CN101238149B

CN101238149B - 新抗igf-ir抗体及其用途

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Publication number: CN101238149B
Application number: CN200680026553.8A
Authority: CN
Inventors: 利利亚纳·格奇; 纳塔莉·科尔瓦亚
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2026-07-21
Also published as: EP1907426B1; AR054175A1; US20090265797A1; BRPI0613642A2; RU2008106751A; AU2006274086B2; GT200600324A; CA2616099C; TW200740846A; NZ565248A; WO2007012614A2; HK1116201A1; FR2888850A1; JP5185817B2; US20130125252A1; US8945871B2; WO2007012614A3; EP2380913A1; EP1907426A2; CA2616099A1

Abstract

本发明涉及新的抗体，其能够特异性结合人***I受体(IFG-IR)。本发明还包括这些抗体作为药物的用途，所述药物用于预防性和/或治疗性处理受IGF1和/或IGF2刺激、过表达IGF-IR的癌症、或者与所述受体过表达相关的任何疾病，以及用于诊断与IGF-IR和/或IGF-I/胰岛素杂合受体过表达相关疾病的方法或试剂盒。

Description

新抗IGF-IR抗体及其用途

本发明涉及新的抗体，其能够特异性结合人***I受体(IGF-IR)和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性，尤其是鼠的、嵌合的和人源化来源的单克隆抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。在一个具体的方面，本发明涉及新的抗体，其不但能够有效地抑制配体IGF1与IGF-IR的结合，而且还能够有效地抑制其它配体(例如，IGF2)与所述相同受体的结合。本发明还包括这些抗体作为药物的用途，所述药物用于预防性和/或治疗性处理受IGF1和/或IGF2刺激的、过表达IGF-IR的癌症、或者与所述受体过表达相关的任何疾病，以及用于诊断与IGF-IR和/或IGF-I/胰岛素杂合受体过表达相关疾病的方法或试剂盒。本发明最后还包括包含这些抗体与例如抗EGFR抗体和/或化合物和/或抗癌剂或者缀合毒素的试剂的产物和/或组合物，以及它们用于预防和/或治疗某些癌症的用途。

被称为IGF-IR的***I受体是已经充分描述的受体，具有与胰岛素受体IR 70％同源性的酪氨酸激酶活性。IGF-IR是分子量约为350,000的糖蛋白。它是异四聚体受体，其中通过二硫桥连接的每一半由细胞外α-亚基和跨膜β-亚基组成。IGF-IR以非常高亲和力(Kd#1 nM)结合IGF1和IGF2，但也能够以低100-1000倍的亲和力结合胰岛素。相反，IR以非常高亲和力结合胰岛素，而IGF仅以低100倍的亲和力结合至胰岛素受体。尽管位于α-亚基的富含半胱氨酸区域和β-亚基C-端部分分别具有较低同源性区段，但是IGF-IR和IR的酪氨酸激酶结构域具有非常高的序列同源性。在α-亚基中观察到的序列差异位于配体结合区段，因此是在IGF-IR和IR分别对IGF和胰岛素的相对亲和力的起源处。β-亚基C-端部分的差异导致两种受体信号途径的分化；IGF-IR介导促有丝***、分化和抗凋亡作用，而IR活化主要涉及代谢途径水平的作用(Baserga et al.，Biochim.Biophys.Acta，1332：F105-126，1997；Baserga R.，Exp.Cell.Res.，253：1-6，1999)。

配体与受体细胞外结构域的结合活化了细胞质酪氨酸激酶蛋白质。激酶活化又涉及刺激不同的细胞内底物，包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb 10(Peruzzi F.et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。IGF-IR的两种主要底物是IRS和Shc，其通过活化大量的下游效应物，介导与IGF附着至该受体相关的大部分生长和分化作用。因此底物可用性可控制与IGF-IR活化相关的最终生物作用。当IRS-1占优势时，细胞趋向增殖和转化。当Shc占优势时，细胞趋向分化(ValentinisB.et al.，J.Biol.Chem.274：12423-12430，1999)。似乎参与抗凋亡保护作用的主要途径是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3激酶)途径(Prisco M.et al.，Horm.Metab.Res.，31：80-89，1999；Peruzzi F.et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。

近十年中IGF***在癌症发生中的作用已经成为大量研究的主题。这种兴趣是在发现以下事实之后：除了促有丝***和抗凋亡特性以外，建立和维持转化表型似乎也需要IGF-IR。事实上，已经在大量不同的细胞中明确，IGF-IR过量表达或者组成性活化，导致细胞在无胎牛血清的培养基中不依赖于支持物的生长，并导致在裸鼠中形成肿瘤。这本身不是独有性质，因为大量不同的过表达基因的产物可以转化细胞，包括很多的生长因子受体。然而，已经明确证实IGF-IR在转化中主要作用的关键发现已经证实，IGF-IR编码基因已经灭活的R-细胞对通常能转化细胞的不同因子完全有抗性，这些因子如牛***瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的过表达、SV40的T抗原、活化ras或最后两种因子的组合(Sell C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11217-11221，1993；Sell C.et al.，Mol.Cell.Biol.，14：3604-3612，1994；Morrione A.J.，Virol.，69：5300-5303，1995；Coppola D.et al.，Mol.Cell.Biol.，14：4588-4595，1994；DeAngelis T.et al.，J.Cell.Physiol，164：214-221，1995)。

IGF-IR在大量不同肿瘤和肿瘤系中表达，并且IGF通过其与IGF-IR的附着促进肿瘤生长。IGF-IR在癌症发生中作用的其他争论来自使用抗该受体的鼠单克隆抗体或者使用IGF-IR显性负突变体的研究。实际上，抗IGF-IR的鼠单克隆抗体抑制大量培养细胞系的增殖和体内肿瘤细胞的生长(Arteaga C.et al.，Cancer Res.，49：6237-6241，1989；Li et al.，Biochem.Biophys.Res.Com.，196：92-98，1993；Zia F.etal.，J.Cell.Biol.，24：269-275，1996；Scotlandi K.et al.，Cancer Res.，58：4127-4131，1998)。与之相似在Jiang等人的工作中(Oncogene，18：6071-6077，1999)也已经显示IGF-IR的显性负突变体能够抑制肿瘤增殖。

这些能够特异性结合IGF-IR抗体已有描述并且已申请了几个专利申请。作为举例，我们可以提及由本申请人中请的专利申请WO03/059951，其中描述了能够结合IGF-IR的单克隆抗体(称为7C10)。可以提及的其它专利申请有如WO 02/053596(PFIZER INC.和ABGENIX INC.)、WO 03/100008(SCHERING CORPORATION)或者WO 03/106621(IMMUNOGEN INC.)。所有这些申请都要求保护能够特异性结合IGF-IR和/或抑制其活性的抗体。

尽管它被认为是这些抗体中每一种的明显特性，但是在这些申请的说明书中清楚地表明，这些抗体能够有效地抑制两种天然配体与IGF-IR的结合，尤其是IGF2与IGF-IR的结合。在这些申请中显示了体外数据，比如对由IGF1和IGF2诱导增殖的抑制，并且表明所述抗体能够有效地抑制IGF1和IGF2诱导的增殖。然而，因为所述抗体的主要部分表现出诱导IGF-IR部分下调的能力，所述抗增殖特性与从IGF-IR上置换IGF1和IGF2直接相关并不是显而易见的。

实际上，例如，在WO 03/106621中显示的数据只涉及IGF1并且没有涉及IGF2与IGF-IR结合的最终抑制作用(见33-35页实施例C和图3，以及35-37页实施例D和图4-6)。

WO 02/053596得到同样的观测结果(见78-79页实施例IV和图3，以及82页实施例VII和图4)。

在所有目前描述过的发现抗人IGF-IR(hIGF-IR)的单克隆或者重组抗体的专利申请中，只有两个(WO 2004/087756和WO 2005/005635)真正地显示了所述抗体(分别为AK1a和AK18)抑制[125I]IGF2结合hIFG-IR的功效。

试验的方法在这两个实例中是相同的，均基于对人结直肠腺癌(HT29)完整细胞的竞争结合。尽管所述方法是合理的，但是其中没有阳性对照，比如天然hIGF-IR配体(IGF1和IGF2)的竞争，这导致竞争结合数据的不可信。另一方面，所显示的只是不完全竞争(对[¹²⁵I]IGF2结合AK1a和AK18抗体的抑制最大为80％)，即使在高抗体浓度条件下，这使得需要开发更有效的抗体以提高在人体中的疗效。最近关于由AK1a和AK18所致的对IGF2介导应答的推定抑制作用的争议点是缺乏显示由hIGF-IR介导的功能性IGF2刺激信号的抑制作用的实例。实际上，即使发生IGF2结合的竞争，这一定与下游hIGF-IR信号伴随而来的抑制相关，并且必须例举这些证据以提供针对抗体功能效果的实质证据。

本发明的目的是能提供可用的鼠单克隆抗体，优选嵌合的或者人源化抗体，其以高亲和性特异性地识别IGF-IR并且其不但能够抑制IGF1与IGF-IR的结合而且还抑制IGF2与IGF-IR的结合。该抗体几乎或者完全不与IR相互作用。它的附着将能够抑制过表达IGF-IR细胞系的体外生长，这主要是通过与IGF1/IGF-IR和IGF2/IGF-IR相互作用期间活化的信号转导途径的相互作用所致。该抗体在体内对所有表达IGF-IR的肿瘤类型将能是有活性的，所述肿瘤类型包括***依赖性***癌和***癌，其不是目前可用的抗IGF-IR单克隆抗体(写作MAb或者MAB)的情形。实际上，αIR3(其指IGF-IR的结构域)完全地抑制***的***依赖性肿瘤(MCF-7)的体外生长，但是对相应的体内模型却没有效果(Arteaga C.et al.，J.Clin.Invest.84：1418-1423，1989)。同样地，源于鼠单克隆1H7的scFv-Fc片段对***MCF-7的肿瘤只有微弱的活性并且对不依赖于雄激素的***肿瘤完全没有活性(Li S.L.et al.，Cancer Immunol.Immunother.，49：243-252，2000)。

以一种令人惊奇的方式，本发明人已产生鼠单克隆抗体(被称为I-3466)，其识别IGF-IR并且符合上述所有标准，也就是说不识别胰岛素的受体，在体外阻断IGF1和尤其是IGF2诱导的增殖，而且同样地在体内抑制表达IGF-IR的不同肿瘤的生长，所述肿瘤是骨肉瘤和***癌。此外，已显示出这些抗体抑制IGF1-和/或IGF-2诱导的对MCF-7和HT29细胞上IGF-IR的β链的酪氨酸的磷酸化。此外，还同样地确定这些抗体引起所述受体的内化及其降解，这与针对天然配体通常所观测到的结果相反，天然配体允许所述的细胞表面上受体的快速再循环。已经有可能通过它们的肽和核酸序列，尤其是通过它们针对IGF-IR的互补性决定区(CDR)的序列来表征这些抗体。

因此，根据第一实施方案，本发明的一个主题是分离的抗体、或其一种功能片段，所述抗体或其一种所述片段能够特异性结合人***I受体和/或能够特异性抑制所述IGF-IR受体的酪氨酸激酶活性，其特征在于它能够以小于0.3nM、优选小于0.03nM的IC₅₀抑制其第一配体IGF1的天然附着并且还能够以小于0.3nM、优选小于0.1nM的IC₅₀抑制其第二配体IGF2的天然附着。

更具体地，本发明涉及分离的抗体，或者其功能性免疫原性片段，其具有针对人***I受体(IGF-IR)的结合亲和性，其特征在于在与所述IGF-IR结合时，它以小于0.3nM、优选小于0.03nM的IC₅₀抑制天然结合伴侣IGF1与所述IGF-IR的结合并且它还以小于0.3nM、优选小于0.1nM的IC₅₀抑制天然结合伴侣IGF2与所述IGF-IR的结合。

此外，本发明涉及分离的抗体，或者其功能性免疫原性片段，其具有人***I受体(IGF-IR)的酪氨酸激酶抑制活性，其特征在于在与所述IGF-IR结合时，它以小于0.3nM、优选小于0.03nM的IC₅₀抑制天然结合伴侣IGF1与所述IGF-IR的结合并且它还以小于0.3nM、优选小于0.1nM的IC₅₀抑制天然结合伴侣IGF2与所述IGF-IR的结合。

在本申请中，如实施例2所解释，IC₅₀已经以图表方式确定。

关于现有技术，称为18的Roche抗体(WO 2004/087756和WO2005/005635)针对IGF1和IGF2具有平均0.3nM的IC₅₀(见WO2005/005635的实施例6)，即超过从抗体I-3466获得的IC₅₀(见实施例2)。

