CN101228188A - IL-1β结合抗体及其片段 - Google Patents

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Abstract

IL－1β结合抗体或其IL－1β结合片段，其含有SEQ ID NO：2氨基酸序列和相关的核酸、载体、细胞核组合物及使用它们用于治疗疾病的方法，以及制备亲和力成熟的IL－1β结合多肽的方法。提供了IL－1β结合抗体或其IL－1β结合片段，其具有期望的亲和力和效力。

Description

IL-1β结合抗体及其片段
对相关申请的交叉引用
本申请要求2005年6月21日提交的美国临时申请No.60/692,830的优先权，这里引入其内容作为参考。
发明领域
本发明涉及IL-1β结合抗体并包括其片段，编码这些抗体的核酸，以及包含所述抗体或核酸的载体、细胞和组合物，以及它们的应用。
发明背景
细胞因子的白介素-1(IL-1)家族已经涉及疾病状态例如类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎(UC)、败血性休克、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主疾病、动脉粥样硬化、成人T细胞性白血病、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、中风以及阿尔茨海默病。IL-1家族成员包括IL-1α、IL-1β和IL-1Ra。尽管与它们结合IL-1受体(IL-1R1和IL-1R2)的能力有关，但这些细胞因子的每一种是由不同的基因所表达的，并且具有不同的一级氨基酸序列。而且，这些细胞因子的生理学活性可以被区分。
破坏IL-1受体信号传导的化合物已经被作为治疗药物进行研究以治疗IL-1介导的疾病。这些化合物包括重组IL-1Ra(Amgen Inc.Thousand Oaks，CA)和IL-1受体“陷阱(trap)”肽(Regeneron Inc.Tarrytown，NY)。结合IL-1细胞因子的动物来源单克隆抗体也已经被研究。然而，由于其免疫原性，因此它们的临床价值是有限的。例如，已知被给药小鼠单克隆抗体的人类受试者会产生人抗小鼠抗体(HAMA)。已经报道HAMA会降低单克隆抗体治疗的效率，并产生负面反应包括对肾脏的损伤。其它的IL-1β抗体受到它们的结合亲和力和/或它们效价(potency)的限制。因此，需要其它能够阻断IL-1受体信号传导的化合物。本发明提供了这类化合物，以及制备和应用这些化合物的方法。
简要概述
本发明提供了IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。这里还提供了编码所述抗体或抗体片段的核酸，以及包含所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的细胞，以及包含所述抗体、核酸或载体的组合物。
本发明还提供了治疗或预防哺乳动物中疾病的方法，其包括为需要治疗的哺乳动物给药有效量的本发明抗体或抗体片段、核酸或载体，这样在哺乳动物中疾病得到了治疗或者预防。
本发明提供了一种制备亲和力成熟的IL-1β结合多肽的方法，其包括(a)提供第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸包含编码IL-1β结合多肽的核酸序列，所述IL-1β结合多肽包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：26中任一项的氨基酸序列，其中所述第二核酸包括与第一核酸序列至少有一个核苷酸不同的核酸序列；(b)进行核酸混编(shuffling)以提供两种或者多种突变的核酸；(c)选择编码突变的核酸，其编码的多肽(i)以比第一核酸所编码的多肽高的亲和力结合IL-1β，(ii)对于IL-1β具有高于IL-1α的选择性，所述选择性高于第一核酸所编码的多肽对IL-1β的选择性，(iii)对于IL-1β具有比第一核酸所编码的多肽低的平衡结合解离常数(KD)，或者(iv)抑制动物中IL-1β诱导的血清IL-6表达达到高于第一核酸所编码的多肽高的程度；以及(d)表达所选择的突变核酸，这样制备了亲和力成熟的IL-1β结合多肽。
本发明提供了新型的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其以低于3pM的解离常数结合到人IL-1β，可选大约2pM或更少，优选大约1pM或更少。这些高亲和力抗体被设计能够用于各种治疗或者预防IL-1相关的疾病或病症的方法。可选地，或者另外地，所述IL-1β结合抗体或者IL-1β结合片段结合到IL-1β抗原决定簇上，这样所结合的抗体或片段基本上不会防止IL-1β结合到I型IL-1受体上。可选地，或者另外地，所述IL-1β结合抗体或者IL-1β结合片段结合到与这里所描述的示例性抗体的一种或者多种基本上相同的抗原决定簇上，例如被指定为AB7的抗体，其包含重链可变区。可选地，或者另外地，所述IL-1β结合抗体或者IL-1β结合片段与具有SEQ ID NO：11轻链可变区以及SEQ ID NO：15重链可变区的抗体竞争结合。可选地，或者另外地，本发明包括结合到包含在序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE(SEQ IDNO：36)中的抗原决定簇的IL-1β结合抗体或者IL-1β结合片段。典型的IL-1β结合抗体包括这里被指定为AB5和AB7的抗体。
本发明还提供了IL-1结合抗体或其IL-1β结合片段，其具有小于3pM的解离常数，可选大约1pM或者更低，可选这里所公开的其它解离常数中的任何一种，并且其包含重链可变区，其中所述重链可变区包含下列氨基酸序列中的一种：氨基酸序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23或SEQ ID NO：24，或者可选地氨基酸序列SEQ ID NO：12、SEQID NO：13或SEQ ID NO：21，或者可选地氨基酸序列SEQ ID NO：13或SEQID NO：21，或者可选地氨基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14或SEQID NO：15，或者可选地氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15。所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段还可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
作为本发明的另一个实施方式，提供了新型的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其以在大约6pM至大约50pM之间的解离常数结合IL-1β，可选在大约13pM至大约25pM之间，可选大约19pM，其中所述抗体或片段具有小于0.5nM(500pM)的IC50，可选在大约5pM至大约200pM之间，可选在大约10pM至大约100pM之间，可选大约30pM，以抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞中释放。抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞释放的IC50是指抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞释放的50％所需浓度。典型的抗体包括这里指定为AB1的抗体。
本发明还提供了IL-1结合抗体或其IL-1β结合片段，其具有在大约6pM至大约50pM之间的解离常数，并包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6之一，可选地氨基酸序列SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之一，可选地是SEQ ID NO：4氨基酸序列。设计在某些情况中，具有相对高解离常数的IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段可以是期望的，例如，用于治疗或者预防IL-1相关疾病或者病症的某些期望相对较低亲和力水平的方法。
示例性抗体包括被指定为AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6、AB7、AB8和AB9的抗体。AB1包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB2包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQID NO：5的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB3包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB4包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB5包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB6包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。AB7包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。AB8包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列。AB9包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
本发明包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其具有重链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-8、SEQ ID NO：12-15、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23-26、SEQ ID NO：28-35或SEQ ID NO：42-57中所列序列的任意一种，可选在SEQ ID NO：21中所列序列的任意一种，可选在SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中所列序列的任意一种，可选在SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中所列序列的任意一种，可选在SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26中所列序列的任意一种。
本发明还包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其具有轻链可变区，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9-11或SEQ ID NO：27所列序列中的任意一种，可选在SEQ ID NO：1中所列序列的任意一种，可选在SEQ IDNO：9中所列序列的任意一种，可选在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所列序列的任意一种。
本发明还包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其具有在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-8、SEQ ID NO：12-15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23-26、SEQ IDNO：28-35或SEQ ID NO：42-57中所列序列的重链可变区之一，以及在SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：9-11或SEQ ID NO：27中所列序列的轻链可变区之一。
本发明还包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其具有不会结合IL-1β但代替为用于其它功能的部分，例如循环半衰期、直接细胞毒性作用、可检测标记或者受体内源补体级联反应或内源细胞毒性的激活。本发明的抗体可以包括抗体恒定区的全部或者一部分。所述恒定区可以选自任何同种型包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。例如，所述抗体可以包含IgG2区。除了或者代替包含恒定区外，本发明的抗体或片段可以包括抗原决定簇标签、补救受体抗原决定簇、用于诊断或纯化目的的标记部分，或者细胞毒性部分例如放射性核素或毒素。
本发明还包括药物组合物，其包含IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段的任意一种以及药物上合适的运载体(carrier)、赋形剂或稀释剂。优选本发明的抗体和化合物能够以治疗有效量为需要这类治疗的受试者进行给药，即其量足以改善与目标蛋白质表达相关的病症或者紊乱的临床体症或症状。在相关的实施方式中，所述药物组合物还包含第二活性药剂。在另一个相关的实施方式中，提供了药物组合物，其中所述第二活性药剂是生长因子或细胞因子的抗体或拮抗剂。在另一个实施方式中，所述第二活性药剂是另一种抗体。
在本发明的另一个实施方式中，设计所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段用于制备预防或者减轻与IL-1相关的病症或者紊乱的药物。在上述任何应用中，所述药物可以与使用第二活性药剂的治疗进行组合。在本发明的另一个实施方式中，设计本发明抗体的协同组合在制备治疗表现出这里所公开的IL-1相关病症或紊乱的症状的患者的药物中的应用，其中所述药物与使用第二活性药剂的治疗进行组合。在相关的实施方式中，所述第二活性药剂是细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂。设计任何前述应用的实施方式，其中所述IL-1β结合抗体或片段在所述药物中的量是以有效降低达到治疗效果所需第二活性药剂剂量的剂量。
本发明还设计了试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含治疗或预防有效量的本发明的化合物或组合物(例如抗体、片段、核酸、载体或细胞)，其被包装在容器中，例如小瓶(vial)或瓶子，并且还包括贴到或者与容器包装的标签，该标签描述该容器的内含物，并提供关于该容器的内含物用于防止或者减轻与目标蛋白质表达相关的病症或疾病的指示和/或使用说明。
附图某些观点的简要说明
图1是一对氨基酸序列，其对应于这里所描述的某些抗体的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图2是一组氨基酸序列，其对应于抗体AB1、AB2、AB3和AB4的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图3是一组氨基酸序列，其对应于抗体AB5、AB5.1和AB5.2的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图4是一组氨基酸序列，其对应于抗体AB5.3和AB5.4的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图4A是一组氨基酸序列，其对应于抗体AB6和AB7的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图4B是一组氨基酸序列，其对应于抗体AB8和AB9的可变区的轻链和重链。氨基酸序列中被下划线标记的部分表示互补性决定区域(CDR)；
图5是表示体外IL-1β刺激实验结果的图；
图6是显示体内IL-1β刺激实验结果的柱状图；
图7是显示被指定为AB1的抗体动态排斥检验(kinetic exclusion assay)结果的图；
图8是显示被指定为AB5的抗体动态排斥检验(kinetic exclusion assay)结果的图；
图9是显示被指定为AB7的抗体动态排斥检验(kinetic exclusion assay)结果的图；
图10是显示被指定为AB1、AB2和AB3的抗体体外IL-1β刺激实验结果的图；
图11是显示被指定为AB1和AB7的抗体体外IL-1β刺激实验结果的图；图12是显示被指定为AB5和AB7的抗体以及Kineret体外IL-1β刺激实验结果的图；
图13是显示被指定为AB5和AB1的抗体体内IL-1β刺激实验结果的柱状图；
图14是显示被指定为AB5和AB7的抗体体内刺激实验结果的柱状图；
图15是显示被指定为AB7的抗体与来自猕猴(cynomolgus monkey)和恒河猴(rhesus macaque)的IL-1β交叉反应实验结果的蛋白质印迹(Westernblot)；
图1 6是显示被指定为AB7的抗体与来自狗、豚鼠、猪和兔的IL-1β交叉反应实验结果的Western印迹；
图17是显示被指定为AB7的抗体与重组人、小鼠和大鼠的IL-1β交叉反应实验结果的Western印迹；
图18是显示被指定为AB7的抗体以及Kineret体外实验结果的图，其包括IL-1诱导的IL-8的产生；
图19是显示检测是否本发明的抗体防止IL-1β结合到I型IL-1受体的检验结果的图；
图20是表示检测是否本发明的抗体防止IL-1β结合到I型IL-1受体示意图。
详细描述
本发明包括新型的IL-1β抗体和片段，其具有期望的亲和力和能力。作为本发明的一个方面，提供了IL-1β结合抗体，与已知IL-1β结合抗体相比，其具有出乎意料高的亲和力和低解离常数(例如小于3pM，可选大约1pM或更少)。典型的抗体包括这里被指定为AB5和AB7的抗体。作为本发明的另一个方面，提供了IL-1β结合抗体，其具有期望的解离常数(例如在大约6pM至大约50pM之间)以及期望的IC50(例如低于500pM)以抑制IL-1β刺激的从人成纤维细胞释放IL-6。
本发明还包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其中它们以比其它抗原高的亲和力选择性地结合到IL-1β。所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段可以选择性地结合到人类IL-1β，但也会可检测地结合到非人类IL-1β上。可选地或者另外地，所述抗体或片段可以结合到人类IL-1β或者至少一种其它哺乳动物(第一哺乳动物)的IL-1β，而不结合到至少一种其它哺乳动物(第二哺乳动物)的IL-1β。例如，所述抗体或者片段可以结合到啮齿类IL-1β、灵长类IL-1β、狗IL-1β和兔IL-1β中的一种或者多种，而不结合到豚鼠IL-1β。可选地或者另外地，所述抗体或片段可以以比大鼠IL-1β高的亲和力结合到小鼠IL-1β。可选地或者另外地，所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段可以对人类IL-1β和灵长类IL-1β具有相同或者基本相同的能力。可选地或者另外地，所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段可以对重组人类IL-1β和内源IL-1β具有相同或者基本相同的能力。可选地或者另外地，所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段可以中和小鼠IL-1β。
这里所使用的，特异性地与目标抗原结合的抗体或片段，是指以比与类似抗原高的亲和力与目标抗原结合的抗体。例如，抗体或片段对于其同源的抗原是特异性的，所述抗原或片段以可检测的优先性识别并结合所述同源的抗原(从其它已知的相同家族多肽中区分该抗原，其通过结合亲和力中可检测的差异，而不管在家族成员之间可能存在的局部序列同一性、同源性或相似性)。能够理解的是，特异性的抗体和片段也会与其它蛋白质相互作用(例如ELISA技术中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白质A或其它抗体)，其通过与抗体可变区之外的序列的相互作用，特别的，是所述抗体或片段的恒定区内的序列。用于确定抗体结合特异性的筛选检验是本领域中公知的，并且常规实施的。关于对这类检验的全面讨论，参见Harlow等人(Eds)，抗体实验室手册冷泉港实验室，冷泉港，纽约(Antibodies A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor，NY)(1988)，第6章。
本发明的一个方面包括IL-1β结合抗体及其IL-1β结合片段，其具有意想不到的低解离常数(KD)，例如小于3pM，可选2pM或更少，可选1pM或更少，可选0.8pM或更少，可选0.74pM或更少，可选0.72pM或更少，可选0.7pM或更少，可选0.6pM或更少，可选0.56pM或更少，可选0.5pM或更少，可选0.3pM或更少，可选0.26pM或更少，可选0.24pM或更少，可选0.2pM或更少。因此，在本发明的某些实施方式中，可以参考解离常数范围的高端值，对IL-1β结合抗体和片段进行描述。此外或者可选地，在本发明的某些实施方式中，可以参考解离常数范围的低端值，对IL-1β结合抗体和片段进行描述，诸如例如解离常数为0.07pM或更高的抗体或片段，可选0.1pM或更高，可选0.11pM或更高，可选0.15pM或更高，可选0.2pM或更高，可选0.24pM或更高，可选0.26pM或更高，可选0.3pM或更高，可选0.5pM或更高，可选0.7pM或更高。如上所限定的任何解离较高的常数和较低的解离常数可以被组合以限定解离常数的范围，只要所选择较低值等于或者低于所选择的较高值。
本发明的另一方面提供了新型IL-1β结合抗体及其IL-1β结合片段，其以高于6pM并低于或等于50pM的解离常数结合IL-1β，可选在大约13pM至大约25pM之间，其中所述抗体或片段具有小于0.5nM(500pM)的IC50，可选在大约5pM至大约200pM之间，可选在大约10pM至大约100pM之间，可选大约30pM，以抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞中释放。设计，可以期望提供一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其具有前面的结合亲和力并具有用于治疗或预防IL-1β介导的病症或疾病的某些方法的能力。典型的抗体包括这里被指定为AB1的抗体。
正如通过这里所列举的解离常数所说明的，本发明的抗体和片段以高亲和力结合到IL-1β。鉴定抗体与抗原亲和力的亲和力常数可以是通过抗原-抗体复合物形成的动力学所检测的结合常数。可选地，结合亲和力可以由解离常数鉴定，其中解离常数是结合常数的倒数。这里所使用的术语KD是指抗体-抗原相互作用的解离常数。
本发明还包括中和抗体或其中和片段，其结合到IL-1β以中和IL-1β的生物学活性。可以通过检验IL-1β生物学活性的一种或者多种指示剂来检验IL-1β生物学活性的中和，例如IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞或其它细胞中释放，IL-1β诱导的IL-8从血细胞中释放，或者IL-1诱导的T辅助细胞的增殖。优选，本发明的IL-1β结合抗体和片段中和与I型IL-1受体(IL-1RI)的信号传导功能相关的IL-1β生物学活性，其中所述I型IL-1受体(IL-1RI)结合I型IL-1β。
通常，本发明的中和抗体和片段能够中和IL-1β的生物学活性，而不管是否IL-1β结合到I型IL-I受体被阻断。更优选，所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段通过结合到IL-1β中和IL-1β的生物学活性，而不会实质性地防止IL-1β结合到I型IL-1受体。这些抗体和片段的潜在优点是能够结合并中和IL-1β，同时允许IL-1β结合到IL-1RI。这会导致IL-1α以及IL-1β生物学活性生物学活性的有效降低，因为有更少未结合的IL-1RI位点用于IL-1α结合。因此，本发明的IL-1β结合抗体和片段可以用于期望在体外和体内中和IL-1生物学活性的方法中。
本发明的抗体或片段可以是中和抗体或片段，其特异性地结合到影响IL-1β生物学活性的IL-1β抗原决定簇上。本发明的抗体或片段能够结合到IL-1β的中和敏感抗原决定簇上。如果IL-1β的中和敏感抗原决定簇被本发明的抗体或片段之一结合，则结果是含有所述抗原决定簇的IL-1β的功能会丧失。
在某些实施方式中，所述IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段抑制IL-1β刺激的IL-1β从血细胞的释放的IC50是低于50pM，可选大约25pM或更低，可选大约10pM或更低，可选大约2pM或更低。抑制IL-1β刺激的IL-1β从血细胞的释放的IC50是指抑制50％IL-1β刺激血细胞所释放IL-8需要的浓度。典型的抗体包括这里被指定为AB7的抗体。
本发明还包括含有被改变的氨基酸序列的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中所述被改变的氨基酸包括针对选自SEQ ID NO：27或28(或者任何这里所公开的其它序列)的起始氨基酸序列的一个或者至少一个替代、添加或缺失，其中所述被改变的抗体或片段具有与起始氨基酸序列相同或基本相同的抗原决定簇结合的亲和力和特异性。设计可以对这里所提供的IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段(例如包含SEQ ID NO：28和/或SEQ ID NO：27的抗体或片段)进行一个或者多个替代、缺失或添加，同时保持与起始抗体或片段相同或基本相同的抗原决定簇结合的亲和力和特异性。例如，本发明包括含有被改变的氨基酸序列的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中所述被改变的氨基酸包括针对包含SEQ ID NO：8(或者这里所公开的可以用作起始氨基酸序列的任何其它序列)的起始氨基酸序列的一个或者至少一个替代、添加或缺失，其中所述被改变的抗体或片段具有与包含SEQ ID NO：8(或者用作起始氨基酸序列的特定序列)的起始氨基酸序列相同或基本相同的抗原决定簇结合的亲和力和特异性。措词“基本相同的”亲和力的意思是，在对包含SEQ IDNO：28或27的抗体或片段的检验中，通过这里的教导所确定的亲和力或解离常数，  不会提高或降低超过固定的偏差，例如进行所述检验3次或者更多次独立的检验时所观察到的偏差。措词“基本相同的”抗原决定簇特异性的意思是，在对包含SEQ ID NO：28或27的抗体或片段的检验中，通过这里的教导所确定的，与含有所述抗原决定簇的氨基酸序列的结合在固定的偏差范围内，例如进行所述检验3次或者更多次独立的检验时所观察到的偏差。如果与包含SEQ ID NO：28或27的抗体或片段相比，其意思是所述比较需要在被改变的氨基酸序列和进行一个或者多个替代、缺失或添加的所述起始氨基酸序列之间进行，这些起始序列在其它所有的氨基酸上一致。
抗体、人源化抗体和人工改造(human engineered)的抗体
本发明的IL-1β结合抗体可以被提供为多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、重组抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、完全人类抗体、单链抗体和/或双特异性抗体以及片段，包括其变体和衍生物，其可以通过已知的技术包括但不限于酶切、肽合成或重组技术提供。
通常抗体包含两条重链多肽和两条轻链多肽，尽管也可以设计具有一条重链和一条轻链的单结构域抗体以及不含有轻链的重链抗体。根据重链恒定区的氨基酸序列，有5种类型的重链，被称作α、δ、ε、γ和μ。这些不同类型的重链产生了五类抗体分别是IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG和IgM，包括四种IgG的亚类即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据恒定区的氨基酸序列，有两类轻链，被称作卡帕(κ)或拉姆达(λ)。全长的抗体包括恒定区和可变区。恒定区不需要出现在抗体的抗原结合片段上。这里所公开的抗体的抗原结合片段可以包括Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)抗体片段。正如下面更详细地讨论的，IL-1β结合片段包括会结合IL-1β的抗体片段和抗原结合多肽。
