明中涉及的氨基化片基具体可用以下几种方法制备。
基片的片基可以为玻片或塑料等，塑料具体可为PMMA。玻片片基可以通过氨基硅烷化或物理吸附的方法使其表面氨基化；塑料片基一般通过氨基硅烷化的方法使其表面氨基化。与硅烷氨基化的玻片表面相比，物理吸附氨基化的玻片表面和硅烷氨基化的塑料表面都更为疏水。
其中，氨基硅烷化所用到的硅烷化试剂可选用3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基二乙氧基硅烷、3-氨丙基-乙氧基硅烷等氨基硅烷化试剂；物理吸附可用含有氨基的聚硅氧烷，如Poly[dimethylsiloxane-co-(3-aminopropyl)methylsiloxane]等。
下面具体分述：
1)氨基硅烷化玻片的方法如下：
将玻片表面用Piranha(浓H2SO4∶30％H2O2，V/V＝7∶3)溶液浸泡2h以上或用铬酸溶液浸泡过夜，然后用去离子水清洗、甩干；或将玻片去离子水清洗甩干后进行等离子处理2min；将处理后的上述玻片与1％(体积百分含量)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中反应；乙醇清洗后甩干即得表面氨基硅烷化的玻片。
2)物理吸附氨基化玻片的方法如下：
清洗玻片；将干净的烧杯放于120℃烘箱中烘烤30min后拿出，迅速滴加几滴HMDS(六甲基二硅氮烷)并立即盖上干净的表面皿，10秒后揭开表面皿，将清洗干净的玻片放入烧杯中并立即盖上表面皿，使玻片表面进行HMDS气相沉积30min；配制0.5％(体积百分含量)的Poly[dimethylsiloxane-co-(3-aminopropyl)methylsiloxane]的二氯甲烷溶液；将处理后的玻片在上述二氯甲烷溶液中通过提拉法使玻片表面物理吸附上一层带氨基的聚硅氧烷，从而实现玻片的氨基化。
3)氨基硅烷化塑料的方法如下(以PMMA为例)：
PMMA片基清洗、甩干后，进行表面臭氧处理1h或Plasma处理30min。配制1％(体积百分含量)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)的水相溶液，立即将处理后的PMMA片基放入其中反应2h，从而使PMMA片基表面氨基硅烷化。
实施例1、葡聚糖醛基基片的制备
先深度醛基化葡聚糖分子，再将其接枝到氨基化片基表面，具体的方法如下：
1、醛基化葡聚糖的制备
称取5.68g高碘酸钠溶于100ml水中，加入0.02g的葡聚糖T-40，溶解后蔽光30℃反应3h；4℃透析干净后，即得醛基化葡聚糖高分子浓缩液，4℃保存。
2、氨基化片基的制备
将玻片表面用Piranha(浓H2SO4∶30％H2O2，V/V＝7∶3)溶液浸泡2h，然后用去离子水清洗、甩干；将处理后的上述玻片与1％(体积百分含量)3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中反应2h；反应后乙醇清洗后甩干即得表面氨基硅烷化的玻片。
3、葡聚糖醛基基片的制备
1)在600ml磷酸缓冲液中加入50ml步骤1得到的醛基化葡聚糖高分子浓缩液，并加入还原剂NaBH3CN 0.08g，然后加入步骤2制得的氨基化玻片反应30min。
2)清洗、甩干，即得葡聚糖醛基基片。
实施例2、葡聚糖醛基基片的制备
先浅度醛基化葡聚糖分子，再将其接枝到氨基化片基表面，然后再进行高碘酸钠深度氧化，具体方法如下：
1、醛基化葡聚糖的制备
称取5.68g高碘酸钠溶于100ml水中，加入0.02g的葡聚糖T-70，溶解后蔽光30℃反应1h；4℃透析干净后，即得醛基化葡聚糖高分子浓缩液，4℃保存。
2、氨基化片基的制备
清洗玻片；将干净的烧杯放于120℃烘箱中烘烤30min后拿出，迅速滴加几滴HMDS(六甲基二硅氮烷)并立即盖上干净的表面皿，10秒后揭开表面皿，将清洗干净的玻片放入烧杯中并立即盖上表面皿，使玻片表面进行HMDS气相沉积30min；配制0.5％(体积百分含量)的Poly[dimethylsiloxane-co-(3-aminopropyl)methylsiloxane]的二氯甲烷溶液；将处理后的玻片在上述二氯甲烷溶液中通过提拉法使玻片表面物理吸附上一层带氨基的聚硅氧烷，从而实现玻片的氨基化。