在本说明书中，术语“结合”和“附着”具有相同的意思并且可以互换使用。

根据本发明的另一实施方案，所述抗体还能够结合IGF-I/胰岛素杂合受体。

实际上，IGF-IR显示出与胰岛素受体(IR)的高同源性，后者以两种亚型A和B存在。

在NCBI GenBank中，IR亚型A和B的序列分别注册为登记号X02160和M10051。没有限制的、与IR相关的其他数据在此引入作为参考(Vinten et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：249-252；Belfiore et al.，2002，The Journal of Biological Chemistry，277：39684-39695；Dumesic et al.，2004，The Journal of Endocrinology &Metabolism，89(7)：3561-3566)。

IGF-IR和IR是四聚体糖蛋白，由通过二硫键连接的两个细胞外α-和两个跨膜β-亚基组成。包含配体结合位点的每个α-亚基大约是130-135kDa，而包含酪氨酸激酶结构域的每个β-亚基大约是90-95kDa。这些受体具有超过50％的总体氨基酸序列相似性和在酪氨酸激酶结构域中84％的相似性。在配体结合后，磷酸化受体募集并磷酸化停靠蛋白(docking protein)，包括胰岛素受体底物-1蛋白质家族(IRS1)、Gab1和Shc(Avruch，1998，Mol.Cell.Biochem.，182，31-48；Roth et al.，1988，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.53，537-543；White，1998，Mol.Cell.Biochem.，182，3-11；Laviola et al.，1997，J.Clin.Invest.99，830-837；Cheatham et al.，1995，Endocr.Rev.16，117-142)，导致不同细胞内介质的活化。尽管IR和IGF-IR相似地活化主要信号途径，但是两种受体之间在募集某些停靠蛋白和细胞内介质中存在差异(Sasaokaet al.，1996，Endocrinology 137，4427-4434；Nakae et al.，2001，Endocr.Rev.22，818-835；Dupont and Le Roith 2001，Horm.Res.55，Suppl.2，22-26；Koval et al.，1998，Biochem.J.330，923-932)。这些差异是IR活化引起的主要代谢作用的基础、和IGF-IR活化引起的主要促有丝***、转化和抗凋亡作用的基础(De Meyts et al.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.，766，388-401；Singh et al.，2000，Prisco et al.，1999，Horm.Metab.Res.31，80-89；ICido et al.2001，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86，972-979)。胰岛素以高亲和力结合至IR(比结合至IGF-IR高100倍)，而***(IGF1和IGF2)以比结合至IR高100倍的亲和力结合至IGF-IR。

人IR存在两种亚型IR-A和IR-B，其由IR基因的选择性剪接产生，其在IRα-亚基的C-端排除或者包括由小外显子(外显子11)所编码的12个氨基酸残基。IR亚型的相对丰度受组织特异性和未知因子调节(Moller et al.，1989，Mol.Endocrinol.，3，1263-1269；Mosthaf et al，1990，EMBO J.，9，2409-2413)。IR-B是在正常成人组织(脂肪组织、肝脏和肌肉)中占优势的IR亚型，所述组织是胰岛素代谢作用的主要靶组织(Moller et al.，1989；Mosthaf et al.，1990)。IR-A是在胎儿组织中占优势的亚型并介导对IGF2应答的胎儿生长(Frasca et al.，1999，Mol.Cell.Biol.，19，3278-3288)，正如在转基因小鼠中实施的遗传研究所提示的(DeChiara et al.，1990，Nature 345，78-80；Louvi et al.，1997，Dev.Biol.189，33-48)。而且，当细胞转化并变成恶性时，去分化经常与IR-A相对丰度增加相关(Pandini et al.，2002，The Journal of BiologicalChemistry，Vol.277，N°42，pp39684-39695)。

基于其高度同源性，胰岛素和IGF-I半受体(由一个α-亚基和一个β-亚基组成)可以异二聚化，导致胰岛素/IGF-I杂合受体(杂合体-R)的形成(Soos et al.，1990，Biochem J.，270，383-390；Kasuya et al.，1993，Biochemistry 32，13531-13536；Seely et al.，1995，Endocrinology 136，1635-1641；Bailyes et al.，1997，Biochem J.327，209-215)。

两种IR亚型都能够与IGF-IR形成杂合体。然而，杂合体-R具有不同的功能特征。杂合体-RsB对IGF1并且尤其是对IGF2的亲和力降低。相反，杂合体-RsA对IGF1具有高亲和力，并且在生理浓度范围内也结合IGF2和胰岛素。杂合体-RsA的表达通过两种不同机制上调IGF***，i)(以高亲和力)结合IGF1和IGF2并被其活化(对杂合体-RsB这不发生)，ii)胰岛素结合以后活化IGF-IR途径。胰岛素结合杂合体-RsA磷酸化IGF-IRβ-亚基并活化IGF-IR-特异性底物(Crk II)，使得杂合体-RsA转换胰岛素至IGF-IR信号传递(Pandini et al.，2002)。

在几种组织中，例如肝、脾或胎盘中，杂合体-R比IGF-IR更具代表性(Bailyes et al.，1997)。当肿瘤组织过表达或者出现异常活化IGF-IR和IR-A时(Frasca et al.，1999；Sciacca et al.，1999，Oncogene 18，2471-2479；Vella et al.，2001，Mol.Pathol.，54，121-124)，杂合体-RsA也可以在多种人恶性肿瘤包括甲状腺和乳癌中过表达，对能对由生理浓度IGF1和/或IGF2以及胰岛素刺激后IGF-IR信号传递类型作出应答的恶性细胞提供选择性生长优势(Bailyes et al.，1997；Pandini et al.，1999，Clin.Cancer Res.，5，1935-1944；Belfiore et al.，1999，Biochimie(Paris)81，403-407；Frasca et al.1999，Sciacca et al.，1999；Vella et al.，2001)。

根据本发明，这些抗体的特征还在于它们能够结合杂合体-R，并且如果需要的话，另外优选能够抑制杂合体-R的配体胰岛素、IGF1和/或IGF-2的天然附着，和/或能够特异性抑制所述杂合体-R的酪氨酸激酶活性。

本发明的一个主题是抗体、或其一种功能片段，其特征在于它还能够100％抑制由IGF1和/或IGF2诱导的IGF-IRβ-链(优选HT29细胞上的)磷酸化。

在另一方面中，根据本发明的抗体、或其一种功能片段的特征在于，它不表现任何内在拮抗活性。

此外，根据本发明的抗体、或其一种功能片段的特征在于，应用同样的FACS分析方法，它能够诱导：

i)在HT29细胞上至少30％的IGF-IR内化，和/或

ii)在MCF-7细胞上至少85％的IGF-IR内化。

根据本发明的抗体，或其一种功能片段的特征在于，应用同样的FACS分析方法，其能够诱导：

i)在HT29细胞上至少50％的IGF-IR降解，和/或

ii)在MCF-7细胞上至少65％的IGF-IR降解。

在另一实施方案中，根据本发明的抗体，或其一种功能片段的特征在于，它能够以至少等于1nM的IC₅₀以及针对IGF1和IGF2试验分别优选至少0.7和0.5nM的IC₅₀抑制由IGF1和IGF2诱导的MCF-7细胞的体外增殖。

根据本发明的抗体，或其一种功能片段的特征还在于，它能够抑制肿瘤细胞系的体内生长。

根据本发明的抗体优选为特异性单克隆抗体，尤其是鼠、嵌合或者人源化来源的，其可以根据本领域技术人员熟知的标准方法而获得。

通常，对于制备单克隆抗体其功能片段，尤其是鼠源的而言，可以参照在手册“抗体(antibodies)”(Harlow and Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY，pp.726，1988)中具体描述的技术，或者参照Kohler和Milstein所述从杂交瘤制备的技术(Nature，256：495-497，1975)。

例如，可以从用IGF-IR或其包含有表位(由本发明所述单克隆抗体特异性识别的表位)的一种片段免疫的动物细胞获得本发明的单克隆抗体。尤其可以根据通常的操作方法，通过以包含于cDNA序列中编码IGF-IR的核酸序列开始的遗传重组方法或者通过从包含有IGF-IR肽序列的氨基酸序列开始的肽合成方法，产生所述IGF-IR或其一种所述片段。

例如，本发明的单克隆抗体可以在亲和柱上被纯化，IGF-IR或其一种片段(其包含由本发明所述单克隆抗体特异性识别的表位)已被预先固定在所述柱上。更具体地，可以通过在蛋白质A和/或G上色谱纯化所述单克隆抗体，在该色谱纯化之后可以跟随或者不跟随离子交换色谱，其目的在于去除残留的蛋白质污染物以及DNA和LPS，其本身跟随或不跟随Sepharose凝胶排阻色谱，其是为了去除由于存在二聚体或者其它多聚体所致的潜在聚集物。以甚至更优选的方式，所有这些技术可以同时或者相继使用。

嵌合或者人源化抗体同样包括在本发明的抗体范围内。

嵌合抗体意指含有源于特定物种抗体的天然可变(轻链和重链)区并且与对于所述特定物种而言为异源物种抗体的轻链和重链恒定区相组合的抗体。

可以通过应用遗传重组技术制备本发明的嵌合型抗体或者它们的片段。例如，可以通过克隆含有启动子和根据本发明的编码非人的尤其是鼠的单克隆抗体的可变区的序列来产生嵌合抗体。例如，由该重组基因编码的本发明嵌合抗体将是鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由源于鼠DNA的可变区决定并且它的亚型由源于人DNA的恒定区所确定。例如，对于制备嵌合抗体的方法而言，可以参照文献Verhoeyn et al.(BioEssays，8：74，1988)。

人源化抗体意指含有源于非人起源抗体的CDR区的抗体，该抗体分子的其它部分源于一种(或者源于多种)人抗体。此外，可以修饰骨架(被称为FR)片段的一些残基，从而保留结合的亲和力(Jones et al.，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann et al.，Nature，332：323-327，1988)。

可以通过本领域技术人员熟知的技术(比如，例如在以下文献中所描述的Singer et al.，J.Immun.，150：2844-2857，1992；Mountain et al.，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或者Bebbington et al.，Bio/Technology，10：169-175，1992)制备本发明的人源化抗体或者它们的片段。本发明的这些人源化抗体优选用于体外诊断方法、或者体内预防性和/或治疗性处理的用途。本领域技术人员公知的其它人源化方法有，例如，由Protein Design Lab(PDL)在专利申请EP 0 451 261、EP 0 682040、EP 0 9 127、EP 0 566 647或者US 5,530,101、US 6,180,370、US5,585,089和US,5,693,761中描述的“CDR嫁接”(CDR Grafting)方法。还可以涉及以下专利申请：US 5,639,641、US 6,054,297、US5,886,152和US 5,877,293。本发明的抗体功能片段具体意指抗体片段，比如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双功能抗体(diabody)、或者通过化学修饰而使半衰期时间增加的任何片段，所述化学修饰比如添加聚(亚烃基)二醇比如聚乙二醇(“PEG化”)(PEG化的片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或者Fab’-PEG)(“PEG”指聚乙二醇)，或者通过掺入脂质体，所述片段具有本发明序列SEQ ID No.1、2、3、4、5或6的至少一种特征性CDR，并且尤其地它能够以通常方式发挥其来源抗体的即使一部分活性，比如尤其是识别和结合IGF-IR的能力，如果需要的话，以及抑制IGF-IR的活性。

优选地，所述功能片段的组成为或者包含其来源抗体的重链可变区或者轻链可变区的部分序列，所述部分序列足以保持与其来源抗体相同的结合特异性以及足够的亲和力，优选至少等于其来源抗体针对IGF-IR的亲和力的1/100、更优选至少1/10。

这种功能片段将包含其来源抗体序列的最少5个氨基酸，优选10、15、25、50和100个连续氨基酸。

优选地，这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab’)₂、F(ab’)、scFv-Fc型或者双功能抗体的片段，其通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。根据本发明，可以通过比如酶(比如胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过比如化学还原切割二硫键桥的方法从抗体(如上述抗体)开始获得本发明的抗体片段。以另一方式，可以通过本领域技术人员同样所熟知的遗传重组技术或者通过肽合成方法(例如自动肽合成仪，比如由Applied Biosystems公司所提供)等获得本发明所包括的抗体片段。

以更优选的方式，本发明包括通过遗传重组或者化学合成获得的根据本发明的抗体或者它们的功能片段，尤其是嵌合或者人源化抗体。

更具体地，根据本发明的一个优选实施方案，所述抗体的特征在于，它包含一种轻链，该轻链包含选自序列SEQ ID No.1、3或5的互补性决定区(CDR)的至少一个CDR或者序列经最优比对后与序列SEQ IDNo.1、3或5具有至少80％一致性的至少一个CDR，或者所述抗体的特征在于，它包含一种重链，该重链包含选自序列SEQ ID No.2、4或6的CDR的至少一个CDR或者序列经最优比对后与序列SEQ ID No.2、4或6具有至少80％一致性的至少一个CDR。