抗体或其抗原结合片段的每一条重链和轻链序列都包括可变区，其具有3个互补性决定区域(CDR)以及非框架区域(FR)。除非以其它方式说明，这里所使用的术语“重链”和“轻链”的意思分别是重链可变区和轻链可变区。这里，重链CDR被称作CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。轻链CDR被称作CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。可以(i)根据本领域中已经开发的通用法则，或者(ii)通过将其序列与已知可变区数据库进行比对来鉴定抗体序列中的可变区和CDR。用于鉴定这些区域的方法被描述在下列中：Kontermann和Dubel，eds.抗体工程，施普林格，纽约(Antibody Engineering，Springer，New York，NY，)，2001；以及Dinarello等人，免疫学现代实验方案(CurrentProtocols inImmunology)，John Wiley and Sons Inc.霍波肯(Hoboken)，NJ，2000。正如在Retter等人，Nucl.Acids Res.33(数据库期)：D671-D674(2005)中所描述的，抗体序列的数据库被描述并通过www.bioinf.org.ulc/abs的“TheKabatman”(由A.C.Martin在英格兰伦敦的伦敦大学生物化学和分子生物学系(in the Department of Biochemistry & Molecular Biology University CollegeLondon，London，England)维持)以及通过www.vbase2.org的VBASE2获得。“Kabatman”数据库网站还包括了用于鉴定CDR的常规经验法则。除非特别说明，术语“CDR”是如在Kabat等人，免疫学感兴趣序列(Sequences ofImmunological Interest，)第5版，健康和人类服务美国部(U.S.Department ofHealth and Human Services)，1991中所描述的。
本发明包括IL-1β结合抗体，其含有两条全长的重链和两条全长的轻链。可选，所述IL-1β结合抗体可以为例如具有与IL-1β结合活性的单链抗体或“迷你型”抗体的构建体。这些构建体可以通过本领域中已知的方法进行制备，例如PCR介导的单链抗体的克隆和组装以在大肠杆菌(E.coli)中进行表达(例如在抗体工程，实践途径系列(Antibody Engineering，The practical approachseries，J.McCafferty)，H.R.Hoogenboom，和D.J.Chiswell，编辑(editors)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，1996中所描述的)。在这种类型的构建体中，从cDNA将抗体分子重链和轻链的可变部分进行PCR扩增。接着，将所得到的扩增子进行组装，例如在另一个PCR步骤中，通过连接体DNA，其中所述连接体DNA编码由氨基酸Gly和Ser构成的柔性蛋白质连接体。该连接体能够使可变的重链和轻链部分以重新产生抗原结合槽，并且以通常与起始全长二聚免疫球蛋白分子相当的亲和力结合抗原的方式进行折叠。
本发明的IL-1β结合抗体和结合片段包括这里所公开的典型抗体、片段和序列的变体。变体包括包含一个或者多个氨基酸序列替代、缺失和/或添加的肽和多肽，其与这里所公开的典型抗体、片段和序列具有相同或基本相同的抗原决定簇结合亲和力和特异性。因此，变体包括包含对这里所公开的典型抗体、片段和序列进行的一个或者多个氨基酸序列替代、缺失和/或添加，其中这些替代、缺失和/或添加不会对抗原决定簇结合的亲和力和特异性造成实质性变化。例如，抗体或片段的变体可以来自对包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：42至SEQ ID NO：57中一个或者多个氨基酸序列的抗体或片段进行一种或者多种改变，其中所改变的抗体或片段与起始序列具有基本相同的抗原决定簇结合亲和力和特异性。变体可以是天然存在的，例如等位基因或拼接变体，或者可以是人工构建的。可以从编码所述变体的相应核酸分子制备这些变体。本发明抗体和IL-1β结合片段的变体可以在轻链和/或重链氨基酸序列中具有改变，其可以是天然出现的，或者通过使用重组DNA技术对原始序列进行体外改造而引入的。天然出现的变体包括“体细胞”变体，其是在应答外源抗原产生抗体的过程中，在相应的生殖系核苷酸序列中体内产生的。
IL-1β结合抗体和IL-1β结合片段的变体也可以通过诱变技术进行制备。例如，可以在整个抗体编码区随机引入氨基酸改变，并可以对所得到的变体筛选IL-1β的结合亲和力或其它性质。可选地，可以在IL-1β抗体的选定区引入氨基酸改变，例如在轻链和/或重链CDR，和/或在框架区内，并可以对所得到的抗体筛选与IL-1β的结合或者某些其它活性。氨基酸改变包括CDR中的一个或者多个氨基酸替代，从对给定CDR如CDR3的单氨基酸差异到引入多个氨基酸置换。在另一种方法中，CDR中每个残基对IL-1β结合的贡献可以通过将CDR中的至少一个残基替代为丙氨酸来进行检验。Lewis等人，(1995)，Mol.Immunol.32：1065-72。借着可以改变对于结合IL-1β不是最佳的残基，以确定更佳的序列。还包括通过***氨基酸以提高CDR如CDR3的尺寸所产生的变体。例如，大多数轻链CDR3序列长度为9个氨基酸。通过***适当的氨基酸以提高CDR的长度，可以优化短于9个氨基酸的抗体轻链序列结合IL-1β。
还可以通过对轻链或重链的“链混编(chain shuffling)”制备变体。Marks等人，(1992)，生物技术(Biotechnology)10：779-83。一条轻链(或重链)可以与具有全部重链(或轻链)的库进行组合，将所得到的群筛选期望的活性例如结合IL-1β。这可以筛选比使用全部重链和轻链要多的不同重链(或轻链)与一条轻链(或重链)组合的样品
本发明的IL-1β结合抗体和片段包括这里所公开的典型抗体、片段和序列的衍生物。衍生物包括已经被化学修饰的多肽或肽、或其变体、片段或衍生物。例子包括共价附着一个或者多个聚合物例如水溶性聚合物、N-连接或O-连接的碳水化合物、糖、磷酸和/或其它这类分子。在所附着的分子的类型或位置中，以与天然出现或起始肽或多肽不同的方式对这些衍生物进行修饰。这些衍生物还包括去除一个或者多个在所述肽或多肽上天然出现的化学基团。
本发明的IL-1β结合抗体和片段可以是双特异性的。双特异性的抗体可以具有多种构型的。例如，双特异性的抗体可以组成单个抗体(或抗体片段)但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。可以通过化学技术(Kranz等人(1981)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：5807)、通过”多域(polydoma)“技术(美国专利No.4,474,893)或通过重组DNA技术产生双特异性的抗体。本发明双特异性的抗体可以具有对至少两种不同抗原决定簇的结合特异性，其中至少一个是IL-1β的抗原决定簇。IL-1β结合抗体和片段也可以是异种抗体。异种抗体是两种或者多种被连接在一起的抗体或抗体片段(Fab)，每种抗体或片段都具有不同的特异性。
作为生产单克隆抗体的用于制造重组DNA版抗原结合区的技术被设计用于本发明的IL-1β结合抗体和片段。将DNA克隆到细菌表达***中。适合实施本发明的技术的一个例子使用λ噬菌体载体***，其具有引导序列能够造成表达的Fab蛋白质迁移到周质间隙中(在细菌的细胞膜和细胞壁之间)或被分泌出。人们能够快速产生和筛选大量有功能的Fab片段得到能够结合IL-1β的。这些IL-1β结合试剂(具有对IL-1β多肽特异性的Fab片段)被特异性地包括在本发明的IL-1β结合抗体和片段中。
本发明的IL-1β结合抗体和片段可以是人源化的抗体或人工改造(humanengineered)的抗体。这里所使用的人源化抗体或其抗原结合片段是重组多肽，其包含来自非人类抗体的抗原结合位点部分以及人类抗体的框架和/或恒定区部分。人工改造的抗体或抗体片段是非人类抗体(例如小鼠)，其已经通过在特定位点对氨基酸进行修饰(例如缺失、***或替代)而被改造以降低或除去被修饰的抗体在人种的所有可检测到的免疫原性。
人源化抗体包括嵌合抗体和CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)。嵌合抗体是包括连接到人恒定区的非人类抗体可变区的抗体。因此，在嵌合抗体中，可变区大部分是非人类的，而恒定区则是人类的。嵌合抗体及其制备方法被描述在Morrison，等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：6841-6855(1984)、Boulianne，等人Nature，312：643-646(1984)以及PCT申请公开WO 86/01533中。尽管它们比小鼠单克隆抗体具有较低的免疫原性，但给药嵌合抗体已经与对抗体的非人类部分的免疫应答(HAMA)有关。也已经通过将具有适当抗原结合特异性的来自小鼠抗体分子的基因与来自具有适当的生物活性(如激活人补体以及介导ADCC的能力)的来自人类抗体分子的基因进行拼接而产生嵌合抗体。Morrison等人(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851；Neuberger等人(1984)，Nature，312：604。一个例子是将Fc区替代位不同同种型的Fc区。
CDR移植抗体是含有来自非人类的“供体”抗体的CDR的抗体，其中所述CDR被连接到来自人类“受体”抗体的框架区上。通常，CDR移植抗体包括比嵌合抗体多的人类抗体序列，因为它们含有来自人类抗体的恒定区序列以及可变区序列(框架)。因此，例如本发明的CDR移植人源化抗体可以含有重链，其中所述重链含有来自人类抗体(例如人类抗体的FR-1、FR-2或FR-3)的连续氨基酸序列(例如大约5个或者更多个、10个或者更多个、甚至15个或者更多个连续的氨基酸残基)，或者可以选择的，包含人类抗体整个框架区的大部分或者全部。CDR移植抗体及其制备方法被描述载Jones等人Nature，321：522-525(1986)，Riechmann等人Nature，332：323-327(1988)以及Verhoeyen等人Science，239：1534-1536(1988))。可以用于制备人源化抗体的方法也被描述在美国专利4,816,567、5,721,367、5,837,243和6,180,377中。CDR移植抗体是认为与嵌合抗体相比不太可能诱导针对非人类抗体部分的免疫反应。然而，已经报道来自供体抗体的框架序列是供体抗体的结合亲和力和/或特异性所必须的，推测因为这些框架序列影响供体抗体的抗原结合部分的折叠。因此，如果供体非人类CDR序列被移植到未改变的人类框架序列上，则所得到的CDR移植抗体能够在某些情况下表现出相对于原始的非人类供体抗体损失结合强度。参见例如Riechmann等人Nature，332：323-327(1988)以及Verhoeyen等人Science，239：1534-1536(1988)。
人工改造的抗体包括“镶饰(veneered)”抗体，并使用HUMANENGINEERINGTM技术(XOMA(US)LLC，伯克利(Berkeley)，CA)制备这些抗体。HUMAN ENGINEERINGTM技术是商业上可以获得的，并且包括改变非人类抗体或抗体片段，例如小鼠或嵌合抗体或抗体片段，其通过对抗体片段的氨基酸序列进行特异改变，以产生在人中免疫原性降低的被锈蚀的抗体，但是仍具有原始非人类抗体的期望结合性能。通常，该技术包括将非人类抗体(例如小鼠)的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用全面风险/回报计算进行这种分类，其相对于取代将影响所得到抗体的折叠和/或抗原结合性能的风险，评价进行特定替代的预计益处(例如对于人体中的免疫原性)。因此，预测为低风险位置的替代是有利的，因为其被预测会降低免疫原性而不会显著影响抗原结合性能。中等风险位置的替代被预测为会降低免疫原性，但更可能会影响蛋白质折叠和/或抗原结合。高风险位置含有最有可能参与蛋白质折叠或抗原结合的残基。通常非人类抗体中的低风险位置被人类残基所替代，高风险位置几乎不被替代，有时在中等风险的位置进行人源化替代，尽管不是无限制的。非人类抗体可变区中具有脯氨酸的位置通常被分类为至少中等风险的位置。
通过将来自非人类抗体可变区的氨基酸序列与特定或多数人抗体序列的相应区域进行比对，可以选择在非人类(例如小鼠)抗体序列中给定的低风险或中等风险位置所被替代的特定人氨基酸残基。根据所述的比对，可以将非人类序列中的低风险或中等风险的氨基酸残基替代为相应的人类抗体序列中的残基。在Studnicka等人蛋白工程(Protein Engineering)，7：805-814(1994)，美国专利5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619以及PCT申请公开WO93/11794中对制备人工改造的蛋白质的技术进行了更详细的描述。
“镶饰”抗体是非人类抗体或人源化抗体(例如嵌合抗体或CDR移植抗体)，其已经被改造为替换某些溶剂暴露的氨基酸残基以进一步降低它们的免疫原性或增强它们的功能。因为嵌合抗体的表面残基被认为不太可能影响正确的抗体折叠并很可能引发免疫反应，因此对嵌合抗体的镶饰可以包括例如鉴定在嵌合抗体的非人类框架区中溶剂暴露的残基，并将它们中的至少一个替换为相应的来自人类框架区的表面残基。可以通过适当的改造技术包括使用上述的人类工程TM(HUMAN ENGINEERINGTM)技术完成所述镶饰。
在不同的方法中，可以通过对CDR移植抗体进行“去人源化”恢复其结合能力。去人源化可以包括将来自供体抗体框架区的残基重建到CDR移植抗体，这样恢复了正确的折叠。可以通过(i)在“受体”抗体中包含“供体”框架区部分，或者(ii)将“供体”抗体框架区部分移植到受体抗体内(与移植的供体CDR)获得相似的“去人源化”。
关于抗体、人源化抗体、人工改造抗体及其制备的进一步讨论，参见Kontermann和Dubel，抗体工程(Antibody Engineering)，Springer，New York，NY，2001。
示例性的人源化或人工改造的抗体包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。本发明可以是任何类型的抗体(IgG、IgM、IgE、IgA和IgD等)或同种型，并且可以看有κ或λ轻链。例如，人体抗体可以含有IgG重链或指定的片段例如同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4种的至少一种。作为进一步的例子，本发明的抗体或片段可以含有IgG1重链和IgG1轻链。
本发明的抗体和片段可以是人类抗体，例如结合IL-1β多肽的抗体，并由人生殖系免疫球蛋白核酸序列天然出现的体细胞变体的核酸序列所编码的，以及其片段、合成的变体、衍生物和融合。通过本领域中已知的方法生产这类抗体，例如通过使用转基因动物(例如转基因小鼠)，在所述转基因动物中原始的免疫球蛋白的全部能力已经被哺乳动物染色体中的人V-基因所替代。这些哺乳动物似乎进行正常形式的人生殖系抗体基因VDJ重组和体细胞超突变，这样产生了具有全部人类序列的高亲和力抗体。
也可以通过体外筛选噬菌体展示抗体库产生人类抗体。参见Hoogenboom等人(1991)，J.MoI.Biol.227：381；以及Marks等人(1991)，J.MoI. Biol.222：581。已经描述了各种含有抗体的噬菌体展示库，并可以被容易制备。库可以含有多种人类抗体序列，例如人Fab、Fv和scFv片段，其针对适当的靶进行筛选。除了被筛选鉴定IL-1β的选择性结合试剂外，噬菌体展示库可以含有肽或蛋白质。
IL-1β结合抗体和片段可以含有一个或者多个不会结合IL-1β的部分，但其对应于其它的功能，例如循环半衰期、引导细胞毒性效应、可检测的标记或受体内源补体级联反应或内源性细胞毒性的激活。所述抗体或片段可以含有恒定区的全部或一部分，并可以是任何同种型，其包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。除了包含恒定区外，或替代包含恒定区外，本发明的抗原结合化合物可以包括抗原决定簇标签、补救受体抗原决定簇、用于诊断或纯化目的的标记部分或者细胞毒性部分例如放射性核素或毒素。
本发明的抗体和片段的恒定区可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、β2或δ或ε型的，优选γ型，更优选y型，而人轻链的恒定区可以是κ或λ型的(其包括λ1、λ2和λ3亚型)，优选是κ型。
变体可以包括含有被修饰的Fc区的抗体，其中所述被修饰的Fc区包含对野生型Fc区至少一个氨基酸的修饰。可以将所述变体Fc区设计成与含有野生型Fc区相当的分子，以便宜更高或更低的亲和力结合Fc受体。
例如，本发明的IL-1β结合抗体和片段可以含有被修饰的Fc区。Fc区指自然出现的或合成的多肽，其与通过对IgG进行木瓜蛋白酶而产生的IgG C-末端同源。IgG Fc具有大约50kD的分子量。在本发明的抗体和片段中，可以使用整个Fc区，或者仅仅是其增强半衰期的部分。另外，可以接受氨基酸序列中的许多修饰，因为原始的活性并不是在所有情况中都是必需的或期望的。
如果期望的话，可以对Fc区进行突变，以抑制其固定补体并以高亲和力结合Fc受体的能力。对于鼠IgG Fc，将Ala替代为Glu318、Lys320以及Lys322会使得该蛋白质不能够引导ADCC。将Glu替代为Leu235会抑制改蛋白质以高亲和力结合Fc受体的能力。已知有各种对人IgG的突变(参见例如Morrison等人1994，免疫学家(The Immunologist)2：119 124和Brekke等人1994，TheImmunologist 2：125)。
在某些实施方式中，本发明的抗体或片段被提供了被修饰的Fc区，其中天然出现的Fc区被修饰以提高所述抗体或片段在生物环境中的半衰期，例如血清半衰期或根据体外检验所得到的半衰期。对IgG的原始形式Fc区进行改变的方法也被描述在美国专利No.6,998,253中。
在某些实施方式中，可以期望对抗体进行修饰，以提高其血清半衰期，例如向抗体片段中加入分子例如PEG或其它水溶性聚合物包括多糖聚合物乙提高所述半衰期。这也可以通过例如将补救受体结合抗原决定簇加入到抗体片段中达到(例如，通过将抗体片段中适当区域进行突变，或者通过将抗原决定簇引入到肽标签中，接着将其与抗体片段在末端或中部进行融合，例如通过DNA或肽合成)(参见国际公开No.WO96/32478)。补救受体结合抗原决定簇指IgG分子的Fc区的抗原决定簇(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，其对应于提高IgG分子的体内血清半衰期。
补救受体结合抗原决定簇可以含有任何一个或多个氨基酸残基，其被从Fc区的一个或两个环转移到抗体片段的类似位置。更优选，转移来自Fc区的一个或两个环的三个或更多个残基。更优选，所述抗原决定簇被从(例如IgG的)Fc区的CH2区取出，并转移到CH1、CH3或VH区或者该抗体的多个这样的区。可选地，所述抗原决定簇被从Fc区的CH2区取出，并转移到所述抗体片段的CL区或VL区或两者。同样参见国际申请WO 97/34631和WO96/32478，其描述了Fc变体及它们与补救受体的相互作用。
Fc受体结合位点内残基的突变可能导致改变的效应子的功能，例如改变的ADCC或CDC活性，或改变的半衰期。可能的突变包括***、缺失或替代一个或多个残基，其包括使用丙氨酸的替代、保守替代、非保守替代、或使用来自不同IgG亚类的在相同位点的相应氨基酸残基的替换(例如使用在该位点相应的IgG2残基替换IgG1残基)。例如，已经报道将IgG4第241位氨基酸的丝氨酸突变成脯氨酸(在IgG1和IgG2中的该位置所发现的)，与原始的嵌合IgG4相比，会导致产生同源抗体，并延长血清半衰期和改善组织分布(Angal等人，Mol Immunol.30：105-8，1993)。
优选，本发明的抗体或抗体片段不会与IL-1β以外的任何目标交叉作用。例如，本发明的抗体和片段优选不会可检测地结合IL-1α。
IL-1β结合抗体或抗体片段
抗体片段是完整全长抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体抗体；单链抗体分子(例如scFv)；多特异性抗体片段如双特异性、三特异性和多特异性抗体(例如双抗体、三抗体和四抗体)；微型抗体；螯合重组抗体；三体(tribodies)或双体(bibodies)；内抗体；纳米抗体(nanobody)；小分子免疫药物(small molecular immunopharmaceutical，SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体(camelized antibody)；含VHH的抗体；以及由抗体片段形成的其它任何多肽。
本发明提供了包含SEQ ID NO：2的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段。图1表示SEQ ID NO：2的氨基酸序列。优选，所述抗体或抗体片段包含SEQID NO：21的氨基酸序列，更优选包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。本发明的抗体还可以包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列，优选包含SEQ IDNO：14或SEQ ID NO：15。典型的，所述抗体或抗体片段包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：4-8、12-15或21的氨基酸序列)。优选，所述抗体的轻链包含SEQID NO：1的氨基酸序列，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成，或基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成。因此，例如，所述抗体的轻链包含SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列构成，或基本上由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列构成。同样优选的是，抗体或抗体片段的重链可变区包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24(例如SEQID NO：25或SEQ ID NO：26)的氨基酸序列，由SEQ ID NO：23或SEQ IDNO：24(例如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)的氨基酸序列构成，或基本上由SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24(例如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)的氨基酸序列构成的抗体或抗体片段。
本发明提供了含有重链可变区的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列之一，可选SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列之一，可选SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：21的氨基酸序列之一，或可选SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或可选SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或可选SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15的氨基酸序列。典型的，所述抗体或抗体片段包含轻链可变区，优选所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列。作为例子，优选的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
本发明还提供了包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列之一的IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段。优选，所述抗体或片段还包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列之一。
本发明还提供了IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其包含SEQ IDNO：29，由SEQ ID NO：29构成，或基本上由SEQ ID NO：29构成。优选，所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：35的氨基酸序列之一，由SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：35的氨基酸序列之一构成，或基本上由SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：35的氨基酸序列之一构成，或者可选所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列，由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成，或基本上由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成，或者可选所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列，由SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成，或基本上由SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的氨基酸序列构成。优选所述抗体或抗体片段还包括轻链可变区，其含SEQ ID NO：27的氨基酸序列之一，可选SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列之一。
图2、图3和图4列出了本发明典型的重链和轻链可变区，其序列对应于这里被称作AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB5.1、AB5.2、AB5.3和AB5.4的抗体。所述AB5.1、AB5.2、AB5.3和AB5.4序列含有在重链CDR3区中被指定为X1和X2的可变位点。这些可变位点可以是任何被指定的氨基酸。优选X1和X2分别是丙氨酸和精氨酸、缬氨酸和精氨酸、苯丙氨酸和精氨酸、赖氨酸和赖氨酸、或者天冬酰胺和精氨酸。
AB5.1包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：12的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：1 0的氨基酸序列。AB5.2包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。AB5.3包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。AB5.4包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
本发明包括IL-1β结合抗体片段，其包含前述任何一种重链或轻链序列病结合IL-1β。这里使用的术语片段指抗体中任何3个或更多个连续氨基酸(例如4个或更多、5个或更多、6个或更多、8个或更多、或者甚至10个或更多个连续氨基酸)，并且包括Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段或其单独的轻链或重链可变区或其部分。IL-1β结合片段包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和scFv。这些缺少完整抗体的Fc片段，会快速地从循环中被清除，并且可以具有比起按整的抗体低的非特异性组织结合。参见Wahl等人(1983)，J.Nucl.Med.24：316-25。可以使用公知的方法从完整的抗体产生这些片段，例如通过用酶进行蛋白质水解剪切如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)。