3、将醛基葡聚糖接枝到氨基化片基上
(1)同实施例1的步骤3中(1)所述。
(2)清洗、甩干。
4、进一步氧化葡聚糖
在600mL去离子水中加入12.8g高碘酸钠配制成高碘酸钠溶液，将步骤3获得的表面接枝上高分子的玻片浸入此高碘酸钠溶液中反应3h。
清洗、甩干，即得葡聚糖醛基基片。
实施例3、葡聚糖醛基基片与普通醛基基片的固定能力比较
本实施例所用的普通醛基基片是根据文献(《Colloids and Surfaces B：Biointerfaces》Volume 36，Issues 3-4，1 August 2004，Pages 178)中提到的方法制备的，即玻片先进行氨基硅烷化后烘烤交联，然后与戊二醛反应制备的。
本实施例用到的葡聚糖醛基基片是按实施例1所述方法制备的。
生物芯片的制备过程如下：
1)用100％DMSO分别配制成含有50％DMSO的3种不同浓度的35mer Oligo样品PBH(序列如表1所示)溶液，每种样品取出10uL转移加入384孔板中；配制50％DMSO溶液作为空白(BC)对照，也取出10uL转移加入384孔板中；QC(点样的阳性质控)是一端带有HEX标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列如表1所示，用100％DMSO配制成含有50％DMSO的溶液，取出10uL转移加入384孔板中。
表1、样品的名称及序列
| 样品名称 | 序列 |
| PBH | NH2-5’-(T)15-TCGGATTCGACAACACCCGT |
| QC | NH2-5’-(T)15-GTG CAA CTC ACT CGA CTG-3’-HEX |
| Arab-HEX | HEX-5’-ACTGGACTTGACGGGTGTTGTCGAATCCGA |
2)通过自动点样装置将准备好的点样液分别点到葡聚糖醛基基片表面和普通醛基基片表面。具体点阵方式如图3所示(其中，A为本发明葡聚糖醛基基片，B为普通醛基基片)：每张芯片包括4个点阵，每个点阵包含30个点，每个点阵的点阵设计为5行*6列，样品重复形式为1*6，点间距为400um，5个样品在芯片点阵上的位置从上至下依次为：2.5uM QC、BC、2.5uM PBH、5.0uM PBH、10uM PBH。
3)将点样后的芯片37℃湿盒过夜固定；
4)用NaBH4溶液封闭，随后清洗、甩干；
5)通过盖片向每个点阵加入含有荧光HEX修饰的Arab-HEX的芯片杂交液(芯片杂交液中主要含有SSC、Denhardt′s、SDS)15ul，于40℃-60℃反应2h；
6)反应后芯片分别在两种洗液中42℃各洗2min，洗液I：0.3×SSC/0.1％SDS，洗液II：0.06×SSC。最后，玻片离心甩干。
7) 芯片扫描和数据处理。数据分析使用晶芯TMLuxscan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描玻片，扫描参数均设定Laser/PMT＝90/650。
两种芯片的扫描图像如图3所示，信号强度比较的柱状图如图4所示(其中，A为本发明的葡聚糖醛基基片；B为普通醛基基片)。
结果表明，3种不同浓度的核酸样品，在本发明葡聚糖醛基基片制作的芯片上的固定量比普通醛基基片的固定量显著增高，相应的信号强度分别有2-5倍不同程度的提高，表明该葡聚糖醛基基片的核酸样品固定能力比普通醛基基片高。
实施例4、葡聚糖醛基基片在高密度核酸芯片中的应用
本实施例用到的葡聚糖醛基基片是按实施例1所述方法制备的。
所用的普通醛基基片与实施例3中所述的相同。
生物芯片的制备过程如下：
1)将33.5K种46Mer～55Mer的Oligo样品(购自Operon公司，人的启动子h sapiens V4.0.2 datasheet，Cat#852102)用100％DMSO分别配制成含有50％DMSO的溶液，每种样品取出10ul转移加入384孔板中；