在本说明书中，术语附着至抗体化合物或其序列的多肽、多肽序列、肽和蛋白质是可以互换的。

必须理解本发明不涉及天然形式的抗体，即是说，它们不是在其天然环境中，但是它们已经能够通过从天然来源中纯化而分离或获得，或者也可通过基因重组或化学合成获得，并且然后它们能够包含将进一步描述的非天然氨基酸。

CDR区或CDR意思是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabat et al.所定义(Kabat et al.，Sequences of proteins ofimmunological interest，5th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH，1991，以及以后版本)。存在三种重链CDR和三种轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。

对本发明来说，两种核酸或者氨基酸序列间的“一致性百分数”是指，在最佳比对(最优比对)后所获得的、待比较的两序列之间相同核苷酸或相同氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的并且两种序列间的差异随机分布并覆盖其全长。两种核酸或者氨基酸序列之间的序列比较通常是在以最优方式使它们匹配以后，通过比较这些序列而进行，所述比较能够通过区段或者通过“比较窗”实施。除了能够手工实施外，用于比较序列的最优比对，还能够通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2：482]的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch的(1970)[J.Mol.Biol.48：443]局部同源性算法、通过Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)相似性搜索方法、通过使用这些算法的计算机软件实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，或者通过BLAST N orBLAST P比较软件)。

通过比较以最优方式匹配的两种序列，并且其中待比较核酸或氨基酸序列可以针对这两种序列间最优匹配的参考序列包含添加或者缺失，从而确定两种核酸或者氨基酸序列之间的一致性百分数。一致性百分数如下计算：通过确定两种序列间核苷酸或者氨基酸残基相同的一致性位置的数目，通过将该一致性位置数目除以“比较窗”中的总位置数并将所得结果乘以100，而获得这两种序列之间的一致性百分数。

例如，可以使用BLAST程序，“BLAST 2 sequences”(Tatusova etal.，″Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，该程序可以从网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html获得，参数使用默认值(尤其是对于参数“open gap penalty”：5，和“extension gappenalty”：2；所选择矩阵为例如该程序建议的矩阵“BLOSUM 62”)，通过该程序直接计算待比较的两种序列间的一致性百分数。

通过与参考氨基酸序列具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的氨基酸序列，优选那些相对于参考序列具有某些修饰的序列，尤其是至少一个氨基酸的缺失、添加或替换、截短或延长。在替换一或多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选用“等同”氨基酸替代被替换的氨基酸。表述“等同氨基酸”在此意思是指能够被基本结构的氨基酸之一所替换的任何氨基酸，然而，所述基本结构的氨基酸基本上不改变相应抗体的生物活性，并且例如将稍后定义，尤其是在实施例中。

本发明的一些替代实施方案提供其中具有其它氨基酸序列修饰的抗IGF-IR抗体。例如，可以期望来改善抗体的结合亲和性和/或其它的生物学特性。通过在抗IGF-IR抗体的核酸中引入适当的核苷酸变化或者通过肽合成来制备抗IGF-IR抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗IGF-IR抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或替换。应用缺失、***和替换的任何组合来获得最终的构建体，只要最终构建体具有期望特性即可。氨基酸变化还可以改变抗IGF-IR抗体的翻译后加工，比如改变糖基化位点的数目或者位置。

鉴定抗IGF-IR抗体的某些残基或者区域的优选诱变位置的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所描述的。在此，鉴定残基或者靶残基组(例如，带电的残基，比如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或者带负电氨基酸(最优选丙氨酸或者多聚丙氨酸)替换以影响氨基酸与IGF-IR抗原的相互作用。随后，通过在替换位置进一步引入其它变异来改进那些证明对替换具有功能敏感性的氨基酸位置。因此，当用于引入氨基酸序列变异的位点被预先确定时，突变本身的特性并不需要被预先确定。例如，为了分析特定位点突变的性能时，在靶密码子或者区域上实施ala扫描或者随机诱变并且筛选表达的抗IGF-IR抗体变体的期望活性。

氨基酸序列***包括氨基-和/或羧基-末端融合，其长度范围从一个残基至包含一百个或更多残基的多肽，以及单或多氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗IGF-IR抗体或者融合有细胞毒素多肽的所述抗体。所述抗IGF-IR抗体分子的其它***变体包括在抗IGF-IR抗体的N-或C-末端融合有酶(例如，ADEPT)或者多肽(其增加所述抗体的血清半衰期)的融合体。

另一类型的变体是氨基酸替换变体。在抗IGF-IR抗体分子的这些变体的至少一个氨基酸残基被不同的残基所替换。对于替换诱变而言的最感兴趣位置包括高变区，此外FR转换(FR alteration)也在考虑之内。在表1中“优选替换”标题下显示保守性替换。如果这些替换导致生物学活性的变化，那么就可以引入更多的改变(在表1中被命名为“典型替换”，或者参照以下氨基酸类别的进一步描述)，并且对该产物进行筛选。

表1氨基酸替换

初始残基	典型替换	优选替换
			Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V)	val；leu；ilelys；gln；asngln；his；asp；lys；argglu；asnser；alaasn；gluasp；glnalaash；gln；lys；argleu；val；met；ala；phe；正亮氨酸正亮氨酸；ile；val；met；ala；phearg；gln；asnleu；phe；ileleu；val；ile；ala；tyralathrsertyr；phetrp；phe；thr；serile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	vallysglngluserasnaspalaargleuileargleutyralathrsertyrpheleu

可以通过选择替换实现抗体生物学特性的显著变化，所述选择替换在它们对保持以下各项的影响方面有显著不同：(a)在替换区域中的多肽骨架结构，例如片层或者螺旋构象，(b)在靶位点处分子的电荷或者疏水性，或者(c)侧链大小(the bulk of the side chain)。根据共同侧链的特性将天然残基分成以下几组：

(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水的：cys、ser、thr；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；和

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守性替换使这些类别之一的成员与另一类别进行交换。

通常还可以用丝氨酸替换不参与维持抗IGF-IR抗体适当构象的任何半胱氨酸残基，从而改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以向抗体加入半胱氨酸键以改善它的稳定性(尤其在所述抗体是抗体片段比如Fv片段的情形)。

替换变体的尤其优选类型包括替换亲本抗体(例如人源化或者人抗体)高变区的一个或多个残基。通常，所选择用于进一步开发的所得变体将具有相对于亲本抗体(所述变体从该抗体产生)而言改进的生物学特性。用于产生这种替换变体的便捷方式包括应用噬菌体展示技术的亲和力成熟。简单地说，使几个高变区位点(例如，6-7个位点)突变以产生每个位点的所有可能氨基酸替换。因此，作为包装在每个颗粒内的与M13的基因III产物相融合的形式，从丝状噬菌体颗粒以单价方式展示由此产生的抗体变体。随后筛选噬菌体展示变体的如本文所公开的生物学活性(例如，结合亲和性)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以实施丙氨酸扫描诱变以鉴定明显有助于抗原结合的高变区残基。作为替代或者除此之外，分析抗原抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人IGF-IR之间的接触点可以是有益的。根据本文详述的技术，这些接触残基和邻近残基是候选的替代。一旦产生这类变体，根据本文所述筛选这些变体集合并且可以选择在一个或多个相关测定中具有优越特性的抗体用于进一步的开发。

抗体另一类型的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意指抗体中缺失了一个或多个糖类部分，和/或添加抗体中本来没有的一个或多个糖基化位点。

抗体的糖基化通常是N-连接的或者O-连接的。N-连接表示糖类部分连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将糖类部分经酶连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列的任一种就产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化表示将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或者木糖连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸和苏氨酸，而且还可以应用5-羟基脯氨酸或者5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列以使得抗体包含一个或多个上述三肽序列(针对N-连接的糖基化位点)可以便捷地实现向所述抗体添加糖基化位点。也可以通过向原始抗体序列添加或替换一个或多个丝氨酸或者苏氨酸残基(针对O-连接的糖基化位点)来实现所述改变。

通过本领域公知的多种方法制备编码所述抗IGF-IR抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在存在天然氨基酸序列变体的情形)或者通过对先前制备的抗IGF-IR抗体的变体或非变体形式实施寡核苷酸介导(或者位点指导的)的诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

有时，可能希望改善本发明抗体的效应功能，例如，从而增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体Fc区引入一个或多个氨基酸替换来实现。作为替代或者除此之外，可以在Fc区引入半胱氨酸残基，由此允许在该区中形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤力和抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。见Caron et al.，J.Exp Med.，176：1191-1195 (1992)和Shopes，B.J.Immunol.，148：2918-2922(1992)。也可以应用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体，如Wolff et al.，Cancer Research，53：2560-2565(1993)所述。或者，可以改造抗体，以使其具有双Fc区并且可以由此具有增强的补体溶血和ADCC能力。见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

同样地，为了增加抗体的血清半衰期，可以向抗体(尤其是抗体片段)掺入补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)，如美国专利No.5,739,277所述。如本文使用的，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或者IgG₄)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。

以一种更优选的方式，本发明涉及根据本发明的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它包含一种重链，该重链包含序列SEQ ID No.2、4和6的三个CDR的至少两个或者三个，或者经最优比对后与序列SEQID No.2、4和6分别具有至少80％一致性的序列的三个CDR的至少两个或者三个。

在一个更优选的实施方案中，本发明的目标是根据本发明的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它包括一种轻链，该轻链包含序列SEQID No.1、3和5的三个CDR的至少两个或者三个，或者经最优比对后与序列SEQ ID No.1、3和5分别具有至少80％一致性的序列的三个CDR的至少两个或者三个。

以一个更优选的方式，本发明的抗体或其一种功能片段的特征在于，它包含一种重链，该重链包含序列SEQ ID No.2、4和6的三个CDR，或者经最优比对后与序列SEQ ID No.2、4和6分别具有至少80％一致性的序列的三个CDR，并且它还包含一种轻链，该轻链包含序列SEQ IDNo.1、3和5的三个CDR，或者经最优比对后与序列SEQ ID No.1、3和5分别具有至少80％一致性的序列的三个CDR。

根据现有技术，已知对于重链的3个CDR并且更具体地为CDR-H3观察到6个CDR之间的最大可变异性(长度和组成)。因而，应当理解本发明抗体的优选典型CDR是重链的3个CDR，即由序列SEQ ID No.2、4和6编码的CDR并且更优选对应于由SEQ ID No.6编码的CDR-H3的CDR。

根据另一方面，本发明的一个主题是根据本发明的抗体或其一种功能片段，其特征在于它不附着于或者不以显著方式附着于人胰岛素受体IR。

以一个优选的方式，根据本发明的所述功能片段将选自Fv、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv-Fc或者双功能抗体的片段，或者通过化学修饰、尤其通过PEG化或者通过掺入脂质体而使半衰期增加的任何功能片段。

根据另一方面，本发明涉及鼠杂交瘤，其能够分泌本发明的单克隆抗体，尤其是比如在2005年6月23日以I-3466号保藏在国家微生物保藏中心(CNCM，National Center of Microorganism Culture)(InstitutPasteur，Paris，France)的鼠源杂交瘤，该杂交瘤源于经免疫小鼠的Balb/c脾细胞与Sp2O Ag 14骨髓瘤细胞系的融合。

在本文中被称为I-3466的单克隆抗体或其一种功能片段的特征在于，通过于2005年6月23日以I-3466号保藏在CNCM的杂交瘤分泌所述抗体，当然，该杂交瘤是本发明的一部分。

在一个具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的鼠抗体或其一种功能片段，其特征在于，所述抗体包含一种轻链，该轻链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.7或者经最优比对后与序列SEQ ID No.7具有至少80％一致性的序列，或/和在于它包含一种重链，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8或者经最优比对后与序列SEQ ID No.8具有至少80％一致性的序列。

根据另外的特定方面，本发明涉及根据本发明的嵌合抗体或者它的一个功能片段，其特征在于，所述抗体还包含源于对小鼠为异源物种(尤其是人)的抗体的轻链和重链恒定区，并且优选源于人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。

在对应于同种型IgG1的一个特定实施方案中，所述抗体的补充特性是潜在地展示出如ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和/或CDC(补体依赖性细胞毒性)的效应功能。

根据另外的特定方面，本发明涉及根据本发明的人源化抗体或其一种功能片段，其特征在于，所述抗体包含轻链和/或重链，其中所述轻链和/或重链的骨架片段FR1-FR4分别源于人抗体轻链和/或重链的骨架片段FR1-FR4。

根据一个优选实施方案，根据本发明的人源化抗体或者它的一个功能片段的特征在于，所述人源化抗体包含一个轻链，该轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.17或者经最优比对后与序列SEQ ID No.17具有至少80％一致性的序列，或/和在于它包含一个重链，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.18或者经最优比对后与序列SEQ ID No.18具有至少80％一致性的序列。

优选地，根据本发明的人源化抗体或者它的一个功能片段的特征在于，所述人源化抗体包含一个轻链，该轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.17，并且在于它包含一个重链序列，该重链序列包含氨基酸序列SEQ IDNo.18。