本发明包括IL-1β结合抗体和其IL-1β结合片段，其选择性地结合IL-1β配体，但允许或基本上允许被结合的IL-1β配体结合到I型IL-1受体(IL-1RI)(参见实施例14和图19及图20)。如实施例14所证明的，与包括许多已知IL-1β结合抗体在内的许多抗体相反，被指定为AB5和AB7的抗体选择性地结合-1β配体，但它们不会阻断或者基本不阻断IL-1β结合IL-1RI。例如，被指定为AB7的抗体结合IL-1β抗原决定簇，但仍允许被结合的IL-1β结合到IL-1RI。因此，本发明包括能够结合到IL-1β抗原决定簇的IL-1β结合抗体或片段，这样所结合的抗体或片段允许或基本允许IL-1β结合I型IL-1受体(IL-1RI)，所述抗体或片段以低于3pM的解离常数结合人IL-1β。
在本领域中被充分描述并用于确定IL-1β结合I型IL-1受体的体内基于细胞的检验包括确定存在结合IL-1β或IL-1RI的分子(例如抗体、拮抗剂或其它抑制剂)的检验(参见例如Evans等人(1995)，生物化学(J.Biol.Chem).270：11477-11483；Vigers等人(2000)，J.Biol.Chem.275：36927-36933；Yanofsky等人(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7381-7386；Fredericks等人(2004)，蛋白质工程(Protein Eng.Des.Sel.17：95-106)；Slack等人(1993)，J.Biol.Chem.268：2513-2524；Smith等人(2003)，Immunity 18：87-96；Vigers等人(1997)，Nature 386：190-194；Ruggiero等人(1997)，J.Immunol.158：3881-3887；Guo等人(1995)，J.Biol.Chem.270：27562-27568；Svenson等人(1 995)，Eur.J.Immunol.25：2842-2850；Arend等人，(1994)，J.Immunol.153：4766-4774)。用于这类检验的重组I型IL-1受体包括人I型IL-1受体是很容易从各种商业来源获得的(参见例如R&D Systems，SIGMA)。也可以从使用本领域中已知的标准分子生物学和转染技术被引入到适当寄主细胞中的表达构建体或载体表达。接着可以分离并纯化所表达的I型IL-1受体用于结合检验中，或者可选直接以细胞结合的形式进行使用。
例如，通过固定IL-1β结合抗体，将IL-1β与固定的抗体接触并确定是否IL-1β被结合到抗体上，并将可溶形式的IL-1RI与被结合的IL-1β/抗体复合体进行接触，并确定是否所述可溶的IL-1RI被结合到复合体上，可以确定IL-1β与I型IL-1受体的结合。该方案还可以包括在于IL-1β接触之前，将可溶的IL-1RI与固定的抗体进行接触，以确认可溶的IL-1RI不会结合到所固定的抗体上。可以使用Biacore结合相互作用动力学分析的设备进行该方案。也可以将该方案用于确定是否抗体或其它分子会允许或阻断IL-1β结合到I型IL-1受体。
对于其它的IL-1β/IL-1RI结合检验，可以通过将存在或不存在IL-1β抗体或其IL-1β结合片段时IL-1β与IL-1RI的结合进行比较，而确定对IL-1β与IL-1RI的结合的允许或阻断。与对照样品相对，在存在抗IL-1β抗体或其IL-1β结合片段时IL-1β与I型IL-1受体结合的降低被认为是检验中所鉴定的阻断结果，其中所述对照样品含有相应的缓冲液或稀释剂而不含有IL-1β抗体或其IL-1β结合片段。该检验结果可以被定量地显示为表示存在或不存在阻断，或者可以被定量地显示为说明由于存在所述抗体或片段而导致的结合的降低百分率或倍数。
可选地或额外地，如果IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段基本上阻断IL-1β结合IL1RI，则与不存在所述抗体或片段时，相同浓度的IL-1β与IL1RI的结合相比，IL-1β结合IL1RI会被降低至少10倍，可选至少大约10倍，可选至少大约20倍，可选至少大约50倍，可选至少大约100倍，可选至少大约1000倍，可选至少大约10000倍或更多。作为另一个实施例，如果IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段基本上允许IL-1β结合到IL1RI，则所述IL-1β结合到IL1RI是在不存在所述抗体或片段时，相同浓度IL-1β和IL1RI的结合的至少大约90％，可选至少大约，可选至少大约95％，可选至少大约99％，可选至少大约99.9％，可选至少大约99.99％，可选至少大约99.999％，可选至少大约99.9999％，可选基本相同。
本发明包括IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段，其与这里所公开的典型抗体结合到相同的抗原决定簇或相同的抗原决定簇。可选或额外，IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段与具有SEQ ID NO：11的轻链可变区和SEQ ID NO：15的重链可变区的抗体竞争结合。可选或额外，本发明包括IL-1β结合抗体和片段，其结合到包含在氨基酸序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE(SEQ IDNO：36)中的抗原决定簇，该抗原决定簇是被指定为AB5和AB7结合的抗原决定簇。正如这里所设计的，通过使用任何本领域中公知的技术，人们可以容易确定是否IL-1β结合抗体或片段结合到与典型的抗体(诸如例如被标记为AB7)的一种或者多种相同的抗原决定簇或基本相同的抗原决定簇。
例如，使用与实施例11中所描述的方法类似的肽阵列可以确定IL-1β结合抗体或片段所结合的关键氨基酸残基(抗原决定簇)。肽阵列例如PepSpotTM肽阵列(PT多肽技术(Peptide Technologies，)柏林，德国)可以直接在膜上被合成，其中长度为十二个氨基酸的肽跨越整个IL-1β氨基酸序列，每条肽与之前的一个有11个氨基酸的重叠。接着使用抗原决定簇结合信息所寻找的抗体对携带所述肽的膜进行探针标记，如在室温下以2μg/ml的浓度进行2小时。使用偶联HRP的羊抗人(或者在适当的时候为小鼠)二抗，接着进行增强的化学发光(ECL)，可以对抗体与结合肽的膜的结合进行检测。对应于成熟IL-1β的特定氨基酸残基或序列以及抗体结合评分为阳性的肽点是所述抗原决定簇被特定抗体结合的指示。
可选或另外，可以进行抗体竞争实验，并且这些检验是本领域中公知的。例如，为了确定是否抗体或片短结合到包含在含有氨基酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE的肽序列中的抗原决定簇，其中氨基酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE对应于成熟的IL-1β蛋白质的残基83至105，该未知特异性的抗体可以与本发明中已知会结合包含在该序列中的抗原决定簇结合的任何典型抗体(例如AB7)进行比较。可以例如通过使用结合相互作用动力学分析Biacore设备或者通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行结合竞争检验。在这类检验中，对抗原决定簇特异性未知的抗体进行评定其对已知比较抗体(例如AB7)竞争结合的能力。通过与IL-1β抗原决定簇的结合与已知比较抗体(例如AB7)降低至少大约50％，或者至少大约70％，或者至少大约80％，或者至少大约90％，或者至少大约95％，或者至少大约99％或者100％，并且是结合到基本相同抗原决定簇的指示。
考虑到本文中对示例性抗体和/或被所公开的抗体识别的抗原决定簇中的IL-1β结合区域的公开，设计与本发明公开的实施方式类似，可以产生具有类似结合特征和治疗或诊断实用性的其它抗体。
而且，本发明的IL-1β抗体和片段包括前述具有一个或者多个保守替代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守替代)的轻链或重链氨基酸序列。根据本发明公开的内容，人们可以确定作为保守替代候选的氨基酸序列的位置，人们可以选择影响保守替代的合成或天然氨基酸替代任何特定的氨基酸。对选择保守替代的考虑包括进行特定氨基酸替代的环境，侧链的疏水性或极性，侧链的整体大小，具有酸性或碱性特征的侧链在生理条件下的pK值。例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常适合相互替代。正如本领域中已知的，这是因为所有这三种氨基酸都具有碱性侧链，而且赖氨酸和精氨酸侧链的pK值与组氨酸(大约6)相比相互接近得多(大约10和12)。类似的，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常适合相互替代，限制是甘氨酸通常不适合替代该组中的其它成员。这是因为这些氨基酸中的每一个在被引入到多肽中时，都是相对疏水的，但甘氨酸缺少允许phi和psi转动角(在α碳周围)的α碳，因此构型自由使得甘氨酸残基能够在构型或二级结构中造成改变，这通常在其它氨基酸互相替代时不会出现。通常适合相互替代的其它氨基酸组包括但不限于由谷氨酸和天冬氨酸所构成的组；有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组；以及由丝氨酸、苏氨酸以及可以选择的酪氨酸构成的组。
通过对氨基酸序列进行保守性修饰或对编码的核苷酸进行相应的修饰，人们可以产生具有有这里所公开的典型抗体或片段相似的功能和化学特征的IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段。相反，在IL-1β结合抗体或IL-1β结合片段的功能和/或化学特征实质性改变的替代，可以通过选择在保持(a)替代区域的分子骨架结构例如片层或螺旋构型，(b)目标位置分子的电荷或疏水性或(c)侧链的体积方面显著不同的替代而完成。
抗体的抗原结合片段包括保持特异性地与抗原结合的能力，通常是由所述抗体的抗原结合区保持的。已经充分建立抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段完成。抗原结合区的例子包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含两个由在铰链区的二硫桥所连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其是和CH1结构域；(iv)Fv片段，其是抗体单臂的VL和VH结构域；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其是VH结构域；以及(vi)分离的互补性决定区域(CDR)。单链抗体也被包含在术语抗体的抗原决定区的范围内。本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括单价或多价活单体或多聚体(例如四聚体)CDR产生的结合结构域，其具有或没有支架(例如蛋白质或糖类支架)。
本发明的IL-1β结合抗体或片段可以是较大的免疫黏附分子的一部分，其是通过抗体或抗体部分与一种或者多种其它蛋白质或肽的共价或非共价结合所形成的。这类免疫黏附分子的例子包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.等人(1995)人类抗体和杂交瘤(Human antibodyand Hybridomas)6：93-101)，以及使用半胱氨酸、标记物肽和C-末端多聚组氨酸标签制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。如这里所述的，通过使用标准的重组DNA技术可以获得包含免疫黏附分子的抗体。优选的抗原结合区是完整的结构域，或者几对完整的结构域。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括结构域抗体(dAb)片段(Ward等人Nature 341：544-546，1989)，其由VH结构域构成。本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括二价抗体的双抗体，其中VH和VL结构域被表达在一条多肽链上，但使用的连接体非常短以允许相通链上的两个结构域之间的配对，这样使得这些结构域与其它链的互补结构域配对，并得到两个抗原结合位点(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448，1993；和Poljak等人Structure 2：1121-1123，1994)。双抗体可以是双特异性或单特异性的。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括结合IL-1β的单链抗体片段(scFv)。scFv包含被可操作地连接到抗体轻链可变区(VL)的抗体重链可变区(VH)，其中所述重链可变区和所述轻链可变区共同或单独形成结合IL-1β的结合位点。scFv可以在氨基末端包含VH区，在羧基末端包含VL区。可选，scFv可以在氨基末端包含VL区，在羧基末端包含VH区。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但她们可以被使用重组方法通过合成的连接体连接起来，这使得它们能够被制成但条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(被称作单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。
可选择的，scFv还可以在重链可变区和轻链可变区之间包含多肽连接体。通常这些多肽连接体包含1至50个之间的氨基酸，可选在3至12个氨基酸之间，可选2个氨基酸。用于连接scFv中的重链和轻链的连接体肽的例子包括5个氨基酸的序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：37)。其它例子包括一个或者多个该序列的前后重复(例如，包含2至4个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQID NO：37)重复的多肽)以形成连接体。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括重链抗体(HCAb)。在骆驼(骆驼、单峰骆驼和骆马(camels，dromedaries and llamas)；Hamers-Casterman等人1993 Nature 363：446；Nguyen等人1998 J.Mol.Biol.275：413)、带纹鲨(Greenberg等人Nature 374：168-73，1995；Roux等人1998 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：11804)以及在银鲛(spotted ratfish)(Nguyen，等人″骆驼属中的重链抗体；进化变革的实例(Heavy-chain antibody in Camelidae；a case ofevolutionary innovation)，″2002免疫遗传学(Immunogenetics)54(1)：39-47)中发现的免疫球蛋白同种型中还出现了不同于传统抗体的H2L2的结构。这些抗体能够明显地仅使用重链可变区形成抗原结合区，这些功能型抗体是仅有重链的二聚体(被常作“重链抗体”或“HCAb”)。因此，本发明IL-1β结合抗体和片段的某些实施方式可以是特异性结合IL-1β的重链抗体(HCAb)。例如术语IgG类别不含有轻链的重链抗体，其由包括骆驼、单峰骆驼和无峰驼的骆驼属(Camelidae)的动物产生(Hamers-Casterman等人自然(Nature)363：446-448(1993))。HCAb的分子重量为大约95kDa，而通常的IgG抗体的分子量为大约160kDa。它们的结合结构与仅由重链可变区构成，其通常被称作VHH以将它们与通常的VH进行区分。Muyldermans等人J.Mol.Recognit.12：131-140(1999)。有时，重链抗体的可变区被称作纳米抗体(nanobody)(Cortez-Retamozo等人肿瘤研究(Cancer Research)64：2853-57，2004)。从被免疫的单峰骆驼可以产生纳米抗体(nanobody)库，如在Conrath等人(Antimicrob Agents Chemother 45：2807-12，2001)中所述的或使用重组方法。
由于缺少第一恒定区(CH1)(由于缺少拼接信号，而在mRNA处理过程中被切除)，可变区(VHH)紧接是铰链区、CH2和CH3区(Nguyen等人Mol.Immunol.36：515-524(1999)；Woolven等人Immunogenetics 50：98-101(1999))。据报道骆驼VHH与IgG2和IgG3恒定区重组，其含有铰链区、CH2区和CH3区，并缺少CH1区(Hamers-Casterman等人见上文)。例如无峰驼IgG1是传统的(H2L2)抗体同种型，其中VH与含有铰链区、CH2区和CH3区的恒定区重组，而无峰驼IgG2和IgG3是仅重链的同种型，其缺少CH1区并且不含轻链。
尽管HCAb不含轻链，但它们仍具有抗原结合能力。Nguyen等人Adv.Immunol 79：261-296(2001)和Nguyen等人Immunogeneties 54：39-47(2002)中对HCAb的遗传产生机制进行了综述。鲨鱼包括铰口鲨表现出含有相似抗原受体的单体V区。Irving等人J.Immunol.Methods 248：31-45(2001)；Roux等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：11804(1998)。
VHH含有的小的完整抗原结合片段(例如大约15kDa，118-136个残基的片段)。骆驼VHH区已经被发现以高亲和力与抗原结合(Desmyter等人J.Biol.Chem.276：26285-90，2001)，其中VHH亲和力通常在纳摩范围内，并且与Fab和scFv片段相当。VHH是高度可溶的，并且比scFv和Fab片段的相应衍生物更稳定。VH片段已经相对难以以可溶形式生成，但溶解度和特异性结合的改善可以在框架残基被改编成更类似VHH而获得。(参见，例如Reichman等人免疫方法杂志(JImmunol Methods)1999，231：25-38.)VHH携带使它们更加亲水并防止与BiP(免疫球蛋白重链结合蛋白质)长时间反应的氨基酸替代，其中在折叠和组装过程中，BiP通常结合到内质网(ER)中的H-链，直到其被L链所替代。由于VHH提高的亲水性，提高了从ER的分泌。
可以通过对被免疫的骆驼的HCAb进行蛋白质水解切割，通过直接从被免疫的骆驼的B细胞直接克隆VHH基因得到充足的VHH，或者从原始库或合成库获得功能性VHH。与Fab或scFv相比，在噬菌体展示中使用VHHS更简单且更有效，因为仅需要克隆一个结构域并表达以获得功能性抗原结合片段。Muyldermans，生物技术(Biotechnol.)74：277-302(2001)；Ghahroudi等人FEBS Lett.414：521-526(1997)；以及van der Linden等人J.Biotechnol.80：261-270(2000)。在美国专利公开No.20050136049和20050037421中也描述了产生具有骆驼重链的抗体的方法。
核糖体展示法可以用于鉴定和分离具有期望的结合活性和亲和力的scFv和/或VHH分子。Irving等人J.Immunol.Methods 248：31-45(2001)。核糖体展示和选择具有产生和展示大容量库(1014)的能力。
其它实施方式通过骆驼化(camelisation)处理提供VHH样分子，其通过对mm-骆驼VH例如人VHH以提高它们的溶解度并防止非特异性结合。这是通过使用VHH样残基替换VH的VL侧链而叨叨的，进而模拟更高溶解度的VHH片段。骆驼VH片段，特别是基于人框架的，被认为在被体内给药给患者时，表现出大大降低的免疫反应，因此，被认为具有用于治疗应用的显著优点。Davies等人FEBS Lett.339：285-290(1994)；Davies等人Protein Eng.9：531-537(1996)；Tanha等人J.Biol.Chem.276：24774-24780(2001)；以及Riechmann等人Immunol.Methods 231：25-38(1999)。
可以利用多种表达体系用于产生包含Fab片段、scFv和VHH的IL-1β片段。例如，原核细胞和真核细胞来源的表达体系都可以被用于大规模生产抗体片段和抗体融合蛋白。特别有利的是允许将大量抗体片段分泌到培养基中的表达体系。
在Schoonjans等人(J Immunol.165：7050-57，2000)和Willems等人(Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786：161-76，2003)中描述了制备双特异性Fab-scFv(“二体”)和三特异性Fab-(scFv)(2)(“三体”)。对于二体或三体，scFv分子被融合到VL-CL(L)和VH-CH1(Fd)链的一条或两条，例如为制备三体，两条scFv被融合到Fab的C-末端，而在二体中，一条scFv被融合到Fab的C-末端。“微型抗体”是由通过肽连接体(无铰链)或通过IgG铰链融合到CH3的scFv所构成的，这已经在Olafsen，等人ProteinEng Des Sel.2004 Apr；17(4)：315-23中被描述。
内抗体是单链抗体，其表示细胞内表达并能够处理细胞内蛋白质功能(Biocca，等人EMBO J.9：101-108，1990；Colby等人Proc Natl Acad Sci U SA.101：17616-21，2004)。可以根据在Mhashilkar等人(EMBO J 14：1542-51，1995)和Wheeler等人(FASEB J.17：1733-5.2003)中所描述的来制备包含细胞信号序列的内抗体，其在细胞内区域中保持抗体结构。穿膜抗体(Transbody)是能透过细胞的抗体，其中蛋白转导域(PTD)被与单链可变片段(scFv)抗体相融合Heng等人(Med Hypotheses.64：1105-8，2005)。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括抗体，其为对目标蛋白质特异性的SMIP或结合结构域免疫球蛋白。这些构建体是单链多肽，其含有与实施抗体效应功能必要的免疫球蛋白结构域融合的抗原结合结构域。参见例如WO03/041600，美国专利公开20030133939和美国专利公开20030118592。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括免疫粘附素。一个或者多个CDR可以被共价或非共价加入到分子中，以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可以引入CDR作为较大的多肽链的一部分，可以将CDR共价连接到另一条多肽链上，或者可以非共价引入CDR。这里所公开的CDR允许免疫粘附素特异性地结合IL-1β。
本发明的IL-1β结合抗体和片段还包括抗体模拟物，其包含在有机或分子支架(例如蛋白质或糖类支架)上建造的一个或者多个IL-1β结合部分。具有相对确定的三维结构的蛋白质，通常被称作蛋白质支架，可以被用作设计抗体模拟物的试剂。这些支架通常含有一个或者多个易于进行特异或随机序列改变的区域，通常进行这些区域的随机化以获得蛋白质库，从该库中可以选择期望的产品。例如，抗体模拟物可以包含非免疫球蛋白结合多肽，其具有免疫球带白杨结构域，含有两个或多个容积暴露环，该环含有与被***到每个环的亲代抗体不同的CDR并表现出对亲代抗体所结合的配体的选择性结合活性。非免疫球蛋白蛋白质支架已经被用于获得具有新型结合特性的蛋白质(Tramontano等人J.Mol.Recognit.7：9，1994；McConnell和Hoess，J.Mol.Biol.250：460，1995)。其它的蛋白质已经被作为框架进行测试，并已经被用于在α螺旋表面(Nord等人Nat.Biotechnol.15：772，1997；Nord等人ProteinEng.8：601，1995)、α螺旋表面束中α螺旋之间的环(Ku和Schultz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6552，1995)以及由二硫键所限定的环例如小蛋白酶抑制剂(Markland等人生物化学(Biochemistry)35：8045，1996；Markland等人Biochemistry 35：8058，1996；Rottgen和Collins，Gene 164：243，1995；Wang等人J.Biol.Chem.270：12250，1995)上展示随机化的残基。将支架用于抗体模拟物的方法被公开在美国专利5,770,380和美国专利公开2004/0171116、2004/0266993和2005/0038229中。
因此可以产生多种IL-1β结合抗体和片段，其包含抗体重链可变区或轻链可变区的一个、两个和/或三个CDR(优选SEQ ID NO：1-26的CDR中的一个或者多个)。
本发明优选的抗体或片段与IL-1β结合，其以(i)根据酶联免疫吸附检验(ELISA)所确定的大约0.5nM或更低(例如大约0.4或更低，大约0.3或更低，或甚至大约0.2或更低)的IC50，(ii)相对于其结合IL-1α高至少大约100倍(例如至少大约150倍，至少大约200倍，或甚至至少大约250倍)的亲和力(即对IL-1β具有比IL-1α高至少大约100倍(例如至少大约大约150倍，至少大约200倍，或甚至至少大约250倍)的选择性)，和/或(iii)对于IL-1β平衡结合(KD)大约为20pM或更低(例如大约15pM或更低，大约10pM或更低，或者甚至大约5pM或更低)。同样优选的本发明的抗体或片段能够抑制IL-1β诱导的血清IL-6在动物中的表达，与未给药本发明抗体或片段的IL-1β刺激的动物中血清IL-6的水平相比，抑制至少50％(例如至少60％，至少70％或甚至至少80％)。因此，在相关的方面，本发明提供了IL-1β结合抗体或IL-1β结合抗体片段，其具有至少一个前述的特征。
尽管本发明此处已经描述了IL-1β结合抗体及其片段(例如包含轻链和重链)，但本发明还提供了不同于IL-1β结合抗体或抗体片段的多肽，例如单链多肽(包括融合多肽、嵌合多肽、共轭物等)。因此，在这点上，本发明提供了包含SEQ ID NO：1-26中任一氨基酸序列的多肽，或者其功能上等价的片段或变体。本发明还提供了包含SEQ ID NO：27-35或42-57中任一氨基酸序列的多肽，或者其功能上等价的片段或变体。
可以通过任何适当的方法制备这里所描述的抗体和抗体片段。用于制备这类抗体和抗体片段的适当方法是本领域中已知的。制备抗体和抗体片段的其它方法在这里被描述作为发明的一部分。如这里所描述的，本发明的抗体、抗体片段或多肽可以被分离或纯化到任何程度。如这里所使用的，所分离的化合物是已经从自然环境中被去除的化合物。纯化的化合物纯度已经被提高，这样该化合物比其存在于(i)自然环境中，或(ii)在实验条件下起始合成和/或扩增时更纯的形式存在，其中“纯度”是相对的术语并且不必要意味着“绝对纯”。
如这里所述，前述本发明的所有抗体、抗体片段或多肽都能够被人源化或人工改造。
制备IL-1β抗体或片段的方法
本发明提供了一种用于制备亲和力成熟的IL-1β结合多肽如抗体或抗体片段(包括抗体区(例如其轻链或重链可变区或任何部分例如CDR))的方法，该方法包括：(a)提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码IL-1β结合多肽的核酸序列，其中所述IL-1β结合多肽包含SEQ ID NO：1-26任一项的氨基酸序列，其中第二核酸序列包含与第一核酸序列至少有一个核苷酸不同的核酸序列；(b)进行核酸混编以提供两种或者更多种突变的核酸；以及(c)选择突变的核酸，其编码以下多肽，该多肽能够(i)以比第一核酸所编码的多肽高的亲和力与IL-1β结合，(ii)对IL-1β具有高于IL-1α的选择性，该选择性大于第一核酸所编码的多肽的选择性，(iii)对于IL-1β具有低于第一核酸所编码的多肽的平衡结合解离常数(KD)，或者(iv)抑制IL-1β诱导的动物中血清IL-6的表达的程度比第一核酸所编码的多肽高；以及(d)表达所选择的突变核酸以提供亲和力成熟的IL-1β多肽。优选，所述多肽是抗体或抗体片段，例如这里所描述作为本发明一部分的任何抗体或抗体片段。