2)通过自动点样装置将准备好的点样液按照相同的点阵方式并行点到本发明葡聚糖醛基基片和普通醛基基片表面。每张芯片包括48个点阵，每个点阵包含697个点，点间距是160um。并行点制效果如图5所示。
3)将点样后的芯片37℃湿盒过夜固定；
4)用NaBH4溶液封闭，随后清洗、甩干；
5)通过盖片向每个点阵加入含有荧光标记的靶标的芯片杂交液于40℃-60℃反应过夜；
6)反应后芯片分别用两种洗液清洗(洗液I：0.3×SSC/0.1％SDS，洗液II：0.06×SSC。)，离心、甩干；
7)芯片扫描和数据处理。并行检测结果如图6所示。
在本实验中，用本发明葡聚糖醛基基片和普通醛基基片分别制作芯片时，所用的探针与杂交液都完全相同，芯片杂交液中主要含有甲酰胺、SSC、Denhardt′s、SDS，相应的反应条件等也都相同。
使用晶芯TMLuxscan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描点样后的芯片，扫描参数均设定Laser/PMT＝90/900。扫描结果表明，在点制高密度oligo芯片过程中，对于普通醛基基片，刚开始点样时，普通醛基基片的点直径在120-125um，当每个点阵点制到约1/3处时点直径开始变小，变小的点直径在50-80um之间(图5A，其中区域C和区域D为放大图)；对于本发明的葡聚糖醛基基片，在整个长时间点样过程中(点样环境湿度大)，点直径几乎没有变化，一直在135-140um(图5B，其中区域C和区域D为放大图)。
使用晶芯TM Luxscan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描杂交后的芯片，扫描参数均设定Laser/PMT＝90/900。扫描结果表明，普通醛基基片制作的芯片，除了个别点直径大小在120-125um左右外，大部分点的直径小且界限模糊(尤其区域D)(图6A，其中区域C和区域D为放大图)，导致提取数据难、不准确甚至无法提取数据；相比之下，本发明的葡聚糖醛基基片所有点的直径大小几乎相等，均为135-140um，且界限非常明显，易于提取数据和数据分析(图6B，其中区域C和区域D为放大图)。
Claims (10)
1、一种生物芯片基片，是在氨基化片基表面接枝上醛基化葡聚糖的基片；所述醛基化葡聚糖是将葡聚糖的糖苷单元上的邻羟基氧化为醛基得到的。
2、根据权利要求1所述的基片，其特征在于：所述醛基化葡聚糖用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化葡聚糖得到。
3、根据权利要求1或2所述的基片，其特征在于：所述葡聚糖为葡聚糖T40或葡聚糖T70。
4、根据权利要求1或2所述的基片，其特征在于：所述氨基化片基按照如下方法制备：将玻片用六甲基二硅氮烷进行气相沉积，然后再用含有氨基的聚硅氧烷进行处理，得到氨基化玻片。
5、一种制备权利要求1所述生物芯片基片的方法，是将葡聚糖醛基化后接枝到氨基化片基表面上得到生物芯片基片。
6、一种制备权利要求1所述生物芯片基片的方法，是将葡聚糖醛基化后接枝到氨基化片基表面上后再用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化得到生物芯片基片。
7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述葡聚糖醛基化是用高碘酸或水溶性高碘酸盐氧化葡聚糖。
8、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述葡聚糖为葡聚糖T40或葡聚糖T70。
9、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述氨基化片基按照如下方法制备：将玻片用六甲基二硅氮烷进行气相沉积，然后再用含有氨基的聚硅氧烷进行处理，得到氨基化玻片。
10、由权利要求1至4中任一所述基片制得的生物芯片。
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