根据一个新的方面，本发明涉及分离的核酸，其特征在于它选自以下核酸：

a)编码本发明的抗体或其一种功能片段的核酸、DNA或者RNA；

b)如a)定义的核酸的互补核酸；

c)能够在高严谨条件下与核酸序列SEQ ID No.9、10、11、12、13或14的至少一个CDR或者经最优比对后与序列SEQ ID No.9、10、11、12、13或14具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸；

d)能够在高严谨条件下与核酸序列SEQ ID No.15的至少轻链和/或核酸序列SEQ ID No.16的重链或者经最优比对后与序列SEQ ID No.15或16具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸；

e)能够在高严谨条件下与核酸序列SEQ ID No.19的至少轻链和/或核酸序列SEQ ID No.20的重链或者经最优比对后与序列SEQ ID No.19或20具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸。

核酸、核序列或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，这些术语将在本说明书中无差异地使用，意思是指准确连接的核苷酸，其被修饰或未被修饰，其允许定义核酸片段或区域，包含或不包含非天然核苷酸，并且能够对应双链DNA、单链DNA以及所述DNA的转录产物。

这里也必须应该理解，本发明不涉及在天然染色体环境即是说天然状态中的核苷酸序列。本发明涉及已经被分离和/或纯化的序列，即是说所述序列已经被直接或间接选择，例如通过拷贝，它们的环境至少已经被部分改变。从而，本发明也旨在指示通过例如宿主细胞的基因重组或者化学合成所获得的分离核酸。

经最优比对后与优选序列具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性百分率的核酸序列意指，相对于参照核酸序列具有某些修饰比如特别是缺失、截短、延长、嵌合融合和/或替换、尤其是点替换的核酸序列。优选涉及编码与参照序列相同的氨基酸序列的序列，这涉及到遗传密码的简并性，或者能够与参照序列特异性杂交的互补序列，优选在高严谨条件下，尤其是如以下定义的。

在高严谨度条件下的杂交表示选择温度条件和离子强度条件，使得它们允许维持两个互补DNA片段之间的杂交。作为实例，对于定义上述多核苷酸片段目的的杂交步骤的高严谨度条件，有利地是以下条件。

以两个步骤实施DNA-DNA或者DNA-RNA杂交：(1)在42℃下，在含5x SSC(1x SSC对应0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10x Denhardt′s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑精DNA的磷酸缓冲液(20mM，pH 7.5)中预杂交3小时；(2)在取决于探针大小的温度下实际杂交20小时(即：对于探针大小＞100个核苷酸，42℃)，接着在20℃在2x SSC+2％SDS中洗涤20分钟进行2次，在0.1x SSC+0.1％SDS中洗涤20分钟进行1次。对于探针大小＞100个核苷酸在60℃下，在0.1x SSC+0.1％SDS中进行30分钟的最后洗涤。根据Sambrook et al.的教导(1989，Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor)，对于更大或更小的寡核苷酸，上述对于确定大小多核苷酸的高严谨度杂交条件可以被本领域技术人员进行适应性修改。

本发明同样涉及包含根据本发明核酸的载体。

本发明目的尤其在于包含根据本发明核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

根据本发明的载体优选包含允许在确定的宿主细胞中表达和/或分泌所述核苷酸序列的元件。因此所述载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号、以及适当的转录调节区。它必须能够以稳定方式在宿主细胞中维持，并且能任选地具有指定所翻译蛋白质分泌的特定信号。作为所用宿主细胞的函数，由本领域技术人员选择和优化这些不同元件。为此，根据本发明的核苷酸序列可以被***所选宿主的自主复制载体中，或者是所选宿主的整合载体。

这些载体由本领域技术人员通过当前使用的方法制备，并且通过标准方法可将所得克隆导入适当宿主中，所述标准方法例如脂转染、电穿孔、热休克、或者化学方法。

根据本发明的载体例如是质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞，以克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。

本发明也包含用根据本发明的载体转化或者包含根据本发明的载体的宿主细胞。

宿主细胞可以选自原核或者真核***，例如细菌细胞以及酵母细胞或者动物细胞尤其是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫细胞或者植物细胞。

本发明也涉及动物，人除外，其包含至少一种根据本发明转化的细胞。

根据另一个方面，本发明的主题是生产根据本发明的抗体或其功能片段之一的方法，其特征在于其包含以下步骤：

a)在培养基中和适当的培养条件下培养本发明的宿主细胞；和

b)从培养基或者所述培养细胞回收由此产生的所述抗体或其一种功能片段。

根据本发明转化的细胞可以被用于根据本发明制备重组多肽的方法。根据本发明以重组方式制备多肽的方法本身被包含在本发明中，所述方法特征在于其利用根据本发明的载体和/或由载体转化的细胞。优选在允许表达所述多肽的条件下培养由根据本发明的载体转化的细胞并回收所述重组肽。

正如所说，宿主细胞可以选自原核或者真核***。具体而言，可以鉴定根据本发明的核苷酸序列，辅助在这些原核或真核***中的分泌。因此，携带这种序列的根据本发明载体可以有利地被用于生产旨在被分泌的重组蛋白质。对此，这些感兴趣重组蛋白质的纯化将受益于以下事实：它们存在于细胞培养物的上清液中而不是在宿主细胞内部。

也可以通过化学合成制备根据本发明的多肽。这种制备方法也是本发明的主题。本领域技术人员已知化学合成方法，例如使用固相的技术(尤其见Steward et al.，1984，Solid phase peptide synthesis，PierceChem.Company，Rockford，111，2nd ed.(1984))或者使用部分固相的技术、通过片段缩合或者通过经典的溶液中合成。通过化学合成获得并能够包含相应非天然氨基酸的多肽同样也包含在本发明中。

通过根据本发明的方法能够获得的抗体或其功能片段之一同样包含在本发明中。

根据第二实施方案，本发明涉及根据本发明的抗体比如如上所述的抗体，其特征在于，它还能够特异性结合人的酪氨酸激酶家族的受体和/或能够抑制该受体的酪氨酸激酶活性。

在第一实施方案中，这样的抗体由双特异性抗体组成，其包含能够特异性抑制EGF与人表皮生长因子受体(EGFR)结合的和/或抑制所述EGFR酪氨酸激酶活性的第二基序。在本发明的一个更优选实施方案中，所述第二抗EGFR基序是由鼠单克隆抗体225、其嵌合衍生物C225或者源于此抗体225的任何人源化抗体产生的。

在第二实施方案中，这样的抗体由双特异性抗体组成，其包含能特异性抑制由HER2/neu受体所调节活性的和/或抑制所述HER2/neu受体酪氨酸激酶活性的第二基序。在本发明的一个更优选实施方案中，所述第二抗HER2/neu基序是由鼠单克隆抗体4D5或2C4或者人源化抗体Trastuzumab或者Pertuzumab产生的。

在第三实施方案中，这样的抗体由双特异性抗体组成，其包含能够特异性抑制肝细胞生长因子(HGF)与cMET受体结合的和/或特异性抑制所述cMET受体酪氨酸激酶活性的第二基序。

最终，在最后的实施方案中，这样的抗体由双特异性抗体组成，其包含能够特异性抑制巨噬细胞刺激蛋白(MSP)与RON受体结合的和/或抑制所述RON受体酪氨酸激酶活性的第二基序。

根据本发明的另一实施方案，还考虑根据本发明的抗体能够与涉及肿瘤发生的任何种类受体(比如，例如不限于VEGFR、FGF(成纤维细胞生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)或者CXCR4或2(趋化因子受体4或2型))相互作用。

双特异性或者双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区在同一个分子中组合(Hollinger and Bohlen，1999，Cancer andmetastasis，rev.18：411-419)。在诊断领域和在治疗领域中已证明了它们的用途，这是由于它们募集新效应因子的功能或者靶向肿瘤细胞表面上几种分子的能力所致。可以通过化学方法(Glennie MJ et al.，1987，J.Immunol.，139，2367-2375；Repp R.et al.，1995，J.Hemat.，377-382)或者体细胞法(Staerz U.D.and Bevan M.J.，1986，PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.et al.，1986，Method Enzymol.，121：210-228)但同样地和优选地通过遗传工程技术(其允许异二聚体化被加强并因此有利于纯化所寻找抗体的纯化过程(Merchand et al.，1998 Nature Biotech.，16：677-681))获得这些抗体。

可以将这些双特异性抗体构建为完整的IgG、双特异性Fab’2、Fab’PEG或者双功能抗体或者其它的双特异性scFv，以及同样的四价双特异性抗体或者存在有针对各个目标抗原的两个附着位点的抗体(Park et al.，2000，Mol.Immunol.，37(18)：1123-30)或者其如上所述的片段。

除了由于生产和施用双特异性抗体比生产两种特异性抗体较省力所致的经济益处之外，应用这样的双特异性抗体还具有降低治疗毒性的优点。这是因为应用双特异性抗体允许循环抗体的总量减少，并因此降低可能的毒性。

在本发明的一个优选实施方案中，双特异性抗体是二价或者四价抗体。

本发明同样涉及药物组合物，其包含由本发明抗体或其一种功能片段组成的活性形式的化合物，优选混合有赋形剂和/或药物可接受载体。

仍根据另一实施方案，本发明同样涉及如上所述的药物组合物，其包含至少一种第二化合物，该第二化合物选自能特异性抑制IGF-IR、EGFR、HER2/neu、VEGFR、cMET和/或RON的酪氨酸激酶活性的化合物。

在本发明的第二优选方面中，所述第二化合物选自分离的抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗VEGFR、抗cMET和/或抗RON抗体或者它们的功能片段，其能够抑制由所述受体介导的增殖和/或抗凋亡和/或血管生成和/或转移弥散诱导活性。

根据本发明的另一实施方案，所述组合物包含至少一种IGF-IR、EGFR、HER2/neu、VEGFR、cMET和/或RON的酪氨酸激酶活性的抑制剂，作为用于同时、分开或者依次应用的组合物。

在另一优选实施方案中，所述的受体的酪氨酸激酶活性的抑制剂选自衍生的天然试剂、二苯胺基邻苯二甲酰亚胺类化合物(dianilinophthalimides)、吡唑并-或者吡咯并吡啶并嘧啶类化合物或者喹唑啉类化合物(quinazilines)。这些抑制剂对于本领域的技术人员是众所周知的并且在文献(Ciardiello E，Drugs 2000，Suppl.1，25-32)中有描述。

本发明的另一个补充实施方案是如上述的组合物，作为同时、分开或依次使用的组合产品，其还包含细胞毒性剂/细胞静止剂和/或分别对应于IGF-I和/或EGF受体的酪氨酸激酶活性的抑制剂。

“同时使用”被理解为意指在单个和同一药物形式中施用根据本发明组合物的两种化合物。

“分开使用”被理解为意指在同时、在不同的药物形式中施用根据本发明组合物的两种化合物。

“依次使用”被理解为意指各自在不同的药物形式中依次施用根据本发明组合物的两种化合物。

在常用方式中，根据本发明的组合物显著增加癌症治疗的功效。换句话说，通过施用细胞毒性剂，根据本发明的抗-IGF-IR抗体的治疗作用以出乎意料的方式被增强。根据本发明的组合物产生的另一个主要的相应优点涉及使用较低功效剂量的活性成分的可能性，其允许避免或者降低次要作用出现的风险，尤其是细胞毒性剂的作用。

另外，根据本发明的这种组合物允许更快获得期望的治疗效果。

“抗癌治疗剂”或者“细胞毒性剂”意指当施用给对象时，治疗或者预防对象身体中癌症发生的物质。作为这类试剂的非限制性实例，它可以是烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝***抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管发生剂、抗***、抗雄激素或者免疫调节剂。

这样的化合物有，例如，在引用的2001版VIDAL中关于癌学和血液学栏的“细胞毒素”的页上涉及的化合物，这些在该文献中引用的细胞毒性化合物在本文中被引用作为优选的细胞毒性剂。

更具体地，以下试剂是本发明优选的。

“烷化剂”是指能够交联或者使任何分子(优选细胞内的核酸(例如，DNA))烷基化的任何物质。烷基化剂的实例包括氮芥比如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、chlorambucol、苯丙氨酸氮芥、chlorydrate、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、磷酸氢二钠(disodic-phosphate)或者雌氮芥；oxazophorins比如环磷酰胺、六甲蜜胺(altretamine)、曲磷胺、sulfofosfamide或者异环磷酰胺；氮丙啶类(aziridines)或者吖丙啶类(imine-ethylenes)比如硫替派、三乙撑胺(triethylenamine)或者altetramine；亚硝基脲类比如卡氮芥(carmustine)、链脲霉素、福莫司汀(fotemustin)或者洛莫司汀(lomustine)；烷基磺酸盐比如白消安(busulfan)、苏消安(treosulfan)或者英丙舒凡(improsulfan)；三氮烯类(triazenes)比如氮烯唑胺(dacarbazine)；或者铂类络合物比如顺铂、奥克赛铂(oxaliplatin)和卡波铂(carboplatin)。