制备亲和力成熟的IL-1β多肽的方法可选择地还包括重复步骤(b)和(c)一次或多次，其中使用(i)至少一种步骤(c)所选择的的突变核酸和(ii)至少一种核酸，其具有与所选择的突变核酸有至少一个核苷酸不同的核酸序列进行步骤(b)的核酸混编。优选，重复步骤(b)和(c)直到选择到最佳的核酸。如果不再可能选择到一种核酸，其编码的多肽具有优于之前所选择的核酸所编码的多肽的对IL-1β的结合特征(例如步骤(c)的特征(i)-(iv))的多肽，则选到了最佳的核酸。
期望地，重复步骤(b)和(c)直到选择一种核酸，其编码具有下列特征中至少一种的多肽：(i)根据酶联免疫吸附检验(ELISA)所确定的大约0.5nM或更低(例如大约0.4或更低，大约0.3或更低，或甚至大约0.2或更低)的IC50；(ii)相对于其结合IL-1α高至少大约100倍(例如至少大约150倍，至少大约200倍，或甚至至少大约250倍)的亲和力(即对IL-1β具有比IL-1α高至少大约100倍(例如至少大约大约150倍，至少大约200倍，或甚至至少大约250倍)的选择性)；(iii)对于IL-1β平衡结合(KD)大约为20pM或更低(例如大约15pM或更低，10pM或更低，5pM或更低，3pM或更低，2pM或更低，1pM或更低，0.7pM或更低，0.5pM或更低，0.3pM或更低，或0.2pM或更低)；或(iv)抑制IL-1β诱导的动物中IL-6的表达，与未给药本发明抗体或片段地IL-1β刺激的动物中血清IL-6的水平相比，抑制至少50％(例如至少60％，至少70％或甚至至少80％)。
通过适当的方法可以进行选择编码具有期望性能的多肽的突变核酸。这里公开了表达所编码的多肽，检验多肽结合亲和力、结合选择性、平衡结合常数以及抑制IL-1β诱导的IL-6表达的方法(参见实施例)。其它的方法是本领域中已知的。如果通过步骤(b)所提供的突变核酸所编码的多肽不是抗体或全部抗体片段(例如Fab)，则必须提供含有该多肽的抗体以确定是否该多肽满足选择标准。因此，本发明制备亲和力成熟的IL-1β多肽的方法还可以包括提供包含所述突变核酸所编码的多肽的抗体的步骤，其中选择编码具有期望性能的多肽的突变核酸的步骤是通过对所述抗体进行检验而进行的。
这里所使用的核酸混编的意思是将两个或多个核酸序列进行分段以提供随机的核酸片段库，将所述片段进行重新组装以形成两个或多个突变的核酸。在这点上，所突变的核酸仅仅是具有已经被改变的核酸序列的核酸。可以通过适当的方法进行核酸混编。许多适当的方法是本领域中已知的，例如在美国专利6,489,145；6,773,900；6,764,835；6,740,506；6,713,282；6,713,281；6,713,279；6,709,841；6,696,275；6,677,115；6,673,552；6,656,677；6,605,449；6,566,050；6,562,594：6,555,315；6,537,776；6,528,249；6,479,258；6,455,254；6,440,668；6,368,798；6,361,974；6,358,709；6,352,842；6,344,328；6,335,179；6,280,926；6,238,884；6,174,673；6,171,820；6,168,919；6,057,103；6,054,267；6,030,7796,001,574；5,965,408；5,958,672；5,939,250；5,763,239；6,395,547；6,376,246；6,372,497；6,368,861；6,365,408；6,365,377；6,358,740；6,358,742；6,355,484；6,344,356；6,337,186；6,335,160；6,323,030；6,319,714；6,319,713；6,303,344；6,297,053；6,291,242；6,287,861；6,277,638；6,180,406；6,165,793；6,132,970；6,117,679；5,834,252；5,830,721；5,811,238；5,605,793中所描述的。
核酸
本发明的抗体、抗体片段和多肽可以由单条核酸(例如包含抗体轻链和重链多肽链的核苷酸序列的单条核酸链)所编码，或者由两条或更多条单独的核酸所编码，其中每一条编码抗体或抗体片段的不同部分。在这一点上，本发明提供了一种或者多种核酸，其编码任何前述的抗体、抗体片段或多肽(例如前述任意一种的轻链或重链可变区)。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码抗体的重链可变区或其一部分。典型的核酸序列是在SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40中所提供的，其分别编码SEQ ID NO：15的重链可变区以及SEQ ID NO：11的轻链可变区。在这一点上，本发明提供了一种编码多肽(例如抗体的重链可变区)的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，可选SEQ ID NO：28的氨基酸序列，期望编码一种包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的多肽(例如包含SEQ ID NO：4-8任一氨基酸序列的多肽)。更优选的是编码一种多肽(如重链可变区)，所述多肽包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO：14-15任一氨基酸序列的多肽)，或者包含SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24(例如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)的氨基酸序列。
可选或另外，本发明的核酸可以包含一种核酸序列，其编码抗体的轻链可变区或其一部分。在这一点上，本发明提供了一种核酸，其编码包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽(例如轻链可变区)。例如，所述核酸序列能够编码包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽。更优选，所述核酸编码包含SEQID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列的多肽。
本发明还包括一种核酸，其编码包含一个或者多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守替代)保守替代的任何前述轻链或重链的氨基酸序列，正如对本发明的抗体和抗体片段所进行的讨论，其中包含替代的抗体和片段具有与这里所公开的示例性抗体的一种或者多种相同或基本相同的抗原决定簇结合亲和力和特异性。
通过任何适当的方法，可以从这里所描述的抗体、抗体片段和轻链或重链可变区的氨基酸序列确定核酸序列，例如通过使用遗传密码将该氨基酸序列转化成相应的核酸序列。编码这些氨基酸序列(例如这里所描述的氨基酸序列)的核酸可以使用本领域中已知的方法进行制备(例如分离或合成的核酸序列)，例如在如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，a LaboratoryManual)，第3版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY)，2001；Ausubel等人，分子生物学现代实验方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)，格瑞尼出版协会(Greene PublishingAssociates)和John Wiley & Sons，纽约(New York)，NY，1994；以及Herdewijn等人，寡聚核苷酸合成：方法及应用(分子生物学方法)(OligonucleotideSynthesis：Methods and Applications(Methods in Molecular Biology))，HumanaPress，Totowa，NJ，2004中所描述的方法。这里所描述的核酸可以被分离或纯化到任何程度。如这里所使用的，所分离的化合物是已经从自然环境中被去除的化合物。纯化的化合物纯度已经被提高，这样该化合物比其存在于(i)自然环境中，或(ii)在实验条件下起始合成和/或扩增时更纯的形式存在，其中“纯度”是相对的术语并且不必要意味着“绝对纯”。
可以使用多种技术对所述核算进行纯化，其包括但不限于制备型凝胶电泳或等电聚焦、亲和、免疫亲和或离子交换层析、分子筛层析、聚焦层析或高压液相层析。
载体(vector)
这里所描述的核酸可以被***到载体中，例如核酸表达和/或靶向载体。可以以各种方式利用这些载体，例如用于在细胞或转基因动物中表达IL-1β结合抗体或抗体片段。因此，本发明提供了一种载体，其包含本发明的任何一种或者多种核酸。“载体”是任何具有携带核酸进入适当的寄住细胞的能力的分子或组合物，其中在所述适当的寄主细胞处可以发生所编码多肽的合成。通常并优选，载体是被使用本领域中已知的重组DNA技术进行改造的核酸，以引入期望的核酸序列(例如本发明的核酸)。期望，所述载体是由DNA构成的。适当的DNA基基因转移载体的例子包括质粒和病毒载体。例如，适当的病毒载体包括肠炎病毒基载体(例如腺相关病毒(AAV)基载体)、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)基载体、AAV-腺病毒嵌合载体、HIV病毒基载体以及腺病毒基载体。所有的这些载体都可以通过标准的重组DNA技术进行制备，所述技术被描述在例如Sambrook等人，supra，和Ausubel等人，supra中。然而，不是基于核酸的载体例如脂质体也是本领域中已知的，能够用于本发明中。所发明的载体可以基于单一的核酸类型(例如质粒)或非核酸分子(例如脂类或聚合物)。可选，所述载体可以是核酸和非核酸的结合(即“嵌合”载体)。例如，携带所述核酸的质粒可以使用脂或聚合物作为传递媒介被制备。这类载体在这里分别被称作“质粒-脂复合体”以及“质粒-聚合物”复合体。所发明的基因转移载体可以被整合到寄主细胞基因组中，或者能够以游离基因的形式出现在寄主细胞中。
本发明的核酸可以被***到免疫球蛋白表达载体中，例如在McLean等人，Mol.Immunol.37：837-45(2000)；Walls等人，Nucleic Acids Res.21：2921-9(1993)；以及Norderhaug等人，J.Immunol.Meth.204：77-87(1997)中所描述的载体。
通常选择在将使用所述载体的细胞中有功能的载体(与寄主细胞机制兼容的载体，这样可以发生基因的扩增和/或表达)。可以在原核细胞、酵母、昆虫(杆状病毒***)和/或真核寄主细胞中扩增/表达编码IL-1β结合抗体或的核酸。对所述寄主细胞的选择将部分依赖于是否所述IL-1β结合抗体或片段会被进行转换后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。如果有，则优选酵母、昆虫或哺乳寄主细胞。在Meth.Enz.v.185(1990；Goeddel，ed.)，Academic Press Inc.SanDiego，Calif可以得到关于表达载体的进一步信息。
通常表达载体含有下列组分中的一个或多个：启动子、一个或者多个增强子序列、复制起点、翻译终止序列、含有供体和受体切割位点的完整内含子序列、分泌的引导序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸序列、多聚连接体区以***要表达的多肽、以及可选择的标记物元件。
载体组分可以是同源的(来自与寄主细胞相同的种和/或株)、异源的(来自与寄主细胞种或株不同的种)、杂交的(来自多种来源的不同序列的组合)、合成的或者原是序列，其通常的功能是调节免疫球蛋白的表达。载体组分的来源可以是任何原核或真核生物，任何脊椎生物或无脊椎生物，或者任何植物，只要这些组分能够在寄主细胞机制中发挥功能，并被寄主细胞机制所激活。
根据用于表达的寄主细胞的类型选择复制的起点。作为例子，来自质粒pBR322(Product No.303-3s，新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，伯克利(Beverly)，Mass.)的复制起点可以用于大部分革兰氏阴性菌中，而来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、泡状口腔炎病毒(VSV)或***状瘤病毒(如HPV或BPV)的各种起点可以用于哺乳细胞中的克隆载体。通常，哺乳细胞表达载体(例如通常使用SV40起点，因为期含有早期的启动子)不需要复制起点组分。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3’末端。原核细胞中的转录终止序列通常包括富含G-C的片段，接着是多聚T序列。可以从作为载体一部分的商业购买或使用核酸合成方法(如上所述)的库克隆转录终止序列。
可选择的标记物基因编码对于寄主细胞在选择培养基上存活或生长所必须的蛋白质。典型的选择标记物基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)提供对抗生素或其它毒素的抗性例如对于原核寄主细胞的青霉素、四环素或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷型；或(c)补给不能从复合培养基中获得的关键营养物。优选的选择标记物是卡那霉素抗性基因、青霉素抗性基因以及四环素抗性基因。新霉素抗性基因也可以用于在原核寄主细胞和真核寄主细胞中进行选择。
其它选择基因可以用于扩增将要表达的基因。扩增是一种过程，其中需要大量生长必需的蛋白质的基因被在重组细胞的连续传代的染色体内被反复复制。哺乳动物的选择标记物包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。所述哺乳细胞转化体被置于选择压力下，仅有唯一通过载体上所出现的标记物的转化体会存活。通过将转化的细胞在培养基中选择试剂的浓度连续变化的条件下进行培养而提供选择压力，这样达到了选择基因以及编码IL-1β抗体或片段的DNA的扩增。结果，从扩增的DNA合成了提高量的抗体。
通常存在核糖体结合位点以起始mRNA翻译。例如，该位点的特征是Shine-Dalgarno序列(原核细胞)或Kozak序列(真核细胞)。该元件通常位于启动子的3’，或要表达的多肽的编码区的5’。所述Shine-Dalgarno序列是可以变化的，但通常是多聚嘌呤(具有高A-G含量)。许多Shine-Dalgarno已经被鉴定，每一种都能够使用上述的方法容易进行合成并用于原核载体中。
引导序列或信号序列可以被用于引导多肽的分泌。信号序列可以被定为在多肽编码区的内部，或直接定位在多肽编码区的5’末端。已经鉴定了许多信号序列，并可以基于用于表达的寄主的进行选择。信号序列与编码需要表达的蛋白质(例如抗体或抗原结合片段)的核酸序列可以是同源的(自然出现的)或异源的。所选的异源信号序列需要是能够被寄主细胞识别并处理(被信号肽酶所切割)的。对于不会识别并处理原始抗体信号序列的原核细胞，所述信号序列被所选择的原核信号序列所替代，例如所述原核信号序列选自碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II引导子的组。对于酵母分泌，原始抗体信号序列可以被酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶引导子所取代。在哺乳细胞中，表达原始信号台通常是令人满意的，尽管其它哺乳信号序列可以是适合的。
在大部分情况中，从寄主细胞分泌抗体或抗原结合片段将导致从抗体或片段去除信号肽。因此，成熟的抗体或片段将缺少任何引导或信号序列。
在某些情况中，例如真核寄主细胞表达***中期望糖基化的情况中，人们可以操作各种前导序列(presequence)以提高糖基化或产率。例如，人们可以改变信号肽的肽酶切割位点，或增加前导序列(presequence)，这也可以会影响糖基化。最终的抗体或片段在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)可以具有一个或者多个额外的易于表达的氨基酸，其可以不用被完全去除。例如，最终抗体或片段可以具有在肽酶切割位点发现的一个或多个连着N-末端的氨基酸。可选，如果酶在成熟抗体或片段的这些区域内进行切割，则使用某些酶切位点可以导致稍微截短形式的期望抗体或片段。
通常所述表达载体将含有能够被寄主生物所识别的启动子，并被可操作地连接到编码IL-1β结合抗体或抗原结合片段的核酸分子上。原始启动子或异源启动子可以被使用，这依赖于用于表达的寄主细胞和期望的产率。
用于原核寄主细胞的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子***；碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子***；以及杂交启动子例如tac启动子。还适合其它已知的细菌启动子。它们的序列已经被公开，并且它们能够被连接到期望的核酸序列，其使用期望补充限制性位点的连接体或接头。
用于酵母寄主的启动子也是本领域中已知的。酵母增强子被有利地与酵母启动子进行使用。适合用于不如细胞的启动子是公知的，并且包括从病毒如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛***状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、细胞巨化病毒、反转录病毒、乙型肝炎肝炎病最优选猿病毒40(SV40)的病毒基因组的启动子。其它适当的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可以用于表达本发明选择性结合试剂的附加启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，Nature，290：304-310，1981)；CMV启动子；包含在鲁斯氏肉瘤病毒的3′长末端重复中的启动子(Yamamoto等人(1980)，Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人(1981)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-5)；金属硫蛋白基因的调解序列(Brinster等人Nature，296；39-42，1982)；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75；3727-3731，1978)；或tac启动子(DeBoer，等人(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-5)。同样感兴趣的是下列动物转录控制区，其表现出组织特异性并已经用于转基因动物中：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺泡细胞中是有活性的(Swift等人(1984)，Cell 38：639-46；Ornitz等人(1986)，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald(1987)，肝脏病学(Hepatology)7：425-515)；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是有活性的(Hanahan(1985)，Nature 315：115-22)；免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴细胞中是有活性的(Grosschedl等人(1984)，Cell 38；647-58；Adames等人(1985)，Nature 318；533-8；Alexander等人(1987)，Mol.Cell.Biol.7：1436-44)；小鼠***肿瘤病毒控制区，其在睾丸、胸部、淋巴和肥大细胞中是有活性的(Leder等人(1986)，Cell 45：485-95)；白蛋白基因控制区，其在肝中是有活性的(Pinkert等人(1987)，基因及发育(Genesand Devel.)1：268-76)；α-胎甲球蛋白基因控制区，其在肝中是有活性的(Krumlauf等人(1985)，Mol.Cell.Biol.5：1639-48；Hammer等人(1987)，Science，235：53-8)；α1-抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中是有活性的(Kelsey等人(1987)，Genes and Devel.1：161-71)；β-球蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中是有活性的(Mogram等人，Nature，315 338-340，1985；Kollias等人(1986)，Cell 46：89-94)；髓磷脂碱性蛋白基因控制区，其在脑中的少突细胞中是有活性的(Readhead等人(1987)，Cell，48：703-12)；肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是有活性的(Sani(1985)，Nature，314：283-6)；以及刺激生殖腺的释放激素基因控制区，其在下丘脑中是有活性的(Mason等人(1986)，Science 234：1372-8)。
可以将增强子序列***到载体中以提高在真核寄主细胞中的转录。已知许多可以从哺乳动物基因(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎甲球蛋白和胰岛素)获得的增强子序列。然而通常将使用来自病毒的增强子。SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是激活真核启动子的示例性增强元件。
尽管增强子可以被切割到多肽编码区的5’或3’位置的载体中，但通常位于启动子的5’位点。
表达核酸的载体包括与细菌、昆虫和哺乳寄主细胞兼容的载体。这些载体除了其它的以外还包括pCRII、pCR3以及pcDNA3.1(印威畴根公司(InvitrogenCompany)，San Diego，Calif.)、pBSII(斯推塔基因公司(Stratagene Company)，拉霍亚(La Jolla)，Calif.)、pET15(诺瓦根(Novagen)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wis.))、pGEX(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，N.J.)、pEGFP-N2(克隆技术(Clontech)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，Calif.)、pETL(BlueBacII；Invitrogen)、pDSR-α(PCT公开No.WO90/14363)以及pFastBacDual(吉伯克(Gibco/BRL)，格兰德岛(GrandIsland)，N.Y.)。
其它可能的载体包括但不限于柯斯质粒(Cosmid)、质粒或被修饰的病毒，但所述载体***必须要与所选择的寄主细胞兼容。这些载体包括但不限于质粒如Bluescript
Figure A20068002655100491
质粒衍生物(高拷贝数ColEl-基噬菌体质粒(phagemid)，斯推塔基因克隆***公司Stratagene Cloning Systems Inc.La Jolla Calif.)、用于克隆Taq-扩增PCR产物的PCR克隆质粒(例如TOPOTM.TA Cloning
Figure A20068002655100492
Kit，PCR2.1质粒衍生物Invitrogen，卡尔斯巴德(Carlsbad)，Calif.)和哺乳动物、酵母或病毒载体如杆状病毒表达***(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，Palo Alto，Calif.)。可以通过转化、转染、电转或其它已知技术将重组分子引入到寄主细胞中。
寄主细胞及其应用
本发明还提供了包含本发明的核酸或载体的细胞(例如分离的或纯化的细胞)。所述细胞可以是能够被转化本发明的核酸或载体以生产其所编码的多肽的所有细胞类型。优选所述细胞是哺乳细胞例如人，更优选是杂交瘤细胞、胚胎干细胞或受精卵。
为了表达IL-1β结合或片段，编码如上述获得的部分或全长轻链和重链的DNA被***到表达载体中，因此这些基因被可操作地连接到转录和翻译控制序列中。在本文中，术语“可操作地”的意思是抗体基因被连接到载体中，这样载体内的转录和翻译控制序列提供了它们期望的调节所述抗体基因转录和翻译的功能。所述表达载体和表达控制序列被选择为与所使用的表达寄主细胞兼容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以被***到不同的载体中，或者更典型的，两个基因被***到相同的表达载体中。通过标准的方法将这些抗体基因***到表达载体中(例如通过连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果没有限制性位点存在则平末端连接)。在***轻链或重链序列之前，所述表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，一种将所选定的VH和VL序列转化成全长抗体基因的方法是将它们分别***到已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，这样所述VH部分被可操作地连接到载体内的CH部分中，VL部分被可操作地连接到载体内的CL部分。另外或可选，所述重组表达载体可以编码信号肽，其辅助抗体链从寄主细胞分泌。所述抗体链基因可以被克隆到载体内，这样信号肽被符合阅读框地连接到抗体链基因的氨基末端。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体可以携带调节序列，其控制抗体链基因在寄主细胞中的表达。术语调节序列是为了包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。这些调控序列被描述在例如Goeddel；基因表达技术：酶学方法(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185，学院出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(Calif).(1990)中。可以理解的是，对表达载体的设计，包括对调控序列的选择将依赖于这些因素例如对进行转化的寄主细胞的选择、期望的蛋白质的表达水平，以及其它的考虑。哺乳寄主细胞表达的优选调节序列包括引导哺乳细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件。
除了所述抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可以携带额外的序列，例如调节寄主细胞中载体复制的序列(例如复制的起点)以及可选择的标记物基因。所述可选择的标记物基因辅助选择已经引入载体的寄主细胞(参见例如美国专利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017，全部是Axel等人的)。例如，通常可选择标记物基因为已经引入载体的寄主细胞提供了对药物的抗性，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-寄主细胞，使用甲氨蝶呤进行选择/扩增)以及neo基因(用G418进行选择)。
将核酸和载体引入到所分离的细胞和培养中，以及在体内外选择所转化的寄主细胞的方法是本领域中已知的，并且包括使用氯化钙介导的转化、转导、偶联、三亲株杂交、DEAE、葡聚糖介导的转染、感染、与脂质体的膜融合、使用覆盖DNA的基因枪弹进行高速轰击、直接微注射倒但细胞内以及电转(参见例如Sambrook等人，见上文；Davis等人，分子生物学基本方法(BasicMethods in Molecular Biology)，第2版，McGraw-Hill Professional，1995；以及Neumann等人，EMBO J.1：841(1982))。
