CN101239711A - 一种基因传输载体磷酸钙纳米的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基因传输载体磷酸钙纳米颗粒的制备方法：其特征是利用化学合成的方法，分别将氯化钙与磷酸氢二钠与表面活性剂混合，各经强力搅拌，然后再将以上两种物质缓慢混合并搅拌，反应一定时间后，产品经用乙醇和水分别洗涤、超声分散，并冻干后得到磷酸钙纳米颗粒。本发明工艺简单、成本较低、易于产业化；所生产的磷酸钙纳米颗粒带有正电荷，具有高效，无毒，可生物降解；本发明提供的方法制备出的纳米粒子分布均匀，粒径大部分分布在23.5－31.4nm左右，是理想的基因传输载体之一。
Description
所属技术领域：
该方法制备的纳米是一种无毒、生物相容性好、可生物降解，并能够用作基因传输载体，适用于生物制药及肿瘤基因治疗领域。
背景技术：
提高DNA的转化效率和靶向性是基因治疗的关键。许多的载体，病毒载体和非病毒载体在以前得到了广泛的应用，病毒载体主要包括腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒等；但病毒载体在安全性方面具有潜在的危险；且免疫原性比较强，注射到机体后很快会被机体的免疫***排斥，如当静脉注射高浓度的腺病毒载体时会使肝脏发生严重的炎症反应；非病毒载体目前常用的如脂质体及多聚阳离子聚合物；多聚阳离子聚合物有多聚氨基酸，聚乳酸，PLGA，PLA等。但脂质体和阳离子聚合物介导基因转移组织的特异性和靶向性，转染效率较低且易被网状内皮***吞噬，基因表达时间短。
鉴于现有病毒载体和非病毒载体存在的缺陷，研制新型的非病毒载体已经成为了研究的热点，纳米颗粒因为具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。研究表明，纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内，不会很快被吞噬细胞清除，从而更多的渗出到血管外，组织间隙，延长与细胞的接触时间，提高转染效率；通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解，但纳米基因载体有浓缩，保护DNA功能，与DNA形成一致密的结构，使DNA不被核酸酶消化降解。Dan Luo等利用硅颗粒与脂质体混合后与DNA一起转染细胞，发现其转染效率比单纯用脂质体转染要高8倍，Carsten Kneuer等用二价阳离子修饰硅纳米颗粒表面后，发现能与DNA结合，并且发现结合在颗粒上的DNA能抵抗DNase的作用。
目前，采用的纳米生物材料大致分为有机材料和无机材料两大类，前者有多聚糖、高分子聚合物等，后者主要集中在对石英、羟基磷灰石、磁铁粉、陶瓷、碳粒、硅氧化物及各种金属或合金的研究。高分子聚合材料作为纳米载体的研究越来越受到重视，其在基因的输送中有许多的优越性，如能保护核苷酸的降解、有助于核苷酸转染细胞，并可起到定位作用，能靶向输送核苷酸，且可控制DNA的释放速率，延长其在体内的作用时间等。生物降解性是药物载体或基因载体的重要特征之一，通过降解，载体与药物/基因片段定向进入靶细胞之后，表层的载体被生物降解，芯部的药物释放出来发挥疗效，避免了药物在其他组织中释放。
发明内容
本项目利用化学方法制备一种30nm左右大小，分散均匀的磷酸钙纳米颗粒，且该纳米颗粒能与质粒DNA有效结合，通过复合体吸附在细胞膜上并进入细胞内，增加进入细胞内DNA量，提高基因转染的效率，并且质粒DNA与纳米颗粒形成的复合体能有效的抵抗血清中酶类对DNA分子的降解，有效的保护DNA分子的完整性(图1-3)。
本新型纳米所采用的技术方案
本技术采用在表面活性剂作用下，(氯化钙与磷酸氢二钠)的浓度比例为2∶1，温度控制在35℃，搅拌速度为350rpm，化学合成制备的磷酸钙纳米颗粒大小在30nm左右，分散较好，本方法制备的过程中工艺要求较高；在改变各反应物的浓度、反应过程中的温度会改变生成颗粒的大小及均匀度，以及反应合成时问、搅拌的速度的改变也同样影响制备磷酸钙纳米的特性，我们经过反复的制备和检测后，已基本形成较完善的制备工艺。
本新型载体的有益效果
作为基因转染的载体必须要求载体能与DNA结合，并且能带上完整的DNA进入细胞内，使外源基因得到有效的表达。磷酸钙纳米颗粒与带负电荷的DNA结合；在中性的环境下，DNA能与磷酸钙颗粒形成复合体，并且DNA与颗粒的结合形成复合体后能保护DNA不被血清降解，这对于体外细胞的培养及体内多酶环境具有重要的意义：作为基因转染的载体要求对细胞、机体无毒。人体骨骼的主要组成成份为钙、磷，磷酸钙是可降解的无机材料，在体内可降解为钙与磷，被骨质吸收，对机体基本无毒。应此该磷酸钙纳米可能作为基因转染的有效载体之一，在肿瘤的基因治疗中有着重要的意义，为临床基因治疗提供新的思路。
具体实施方式
用0.05mol/L CaCl2：溶液与微环境(I％SDS 5ml，1％F-68 5ml，正丁醇，水等)，室温反应并搅拌(300rpm)24h，形成液体A，再将0.025mol/L Na2HPO4，0.025mol/L柠檬酸钠(Sodium Citrate)溶液与微环境(I％SDS 5ml，1％F一68，5ml，水等)，室温反应并搅拌(300rpm)24h，形成液体B；24小时后将B液以每小时10毫升的速度滴入到A液中并以350rpm速度搅拌混合，温度控制为35℃，充分搅拌48小时，(3)分别以10ml丙酮，25ml乙醇重悬，13500rDm离心25min，室温(25℃)，洗涤，超声分散1h，冻干，即得平均粒经为23.5-31.4nm磷酸钙纳米。
图片见附图。
Claims (3)
1. 一种制备基因传输载体磷酸钙纳米的方法：其特征在于用0.05mol/L CaCl2溶液与微环境(1％SDS 5ml，1％F-685ml，正丁醇，水等)，室温反应并搅拌(300rpm)24h，形成液体A，再将0.025mol/LNa2HPO4，0.025mol/L柠檬酸钠(Sodium Citrate)溶液与微环境(1％SDS 5ml，1％F-685ml，水等)，室温反应并搅拌(300rpm)24h，形成液体B。
2. 24小时后将B液以每小时10毫升的速度滴入到A液中并以350rpm速度搅拌混合，温度控制为35℃，充分搅拌48小时。
3. 分别以10ml丙酮，25ml乙醇重悬，13500rpm离心25min，室温(25℃)，洗涤，超声分散1h，冻干，即得平均粒经为23.5-31.4nm磷酸钙纳米。
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