“抗代谢物”是指通过干扰某些活性(通常为DNA合成)阻断细胞生长和/或代谢的物质。抗代谢物的实例包括氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、2-脱氧氟尿苷(floxuridine)、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷、氟阿糖腺苷(fludarabine)、胞嘧啶***糖苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮胞苷、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine)、脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)和喷妥司汀。

“抗肿瘤抗生素”是指可以防止或者抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。抗肿瘤抗生素的实例包括阿霉素、道诺红菌素(daunorubicin)、黄胆素(idarubicin)、戊柔比星、米托蒽醌(mitoxantrone)、放线菌素D、光神霉素、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素C、博莱霉素和甲基苄肼。

“有丝***抑制剂”阻止细胞周期和有丝***的正常进程。通常，微管抑制剂或者紫杉醇化合物(taxoides)比如紫杉醇(paclitaxel)和紫杉特尔(docetaxel)能够抑制有丝***。长春花属生物碱(vincaalkaloid)比如长春茂碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)也能够抑制有丝***。

“染色质功能抑制剂”或者“拓扑异构酶抑制剂”是指抑制染色质建构蛋白(modeling proteins)正常功能的物质，比如拓扑异构酶I或者拓扑异构酶II。染色质功能抑制剂的实例包括，针对拓扑异构酶I的喜树碱和其衍生物比如托泊替康(topotecan)或者伊立替康(irinotecan)和针对拓扑异构酶II的依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)和替尼泊苷(teniposide)。

“抗血管发生剂”是指抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或者试剂。示例性抗血管发生剂包括但不限于雷佐生(razoxin)、马立马司他(marimastat)、巴马司他(batimastat)、prinomastat、tanomastat、伊洛马司他(ilomastat)、CGS-27023A、卤夫酮(halofuginon)、COL-3，新伐司他(neovastat)、BMS-275291、萨利多胺(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、L-651582、鲨胺、内皮抑素(endostatin)、SU5416、SU6668、干扰素-α、EMD121974、白介素-12、IM862、血管生成抑制素和vitaxin。

“抗***”或者“抗***剂”是指降低、拮抗或者抑制***作用的任何物质。抗***剂的实例有他莫西芬、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、阿纳曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)和依西美坦(exemestane)。

“抗雄激素”或者“抗雄激素剂”是指降低、拮抗或者抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素的实例有氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、sprironolactone、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)和甲氰咪呱(cimitidine)。

免疫调节剂是刺激免疫***的物质。

免疫调节剂的实例包括干扰素、白介素比如阿地白介素(aldesleukine)、OCT-43、denileukin diflitox和白介素-2、肿瘤坏死因子比如tasonermine或者其它免疫调节剂比如香菇多糖、西佐喃、罗喹美克、匹多莫德(pidotimod)、培加酶、胸腺喷丁、多聚I:C或者左旋四咪唑连同5-氟尿嘧啶。

对于更多的细节，本领域的技术人员可以参照由“AssociationFrancaise des Enseignants de Chimie Therapeutique”编辑并且题目为“traite de chimie therapeutique，vol.6，Medicaments.antitumoraux etperspectives dans Ie traitement des cancers，edition TEC & DOC，2003”的手册。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的作为组合产品的所述组合物的特征在于，所述细胞毒性剂与所述抗体化学偶联用于同时应用。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的所述组合物的特征在于，所述细胞毒性剂/细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或者稳定剂，优选长春瑞滨(vinorelbine)和/或长春氟宁(vinflunine)和/或长春新碱。

为了促进所述细胞毒性剂和本发明所述抗体之间的偶联，尤其可以在待偶联的两个化合物之间引入间隔分子，比如聚亚烷基二醇如聚乙二醇，或者其它的氨基酸，或者在另一实施方案中，能够应用所述细胞毒性剂的衍生物，并已向其引入能够与本发明所述抗体反应的功能。这些偶联技术对于本领域的技术人员是众所周知的并且将不在本说明书中详述。

其它的EGFR抑制剂能够没有任何限制的由抗EGFR单克隆抗体C225和22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)或者化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、来氟米特(leflunomide)(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner-LambertParke-Davis)、CI-1033/PD 183、805(Warner-Lambert Parke-Davis)、CL-387、785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer MannheimGmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol-Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck &Co)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer ResearchFund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes CancerCenter)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)或者“EGFR疫苗”(York Medical/Centro de Immunologia Molecular)组成。

根据本发明另一个实施方案，如上述的组合物也可以包含另一种抗-HER2/neu受体细胞外结构域的抗体化合物，作为用于同时、分开或者依次使用的组合产品，其旨在预防和治疗癌症，尤其是过表达所述HER2/neu受体和受体IGF-IR和/或EGFR的癌症，例如尤其是乳癌。

尤其可以参考Albanell et al.(J.of the National Cancer Institute，93(24)：1830-1831，2001)和Lu et al.(J.of the National Cancer Institute，93(24)：1852-1857，2001)的出版物，其支持将抗-HER2/neu抗体与根据本发明的抗-IGF-IR抗体相组合的意外兴趣。

在一种具体方式中，根据本发明组合物的所述抗-HER2/neu抗体是被称为Trastuzumab(也被称为Herceptin)的抗体。

在另一个方面中，本发明涉及一种组合物，其特征在于一种、至少一种所述抗体或其功能片段之一与细胞毒性剂和/或放射性元素偶联。

优选所述毒素或者所述放射性元素能够抑制表达IGF-IR的细胞的至少一种细胞活性，在更优选的方式中，能够阻止所述细胞的生长或者增殖，尤其是能够完全灭活所述细胞。

还优选，所述毒素是肠细菌毒素，尤其是假单胞菌外毒素A。

优选与所用抗体偶联用于治疗的放射性元素(或者放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素，并且优选碘¹³¹、钇⁹⁰、金¹⁹⁹、钯¹⁰⁰、铜⁶⁷、铋²¹⁷、和锑²¹¹。发射β和α射线的放射性同位素也可以用于治疗。

与根据本发明至少一种抗体或其功能片段之一偶联的毒素或者放射性元素，意思是指允许所述毒素或者所述放射性元素结合至所述至少一种抗体的任何方式，尤其是通过两种化合物间的共价偶联，可以引入或不引入连接分子。

在允许以化学(共价)、静电或者非共价方式结合偶联物的全部或部分组分的试剂中，尤其要提及的是苯醌、碳二亚胺并且更尤其是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]-碳二亚胺盐酸盐)、二马来酰亚胺、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、具有一个或多个可与紫外线(U.V.)反应的叠氮苯基团的桥联剂，并优选N-[-4-(叠氮基水杨基氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)-丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。

另一种形式的偶联，尤其对于放射性元素而言，可以存在于使用双功能离子螯合剂。

在这些螯合剂中，可以提及来源于EDTA(乙二胺四乙酸)或者DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的螯合剂，其已经被开发用于结合金属尤其是放射性金属、和免疫球蛋白。因此，为了增加配体金属络合物的稳定性和刚度，可以在碳链上用不同基团取代DTPA及其衍生物(Krejcarek et al.，1977；Brechbiel et al.，1991；Gansow，1991；USpatent 4,831,175)。

例如，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物，其已经以游离形式或者以与金属离子络合物的形式长期广泛用于医药和生物学中，具有与金属离子形成稳定螯合物的显著特性并且能与治疗或诊断兴趣的蛋白质如抗体偶联，以开发用于癌症治疗的放射性免疫偶联物(Meases et al.，1984；Gansow et al.，1990)。

同样优选，根据本发明形成所述偶联物的所述至少一种抗体选自其功能片段，尤其是截除其Fc部分的片段、如scFv片段。

本发明还包含根据本发明的组合物用于制备药物的用途。

更具体而言，根据另一个实施方案，本发明涉及抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗由IGF-IR的过表达和/或异常活化所诱导的疾病、和/或与由IGF1或IGF2与IGF-IR相互作用所介导的信号转导途径的过度活化相关的疾病。

仍根据另一优选实施方案，本发明涉及抗体或其一种功能片段和/或组合物用于制备预防或治疗疾病的药物的用途，所述疾病是由于IGF-IR的过表达和/或异常活化引起的，和/或与由IGF2与IGF-IR相互作用所介导信号的转导途径的过度活化有关的。

优选地，根据本发明的所述用途，其特征在于施用所述药物不诱导或者仅仅诱导与胰岛素受体IR抑制有关的轻微次级作用，即是说，由于存在所述药物抑制IR与其天然配体的相互作用，尤其是通过与所述药物与IR附着相关的竞争性抑制。

本发明还包含根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制正常细胞向具有肿瘤特征细胞的转化，所述肿瘤细胞优选具有IGF-依赖性、尤其是至少IGF2-依赖性细胞。

本发明也涉及根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，所述肿瘤细胞优选具有IGF-依赖性、尤其是至少IGF2-依赖性细胞。

在通常方式中，本发明的一个主题是根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗癌症，所述癌症优选表达IGF-IR和/或优选具有通过IGF1和/或IGF2与IGF-IR相互作用所介导信号转导途径的过度活化，例如IRS1的过量表达。

本发明的一个主题也是根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备旨在预防或者治疗牛皮癣的药物的用途，所述牛皮癣的表皮过度增殖可以与IGF-IR的表达或过表达有关，和/或与IGF-IR与其天然配体(Wraight CJ.et al.，Nat.Biotechnol.，2000，18(5)：521-526.通过***I受体反义寡核苷酸逆转牛皮癣中的表皮过度增殖)和/或EGFR与其天然配体的相互作用所介导信号转导途径的过度活化有关。

本发明还涉及抗体或者其任何功能片段(优选人源化的)和/或包含所述抗体的任何组合物用于制备治疗或者预防动脉粥样硬化的药物的用途。

在能够预防和/或治疗的癌症中，优选***癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或者卵巢癌或者其它任何过表达IGF-IR的癌症。

在一个更优选的实施方案中，由于置换IGF2的特定能力，本发明涉及根据本发明的抗体或者其片段用于预防、诊断或者治疗结肠癌的用途，因为已知该癌症尤其涉及IGF2。

根据另一个方面，本发明的一个主题是与IGF-IR过表达或低表达、优选过表达、相关的疾病诊断方法，优选体外诊断方法，所述IGF-IR来源于被怀疑异常存在IGF-IR的生物样品，其特征在于所述生物样品与根据本发明的抗体或其功能片段之一相接触，如果必要，所述抗体可以被标记。

优选地，在所述诊断方法中与IGF-IR过表达相关的疾病是癌症。

所述抗体或其功能片段之一可以免疫偶联物或者标记抗体的形式存在，以便获得可检测和/或可定量的信号。

本发明的一个主题是体外诊断特征在于相对于正常情形而言IGF-IR异常表达的病理状况的方法，所述方法包括让怀疑含有IGF-IR的生物学样品与本发明的抗体在有利于形成IGF-IR/抗体复合物的条件下接触，并且检测所述复合物以指示在所述样品中存在所述IGF-IR。在一个优选实施方案中，所述抗体以可检测的方式被标记。

在第一方面中，IGF-IR的异常表达是IGF-IR的过表达。在第二方面中，IGF-IR的异常表达是IGF-IR的欠表达(underexpression)。

根据本发明的标记抗体或其功能片段包括，例如被称为免疫偶联物的抗体，例如其可以偶联酶或分子，所述酶例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或者葡萄糖6-磷酸脱氢酶，所述分子例如生物素、地高辛或者5-溴脱氧尿苷。荧光标记物也可以偶联至根据本发明的抗体或其功能片段，并且尤其包括荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明及其衍生物、GFP(GFP指“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰基、伞形酮等。在这些偶联物中，本领域技术人员可以通过已知方法制备本发明的抗体或其功能片段。它们可以被直接偶联到酶或荧光标记物，或者通过间隔基团或连接基团介导，例如聚醛如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，或存在偶联剂如上面提及用于治疗性偶联物的偶联剂。含荧光素类型标记的偶联物可以通过与异硫氰酸酯反应制备。

其他偶联物也可以包括化学发光标记如鲁米诺、二氧杂环丁烷类(dioxetanes)，生物发光标记如萤光素酶和萤光素，也或者放射性标记如碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹²⁶、碘¹³³、溴⁷⁷、锝^99m、铟¹¹¹、铟^113m、镓⁶⁷、镓⁶⁸、钌⁹⁵、钌⁹⁷、钌¹⁰³、钌¹⁰⁵、汞¹⁰⁷、汞²⁰³、铼^99m、铼¹⁰¹、铼¹⁰⁵、钪⁴⁷、碲^121m、碲^122m、碲^125m、铥¹⁶⁵、铥¹⁶⁷、铥¹⁶⁸、氟¹⁸、钇¹⁹⁹、碘¹³¹。通过直接或者通过螯合剂如上面提及的EDTA、DTPA，本领域技术人员已知的将治疗性放射性同位素偶联至抗体上的现有方法可用于在诊断中可用的放射性元素。还可以提及的是通过氯胺T方法用Na[I¹²⁵]标记[Hunter W.M.and Greenwood F.C.，1962，Nature 194：495]，也或者通过Crockford et al.的技术用锝^99m标记(US patent 4,424,200)，或者如Hnatowich所述通过DTPA附着(US patent 4,479,930)。