所述包含本发明的核酸或载体的细胞能够被用于生产IL-1β结合抗体、其片段或其一部分(例如由所述核酸或载体所编码的重链序列或轻链序列)。将本发明的核酸或载体引导到细胞中后，在适合表达所编码序列表达的条件下对细胞进行培养。接着可以从细胞分离所述抗体、抗原结合片段或抗体的一部分。
在某些实施方式中，可以将两种或者多种共同编码IL-1β结合抗体或其抗原结合片段的载体引入到细胞中。例如编码重链可变区或完整重链序列的第一载体可以被引入到寄主细胞中，编码轻链可变区或完整轻链序列的第二载体也被引入到寄主细胞中。接着在适合表达第一和第二载体所编码的两条序列的条件下，对细胞进行培养。如果必要，可以接着将所分离的多肽在促进它们联合和组合成IL-1β结合抗体或其抗原结合片段的条件下将所分离的多肽进行组合。可选，所述第一和第二载体能够被引入到不同的细胞中，并可以从各自细胞分离产品，并连接以提供IL-1β结合抗体或其抗原结合片段。用于促进抗体链和和组合成抗原结合多肽的方法在本领域中已经被描述。类似的，分离抗体、其抗原结合片段或重链和轻链片段的方法是本领域技术人员所已知的。
含有本发明的核酸或载体的胚胎干细胞可以被用于产生转基因非人动物。用于制备转基因动物的方法被描述在Hofker等人，转基因小鼠：方法和实验方案(分子生物学方法)(Transgenic Mouse：Methods and Portocols(Methods inMolecular Biology))，Humana Press，Clifton，NJ，2002中。这里所公开的含有核酸或载体的转基因非人动物可以被用与表达所编码的抗体、抗原结合片段或所述抗体的一部分。接着可以从该动物分离抗体、抗原结合片段或所述抗体的一部分。接着可以对抗体的一部分进行重新构建(与抗体其它部分进行组合)成本发明的IL-1β结合抗体或抗体片段。
所述寄主细胞可以是原核寄主细胞(例如大肠杆菌)或真核寄主细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。在适当的条件下培养时，所述寄主细胞表达IL-1β结合抗体或片段，接着可以从培养基中被收集(如果寄主细胞将其分泌到培养基中)，或者直接从生产它的细胞中被收集(如果不被分泌)。选择适当的寄主细胞将依赖于各种因素，例如期望的表达水平、对于活性是期望或必要的多肽修饰如糖基化或磷酸化、以及容易折叠成生物学上有活性的分子。在本领域中已知许多适合的寄主细胞，并可以从美国典型培养物库(ATCC)Manassas，Va获得。例子包括哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)CHO DHFR-细胞(Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，4216-4220(1980))、人胚胎肾(HEK)293或293T细胞(ATCC No.CRL1573)、3T3细胞(ATCC No.CCL92)或PER.C6细胞。对适当哺乳动物寄主细胞的选择，以及转化、培养、扩增、筛选和产物生产以及纯化的方法是本领域中已知的。其它适当的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC No.CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC No.CRL1651)以及CV-1细胞系(ATCCNo.CCL70)。其它的典型哺乳寄主细胞包括灵长类细胞系、鸟类细胞系和啮齿类细胞系，包括被转化的细胞系。正常的二倍体细胞，来自体内原代培养组织的细胞主以及原代外植体也是适当的。候选的细胞可以在选择基因上基因型缺陷，或者可以含有显性发挥作用的选择基因。其它适合的哺乳动物细胞包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞、来自SwissBalb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系，其可以从美国典型培养物库Manassas，Va获得。这些细胞系中的每一种都是蛋白质表达领域的技术人员知道并可以得到的。
类似可以用作本发明的寄主细胞是细菌细胞。例如各种大肠杆菌(E.coli)株(例如HB101、(ATCC No.33694)DH5α、DH10以及MC1061(ATCC No.53338))是在生物技术领域中公知的寄主细胞。枯草杆菌(B.subtilis)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、其它杆菌(Bacillus spp.)、链霉菌(Streptomycesspp.)等的各种株都可以用于本发明中。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体被通过标准技术转染到寄主细胞中。转染包括多种通常用于将外源DNA引入到原核或真核寄主细胞中的多种技术，例如电转、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可以在原核或真核寄主细胞中都能够表达IL-1β结合抗体或片段，但优选在真核寄主细胞中表达所述抗体或片段，最优选在哺乳动物寄主细胞中，因为真核细胞特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能组装和分泌被正确折叠并且具有免疫学活性的抗体。用于表达本发明重组抗体的哺乳寄主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，其在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：42164220中被描述，使用DHFR作为可选择的标记物，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述的)，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。如果编码抗体基因的重组表达载体被引入到哺乳动物寄主细胞中，则通过将该寄主细胞培养一段时间来制备所述抗体，其中所述时间足以允许在寄主细胞中表达抗体，或者更优选将所述抗提分泌到寄主细胞生长的培养基中。使用标准的蛋白质纯化方法可以从培养基中回收所述抗体。
许多本领域中已知的酵母细胞株也可以用作表达抗体和片段的寄主细胞。优选的细胞包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)。另外，如果期望，可以利用昆虫细胞。这些***可以被描述在例如Kitts等人(Biotechniques，14，810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.4，564-572(1993))以及Lucklow等人(J.Virol.67，4566-4579(1993))中。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。
可以通过公知的方法包括氯化钙法、电转法、微注射法、脂质体转染法或DEAE-葡聚糖法，将编码IL-1β结合抗体或片段转化或转染到选定的寄主细胞中。所选择的方法将部分依赖于所使用的细胞类型。这些方法和其它适当的方法是公知的，并且在Sambrook等人见上文中被列出。
转基因动物也可以用于表达糖基化抗体和片段。例如，人们可以使用转基因的产奶动物(例如牛和羊)并在动物奶中得到糖基化的结合试剂。可选地，人们可以使用植物来生产糖基化的选择结合试剂。
可以使用本领域中已知的培养基培养含有编码IL-1β结合抗体或片段的表达载体的寄主细胞。所述培养基通常含有细胞生长和存活所必须的所有营养物。用于培养大肠杆菌细胞的培养基的例子包括Luria Broth(LB)和/或TerrificBroth(TB)。用于培养真核细胞的适当培养基是RPMI1640、MEM、DMEM，其可以被补充血清和/或培养特定细胞系所期望的生长因子。典型的昆虫培养基是格雷斯氏培养基，其被补充了酵母粉、乳白蛋白水解产物和/或胎牛血清作为必需品。
可以用于被转染细胞或转化细胞的选择性生长的抗生素或其它化合物可以被加入到培养基中作为补充物。根据在转化细胞的质粒上所出现的选择标记物，对该化合物进行选择。例如，如果所述可选择的标记物元件是卡那霉素抗性，则加入到培养基中的化合物将是卡那霉素。用于选择性培养的其它化合物包括青霉素、四环素和新霉素。
通过使用本领域已知的方法可以确定寄主细胞所产生的IL-1β结合抗体或片段的量。这些方法包括但不限于蛋白质印迹(Western blot)分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀和/或活性检验。
对已经被分泌到细胞培养基中的IL-1β结合抗体或片段的纯化，可以通过使用许多技术完成包括亲和、免疫亲和或离子交换层析、分子筛层析、制备型凝胶电泳或等电聚焦、聚焦层析和高压气相色谱。例如，可以通过亲和层析使用蛋白质A纯化含有Fc区的抗体，其中蛋白质A选择性地结合Fc区。可以制备在其羧基或氨基末端具有亲和标签包括六聚组胺酸或其它小肽如FLAG(Eastman Kodak Co.New Haven，Conn.)或myc(Invitrogen)的被修饰形式的抗体或抗原结合片段，接着通过一步亲和柱进行纯化。例如多聚组胺酸以高亲和力和特异性结合镍，因此镍柱的亲和力(例如Qiagen..镍柱)可以被用于纯化具有多聚组胺酸标签的选择结合试剂(参见例如Ausubel等人eds.Current Protocols in Molecular Biology，Section 10.11.8，John Wiley & Sons，NewYork(1993))。在某些情况中，可以采用多步纯化。
在原核寄主细胞中表达的IL-1β结合抗体或片段可以以可溶形式出现在细胞质的周质间隙中，或者以不溶形式作为细胞内含体的一部分。IL-1β结合抗体或片段可以被从寄主细胞中提取出来，其使用本领域中已知的任何适当技术。例如，所述寄主细胞可以被裂解以释放外周胞质/细胞质的成分，其通过弗氏压碎(French pressure)、匀浆和/或超声接着离心。
可以使用本领域已知的方法，对在细胞质中出现或从细胞周质间隙释放的可溶形式的IL-1β结合抗体或片段进行进一步的纯化，例如通过渗透压休克技术从细菌周质间隙释放Fab片段。
如果已经形成了含有抗体或片段的内含体，则它们通常会结合到细胞膜的内壁和/或外壁上，因此会最初在离心后的沉淀材料中被发现。接着在pH极限下或使用离液剂如去污剂、胍或胍衍生物、尿素或尿素衍生物在存在还原剂如二硫苏糖醇在碱性pH下或三羧乙基磷在酸性pH下对沉淀材料进行处理，以释放、分离和溶解内含体。接着可以将可溶的抗体或片段使用凝胶电泳、免疫沉淀等进行分析。如果希望可溶的抗体或抗原结合片段，则可以使用标准的方法如在下面和在Marston等人(Meth.Enz.182：264-275(1990))中所描述的方法进行分离。
在某些情况中，在分离后，IL-1β结合抗体或片段可能不具有生物学活性。可以使用许多用于“重新折叠”或将多肽转化成其四级结构并生成二硫键的方法以恢复其生物学活性。这些方法包括将溶解的多肽在存在特定浓度的离液剂时暴露到通常高于7的pH下。对离液剂的选择非常类似于用于内含体溶解的选择，但通常离液剂被以较低的浓度使用，并且不必要与溶解时所使用的离液剂相同。在大多数情况中，重新折叠/氧化溶液将还含有还原剂或以特定比例的还原剂和其氧化形式，以得到特定的氧化还原势能，以能够使二硫键混编在所形成的蛋白质半胱氨酸桥中出现。某些通常使用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫二GSH、氯化铜、二硫苏二醇(DTT)/二噻烷DTT以及2-巯基乙醇(bME)/二-硫代-b(ME)。在许多情况中，可以使用助溶剂来提高重新折叠的效率，用于该目的通常使用的试剂包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
也可以通过化学合成方法(例如固相肽合成)制备本发明的IL-1β结合抗体或片段，其使用本领域中已知的技术，例如在Merrifield等人(1963)，J.Am.Chem.Soc，85：2149，Houghten等人(1985)，Proc Natl Acad.Sci.USA，82：5132，以及Stewart和Young(1984)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis，)皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.)，罗克福德(Rockford)，111中所列出的。这些抗体或片段可以被合成为在氨基末端具有或者没有甲硫氨酸。化学合成的抗体和抗原结合片段可以使用在这些参考文献中所列出的方法被氧化以形成二硫桥。这样制备的抗体和片段将保持与原始或重组产生的IL-1β结合抗体或片段相关的至少一种生物学功能。
药物组合物
可以将本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体配制在组合物中。这类组合物包含治疗或预防有效量的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体，其与适当的运载体混合例如药物上可以接受的试剂。通常，在配制到药物组合物之前，本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体被充分纯化用于为动物给药。
用于本发明药物组合物的药物上可以接受的试剂包括运载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、芳香剂和稀释试剂、乳化剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、传输载体、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲试剂、抗菌剂和表面活性剂。
中性缓冲盐或与血清蛋白混合的盐是典型的适当运载体。所述药物组合物可以含有抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；形成盐的带相反电荷的离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如Tween、普卢兰尼克(Pluronic)或聚乙二醇(PEG)。同样，作为例子，适当的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等。适当的防腐剂包括苯甲烷氯化铵、硫汞撒、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可以被用作防腐剂。适当的助溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。适当的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基-丙基-β-环糊精。适当的表面活性剂或湿润基包括山梨聚糖酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊等。缓冲液可以是传统的缓冲液例如醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。醋酸盐缓冲液可以是大约pH 4-5.5，Tris缓冲液可以是大约pH 7-8.5。在雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，A.R.Gennaro，ed.马克出版公司(Mack Publishing Company)，1990中列出了其它的药物试剂。
所述组合物可以是液体形式，或者是冻干或冷冻干燥的形式，并可以含有一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂(参见例如美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在一个实施方式中，含有冻干保护剂，其是非还原糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常所含的冻干保护剂的量是，通过重新构建，所得到的制剂将是等渗的，尽管高渗或稍微高渗的制剂也可以是适当的。另外，冻干保护剂的量需要足以防止由于冻干出现不能接受的变性和/或聚集的量。在预先冻干的制剂中典型冻干保护剂糖(例如蔗糖、乳糖或海藻糖)的浓度是大约10mM至大约400mM。在另一个实施方式中，含有表面活性剂，例如如非离子表面活性剂和离子表面活性剂如聚山梨醇酯  (例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；聚(乙二醇基)苯醚(例如Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂烷基硫酸钠；辛烷基糖苷钠；月桂烷基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂烷基-、肉豆蔻基-、亚油烯基-或硬脂酰基-肌氨酸；亚油烯基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油烯基酰胺丙基-、肉豆蔻基酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻基酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；椰油甲基牛磺酸钠或甲基ofeyl牛磺酸二钠(methyl ofeyl-taurate)；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.Paterson，N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。在预先冻干的制剂中表面活性剂的典型量是大约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如填充剂、粘合剂)可以包括例如***树胶、白蛋白、褐藻酸、磷酸钙(二盐)、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、甲基纤维素、预胶凝淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、凝胶、葡萄糖、瓜尔树胶、液状葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、聚氧乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、黄芪胶微晶纤维素、淀粉和玉米蛋白。高分子量结构添加剂的典型浓度是0.1重量％至10重量％。在其它实施方式中，可以包含膨胀剂(例如甘露醇、甘氨酸)。
组合物可以适合肠胃外给药。适合通过任何路线注射或灌注进入动物的典型组合物是本领域技术人员可以得到的，例如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或损伤内路线。肠胃外给药的制剂通常是无菌、无热原、等渗的水溶液，可选择地含有药物上可以接受的防腐剂。
非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的有机酯如油酸乙酯。含水运载体包括水、醇/水溶液、乳化剂或悬浮液包括盐水和缓冲介质。肠胃外给药媒介包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定性油。静脉内给药的媒介包括液体和营养补充物、电解液补充物例如基于林格氏右旋糖的等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。通常，参见Remington′s PharmaceuticalScience，第16版，Mack Eds.1980，这里将其引入作为参考。
这里所描述的药物组合物可以被配制成可控释放或持续释放，其以提供局部产品浓度(例如团块(bolus)、积存作用)和/或在特定局部环境中提高半衰期的方式。该组合物可以含有本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的制剂，其具有微粒聚合化合物配制品如聚乳酸等、聚乙醇酸以及诸如生物可降解基质、可注射微球、微胶囊颗粒、微胶囊、生物蚀解的颗粒珠、脂质体和可植入释放设备，其提供对所述活性试剂的可控或持续释放，接着其可以作为积存注射被释放。用于配制这类持续释放或可控释放的方法是已知的，并且许多聚合物已经被开发并用于控制释放和传输药物。通常这些聚合物是生物可降解的和生物兼容的。聚合物水凝胶包括通过对映体聚合物的或多肽部分的络合、具有温度或pH敏感性能的水凝胶可以期望用于提供药物积存作用，因为在捕获生物活性蛋白脂药物(例如抗体)中有关的潮湿和含水的条件。参见，例如在PCT专利申请WO 93/15722中关于释放多孔聚合物微颗粒用于传输药物组合物。
用于此目的的适当材料包括聚交酯(参见，例如美国专利3,773,919)、聚(a-羟基羧酸)聚合物，例如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988A)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等人，生物高聚物(Biopolymers)，22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基炳烯酸脂)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)以及Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3羟基丁酸。其它生物可降解聚合物包括聚(内酯)、聚(乙缩醛)、聚(原酸酯)以及聚(原碳酸酯)。持续释放的组合物还可以包含脂质体，其可以通过任何本领域已知的方法被制备(参见，例如Eppstein等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-92(1985))。运载体自身或其降解产物在目标组织中应该是无毒的，并且不应该进一步使病症恶化。这可以通过在目标失调的动物模型中直接筛选而确定，或者如果没有这类模型，则在正常动物中进行。
用于持续释放的对重组蛋白的微胶囊化已经成功地应用于人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN--)、白介素-2和MNrgpl20。Johnson等人，Nat.Med.2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.27：1221-1223(1993)；Hora等人Bio/Technologv.8：755-758(1990)；Cleland，″使用聚交酯聚乙二醇微球体***的单免疫疫苗的设计和制备(Design and Production of Single ImmunizationVaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems)，″在疫苗设计中：亚单位和辅剂途径(in Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)，Powell and Newman，eds，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；和美国专利No.5,654,010。由于其生物兼容性和生物可降解性能的宽范围，使用乳酸-乙二醇酸共聚物(PLGA)开发这些蛋白质的持续释放的制剂。PLGA的降解产物，乳酸和乙二醇酸可以在人体内被快速清除。而且，该聚合物的降解能力能够依赖于其分子量和组成。Lewis，″来自交酯/糖脂类聚合物的生物活性试剂的受控释放(Controlled releaseof bioactive agents from lactide/glycolide polymer)，″在：(in：)M.Chasin和R.Langer(Eds.)，生物所能降解的聚合物作为药物递呈***(BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems)(Marcel Dekker：New York，1990)，pp.1-41。其它持续释放组合物的例子包括例如EP 58,481 A、美国专利No.3,887,699、EP 158,277A、加拿大专利No.1176565、U.Sidman等人，Biopolymers 22，547[1983]，R.Langer等人，Chem.Tech.12，98[1982]，Sinha等人，控释(J.Control.Release)90，261[2003]，Zhu等人，Nat.Biotechnol.18，24[2000]，以及Dai等人，胶体Surf B生物界面(Colloids Surf B Biointerfaces)41，117[2005]。
生物粘合剂聚合物也被期望用于本发明的组合物中，或者与本发明的组合物共同使用。生物粘合剂是合成和天然出现的材料，其能够长时间附着到生物基质上。例如，卡波姆和聚卡波非都是聚(丙烯酸)的合成交联衍生物。基于天然物质的生物粘合剂传输***包括例如透明质酸，也被称作透明质烷(hyaluronan)。透明质酸是天然的黏多糖，其由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖的残基构成。透明质酸是在脊椎动物的细胞外组织基质中被发现的包括在***中以及在滑液中和在眼睛的玻璃质和水状液中。透明质酸的酯衍生物已经被用于生产用于生物兼容的和生物可降解的传输中的微球(参见例如Cortivo等人，Biomaterials(1991)12：727-730；欧洲公开No.517,565；国际公开No.WO 96/29998；Ilium等人，J.ControlledRel.(1994)29：133-141)。含有本发明组合物的典型透明质酸含有透明质酸酯聚合物，其量为IL-1β结合抗体或片段相对透明质酸聚合物为大约0.1％(w/w)至大约40％(w/w)。
生物可降解和非生物可降解基质都可以被用于传输本发明的组合物，这类聚合物基质可以含有天然或合成聚合物。优选生物可降解的基质。释放出现的时间基于对该聚合物的选择。通常在几个小时到12个月的范围内的释放经历的时间是最优选的。可以用于形成生物可降解传输***的典型聚合物包括：乳酸和乙二醇酸的聚合物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、聚硅氧烷、聚酐、聚氨酯及其共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素醋酸丁酸酯、纤维素醋酸邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三醋酸酯、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚(氧乙烯)、聚(乙烯对苯二酸酯)、聚(乙烯醇)、聚乙烯醋酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。典型的天然聚合物包括藻酸盐和其他多糖包括葡聚糖和纤维素、胶原及其化学衍生物(取代、增加化学基团如烷基、烯基、羟基化、氧化和由本领域技术人员直接进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水蛋白质、玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白以及疏水蛋白质、它们的共聚物和混合物。通常，这些材料会通过酶水解或在体内暴露到水、通过表面或体(bulk)侵蚀而被降解。可选择的，所述聚合物是以水凝胶的形式(参见例如WO 04/009664、WO 05/087201、Sawhney，等人，Macromolecules，1993，26，581-587，)，其能够在水中吸收最高达到其重量的大约90％，可选择地其进一步与多价离子或其它聚合物进行交联。
传输***还包括非聚合物***，其为脂类包括固醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或其它中性脂肪如甘油单酸酯、甘油二酸酯甘油和三酸酯；水凝胶释放体系；肽基***；石蜡涂层、使用传统的粘结剂和赋形剂的压缩片；部分融合的植入物等。具体的例子包括但不限于：(a)侵蚀***，其中包含在基质内的形式的所述产品，如在美国专利No.4,452,775、4,675,189和5,736,152中所描述的；和(b)扩散***，其中产品以可控的速率从聚合物渗透例如在美国专利No.3,854,480、5,133,974和5,407,686中所描述的。通过已知的方法可以制备含有所述产品的脂质体，诸如例如(DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和4,544,545；以及EP102,324)。