因此，根据本发明的抗体或其功能片段可以用于检测和/或定量生物样品中IGF-IR的过表达或欠表达、优选过表达的方法，其特征在于其包含以下步骤：

a)让生物学样品与本发明的抗体或其一种功能片段相接触；和

b)证明可能形成的IGF-IR/抗体复合物。

在一个具体实施方案中，根据本发明的抗体或其功能片段可以用于检测和/或定量生物样品中的IGF-IR的方法，用于监测IGF依赖性癌症或者牛皮癣或粥样硬化的预防和/或治疗性处理的功效。

更通常地，根据本发明的抗体或其功能片段可以有利地用于必须以定性和/或定量方式观察IGF-IR表达的任何情况中。

优选地，生物样品由生物流体形成，例如人来源的血清、全血、细胞、组织样品或者活组织检查样品。

本发明的另一方面是用于预测***细胞样品致癌潜力的诊断方法，其包括以下步骤：

(a)提供人***组织的样品；和

(b)确定样品中存在IGF-IR，所述步骤包括让所述样品与本发明的抗体在有利于形成IGF-IR/抗体复合物的条件下接触，其中所述复合物的存在指示所述细胞在所述组织中有致癌性潜力。

在另一实施方案中，所述复合物的存在指示患者具有发生或发作特征在于所述IGF-IR过表达的病理疾病的风险。

本发明的一个目的还是跟踪治疗方案进程的方法，所述治疗方案设计用来减轻特征在于IGF-IR表达的异常表达的病理疾病，该方法包括以下步骤：

(a)分析来自对象的样品以确定在第一时间点的IGF-IR水平；

(b)分析在第二时间点的所述样品；和

(c)对在所述第二时间点的所述水平与在(a)中所确定水平进行比较作为对所述治疗方案效果的确定，其中在所述样品中IGF-IR水平的下降可确定在所述患者中所述病理疾病的消退，或者IGF-IR水平的增加可确定在所述患者中所述病理疾病的进展。

为了实施这种检测和/或给药，可以使用任何方法或者常规测试。所述测试可以是竞争或者三明治测试，或者是本领域技术人员已知的依赖于抗体-抗原型免疫复合物形成的任何测试。根据本发明施用以后，抗体或其功能片段之一可以被固定或者标记。可以在本领域技术人员已知的很多支持物上实施固定。这些支持物尤其可以包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、或者天然或修饰细胞。这些支持物可以是可溶或者不可溶的。

作为实例，一种优选方法使用根据ELISA技术免疫酶方法、通过免疫荧光或放射免疫测定(RIA)技术或者等同技术。

因此，本发明也包含试剂盒或套装，其是实施由IGF-IR过表达或低表达所诱导疾病的诊断方法所必要的、或者实施检测和/或定量生物样品中IGF-IR过表达或低表达的方法所必要的，其特征在于所述试剂盒或者套装包含以下要素：

a)本发明的抗体或其一种功能片段；

b)任选地，用于形成有助于免疫反应的介质的试剂；

c)任选地，允许验证由免疫反应产生的IGF-IR/抗体复合物的试剂。

本发明还涉及组合物作为根据本发明的组合产品用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗癌症，尤其是一般处方所述细胞毒性剂或所述抗-HER2/neu抗体的癌症，对该癌症所述肿瘤细胞表达或者过表达IGF-IR。

本发明的另一个主题是根据本发明的抗体用于制备药物的用途，所述药物旨在将生物活性化合物特异性靶向至表达或过表达IGF-IR的细胞。

本文中生物活性化合物意思是指能够调节尤其是抑制细胞活性尤其是其生长、增殖、转录或者基因翻译的任何化合物。

本发明的另一个主题是包含根据本发明的抗体或其功能片段之一的体内诊断试剂，所述抗体优选被标记尤其是放射标记，及其在医学影像中的用途，尤其是用于检测与细胞表达或过表达IGF-IR相关的癌症。

本发明也涉及作为组合产品的根据本发明的组合物，或者涉及作为药物的根据本发明的抗-IGF-IR/毒素偶联物或放射性元素。

优选作为组合产品的根据本发明所述组合物或者所述偶联物，将与赋形剂和/或药用可接受的载体混合。

在本说明书中，药用可接受的载体意思是指进入药物组合物中而不激发次级反应的化合物或者化合物组合，并且其允许例如促进活性化合物的施用、增加其使用期限和/或体内功效、增加其在溶液中的溶解度或者改善其保存性能。这些药用可接受的载体是公知的并且将被本领域技术人员作为所选活性化合物的本性和施用模式的函数进行适应性修改。

优选地，通过***途径施用这些化合物，尤其通过静脉途径、肌肉、皮内、腹膜内或者皮下途径、或者通过口服途径。在一种更优选方式中，包含根据本发明抗体的组合物将以依次方式几次施用。

可以根据确定适用于患者的治疗一般所考虑的标准来确定其施用模式、剂量和最优药物形式，这些标准例如患者年龄或者体重、其一般健康状况的严重性、对治疗以及所提及次级作用的耐受性。

本发明的其它特征和优点将与实施例和附图一起出现在说明书下面的连续部分中，其附图说明如下所示。

附图说明

图1：单克隆抗体I-3466对[¹²⁵I]-IGF-1结合IGF-IR的竞争。

作为配体浓度的函数，在半对数图上对[¹²⁵I]-IGF-1的特异性结合(％)作图。特异性结合的值是实施试验三次的平均值。

图2：单克隆抗体I-3466对[¹²⁵I]-IGF-2结合IGF-IR的竞争。

作为配体浓度的函数，在半对数图上对[¹²⁵I]-IGF-2的特异性结合(％)作图。特异性结合的值是实施试验三次的平均值。

图3A和3B：I-3466抗体对IGF1或者IGF2诱导的MCF-7生长的体外影响。

图4A和4B：I-3466Mab对IGF1(图4A)或者IGF2(图4B)诱导的MCF-7细胞上IGF-IRβ链的磷酸化的影响。

图5A和5B：I-3466Mab对IGF1(图5A)或者IGF2(图5B)诱导的HT29细胞上IGF-IRβ链的磷酸化的影响。

图6A-6C：I-3466在DU145(图6A)、SK-ES-1(图6B)、HT29(图6C)、A549(图6D)和MCF-7(图6E)异种移植肿瘤模型中的体内活性。

图7：小鼠I-3466(SEQ ID No.7)的和经CDR移植I-3466人源化的(SEQ ID No.20)的轻链(VL)可变区氨基酸序列的比较。

符号^*(星号)表示对维持CDR环构象重要的残基，符号#(井号)表示在VL/VH界面上发现的保守残基。

图8：小鼠I-3466(SEQ ID No.8)的和经CDR移植I-3466人源化的(SEQ ID No.21)的重链(VH)可变区氨基酸序列的比较。

图9：纯化的I-3466抗体的SDS-PAGE分析。图例如下：

M：标志物，

泳道1：I-3466人源化可变区，

泳道2：I-3466小鼠可变区，

图A：还原SDS-PAGE，

图B：非还原SDS-PAGE。

小鼠和人源化3466的恒定区都是人的。

图10：生物传感器捕获测定的示意图。

抗恒定Fc部分的人IgG1 Mab共价地附着至CM5传感器表面上。固定有限量的待检测Mab并用来捕获分析物hIGF-IR-ECD。分别用结合和解离率的常数K_a和K_d来表征Mab与分析物的结合。通过解离和结合率常数的比来计算平衡解离常数(KD)。

图11：针对5个不同浓度的hIGF-IR-ECD，IgG1人源化I-3466/hIGF-IR-ECD复合物的结合和解离期的传感器结果图。

实施例1：鼠单克隆抗体(MAb)的产生和选择

为了产生特异性抗IGF-IR并且不识别IR的MAb，实施一个包括6个筛选阶段的方案。

它由以下阶段组成：

-用人重组IGF-IR免疫小鼠，从而产生杂交瘤，

-对用作免疫的重组蛋白通过ELISA筛选培养上清液，

-对MCF-7肿瘤细胞表面上过表达的天然受体通过ELISA检验阳性杂交瘤的所有上清液，

-实施结合试验以选择特异性识别IGF-IR的抗体，

-验证在此阶段选择的抗体能够在体外抑制由IGF1诱导的MCF-7细胞的增殖，

-在裸鼠中确认根据对肿瘤MCF-7生长的影响而保留的候选物的体内活性。

所有这些不同的阶段和获得的结果将在实施例1中进行简要描述。

对于免疫阶段，用8μg重组IGF-IR通过皮下途径注射小鼠两次。在脾细胞与鼠骨髓瘤Sp2OAg14细胞融合前3天，小鼠通过静脉内注射接受3μg的重组受体。融合后14天，在由重组IGF-IR致敏的平板上，通过ELISA筛选杂交瘤的上清液。保留上清液为阳性的杂交瘤并在通过FACScan分析检验之前进行扩增，从而确认产生的抗体同样能够识别天然IGF-IR。

实施例2：[¹²⁵I]-IGF1和[¹²⁵I]-IGF2结合人IGF-1受体的抑制制备膜裂解物

在补充有10％胎牛血清的DMEM中培养用人IGF-IR cDNA稳定转染的NIH 3T3细胞。通过刮除使其脱离后，通过离心进一步收集血清饥饿的细胞。用磷酸盐缓冲液清洗细胞沉淀并重悬在裂解缓冲液中：10mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液，其含有蛋白酶抑制剂。将约1ml缓冲液添加到25×10⁶个细胞中。通过3个冻融循环进一步裂解细胞，接着在1,900rpm条件下进行30次Potter均质器处理。在经超声处理后，在+4℃通过1,000g离心15分钟来去除核和大的细胞碎片。通过在+4℃以105,000g离心1小时来获得总细胞膜。在裂解缓冲液中清洗膜沉淀并在+4℃以105,000g离心1小时。终沉淀被重悬在50mM Tris-HCl缓冲液中，该缓冲液包含150mM NaCl、0.5％IGEPAL、0.5％TritonX-100、0.25％去氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂，并在+4℃搅拌过夜。通过在+4℃以10,000g离心10分钟使不溶的物质从含有hIGF-IR的可溶提取物中分离。通过BCA(bicinchoninic)法测定分析膜裂解产物的蛋白质浓度，利用Western印迹分析IGF-IR。

[¹²⁵I]-IGF1和[¹²⁵I]-IGF2结合的测定

首先用商品单克隆抗体17-69(Neomarkers，Fremont，CA，USA)(已表明其识别IGF-IRα亚基)包被在Protein A FlashPlate96孔微量培养板上(Perkin Elmer，Boston，MA，USA)以固定IGF-IR。向各个孔加入200μl的溶于PBS的20μg/ml抗体溶液，并在+4℃孵育过夜。通过抽吸去除含未与蛋白质A结合的残余17-69的缓冲液。再添加200μl的100μg/ml的膜裂解物并在室温下孵育2小时以固定IGF-IR。通过抽吸去除未被捕获的蛋白质。对于竞争测定，在含有50mM Hepes pH7.6、150mM NaCl、0.05％Tween 20、1％牛血清白蛋白和1mM PMSF的结合缓冲液中，在存在从1pM至1μM的不同浓度的单克隆抗体I-3466或者配体IGF1、IGF2和胰岛素(Sigma，Saint-Quentin Fallavier，France)的条件下测量100pM的[¹²⁵I]-IGF1(Perkin Elmer，Boston，MA，USA)或[¹²⁵I]-IGF2(Amersham Biosciences，Saclay，France)与固定的IGF-IR的结合。在室温下孵育板2小时，然后在Packard Top Count微板闪烁计数器上计数。在存在1μM IGF1的条件下确定非特异性结合。应用单克隆抗体9G4(其不针对hIGF-IR，但是特异性识别大肠杆菌的蛋白质)作为小鼠IgG1亚型对照。

结果

作为配体浓度的函数，在半对数图上对[¹²⁵I]-IGF1和[¹²⁵I]-IGF2的特异性结合百分率作图。从获得的S形竞争曲线(图1和2)图示确定以50％(IC₅₀)抑制放射性配体结合所需的各种抑制剂的浓度。

IGF1和IGF2配体有效地置换了[¹²⁵I]-IGF1与固定化hIGF-IR的结合，而胰岛素和亚型对照抗体9G4不能以低于500nM的浓度抑制[¹²⁵I]-IGF1的结合(图1)。单克隆抗体I-3466能够以0.021nM的IC₅₀(其比针对非放射性标记的IGF1所确定的IC₅₀低30倍)抑制[¹²⁵I]-IGF1的结合(图1)。

此外，抗体I-3466还表现出[¹²⁵I]-IGF2对于固定化hIGF-IR的强结合抑制活性(图2)。在该情形中，从竞争曲线推导出的IC₅₀值约为0.1nM。I-3466的这种IGF2阻断活性近似于由IGF2诱导的抑制活性(IC₅₀＝0.06nM)。这稍低于IGF1的抑制活性(IC₅₀＝0.03nM)并明显大于胰岛素的抑制活性(IC₅₀～200nM)。正如所预料的，对照抗体9G4没有显示出任何IGF2阻断活性。

实施例3：I-3466抗体对IGF1或者IGF2诱导的MCF-7生长的体外影响

如上面所指出的，多种肿瘤细胞过表达IGF-IR，而且有报道在乳癌和结肠癌中的量非常显著，通过IGF2(有时被写为IGF-2、IGF-II或者IGFII)对该受体提供增殖信号。因此必须确保MAb I-3466能够同样抑制IGF1和IGF2诱导的MCF-7细胞的体外生长。为了这点，将200μl无血清培养基(无酚红RPMI培养基加L-谷氨酰胺)中的细胞以5×10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。接种后24小时，在存在或者缺少I-3466或者鼠非中和性抗IGF-IR抗体(7G3)(用作亚型对照)的条件下，将终浓度50μg/ml(6.6nM)的IGF1或者IGF2(终浓度100ng/ml(13.2nM))添加至MCF-7细胞，再孵育约52小时。

在终浓度范围从10μg/ml(66nM)至0.0097μg/ml(0.065nM)的条件下检测抗体。随后，用0.25μCi的[³H]胸苷脉冲细胞16小时并通过液体闪烁计数定量掺入DNA的[³H]胸苷的量。IGF-1和IGF-2显著地刺激MCF-7细胞的生长(表2)。

当用剂量逐渐增加的亚型对照抗体处理细胞时，没有观察到明显的抑制。

相反，当用剂量逐渐增加的I-3466抗体孵育细胞时，观察到对由IGF1(90％)和IGF2(84％)所诱导增殖的明显剂量依赖性的抑制，其中IC₅₀分别为0.7nM和0.5nM(表2和图3A-3B)。

表2

I-3466抗体对IGF1(A)或者IGF2(B)诱导的MCF-7的生长的体外影响

实施例4：I-3466抑制IGF1和IGF2诱导的IGF-IR β链的磷酸化

在20ml无酚红的RPMI中以5×10⁴个细胞/cm²(75cm²的板，COSTAR)的量培养MCF7或者HT29细胞24小时，所述RPMI中混有5mM的谷氨酰胺、青霉素/链霉素(分别为100U/100μg/ml)和10％胎牛血清。在PBS中清洗三次后，在无酚红培养基(RPMI)中孵育细胞12小时，所述培养基不含有胎牛血清并混有5mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素、0.5μg/ml牛血清白蛋白(Sigma A-8022)和5μg/ml转铁蛋白(Sigma T8158)。

为了活化，细胞首先与待检测的封闭抗体(10μg/ml)在37℃孵育15分钟，随后加入IGF1或者IGF2再孵育2分钟。通过吸出孵育介质停止反应并将平板置于冰上。通过加入0.5ml裂解缓冲液(50mMtris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1％Nonidet P40、0.5％脱氧胆酸钠)来裂解细胞，其中混有蛋白酶抑制剂(每50ml一片，Boehringer Ref：1697 498)和磷酸酶抑制剂(Calbiochem Ref：524625(1/100))。刮除细胞并回收悬液并且置于混合器上于4℃保持1.5小时。以12,000rpm离心溶液10分钟(4℃)并且通过BCA定量上清液的蛋白质浓度。

将500μg的细胞裂解物蛋白质与抗IGF-IR(Santa cruz Ref：sc-713)混合用于免疫沉淀并且置于混合器上，于4℃保持1.5小时。通过加入蛋白A-琼脂糖(Boehringer Ref：1 134 515)回收免疫沉淀物并于4℃放置在混合器上过夜。琼脂糖珠用1ml的裂解缓冲液清洗两次，用清洗缓冲液1(50mM tris-HCl pH 7.5；500mM NaCl；0.1％NonidetP40；0.05％脱氧胆酸钠(Boehringer 1 332 597)，混合有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)清洗两次并用清洗缓冲液2(50mM tris-HCl；0.1％Nonidet P40；0.05％脱氧胆酸钠(Boehringer Ref：1 332 597)，混合有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(1/100))清洗一次。免疫沉淀物被重悬于Laemmli缓冲液中，加热至100℃持续5分钟。通过聚丙烯酰胺SDS凝胶(8％Novex EC6015)电泳分析上清液。将蛋白质转移至硝酸纤维膜上，接着用偶联HRP的抗磷酸酪氨酸抗体(BD transduction LabsPY20)或者抗IGF-IRβ链抗体(Santa Cruz Ref：sc 713)然后是偶联HRP的抗兔抗体进行免疫印迹。通过化学发光物(Amersham RPN2209)接着通过在Kodak X-mat AR胶片上的放射自显影来显示印迹。

图4A和4B表示未经刺激的(泳道1，图A和B)或者单独用50ng/ml IGF1(泳道2，图A)或者100ng/ml IGF2(泳道2，图B)刺激的MCF-7细胞。正如所料，在MCF-7细胞中没有观测到IGF-IR的基础水平刺激，而当MCF-7细胞与IGF1或者IGF2一起孵育时，观测到IGF-IRβ链的显著磷酸化。当细胞用IgG1亚型对照(泳道3，图A和B)或者单独用I-3466抗体(泳道4，图A和B)进行处理时没有观测到刺激，这表明I-3466对IGF-IR没有表现出激动作用。当I-3466与IGF1或者IGF2一起添加时，观测到对配体诱导的磷酸化的完全抑制(泳道5，图A和B)。被用作同种型对照的9G4抗体对IGF1或者IGF2诱导的磷酸化没有任何作用(泳道6，图A和B)。

观测到I-3466对用IGF1或者IGF2刺激的HT29细胞的同样抑制活性(图5A和5B)。这些结果与实施例2中描述的结果一致，实施例2显示了I-3466能够从IGF-IR置换IGF1和IGF2。

实施例5：IGF-IR的内化和降解研究

通过FACS分析来分析内化和降解。应用鼠生物素化的抗IGF-IR单克隆抗体(Mab)(以后被称为12B1 Mab)以及与来自被I-3466抗体所识别抗原的不同表位的结合来实施内化研究。引入9G4 Mab作为亚型对照。在我们的实验室中制备这两种抗体。用胰蛋白酶处理汇合的MCF-7细胞并将来自每种细胞悬液的1×10⁶个细胞接种于96孔板上的FACS缓冲液中。在37℃，用IGF1(50ng/ml)或者用30μg/ml的I-3466、9G4、mIgG1孵育平板4小时。

单独用FACS缓冲液孵育的细胞用来确定IGF-IR表达的基础水平。

随后清洗细胞两次并且将20μg/ml的生物素化12B1 MAb加入板中。为避免受体内化而在4℃孵育30分钟后，在4℃清洗细胞3次并通过添加链亲和素Alexa Fluor488偶联物(Molecular Probes Europe BV，Leiden，Netherlands)进行染色。对于降解试验，在用生物素化12B1和链亲和素Alexa Fluor488偶联物染色细胞之前，另外加入了细胞渗透性处理的步骤。

表3显示，在孵育4小时后，I-3466导致对MCF-7和HT29细胞上IGF-IR的下调。当细胞与9G4 Mab(被用作亚型对照)一起孵育时，没有观测到下调。

表3

应用I-3466抗体的IGF-IR的内化/降解试验

A-内化试验

细胞系ID	检验的Mab	MFI 12B1-mIgG1	％，内化
				MCF-7	PBS9G4I-3466	24722631	86
HT29	PBS9G4I-3466	696342	33

B-降解试验

细胞系ID	检验的Mab	MFI 12B1-mIgG1	％，降解
				MCF-7	PBS9G4I-3466	11210537	65
HT29	PBS9G4I-3466	344823	52

实施例6：I-3466Mab对DU145、SK-ES-1、HT29、A549和MCF-7异种移植肿瘤模型的抗肿瘤作用

为探究I-3466抗体对体内肿瘤生长的活性，应用5种异种移植肿瘤模型：不依赖于雄激素的DU145***癌、骨肉瘤SK-ES-1、结肠癌HT29、非小细胞肺癌A549和乳癌MCF-7。为此目的，对于DU-145、SK-ES-1、HT29、A549和MCF-7，分别用2×10⁶、5×10⁷、5×10⁶、10×10⁶和5×10⁶个细胞对6-8周大的雌性无胸腺裸鼠进行皮下注射。对于DU-145和SK-ES-1，在细胞注射后24小时，用200μg的未纯化抗体处理小鼠。

一周重复处理两次。对于HT29，当肿瘤体积达到49-59mm³时开始处理，一周3次用0.5mg的纯化抗体对小鼠进行腹膜内注射。

对于A549，肿瘤初始体积介于38-43mm³，对于MCF-7试验，肿瘤初始体积在处理开始时介于42-59mm³。一周一次或两次评价肿瘤体积并通过以下公式进行计算：π/6×长度×宽度×高度。

图6A-6E显示用非纯化抗体实施的部分结果，其表明I-3466能够明显地抑制5种检验细胞系的体内肿瘤生长。

实施例7：人源化I-3466 IgG1抗体的克隆、制备和表征

PCR扩增人源化抗体I-3466轻链和重链的化学合成可变区，并克隆至抗体表达载体，所述载体分别携带有人轻链κ和重链IgG1恒定区。PCR引物含有36个核苷酸，其中15个核苷酸用于与载体重叠克隆区的融合内(IN-Fusion)退火和21个核苷酸用于与可变区的退火。确切的核苷酸序列显示如下：

用于轻链可变区克隆：

IF-人源化I-3466-LCK-F(SEQ ID No.21)

[5’-ACAGATGCCAGATGCGACATTGTGATGACCCAGTCC]，

IF-人源化I-3466-LCK-R(SEQ ID No.22)

[5’-TGCAGCCACCGTACGCTTGATCTCCACCTTGGTGCC]，

用于重链可变区克隆：

IF-人源化I-3466-HCG1-F(SEQ ID No.23)

[5’-ACAGGTGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT]，

IF-人源化I-3466-HCG1-R(SEQ ID No.24)

[5’-GCCCTTGGTGGATGCGGAGGAGACTGTCACCAGGGT]

用BmtI和FspI消化载体，使载体线性化。根据销售商推荐的方案实施融合内反应(In-Fusion reaction)。通过测序验证所得克隆。应用轻链和重链质粒DNA转染人胚肾293细胞。收集含有所分泌抗体的培养基并浓缩。应用蛋白A/G柱亲和纯化抗体并浓缩，以及在PBS中透析。通过OD280nm来确定蛋白质浓度并通过还原和非还原SDS-PAGE分析纯度(图9)。

实施例8：人源化I-3466 IgG1抗体的BIACore分析

设备和材料

BIAcore T100仪器、CM5生物传感器芯片、HBS-EP缓冲液、乙酸缓冲液(pH 5)、甘氨酸-HCl缓冲液(pH 1.5)、胺偶联试剂盒都来自BIAcore(Upsala，Sweden)。抗人IgG Fc来自Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.(West Grove，USA)，可溶性人***-1受体(hIGF-IR)胞外结构域(ECD)来自R&D Systems(Minneapolis，USA)。

Biacore测定

在25℃以40μl/min的流速实施所有试验。为准备BIAcore测定(见图10)，按照使用说明的描述应用胺偶联方法将抗人IgG-Fc抗体(50μg/ml，溶于乙酸缓冲液，pH 5)固定在羧甲基葡聚糖传感器芯片上(CM5)。11042和11111共振单位(RU)的抗IgG Fc抗体被分别连接于流动池(Flowcells，FC)1和3上。以5μg/ml的浓度将待检验的纯化Mab稀释于0.5％P20，HBS-EP缓冲液，并被注射至FC3上以达到500-1000RU。应用FC1作为参照池。特异性信号(specific signals)对应于在FC2对FC1上所获得信号的差异。在90秒期间，以5种不同浓度(100、50、25、12.5和6.25nM)注射溶于0.5％P20、HBS-EP缓冲液的分析物(可溶性hIGF-IR，表观分子量365kDa)。从溶于0.5％P20、HBS-EP缓冲液的贮备液制备这些浓度物。在10分钟期间，监测分析物的解离阶段。还在相同条件下注射工作缓冲液(Running buffer)作为双对照。每个循环(抗体+hIGF-IR注射)后，通过注射20-45μl的甘氨酸-HCl缓冲液(pH 1.5)使两个流动池再生。这样的再生足以去除所有在传感器芯片上捕获的Mab和Mab/hIGF-IR复合物。