可选或额外，所述组合物可以被局部给药，其通过将已经吸附或封装本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的膜、海绵或其它适当材料植入到受影响的区域内。如果使用植入设备，则所述设备可以被植入到任何适当的组织或器官中，本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的释放可以直接通过该设备经过推注(bolus)或经过连续给药，或经过使用连续灌输的导管进行。
含有本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物可以被配制为吸入药诸如例如作为干粉。吸入药溶液也可以被配制在液体推进药中进行气雾剂传输。在另一种制剂中，溶液可以被制成喷雾状。用于肺部给药的其它药物组合物包括例如在PCT申请公开WO 94/20069中所描述的，其公开了肺部传输化学修饰的蛋白质。为了进行肺部传输，粒度应该适合传输到肺部末端(distal lung)。例如，所述粒度可以为1μm至5μm；然而，可以使用更大的颗粒例如如果每个颗粒都完全是多孔的。
某些含有本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的制剂可以被口服给药。以这种形式给药的制剂可以使用或不使用通常用于固体剂型如药片和胶囊的组合中的那些运载体进行给药。例如，如果生物利用度被最大化，前药降解(pre-systemic degradation)被最小化，则胶囊可以被设计为在肠胃道中的位置释放该制剂的活性部分。可以包含其它的药物以促进选择性结合剂的吸附。稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片崩解剂，还可以采用粘结剂。
另一种制剂可以含有有效量的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或运载体与适合制备药片的无毒赋形剂的混合。通过将所述药片溶解在无菌水中，或者其它适当的运载体中，可以以单位剂型制备该溶液。适当的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘结剂如淀粉、凝胶或***树胶；或乳化剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
考虑到这里的公开内容以及配制技术的公知技术，根据所期望的给药路线、传输方式以及期望的剂量，可以确定适当的和/或优选的药物制剂。不管给药方式如何，根据患者体重、体表面积或器官大小可以计算有效的剂量。对确定采用这里所描述的每一种制剂用于治疗的适当剂量的计算的进一步改进是本领域中常规进行的，并且在本领域中常规完成的任务范围内。通过使用适当的剂量响应数据可以确定适当的剂量。
根据本发明的公开内容其它的制剂将是明显的，其包括含有与一种或者其它治疗药物组和的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的制剂。例如，在某些制剂中，本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体被配制为IL-1信号通路的第二抑制剂结合。代表性的第二抑制剂包括但不限于抗体、抗体片段、肽、多肽、化合物、核酸、载体和药物组合物例如如在US6899878、US2003022869、US20060094663、US20050186615、US20030166069、WO/04022718、WO/05084696和WO/05019259中所描述的。例如，该组合物可以含有与IL-1β结合抗体、片段或编码这类抗体或片段的载体的核酸或载体结合的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体。
所述药物组合物可以包含与其它活性试剂结合的IL-1β结合抗体或片段。这些组合是可以用于它们期望目的的。下面列出的活性试剂是为了说明的目的，并不是为了限制。作为本发明一部分的组合可以使本发明的抗体和片段以及至少至少选自下表中的一种额外的试剂的组合。如果该组合被形成能够进行其期望的功能的组合物的话，该组合还可以包含多种额外的试剂例如两种或三种。
活性试剂或与本发明抗体或片段的组合包括非类固醇抗炎药物(NSAID)例如：阿斯匹林、布洛芬和其它丙酸衍生物(阿明洛芬、苯噁洛芬、氯环己苯酰丙酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚布洛芬、酮基布洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普嗪、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫噁洛芬)、醋酸衍生物(吲哚美辛、阿西关辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、弗洛芬那(fuirofenac)、异丁芬酸、伊索克酸、奥斯皮纳(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托尔米汀、齐多美辛和佐美酸)、灭酸衍生物(氟芬那酸、甲氯灭酸、甲灭酸、尼氟灭酸和托芬那酸)、联苯羧酸衍生物(迪夫尼沙(difiunisal)和氟苯柳)、昔康类(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康)、水杨酸盐(乙酰水杨酸酯、柳氮磺胺吡啶)和吡唑啉酮类(阿扎丙宗、本扎披派瑞隆(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羟基保泰松、保泰松)。其它组和包括环氧合酶-2(COX-2)抑制剂。其它用于组合的活性试剂包括类固醇例如氢化波尼松、强的松、甲基氢化波尼松、倍它米松、***或氢化可的松。这类组合可以是特别有利的，因为在使用本发明的抗体和片段地组合进行治疗患者时，通过将逐渐所需的胆固醇剂量的量可以减少甚至消除一种或者多种副作用。
用于与IL-1β结合抗体或片段组合治疗风湿性关节炎的活性试剂的其它例子包括细胞因子抑制性抗炎药物(CSAIDs)；其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，其中所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF。所述IL-1β结合抗体和片段可以与细胞表面分子的抗体组合，其中所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配体包括CD 154(gp39或CD40L)。
活性试剂的优选组合可以在自体免疫及后续炎症级联反应中的不同点干扰；优选的例子包括TNF拮抗剂例如嵌合、人源化或人TNF抗体、D2E7、cA2(RemicadeTM)、CDP571、抗-TNF抗体片段(例如CDP870)以及可溶p55或p75TNF受体、其衍生物、(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept)、可溶IL-13受体(sIL-13)以及TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似的，由于相同的理由，IL-1抑制剂(例如白介素-1转化酶抑制剂如Vx740或IL-1RA等)可以是有效的。其它优选的组合包括白介素11、抗-P7s和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。另一种组合是自体免疫反应的其它关键参与物，其可以与IL-1β发挥类似功能、依赖IL-1β或与IL-1β一致发挥功能。
可以与抗体或抗体结合部分组合以治疗克罗恩病的活性试剂包括TNF拮抗剂例如抗TNF抗体、D2E7、cA2(RemicadeTM)、CDP 571、抗-TNF抗体片段(例如CDP870)、TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept))、抗-P7、p-选择素糖蛋白配体、可溶IL-13受体(sIL-13)以及PDE4抑制剂。IL-1β结合抗体或片段可以与皮质甾类组合如布地缩松和***。所述IL-1β结合抗体或片段也可以与诸如下列的试剂组合：柳氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪以及干扰促进炎症的细胞因子如IL-1的合成或功能的试剂例如IL-1转化酶抑制剂(例如Vx740)和IL-1ra。IL-1β结合抗体或片段也可以与T细胞信号传导抑制剂共同使用，例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。IL-1β结合抗体或片段可以与IL-11组合。
可以与抗体或抗体结合部分组合以治疗多发性硬化症的活性试剂的其它例子包括皮质甾类；波尼松龙；甲基波尼松龙；咪唑硫嘌呤；环磷酰胺；环孢霉素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(Avonex；Biogen)；干扰素-β1b(Betaseron；Chiron/Berlex)；共聚物1(Copolymer 1)(Cop-1；可巴松(Copaxone)；泰瓦制药工业公司(Teva Pharmaceutical Industries，Inc.))；高压氧；静脉注射免疫球蛋白；克拉比彬(clabribine)；其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，其中所述人细胞因子或生长因子如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。The IL-1β结合抗体或片段可以与细胞表面分子的抗体结合，其中所述细胞表面分子如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或它们的配体。IL-1β结合抗体或片段可以与试剂组合，例如甲氨蝶呤、环孢霉素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质甾类例如***龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷拮抗剂、抗血栓形成试剂、补体抑制剂、释放肾上腺素的药物、干扰促进炎症的细胞因子如TNFα或IL-1的信号传导的试剂(如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗-P7、p-选择素糖蛋白配体(PSGL)、TACE抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、血管收缩素转化酶抑制剂、可溶细胞因子受体及其衍生物(例如可溶p55或p75 TNF受体、sIL-1 RI、sIL-1 RII、sIL-6R、可溶IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ)。
可以与抗体或抗体结合部分组合以治疗多发性硬化症的活性试剂的优选例子能够包括干扰素-β例如IFNβ1a和IFNβ1b；Copaxone、皮质甾类、IL-1抑制剂、TNF抑制剂和CD40配体和CD80的抗体。
药物组合物可以含有治疗有效量或预防有效量的本发明的IL-1β结合抗体或片段。治疗有效量是指以该剂量持续必要的时间能够有效达到期望的治疗效果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以根据许多因素而变化例如疾病状态、年龄、性别、个体重量以及抗体或抗体部分在个体中表现出期望响应的能力。治疗有效量还是治疗有益效果超过所述抗体或抗体部分的所有毒性或有害效果的量。预防有效量是指以该剂量持续必要的时间能够有效达到期望的预防效果的量。通常，由于预防剂量是在受试者中在疾病之前或疾病早期使用的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
可以单独采用本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体，或者与其它活性试剂组合应用，其可以是相同的药物组合物，也可以是不同的药物组合物。例如，这些其它的活性药物可以包括：(i)IL-1拮抗剂(例如重组IL-1Ra或IL-trap)；(ii)白介素-1受体拮抗剂；(iii)可溶TNF受体-1；(iv)可溶TNF受体-2(例如依那西普)；(iv)TNF抑制剂(例如抗体如D2E7)；和/或(v)癌症治疗试剂。因此，这些组分中的一种或多种可以结合本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体被包含在本发明的组合物中。
在某些情况中，可以期望以离体的方式使用包含本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物。在这种情况中，已经从患者中取出的细胞、组织或器官被暴露到含有本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物中，之后，接着所述将细胞、组织和/或器官植入回患者中。
在某些情况中，可以通过植入患者已经被基因改造的这里所述的细胞以表达和分泌多肽、选择性结合试剂、片段、变体或衍生物，而传输含有IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的组合物。这些细胞可以是动物或人细胞，并且可以来自患者自身组织或者从其它来源无论是人还是非人类来源。可选择的，这些细胞可以是被固定的细胞。然而，为了降低免疫反应的机会，优选这些细胞被封装以防止渗透到周围的组织中。封装材料通常是生物兼容的、半渗透聚合物包装或者是能够允许蛋白质产物释放但防止细胞被患者免疫***或其它来自周围组织的破坏性因子所破坏的膜。
用于对细胞进行膜封装的方法是已知的，制备被封装的细胞以及将它们植入患者内也已经被描述，例如在美国专利4,892,538、5,011,472和5,106,627中。PCT申请公开WO 91/10425中描述了用于封装或细胞的***。用于配制多种其它持续或可控传输方式的技术例如脂质体载体、生物可侵蚀的颗粒或珠也是本领域技术人员已知的，并被描述。被封装或未被封装的细胞可以被植入到患者适当的身体组织或器官中。
含有本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体的药物组合物的治疗有效量或预防有效量将依赖于例如所述组合物被用于的症状、给药路线何受试者的病症。以治疗或预防有效的量给药药物组合物以治疗IL-1相关病症。“治疗有效量或预防有效量”的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体是能够治疗或防止一种或多种受试者中IL-1相关疾病的症状的量。
因此，期望对本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体进行滴定，并根据能够获得最佳的治疗效果修改给药路线。根据上面所提到的因素，剂量范围包括大约0.1ng/kg至大约100mg/kg或更多(每单位体重被给药活性试剂的受试者的活性试剂的量)。在其它实施方式中，剂量范围是大约0.1μg/kg至大约100mg/kg，大约1μg/kg至大约100mg/kg，大约5Mg/kg至大约100mg/kg，大约0.5mg/kg至大约100mg/kg，大约1mg/kg至大约100mg/kg。其它的剂量也可以是适当的。可以以单次剂量，或经过一段时间两次或多次剂量(其可以含有或可以不含有相同量的本发明的IL-1β结合抗体、抗体片段、核酸或载体)，或者通过例如植入设备或导管进行连续灌注。
应用方法
本发明的抗体、抗体片段、核酸、载体、细胞和组合物(统称为“本发明的化合物和组合物”)可以被用于任何目的。例如，本本发明的化合物和组合物可以被用于研究IL-1相关机制以及与IL-1相关机制有关的疾病和病症。然而，本发明的化合物和组合物对于治疗需要治疗IL-1相关病症如自体免疫或炎症疾病或失调的受试者(如哺乳动物或人)是特别有用的。因此，本发明提供了一种治疗或预防哺乳动物中疾病的方法，该方法包括：为需要的哺乳动物给药有效量的本发明的抗体或抗体片段、核酸或载体，这样在哺乳动物中对所述疾病进行了治疗或预防。术语“有效量”指的是建立预防或治疗效果所需的本发明的抗体或抗体片段、核酸或载体的量。正如这里所使用的，治疗疾病或病症被定义为暂时或永久减少或消除疾病或病症的症状或进展。类似的，预防疾病或病症的意思是暂时或永久抑制、减慢或防止疾病或病症(或疾病或病症的症状)的开始。
本发明的方法可以用于治疗或防止IL-1相关的疾病或病症。例如，本发明的抗体和片段被设计为用于预防和治疗IL-1介导的疾病或医学症状例如炎症病症、过敏或过敏症状、癌症、超敏性反应、自体免疫疾病、严重感染和器官或组织移植排斥。IL-1相关的病症包括类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎(UC)、败血性休克、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主疾病、动脉粥样硬化、成人T细胞性白血病、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、中风以及阿尔茨海默病。本发明的抗体和片段也可以用于防止新生儿多***炎症性疾病(NOMID/CINCA)、全身性幼年特发性关节炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)、斯蒂尔病(Stills disease)、CAPS或穆-韦二氏综合症(Muckle-Wells syndrome)。
通常，如果与体液或组织中提高的IL-1β水平相关，或者如果从身体取出的细胞或组织在培养中产生提高水平的IL-1β，则该疾病或病症被认为是IL-1β相关疾病或病症。
例如，本发明的方法可以被用于治疗或防止新生儿多***炎症性疾病(NOMID/CINCA)、全身性幼年特发性关节炎(systemic onset juvenileidiopathic arthritis)、CIASl相关周期性综合症(CAPS)、斯蒂尔病(Stills disease)或Muckle-Wells综合症。
作为另一个实施例，本发明可以被用于治疗或者防止类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、败血性休克、慢性阻塞性肺部疾病、哮喘、移植物抗宿主疾病、动脉粥样硬化、成人T细胞性白血病、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、中风以及阿尔茨海默病。
作为另一个实施例，本发明的方法可以被用于治疗或者防止全身性幼年特发性关节炎(systemic onset juvenile idiopathic arthritis)、类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化或重症肌无力。
IL-1β相关病症的其它例子是急性胰炎；ALS；厌食-恶病质综合症包括AIDS-诱导的恶病质；哮喘和其它肺部疾病；自体免疫脉管炎；CIASl相关周期性综合症(CAPS)；慢性疲乏综合症；破伤风相关疾病包括破伤风相关的腹泻；心脏病症和征兆包括充血性心力衰竭、冠状动脉再次狭窄、心肌梗死、心肌机能障碍(例如与败血症相关)以及冠状动脉旁路搭桥；癌症例如多发性骨髓瘤和骨髓性(例如AML和CML)和其它白血病以及肿瘤转移；糖尿病(例如胰岛素性糖尿病)；子宫内膜异位；家族性寒冷型自身炎症综合症(FCAS)；家族性地中海热(FMF)；发烧；肌纤维瘤；肾小球性肾炎；移植物抗宿主病/抑制物排斥；出血性休克；痛觉过敏；炎症性肠病；炎症性关节病包括牛皮癣关节炎(以及骨关节炎和类风湿性关节炎)；炎症性眼病；也可以与下列相关如角膜移植；局部缺血包括大脑局部缺血(例如外伤、癫痫、出血或休克所引起的脑部损伤，每一种都可能引起神经退行性疾病)；Kawasaki氏疾病；认知缺陷；肺病(例如ARDS)；肌病(例如肌肉蛋白代谢疾病特别是在败血症中)；神经毒性(例如HIV所诱导的)；骨质疏松症；疼痛包括癌症相关的疼痛；帕金森病；牙周疾病；未足月产；牛皮癣；再灌注损伤；辐射治疗的副作用；睡眠障碍；暂时颚关节疾病；肿瘤坏死因子受体相关周期发热综合症(TRAPS)；葡萄膜炎；或者来自过度疲劳、扭伤、软骨损伤、外伤、整形外科手术、感染和其它疾病过程的炎症病症。
本发明的抗体和片段还被设计用于治疗心脏、肺、联合心脏-肺、肝、肾、胰、皮肤或角膜移植的受体，其包括同种异体移植物排斥或异种移植物排斥，或者为了防止移植物抗宿主病例如在骨髓移植之后，或器官移植相关的动脉硬化。
本发明的抗体和片段被设计用于治疗或防止自体疾病或炎症疾病，特别是炎症病症其病源包括自体免疫组分如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进育型关节炎(arthritis chronica progrediente)和关节炎和风湿疾病包括炎症疾病和具有骨损失、炎症疼痛、超敏(包括气道超敏和皮肤超敏)的风湿疾病或过敏。本发明的抗体和片段可以被应用的聚体自体免疫疾病包括自体免疫血液疾病(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血和先天性血小板减少)、***性红斑狼疮、多软骨炎、硬化症、Wegener肉芽肿病、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、，斯-琼氏综合症(Steven-Johnson syndrome)、先天性脂肪泻、自体免疫发炎性肠病(包括例如溃疡性结膜炎、克罗恩病和过敏性肠综合症)、内毒素Graves病、肉状瘤病、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎和间质纤维化、牛皮癣关节炎或肾小球性肾炎(具有和不具有肾病综合症例如包括先天性肾病综合症或微小病变肾病)。
本发明的抗体和片段还被设计用于治疗、防止或改善哮喘、支气管炎、肺尘病、肺气肿以及其它气道的梗阻性或炎症疾病。用于治疗不期望的急性和超急性IL-1α介导的炎症反应的抗体或片段包括产生特别是促进IL-1的TNF释放，例如急性感染例如败血性休克(例如内毒性休克和成人呼吸窘迫综合症)、脑膜炎、肺炎；和重度烧伤；以及用于治疗恶病质或感染、癌症或器官机能障碍之后与病态TNF释放相关的消耗综合症，特别是AIDS-相关的或由于HIV感染所引起的恶病质。
本发明的抗体和片段还被设计为用于骨代谢疾病中，其包括骨关节炎、骨质疏松症和其它的炎性关节炎皮疹和整体的骨损失包括年龄相关的骨损失，特别是牙周疾病。
本发明的抗体和片段还被设计为用于治疗或防止CIASl相关周期性综合症(CAPS)，包括新生儿多***炎症性疾病(NOMID)、Muckle-Wells综合症(MWS)以及家族性寒冷型自身炎症综合症(FCAS)。基因CIASl中的图片目前被识别为对三种罕见的遗传综合症负责：新生儿多***炎症性疾病(NOMID)、Muckle-Wells综合症(MWS)以及家族性寒冷型自身炎症综合症(FCAS)。(Hoffman等人2001 Naure 29：301-305；Feldmann等人2002 AmJ Hum Genet 71：198-203；Aksentijevich等人2002 Arthritis Rheum46：3340-3348)。这三种病症被统称为“CAPS”。CIASl编码一种被称作NALP3的蛋白质，NALP3是“发炎体(inflammasome)”的组分，发炎体是一种酶复合物，其调节半胱天冬酶1(caspasel)的活性。Caspasel是将无活性的促进炎症反应的细胞因子IL-1的前体形式切割成其生物活性形式的酶(Agostini等人2004见上文)。CIASl中的突变会导致IL-1生成的提高。
通常本发明的抗体或抗体片段、核酸或载体被作为含有本发明的抗体或抗体片段、核酸或载体以及药物上可以接受的运载体的药物组合物为哺乳动物或人进行给药。适合用于治疗或防止疾病的药物组合物是如前面所描述的。
本发明的抗体或抗体片段、核酸或载体可以作为主要的活性试剂或者与一种或者多种会破坏IL-1受体信号传导的试剂联合为哺乳动物进行给药。破坏IL-1受体信号传导的试剂可以是任何抑制IL-1β和IL-1受体之间相互作用的化合物或组合物。例如，破坏IL-1受体信号传导的试剂包括结合IL-1β或结合IL-1受体的抗体、重组IL-IRa(例如来自艾姆根公司(Amgen Inc.)，ThousandOaks，CA)以及IL-1受体“陷阱”肽(例如来自再生公司(Regeneron Inc.)，塔利顿(Tarrytown)，NY)。如果使用两种或更多种破坏IL-1受体信号传导的试剂，则它们可以被共同给药(例如在一种药物组合物中)，或者可以分别将每一种进行给药(例如在分别的药物组合物中)。
本发明的抗体、片段、核酸或载体可以被给药给哺乳动物，其与一种或者多种其它的活性试剂组合或联合，以治疗或防止IL-1介导的上述病症或疾病。
诊断应用
除了治疗应用外，本发明的抗体和片段还可以用于检测IL-1β的诊断方法中(例如，在生物样品如血清或血浆中)，其使用传统的免疫检验例如酶联免疫吸附检验(ELISA)、放射免疫检验(RIA)或组织免疫化学。用于在生物样品中检测IL-1β的方法可以包括步骤：将生物样品与一种或者多种本发明的抗体或片段进行接触，检测结合IL-1β的抗体或片段，或者未结合的抗体或片段，进而检测生物样品中的IL-1β。所述抗体或片段可以被直接或间接使用可检测的物质进行标记以辅助检测结合或未结合的抗体。适当的可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。适当的酶的离子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光材料的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三哌嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺(luminol)；适当的放射性材料的离子包括125I、131I、35S或3H。
除了标记抗体外，通过利用被标记可检测物质的IL-1β标准和未标记的抗IL-1β抗体进行的竞争免疫检验也可以在生物液中对IL-1β进行检验。在该检验中，生物样品、被标记的rIL-1β标准和抗IL-1β抗体被组合在一起，并确定结合到未标记的抗体的被标记的IL-1β标准的量。生物样品中IL-1β的量与结合到抗IL-1β抗体上的被标记的IL-1β的量成反比。
实施例
下面的实施例进一步说明本发明，当然其不能被认为以任何方式限制发明的保护范围。
在下面的实施例中，本发明参考的各种抗体包括被指定为AB1、AB5和AB7的抗体。如上所提到的，AB1含有重链区和轻链区，其中所述重链区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述轻链区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB5含有重链区和轻链区，其中所述重链区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。AB7含有重链区和轻链区，其中所述重链区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述轻链区包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列。
对于下列实施例中的各种比较，参考被指定为AB-对照的抗体，其是可以商业获得的具有对IL-1β相对高亲和力的抗体。AB-对照是鼠抗体，其被认为具有重链和轻链，其中所述重链区包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，所述轻链区包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。这些鼠的序列被列在美国专利申请公开No.2003/0026806在图6A和图6B中。
在下面的几个实施例中，AB5和AB7显示与人IL-1β具有比AB-对照与人IL-1β意想不到高的亲和力。
实施例1
本实施例1说明本发明的某些抗体与IL-1β的结合亲和力。
使用抗体KTNEXATM设备(来自萨匹迪恩仪器公司(Sapidyne InstrumentsInc.)，博伊西(Boise)，ID)对指定为AB1和AB5的抗体进行检验与IL-1β的结合性能。图2和图3中提供了抗体AB1和AB5的重链和轻链可变区的氨基酸序列。商业购买的与IL-1β具有相对高亲和力的抗体(这里被称作AB-对照)被检验用于比较。
表1中总结了IL-1β结合检验结果。KD值表示每种抗体-IL-1β复合物的解离常数。KD被计算为“离开速率”(抗体-IL-1β复合物解离的速率)与“结合速率”(抗体-IL-1β复合物的组合速率)的比例。较低的KD比例是较高抗体亲和力的指示。
表1：IL-1β结合结果
抗体 KD(pM)
AB-对照 3.06
AB1(发明) 18.63
AB5(发明) 0.261
这些实验的结果显示AB1和AB5以高亲和力结合IL-1β。本发明的抗体对IL-1β的亲和力与AB-对照对IL-1β的亲和力相当，或者更好。
实施例2
本实施例表示使用本发明的抗体体外抑制IL-1β。
使用检测IL-1β刺激的从人成纤维细胞释放的IL-6的生物检验，评估AB1和AB5抗体(参见实施例1)抑制IL-1β的能力。如实施例1中的，AB-对照被用作对照样品。在Dinarello等人，免疫学现有实验方案(Current Protocols inImmunology)，Ch.6.2.1-6.2.7，John Wiley and Sons Inc.Hoboken，NJ，2000中描述了该检验的细节。简单的讲，在多孔板中将来自美国典型培养物库(ATCC)马纳萨斯(Manassas)，VA的人MRC5人成纤维细胞(ATCC#CCL-171)培养至汇合。使用经过滴定剂量的AB5抗体对细胞进行处理。接着将细胞接触(i)100pg/ml IL-1β或(ii)100pg/ml IL-1β和AB1或AB5抗体(来自实施例1)。不使用IL-1β对阴性对照细胞刺激。使用来自BD法米根(BDPharmingen)(富兰克林湖(Franklin Lakes)，NJ)IL-6 ELISA试剂盒根据制造商的使用说明检测每组中被处理的细胞中所释放的IL-6。图5中表示了ELISA结果，并总结在表2中。IC50是抑制由IL-1β刺激所释放的IL-6的50％所需要的抗体浓度。
表2 ELISA结果
抗体 IC50(nM)
AB-对照 0.017
AB1(发明) 0.15
AB5(发明) 0.014
这些结果证明了本发明的抗体体外抑制IL-1β的能力。而且，对MRC5中IL-1β刺激的细胞因子释放的抑制已经显示与该试剂抑制IL-1介导的体内活性有关。因此，这些结果说明本发明的抗体将在体内具有IL-1β抑制效力。
实施例3
本实施例说明使用本发明的抗体对IL-1β的体内抑制。
为了确认AB5的体内效力，在小鼠中对AB5阻断人IL-1β生物学活性的能力进行测试。该检验的细节被描述在Economides等人，天然医药(NatureMed.)，9：47-52(2003)中。简单的讲，将雄性C57/B16小鼠(Jackson实验室栅海港，缅因州(Jackson Laboratory Bar Harbor，Maine))经腹膜注射经滴定计量的AB5(实施例1)、AB-对照(实施例1)或对照IgG(Jackson免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，West Grove，PA)。注射抗体24小时后，给小鼠皮下注射计量为1μg/kg的重组人IL-1β(rhIL-1β)(来自PeproTech Inc.Rocky Hill，NJ)。注射rhIL-1β后2小时(IL-6反应峰时间)，将小鼠处死，收集血液并处理得到血清。通过ELISA(BD Pharmingen，FranklinLakes，NJ)根据制造商的方案检验血清IL-6水平。通过实验动物血清中所检测到的IL-6与对照中所检测到的IL-6的比例计算抑制百分比(乘以100)。
结果列在图6中。抑制体内IL-1β活性的能力被评定为IL-1β刺激的血清中IL-6水平的函数。如图6所表示的，对于抑制人IL-1β的活性，即使AB5抗体不比AB-对照更有效，AB5也是有效的。在该检验中，3μg AB5与10μgAB-对照的效力相同。
因此，这些结果说明所测试的抗体可以用于在体内抑制IL-1β活性。这些结果还显示单次注射AB5能够阻断IL-1β长时间刺激的***性作用。
实施例4
下面的实施例表示根据本发明制备抗体。
使用HUMAN ENGINEERINGTM技术产生许多人工改造的抗体序列，其如在Studnicka等人，Protein Engineering，7：805-814(1994)和在美国专利5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619以及PCT申请公开WO 93/11794。所产生的人工改造抗体序列包括AB5.1、AB5.2、AB5.3和AB5.4。如图3和图4所示，这些序列中的每一条都在CDR-3H区中含有标记为X1和X2的两个可变位点。因此，在这些人工改造的每一个抗体的某些实施例中，CDR3的X1和X2分别对应丙氨酸和精氨酸、缬氨酸和精氨酸、苯丙氨酸和精氨酸、赖氨酸和赖氨酸、或者天冬酰胺和精氨酸。
实施例5
对被指定为AB5和AB7的抗体(人工改造的抗体序列)检验其IL-1β结合性能，其使用以类似实施例1中所描述类似的方式，在开奈夏TM(KINEXATM)设备上进行的动态排斥检验。其它关于KINEXATM设备和抗体鉴定的描述可以从制造商获得，并可以在公开的文献中得到例如美国专利No.6,664,114(Sapidyne，Inc.)；以及Darling等人″动力排除检测技术：分子相互作用特征(Kinetic Exclusion Assay Technology：Characterization of MolecularInteractions).″检测及药物开发技术(ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies)，2004，2，647-657。所述KINEXATM设备进行动态排斥检验，并将数据符合各种理论曲线，这样确定了KD以及其它的性能例如KD的95％置信区间。对于亲和力特征的分析例如解离常数和“离开速率”，KINEXATM设备比其它的设备(如比阿考(BiaCore)设备)更灵敏。
图3和图4A分别提供了AB5和AB7的重链和轻链可变区的氨基酸序列。表3中总结了IL-1β结合检验。如同实施例1，KD被计算为“离开速率”与“结合速率”的比值，并且较低的KD比例是较高抗体亲和力的指示。
表3
抗体  KD(pM)
AB5  0.24
AB5  0.30
这些实验的结果显示AB5(与实施例1中所观察到的结果一致)和AB7以意想不到高的亲和力与IL-1β结合，这是由它们的解离常数意想不到的低数值所表示的。
图7、图8和图9分别显示被指定为AB1、AB5和AB7的抗体的结合亲和力，其是从一个对每种蛋白使用KINEXA分析是代表性实验所确定的。图7反映在表1中所列出的结果，而图8和图9则反映表3中所列出的结果。
除了表3中所列的数值外，KINEXA检验结果还表示低的和高的95％置信区间(KD-低和KD-高)。对于AB5，KD-低是0.07pM，KD-高是0.72pM。对于AB7，KD-低是0.11pM，KD-高是0.74pM。
在实施例1中所列的检验中发现了类似的KD-低和KD-高的数值。对于AB-对照，KD-低是1.62pM，KD-高是5.23pM。对于AB1，KD--低是13.38pM，KD-高是24.84pM。对于AB5，KD-低是0.11pM，KD-高是0.56pM。
KINEXA检验结果显示AB5和AB7具有比AB-对照意想不到低的解离常数。
实施例6
该实施例表示体外抑制IL-1β刺激的IL-6释放。下面对本发明的多种抗体，检验了抑制IL-1β刺激的IL-6从成纤维细胞中释放的IC50。
以类似实施例2中所描述的方法，评估AB5和AB7抑制IL-1β的能力，其使用检测IL-1β刺激的从人成纤维细胞释放的IL-6的生物检验。图10至12显示对于每种检验对各种抗体的结合曲线。图10显示被指定为AB1、AB2和AB3的抗体抑制IL-6从人成纤维细胞的释放，这3种单独检验的结果说明AB1的IC50是0.029nM(29pM)、AB2的IC50是0.076nM(76pM)、AB3的IC50是0.214nM(214pM)。图11在另外的检验中，被指定为AB1和AB7的抗体抑制IL-6从人成纤维细胞的释放。图12表示AB5和AB7以及商业上可以获得的Kineret
Figure A20068002655100751
的抗体抑制IL-6从人成纤维细胞的释放。这些结果显示，关于抑制IL-1β，根据在这些检验中确定的IC50，AB5和AB7基本上具有比开奈瑞特(Kineret)
Figure A20068002655100752
更好的能力。Kineret
Figure A20068002655100753
是人造蛋白质，其类似于在人体中被称作白介素-1受体拮抗剂(IL-lra)的天然出现的蛋白质。图10至图12表示，按照IL-6的抑制百分比抗体或无抗体的Kineret
Figure A20068002655100754
的能力的单独检验结果，表4显示从这些单独的检验中所计算的IC50。IC50是抑制由IL-1β刺激所释放的IL-6的50％所需要抗体或Kineret
Figure A20068002655100761
的浓度。
表4
抗体  IC50(Nm)
AB5  0.0049(4.9pM)
AB7  0.0044(4.4pM)
Kineret  0.0454(45.4pM)
除了在表2和表4中所报道以及图6、图10、图11和图12中所显示的单独检验结果外，对AB1、AB7和AB-对照进行其它的单独检验。可以从单独的检验结果计算平均的IC50。AB1的平均IC50是66.7pM，其是从35pM、30pM、150pM(该数值也被显示在表2中)和52pM的单独检验结果计算得到的。AB7的平均IC50是5.6pM，其是从7.3pM、4.2pM、4.5pM、4.4pM(该数值也被显示在表4中)、6.0pM、5.0pM和7.8pM的单独检验结果计算得到的。AB-对照的平均IC50是5.6pM，其是从5.0pM、17.0pM(该数值也被显示在表2中)和4.9pM的单独检验结果计算得到的。
这些结果证明AB1、AB5和AB7体外抑制IL-1β的能力。而且，抑制IL-1β刺激的细胞因子在人成纤维细胞中的释放与该抑制试剂抑制IL-1介导的体内活性有关。因此，这些结果说明本发明的抗体将在体内具有IL-1β抑制效力。
实施例7
该实施例表示使用IL-1β结合抗体对IL-1β的体内抑制。
以类似于实施例3中所描述类似的方式，在小鼠中检测AB5、AB1和AB7的体内效力，以及它们阻断人IL-1β生物活性的能力。测试AB5和AB1的结果被列在图13中，测试AB5和AB7的结果被列在图14中。抑制体内IL-1β活性的能力被评定为IL-1β刺激的血清中IL-6水平的函数。如图13和图14所表示的，AB5、AB1和AB7抗体能有效抑制人IL-1β的体内活性。
这些结果显示所测试的抗体能用于体内抑制IL-1β的活性。
实施例8
本实施例表示至少某些根据本发明的IL-1β结合抗体与来自非人类的某些哺乳动物的IL-1β交叉反应，而与其它的非人类步入动物的IL-1β不发生交叉反应。检验被指定为AB7的抗体(以高亲和力结合人IL-1β的抗体)其与来自非人类的哺乳动物的IL-1β的结合即：恒河猴(rhesus macaque)、猕猴(cynomolgus monkey)、狗、豚鼠和兔。
来自恒河猴(rhesus macaque)、猕猴(cynomolgus monkey)、狗、豚鼠和兔的新鲜的肝素化全血是从查尔斯河实验室(Charles River Labs)获得的。通过Ficoll密度梯度临新分离全血，并分离外周血单核细胞(PBMC)。对于每种物种的PBMC，将2.5×105细胞/ml孵育在外周培养基中，其含有或不含50ng/ml脂多糖LPS(大肠杆菌E.Coli 055：B5)，在刺激后收集上清。LPS被认为刺激PBMC产生IL-1β。将2ml的每种上清与2μgAB7孵育3个小时，接着加入50μl蛋白质A-琼脂糖珠浆以免疫沉淀AB7/IL-1β复合物。将人IL-1β(Peprotech)掺入到RPMI中，并作为免疫沉淀/Western印迹的对照进行电泳。离心并清洗蛋白质A-琼脂糖珠后，将所有的样品上样到SDS-PAGE凝胶上，并在120V下电泳1个小时。在22V下转移到稳定素-P(Immobilon-P)膜过夜并使用5％脱脂牛奶封闭之后，将AB7以2μg/ml与该膜孵育2小时。在清洗步骤后，加入偶联辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗人IgG二抗，检测是使用一步四甲基联苯胺(TMB)溶液。
图15和图16显示从该方法得到的Western印迹。在图15中印迹左侧(泳道1至3)是对照，其中不同量(5ng、10ng和20ng)的人IL-1β被加入到RPMI培养基中。在该印迹的底部附近，可以在每条泳道中对应大约17kDa的分子量区域观察到带。这些带是AB7结合人IL-1β的指示。中间的泳道(泳道4)是RPMI培养基。在图15中所显示的印迹的右侧(泳道5至泳道8)，显示了来自猕猴(cynomolgus monkey)和恒河猴(rhesus macaque)的样品的结果。泳道5和泳道6分别是不含LPS的猕猴(cynomolgus monkey)样品和含有50ngLPS加入到RPMI培养基中的猕猴(cynomolgus monkey)样品。泳道7和泳道8分别是不含LPS的恒河猴(rhesus macaque)样品和含有50ngLPS加入到RPMI培养基中的恒河猴(rhesus macaque)样品。在该印迹的底部附近，可以在泳道6和泳道8(加入LPS的样品)中对应大约17kDa的分子量区域观察到带。泳道6和泳道8中的这些带是AB7与灵长类IL-1β(即来自猕猴(cynomolgus monkey)和恒河猴(rhesus macaque)的IL-1β)交叉反应的指示。
图16显示来自狗、豚鼠和兔的对照和样品的Western印迹。在图16中印迹左侧(泳道1至4)是对照，其中不同量(5ng、10ng、50ng和200ng)的人IL-1β被加入到RPMI培养基中。在该印迹的底部附近，可以在每条泳道中对应大约17kDa的分子量区域观察到带。这些带是AB7结合人IL-1β的指示。图15中的泳道5是RPMI培养基。泳道6至泳道8是来自狗PBMC的样品的结果，分别是不含LPS、含50ngLPS和200ngLPS。泳道9和泳道10是来自豚鼠PBMC的样品的结果，分别是不含LPS和含50ngLPS。泳道9和泳道10是来自兔PBMC的样品的结果，分别是不含LPS和含50ngLPS。在该印迹的底部附近，可以在泳道7、泳道8和泳道12(加入LPS的狗和兔样品)中对应大约17kDa的分子量区域观察到带。泳道7、泳道8和泳道12中的这些带是AB7与狗IL-1β以及兔IL-1β交叉反应的指示。在泳道10(加入50ng LPS的豚鼠PBMC)中缺少可见的带说明AB7与豚鼠IL-1β不发生交叉反应。
这些结果说明AB7与来自某些非人类哺乳动物的IL-1β发生交叉反应即恒河猴(rhesus macaque)、猕猴(cynomolgus monkey)、狗和兔，但与来自至少一种其它的非人类哺乳动物的IL-1β不发生交叉反应即豚鼠。
实施例9
本实施例进一步说明本发明至少某些根据本发明的IL-1β结合抗体与来自非人类的其它某些哺乳动物的IL-1β交叉反应。检验抗体AB7结合来自非人类哺乳动物即小鼠和大鼠的IL-1β。
将重组人、小鼠和大鼠的IL-1β(派普泰克(Peprotech))在还原条件和非还原条件下上样到SDS-PAGE凝胶上，并在120V下电泳1小时。在22V下转移到Immobilon-P膜过夜并使用5％脱脂牛奶封闭之后，将AB7以2μg/ml与该膜孵育2小时。在清洗步骤后，加入偶联HRP的羊抗人IgG二抗，检测是使用一步TMB溶液。
图17显示根据前述方法所获得的Western印迹。泳道1和泳道2分别是非还原的和还原的人IL-1β。泳道3和4分别是非还原的和还原的小鼠IL-1β。泳道5和6分别是非还原的和还原的大鼠IL-1β。在该印迹的底部附近，可以在每条泳道中对应大约17kDa的分子量区域观察到带。这些带是存在IL-1β的指示，接着是AB7结合人IL-1β、小鼠IL-1β和大鼠IL-1β的指示。这些结果说明AB7与啮齿类IL-1β交叉反应。
实施例10
本实施例还说明本发明的至少某些本发明的IL-1β结合抗体是来自人类和至少某些非人类哺乳动物的IL-1β的抑制剂。检验AB7抑制由人、恒河猴(rhesus macaque)、小鼠和大鼠IL-1β刺激的D10细胞的增殖。
D10.G4.1(D10)细胞是鼠T辅助细胞，其对来自蛋白的伴清蛋白有特异性。该细胞系来自AKR/J小鼠(H-2k MHC单倍型)并需要IL-1和抗原受体激活进行生长、增殖和存活。D10细胞系对IL-1高度敏感，并能对来自多种物种(包括人、猴、小鼠和大鼠)的IL-1做出反应，这使得可以检测IL-1β结合抗体或片段如AB7的交叉反应中和能力。D10的增殖不受LPS的影响，也不受来自巨噬细胞的细胞因子如IL-6和TNF-a的影响。结果，D10检验可以用于检验来自内源的特异性IL-1活性(即LPS-激活的巨噬细胞)。
在存在或不存在多种浓度的AB7的情况下，使用刀豆球蛋白A(Con A)和稳定水平的重组或原始IL-1对D10细胞进行激活。以2×104/孔将细胞进行铺板，并使用2.5μg/ml Con A和不同浓度的IL-1β进行刺激。将细胞培养72小时，并通过在培养的最后8至14小时中加入氧化还原能力染料阿拉玛(Alamar)蓝并检测O.D.570-600来检测增殖。
为了检测AB7的能力和物种交叉反应，使用下列浓度的重组或原始IL-1β进行D10生物检验：10pg/ml重组人IL-1β；10pg/ml重组恒河猴IL-1β；10pg/ml小鼠IL-1β；以及100pg/ml大鼠IL-1β。对于采用内源人IL-1β的D10检验，使用1∶360稀释的来自LPS激活的人PBMC上清。使用每种IL-1β对不同浓度的AB7进行测试。使用Graphpad Prism确定IC50的测量值。使用MicrosoftExcel计算IC50的标准偏差(SD)和标准误差(SEM)。
表5总结了来自D10检验的结果，其包括平均IC50和SEM(基于4次重组人IL-1β实验和3次其它来源的IL-1β实验)。AB7在中和重组人IL-1β和内源产生的(原始)人IL-1β中高度有效。AB7在中和重组恒河猴IL-1β中也高度有效。AB7以较低的效力中和重组小鼠IL-1β，其IC50比人高1000倍。在该检验中，AB7不具有针对对大鼠IL-1β的显著活性。
表5 ELISA结果
IC50(pM) SEM(pM)
重组人IL-1β  2.4 ±0.52
内源产生的(天然)人IL-1β  2.6 ±0.11
重组恒河猴IL-1β  2.7 ±0.73
重组小鼠IL-1β  2618 ±60.9
这些结果显示AB7是针对人IL-1β的高度有效的中和抗体，其具有对重组和原始形式的该细胞因子的类似效力。对非人灵长类恒河猴IL-1β的活性与对人IL-1β的活性相似。因此，至少某些本发明的抗体和片段包括抗体和片段，其具有针对人IL-1β和灵长类IL-1β基本相同的效力，和/或具有针对重组人IL-1β和内源人IL-1β基本相同的效力。这些结果还说明AB7也会中和小鼠AB7。
实施例11
本实施例说明了本发明的至少某些抗体(例如被指定为AB7的抗体)所结合的IL-1β抗原决定簇的图谱。
PepSpotTM肽阵列(JPT多肽技术(JPT Peptide Technologies)，柏林，德国)被用于鉴定参与AB7结合的IL-1β关键氨基酸序列(抗原决定簇)。将一系列十二个氨基酸的肽直接合成在膜上。其中所述一系列十二个氨基酸的肽跨越了整个IL-1β氨基酸序列，每条肽与前一条有11个氨基酸的重叠。使用AB7以2μg/ml在室温下对携带这些肽的膜标记2小时。使用偶联HRP的羊抗人二抗，接着进行增强的化学发光(ECL)检测AB7与膜所结合肽的结合。对应IL-1β83至105位残基的肽点被评分为与AB7阳性结合。
该图谱说明AB7结合对应成熟的IL-1β蛋白质中第83至105位残基的序列内的抗原决定簇。该序列包含氨基酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE，AB7是能够结合该序列内的抗原决定簇的典型抗体。期望被指定为AB6、AB8、AB9的抗体和其它诸如具有SEQ ID NO：29重链和SEQ ID NO：27轻链的抗体也结合包含在该序列内的抗原决定簇。
实施例12
本实施例说明在细胞基检验IL-8中使用本发明的抗体对IL-1β的体外抑制。
从健康的供体收集新鲜的肝素化外周血。将180μl全血接种在96孔板中，并与各种浓度的抗体AB7和100pM rh IL-1β进行孵育。对于Kineret处理的样品，在混合之前，将Kineret
Figure A20068002655100812
和rhIL-1β按1∶1组合。在37℃下5％的CO2中将样品孵育6个小时。接着使用2.5％50μl Triton X-100将全血细胞进行裂解。通过ELISA(Quantikine human IL-8 ELISA试剂盒，R&D Systems)，根据制造商的使用说明对清澈的裂解液中白介素-8(IL-8)的浓度进行检验。将AB7和Kineret
Figure A20068002655100813
处理的样品中IL-8的含量与使用抗KLH对照处理的对照样品进行比较。图18反映了这些结果，并总结在表6中。IC50是指抑制由IL-1β刺激所引起的IL-8的50％所需要的抗体量。
表6
Figure A20068002655100814
根据对IL-1β刺激IL-8释放的抑制所检测的，这些结果证明了AB7的体外能力。与Kineret
Figure A20068002655100815
相比，显示更强能力的结果说明本发明的抗体将具有体内抑制IL-1β的能力。
实施例13
本实施例说明本发明的抗体与具有类似序列的抗体相比具有令人吃惊的高亲和力。
将AB5与AB-对照在序列和结合亲和力方面进行比较。AB5含有在SEQID NO：8中所列出的重链可变区以及在SEQ ID NO：9中所列出的轻链可变区。AB-对照被认为具有在SEQ ID NO：38中所列出的重链可变区以及在SEQID NO：39中所列出的轻链可变区。美国专利申请公开No.2003/0026806中在图6A和图6B中列出了这些序列。AB5和AB-对照在它们的重链和轻链可变区中具有相同的互补性决定区。它们的重链在框架区3中位于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：38中位置68、74和86的三个氨基酸处有区别。它们各自的轻链在框架3中位于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：39中位置72的一个氨基酸处有区别。尽管在它们重链和轻链可变区序列中的相似性包括相同的CDR，AB5和AB-对照在它们的结合亲和力方面显著并出人意料地不同。正如在上面实施例1和5中所讨论的，发现AB5具有低于0.3pM的解离常数(KD-低是0.11pM，KD-高是0.56pM)，发现AB-对照具有3pM的解离常数(KD-低是1.62pM，KD-高是5.23pM)。考虑到氨基酸序列中的湘西行，令人惊奇的是AB5具有一个数量级高的亲和力。
如实施例4中所述，使用HUMAN ENGINEERINGTM技术产生AB7。AB7的轻链和重链包括AB5的轻链和重链序列中的低风险和中等风险位点。AB7包含在SEQ ID NO：15中所列出的重链可变区以及在SEQ ID NO：11中所列出的轻链可变区。
将AB7与AB5、AB-对照在序列和结合亲和力方面进行比较。AB7和AB-对照在它们的重链和轻链可变区中具有相同的互补性决定区。它们的重链在框架区3中AB5与AB-对照不同的3个氨基酸位置中有2个氨基酸不同(SEQ IDNO：15和38中位置74和86)；而在SEQ ID NO：15中的位置68中，AB7具有与AB-对照相同的氨基酸。在AB7的轻链中，SEQ ID NO：11中位置72与AB-对照和AB5都不同。如果利用HUMAN ENGINEERINGTM工艺与AB-对照和AB5进行比较，则AB7含有许多其它的不同。尽管在中等风险的位点含有改变，特别是考虑到AB7和AB5相比在重链可变区中的位置68以及轻链可变区中的位置72有改变，AB7和AB5具有相似的解离常数，但AB7和AB-对照在结合亲和力方面显著地并意想不到地不同。如在上面实施例5中所讨论的，发现AB7具有0.3pM的解离常数(KD-低是0.11pM，KD-高是0.74pM)。发现AB5具有0.24pM的解离常数(KD-低是0.07pM，KD-高是0.72pM)。考虑到在中等风险位置所作的改变以及氨基酸序列中的整体相似性特别是在CDR中，令人吃惊的是AB7与AB5具有相似的亲和力，但具有比AB-对照高一个数量级的亲和力。
实施例14
本实施例显示至少一种本发明的抗体结合IL-1β的抗原决定簇，这样所结合的抗体基本上不会防止所结合的IL-1β结合I型IL-1受体。该实施例采用Biacore
Figure A20068002655100821
动力学分析设备检测是否结合到本发明的一种抗体(AB7)的IL-1β仍能够结合I型IL-1受体。
对于该实施例，如下AB7被固定在Biacore设备中的CM-5传感器芯片的表面上。使用HBS-EP(Biacore
Figure A20068002655100831
，Inc.)作为电泳缓冲液，将温度设定为25℃，流速设定为10μL/分钟，流体通道被导向为仅流动细胞2。将135μL的每种NHS和ECD溶液(Biacore
Figure A20068002655100832
，Inc.)进行混合，并立刻将70μL NHS/ECD溶液注射到流体通道中。接着注射90μL AB7溶液(在醋酸钠缓冲液中大约20μg/ml(Biacore
Figure A20068002655100833
，Inc.))，接着注射70μL 1M乙醇胺(Biacore
Figure A20068002655100834
，Inc.)。这样固定了大约5650 RU的AB7。为了制备参照表面，将流体通道改变为仅流动细胞1。将135μL的每种NHS和ECD溶液(Biacore，Inc.)进行混合，并立即在流体通道中注射70μLNHS/ECD溶液，接着注射70μL1M乙醇胺(Biacore
Figure A20068002655100836
，Inc.)。
接着将Biacore
Figure A20068002655100837
设备准备好用于分析是否结合到AB7的IL-1β仍会结合I型IL-1受体。为进行该分析，使用可溶I型IL-1受体(IL-1 sRI)，并将IL-1 sRI与复合物AB7/IL-1β的结合。IL-1 sRI(RnDSystems ca#269-lR-100/CF)和IL-1β(Peprotech，cat#200-01B)被分别在HBS-EP中被稀释成10μg/ml。流速被设置成10μL/分钟。流体通道被设置为流动细胞1和2以及参照，从流动细胞1减去流动细胞2被用于确定反应差别。图19显示经过分析过程从Biacore设备所检测的反应差别。图20提供了对该分析中所使用步骤的说明，其说明依次分别向流动细胞加入(A)IL-1 sRI、(B)IL-1β以及(C)IL-1 sRI。
在第200秒，注射20μL IL-1 sRI以确认不存在直接结合到固定的AB7(在图19和图20中的注射A)。如图19所示，IL-1 sRI不会提高反应单位，这说明IL-1 sRI不会直接结合被固定的AB7。
在第600秒，大约1000RU的IL-1β被AB7结合，这在芯片表面上形成了AB7/IL-1β复合物(图19和图20中的注射)。反应单位的提高说明IL-1β被结合到固定的AB7上。接着在1200秒注射20μL IL-1 sRI以测试IL-1 sRI与AB7和IL-1β复合物的结合。大约1500RU IL-1 sRI被结合到AB7/IL-1β复合物(在图19和图20中的注射C)。这种反应单位中的提高说明IL-1 sRI结合到IL-1β/AB7复合物。
该实施例说明IL-1 sRI结合IL-1β但不会结合AB7，AB7结合IL-1β的抗原决定簇，这样AB7基本上不会防止IL-1β结合IL-1 sRI。
所有的参考包括这里所引用的出版物、专利申请和专利在这里被引入作为参考，达到与将每一份参考单独和具体地指出以作为参考引入并将其全部内容在这里列出同样的程度。