结果

分别通过结合和解离率常数k_a和k_d表征Mab人源化I-3466与分析物hIGF-IR-ECD的结合。通过解离和结合率常数的比值来计算平衡解离常数(KD)。在下表4中给出结果。在图11中显示对应于不同分析物浓度的传感器结果图。

表4

IGF-IRAbs	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				IgG1 HI3466	1.84E+05	6.29E-05	3.42E-10

序列表

<110>皮埃尔法布尔制药公司

利利亚纳·格奇

纳塔莉·科尔瓦亚

<120>新抗IGF-IR抗体和其用途

<130>D23693

<150>FR 05/07829

<151>2005-07-22

<150>US 60/701,622

<151>2005-07-22

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠

<400>1

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Asn Asn Tyr Ile Met Ser

1 5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠

<400>3

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>5

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr

1 5

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro Arg Ala

1 5 10 15

Trp Phe Thr Tyr

20

<210>7

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<400>7

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>8

<211>129

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro

100 105 110

Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ala

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>小鼠

<400>9

aaatccagtc agagtctact cgacagtaga acccgaaaga actacttggc t 51

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>小鼠

<400>10

aataactata tcatgtct 18

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>小鼠

<400>11

tgggcatcca ctagggaatc t 21

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>小鼠

<400>12

accattagtg gtggtggtag ttataccttc tatccagaca gtgtgaaggg a 51

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>小鼠

<400>13

aagcaatctt ataatctgtt cacg 24

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>小鼠

<400>14

aatcaattac ttactgggat gatcaatccc ctgactacgc ctagagcctg gtttacttac 60

<210>15

<211>336

<212>DNA

<213>小鼠

<400>15

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60

atgaactgca aatccagtca gagtctactc gacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300

ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336

<210>16

<211>387

<212>DNA

<213>小鼠

<400>16

gaagtgatgc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctaaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcaat aactatatca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtta taccttctat 180

ccagacagtg tgaagggacg attctccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 240

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtac aaggaatcaa 300

ttacttactg ggatgatcaa tcccctgact acgcctagag cctggtttac ttactggggc 360

caagggactc tggtcactgt ctctgca 387

<210>17

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体，轻链

<400>17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>18

<211>129

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体，重链

<400>18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Asn Gln Leu Leu Thr Gly Met Ile Asn Pro Leu Thr Thr Pro

100 105 110

Arg Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210>19

<211>336

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体，轻链

<400>19

gacattgtga tgacccagtc ccctgactcc ctggctgtct ccctgggcga gcgggccacc 60

atcaactgca agtcctccca gtccctgctg gactcccgga cccggaagaa ctacctggcc 120

tggtaccagc agaagcctgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc ctccacccgg 180

gagtctggcg tgcctgaccg gttctctggc tctggctctg gcacagactt caccctgacc 240

atctcctccc tgcaggctga ggatgtggct gtctactact gcaagcagtc ctacaacctg 300

ttcacctttg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336

<210>20

<211>387

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体，重链

<400>20

gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgac ctggtgcagc ctggcggctc cctgcggctg 60

tcctgtgctg cctctggctt caccttcaac aactacatca tgtcctgggt gcggcaggcc 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atctctggcg gcggctccta caccttctac 180

cctgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggctgaggac acagctgtct acttctgcac ccggaaccag 300

ctgctgacag gcatgatcaa ccccctgacc accccccggg cctggttcac ctactggggc 360

cagggcaccc tggtgacagt ctcctcc 387

<210>21

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体I-3466轻链扩增的IF-人源化I-3466-LCK-F引物

<400>21

acagatgcca gatgcgacat tgtgatgacc cagtcc 36

<210>22

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体I-3466轻链扩增的IF-人源化I-3466-LCK-R引物

<400>22

tgcagccacc gtacgcttga tctccacctt ggtgcc 36

<210>23

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体I-3466重链扩增的IF-人源化I-3466-HCG1-F引物

<400>23

acaggtgtcc actcggaggt gcagctggtg gagtct 36

<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人源化抗体I-3466重链扩增的IF-人源化I-3466-HCG1-R引物

<400>24

gcccttggtg gatgcggagg agactgtcac cagggt 36

Claims

1.一种分离的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它包含一种重链，该重链包含序列SEQ ID No.2、4和6的三个CDR，并且它还包含一种轻链，该轻链包含序列SEQ ID No.1、3和5的三个CDR。

2.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其具有针对人***I受体(IGF-IR)的结合亲和性，其特征在于，在结合所述IGF-IR时，它以小于0.3nM的IC50抑制天然结合伴侣IGF1与所述IGF-IR的结合，并且它还以小于0.3nM的IC50抑制天然结合伴侣IGF2与所述IGF-IR的结合。

3.根据权利要求1的分离的抗体或其一种功能片段，其具有人***I受体(IGF-IR)酪氨酸激酶抑制活性，其特征在于，在结合所述IGF-IR时，它以小于0.3nM的IC50抑制天然结合伴侣IGF1与所述IGF-IR的结合，并且它还以小于0.3nM的IC50抑制天然结合伴侣IGF2与所述IGF-IR的结合。

4.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它还能够100％抑制IGF1和／或IGF2诱导的IGF-IRβ链的磷酸化。

5.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它不存在任何内在性激动活性。

6.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于，通过同样的FACS分析方法表明，它能够诱导：

i)HT29细胞上至少30％的IGF-IR内化，和／或

ii)MCF-7细胞上至少85％的IGF-IR内化。

7.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于，通过同样的FACS分析方法表明，它能够诱导：

i)HT29细胞上至少50％的IGF-IR降解，和／或

ii)MCF-7细胞上至少65％的IGF-IR降解。

8.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于，它能够以针对IGF1和IGF2分别至少等于1和0.5nM的IC50抑制IGF1和IGF2诱导的MCF-7细胞的体外增殖。

9.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于它不以显著方式附着于人胰岛素受体(IR)。

10.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于所述功能片段选自片段Fv、Fab、F(ab')₂、Fab'、scFv、scFv-Fc和双功能抗体。

11.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于所述抗体包含一种轻链，该轻链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.7，并且它包含一种重链，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8。

12.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段，其特征在于所述抗体是嵌合抗体并且还包含源于对小鼠为异源物种之抗体的轻链和重链恒定区。

13.根据权利要求12的嵌合抗体或其一种功能片段，其特征在于所述异源物种是人。

14.根据权利要求13的嵌合抗体或其一种功能片段，其特征在于源于人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。

15.根据权利要求14的人源化抗体或其一种功能片段，其特征在于它包含一种轻链，该轻链包含氨基酸序列SEQ ID N o.17，并且它包含一种重链，该重链序列包含氨基酸序列SEQ ID No.18。

16.能够分泌权利要求1的抗体的鼠杂交瘤，其于2005年6月23日以编号1-3466保藏在巴黎的巴斯德研究所的CNCM。

17.一种抗体或其一种功能片段，其特征在于所述抗体由权利要求16所述的杂交瘤细胞分泌。

18.一种分离的核酸，其特征在于它选自以下核酸：

a)编码权利要求1的抗体或其一种功能片段的核酸；

b)如a)所定义核酸的互补核酸。

19.包含权利要求18所述核酸的载体。

20.包含权利要求19所述载体的宿主细胞。

21.生产权利要求1所述抗体或其一种功能片段的方法，其特征在于它包括以下阶段：

a)在培养基中和适当的培养条件下培养权利要求20的细胞；和

22.包含作为活性成分的化合物的组合物，所述化合物由权利要求1的抗体或其一种功能片段组成。

23.根据权利要求22的组合物，其特征在于它包含至少第二化合物，所述第二化合物选自能够特异性抑制IGF-IR、EGFR、HER2／neu、cMET和／或RON的酪氨酸激酶活性的化合物。

24.根据权利要求23的组合物，其特征在于所述第二化合物选自分离的抗-EGFR、-IGF-IR、-HER2／neu、-cMET和／或-RON抗体或其功能片段，其能够抑制由所述受体介导的增殖性和／或抗凋亡性和／或血管生成性和／或转移性弥散诱导活性。

25.根据权利要求23的组合物，其特征在于，作为用于同时、分开或者依次应用的组合产物，它包含IR、IGF-IR、EGFR、HER2／neu、cMET和／或RON的酪氨酸激酶活性的至少一种抑制剂。

26.根据权利要求25的组合物，其特征在于所述的酪氨酸激酶活性的抑制剂选自二苯胺基邻苯二甲酰亚胺类化合物、吡唑并-或者吡咯并吡啶并嘧啶类化合物或者喹唑啉类化合物。

27.根据权利要求23的组合物，其特征在于，作为用于同时、分开或者依次应用的组合产物，它还包含细胞毒性剂／细胞生长抑制剂。

28.根据权利要求27的组合物，其特征在于所述细胞毒性剂／细胞生长抑制剂选自与DNA相互作用的试剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、或者纺锤体抑制剂或稳定剂或者其它能够用于化疗的任何试剂。

29.根据权利要求27的组合物，其特征在于所述细胞毒性剂／细胞生长抑制剂被化学偶联至所述组合物的至少一种组分用于同时应用。

30.根据权利要求27的组合物，其特征在于所述细胞毒性剂／细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂。

31.根据权利要求30的组合物，其特征在于所述细胞毒性剂／细胞生长抑制剂选自长春瑞滨、长春氟宁或长春新碱。

32.根据权利要求23的组合物，其特征在于所述抗体或其一种功能片段的至少一种与细胞毒素和／或放射性元素缀合。

33.根据权利要求1的抗体或其一种功能片段用于制备药物的用途，其特征在于所述药物用于预防或治疗选自***癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌、乳癌或者结肠癌的癌症。

34.根据权利要求33的用途，其特征在于所述癌症是结肠癌。

35.权利要求1的抗体用于制备组合物的用途，所述组合物用于体外诊断特征在于相对于正常情形而言IGF-IR异常表达的病理状况的方法，所述方法包括让怀疑含有IGF-IR的生物学样品与所述组合物在有利于形成IGF-IR／抗体复合物的条件下接触，并且检测作为指示在所述样品中存在所述IGF-IR的所述复合物。

36.根据权利要求35的用途，其中所述抗体以可检测的方式被标记。

37.根据权利要求35的用途，其中IGF-IR的异常表达是IGF-IR的过表达。

38.根据权利要求35的用途，其中IGF-IR的异常表达是IGF-IR的欠表达。

39.权利要求1的抗体用于制备组合物的用途，所述组合物用于预测***细胞样品的致癌性潜力的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供人肺或***组织的样品；和

(b)确定样品中是否存在IGF-IR，所述步骤包括让所述样品与所述组合物在有利于形成IGF-IR／抗体复合物的条件下接触，其中所述复合物的存在指示所述细胞在所述组织中的致癌性潜力。

40.根据权利要求39的用途，其中所述复合物的存在指示患者具有发展或发作其特征在于所述IGF-IR过表达的病理疾病的风险。

41.权利要求1的抗体用于制备组合物的用途，所述组合物用于跟踪治疗方案进程的方法，所述治疗方案设计用来减轻特征在于IGF-IR表达异常的病理疾病，所述方法包括以下步骤：

(a)分析来自对象的样品以确定在第一时间点的IGF-IR水平；

(b)分析在第二时间点的所述样品；和

(c)对在所述第二时间点的所述水平与在(a)中所确定水平进行比较，作为对所述治疗方案效果的确定，其中在所述样品中IGF-IR水平的下降确定了在所述对象中所述病理疾病的消退，或者IGF-IR水平的增加确定了在所述对象中所述病理疾病的进展。

42.一种试剂盒或其组合，其用于实施诊断由于IGF-IR过表达或者欠表达所引起疾病的方法或者用于实施检测和／或定量生物学样品中IGF-IR过表达或者欠表达的方法，所述试剂盒或组合的特征在于它包括以下成分：

a)权利要求1的抗体或其一种功能片段；

b)任选地，用于形成有助于免疫反应的介质的试剂；

c)任选地，允许证实由免疫反应产生的IGF-IR／抗体复合物的试剂。

43.权利要求1的抗体或其一种功能片段用于制备旨在将生物活性化合物特异性靶向到表达或者过表达IGF-IR的细胞处的药物的用途。

44.一种调节IGF-IR反应性哺乳动物细胞中IGF-IR活性的用于非治疗目的的方法，其包括：让细胞与权利要求1的抗体在相对于非IGF-IR反应性细胞而言足以调节所述IGF-IR活性的条件下接触。

45.一种相对于正常细胞而言降低IGF-IR反应性哺乳动物细胞中IGF-IR活性的用于非治疗目的的方法，其包括：让细胞与权利要求1的抗体接触。

46.一种从样品纯化IGF-IR的方法，该方法包括：a)在允许抗体和受体特异性结合的条件下将权利要求1的抗体与样品一起孵育，和b)从所述样品中分离抗体并获得纯化的受体。