在本发明的描述中(特别是后面的权利要求中)，术语“a”和“an”被认为是覆盖单数和复数，除非这里以其它方式表示或在文中明显矛盾。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”被认为是开放式的术语(即意思是“包括单不限于”)，除非以其它方式说明。无论在何处使用开放式术语对本发明的特征或元件进行描述，其都被具体认为封闭式的术语可以被用于替换该开放式术语，而不离开本发明的主旨和范围。这里所引用的数值范围仅仅作为单独引用每个落入该范围内单独数值的简略的表达方法，除非以其它方式说明，因此每个单独的数值都被引入到说明书中，就像其在这里被单独引用一样。这里所描述的所有方法都能够以任何适当的顺序进行，除非这里以其它方式表示或在文中明显矛盾。对这里所提供的任何和全部例子或者示范语言(例如“诸如”)的使用仅仅被认为是更好地说明本发明，而不会对本发明的保护范围造成限制。说明书中没有语言被认为是说明任何没有请求保护的元素是实施本发明所必须的。
这里描述了本发明的优选实施方式包括实施本发明的最佳模式。对于本领域技术人员在阅读了前述说明书后，对这些优选实施方式的改变是显而易见的。本发名人认为本领域技术人员能够在适当时采用这些变化，并且本发明人希望本发明被实施，而不是这里所具体描述的。因此，本发名包括了所有的恶修饰和主题内容的等价，其被记录在后面的权利要求书中，只要被适用的法律所允许。而且，在其所有可能的变化中，上述元素的任何组合都被本发名所包括，除非这里以其它方式表示或在文中明显矛盾。
序列表
<110>佐马技术有限公司
<120>IL-1β结合抗体及其片段
<130>PIUS0712321
<160>57
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>″Xaa″是Leu或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>″Xaa″是Asp或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>″Xaa″是Gly或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(43)..(43)
<223>″Xaa″是Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(72)..(72)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<400>1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Xaa Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Xaa Xaa Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        100                     105
<210>2
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>″Xaa″是Thr或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>″Xaa″是Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>″Xaa″是Ile或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>″Xaa″是Leu或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>″Xaa″是Gln或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(81)..(81)
<223>″Xaa″是Phe或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(88)..(88)
<223>″Xaa″是Asp或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>″Xaa″是Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(90)
<223>″Xaa″是Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(94)..(94)
<223>″Xaa″是Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>2
Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Xaa Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Xaa Leu Lys Ile Thr Ser Val Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>3
Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>4
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>4
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>5
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                  110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>6
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>6
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                 85                  90                  95
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
             100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
         35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>8
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                 85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>11
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>12
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys lle Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>13
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>14
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>15
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>16
Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1                   5               10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>17
Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>18
Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>19
Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>20
Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>21
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>22
Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5
<210>23
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
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<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>24
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1                5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>25
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>26
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>27
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(79)..(79)
<223>″Xaa″是Glu或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(83)..(83)
<223>″Xaa″是Ile或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Gly或Gln
<400>27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Xaa Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Xaa Xaa Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Xaa Leu Xaa Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>28
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>″Xaa″是Thr或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
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<220>
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<222>(11)..(11)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>″Xaa″是Gln或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(74)..(74)
<223>″Xaa″是Asp或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(81)..(81)
<223>″Xaa″是Phe或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(88)..(88)
<223>″Xaa″是Asp或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>″Xaa″是Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(90)
<223>″Xaa″是Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(94)..(94)
<223>″Xaa″是Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<400>28
Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Lys Xaa Thr Ser Xaa Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Xaa Leu Lys Ile Thr Ser Val Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                  105                  110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>29
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>″Xaa″是Thr或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>″Xaa″是Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>″Xaa″是Ile或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>″Xaa″是Leu或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(67)..(67)
<223>″Xaa″是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(68)..(68)
<223>″Xaa″是Gln或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(74)..(74)
<223>″Xaa″是Asp或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(77)..(77)
<223>″Xaa″是Arg或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(81)..(81)
<223>″Xaa″是Phe或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(88)..(88)
<223>″Xaa″是Asp或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>″Xaa″是Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(90)
<223>″Xaa″是Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(94)..(94)
<223>″Xaa″是Thr或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>29
Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Lys Xaa Thr Ser Xaa Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Xaa Leu Lys Ile Thr Ser Val Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Phe
                 85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
             100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>″Xaa″是Arg或Lys，但如果(1)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>30
Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp
1               5                   10
<210>31
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>32
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>33
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>″Xaa″是Arg或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
      115                 120
<210>34
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>"Xaa"是Arg或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>35
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>″Xaa″是Ala，Val，Phe，Lys或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(101)..(101)
<223>"Xaa"或Lys，但如果(100)位是Lys则″Xaa″不是Lys。
<400>35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>36
<211>23
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>36
Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg
1               5                   10                  15
Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu
            20
<210>37
<211>5
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>连接体序列(Linker Sequence)
<400>37
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>38
<211>360
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>38
caagtacaac ttcaagaaag cggtccaggc cttgttaaac cctcccaaac tctttctctt  60
acctgttctt tctctggatt ctctctctct acctctggca tgggcgtcgg ctggatacgt 120
caaccaagtg gaaaaggact cgaatggctt gcacatatat ggtgggatgg cgacgaatct    180
tataaccctt ctcttaaatc tcgacttaca atttctaaag acacttccaa aaaccaagtt    240
tccctcaaaa taacctccgt cactgctgca gatactgctg tctatttttg cgcacgaaac    300
agatatgatc ccccctggtt cgttgattgg ggccaaggaa cactcgtaac cgttagctca    360
<210>39
<211>321
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>39
gacatccaaa tgactcaatc cacttcctca ctctcagcct ctgtcggaga ccgtgtaact     60
atcacctgcc gtgcttccca agacatctct aattatctct cctggtatca acaaaaacct    120
ggtaaagctg ttaaacttct catttattat acttctaaac ttcactccgg tgtgccttct    180
cgtttctcag gatcaggctc aggaaccgac tatacactca ccatctcctc cctccaacaa    240
gaagacttcg ctacttactt ttgccttcaa ggaaaaatgc tcccctggac tttcggacaa    300
ggaacaaagc tcgaaattaa a                                              321
<210>40
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>40
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Thr Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>41
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>42
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
         35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>43
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>44
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>45
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                 85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>46
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>47
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>47
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>48
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>49
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
   50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>50
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>51
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>52
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
             20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>53
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>54
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>54
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>55
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>55
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                    10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
             100                105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>56
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>57
<211>120
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成
<400>57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120

Claims (66)

1.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中，所述的抗体或片段包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
3.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段以大约1pM或更低的解离常数结合人IL-1β。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或片段以大约0.3pM或更低的解离常数结合人IL-1β。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或片段以大约0.24pM的解离常数结合人IL-1β。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或片段以大约0.11pM的解离常数结合人IL-1β。
7.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段结合到IL-1β抗原决定簇上，这样所结合的抗体或片段基本上允许IL-1β结合到I型IL-1受体上(IL-1RI)，并且所述抗体或片段以低于1pM的解离常数结合人IL-1β。
8.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段以低于1pM的解离常数结合人IL-1β，并且所述抗体或片段结合与具有SEQ IDNO：11轻链可变区和SEQ ID NO：15重链可变区的抗体所结合的基本上相同的抗原决定簇。
9.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段以低于1pM的解离常数结合人IL-1β，并且所述抗体或片段与具有SEQ ID NO：11轻链可变区和SEQ ID NO：15重链可变区的抗体竞争结合。
10.根据权利要求8所述的抗体或片段，其中，所述的抗体或抗体片段结合包含在序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE(SEQ ID NO：36)中的抗原决定簇。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是人源化的或人工改造的。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述的抗体或抗体片段是人抗体或人抗体片段。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是中和抗体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含λ轻链。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含IgG2区。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是Fab、F(ab′)2、Fv、单链抗体片段，或者这些抗体或片段中任一种的变体或衍生物。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是多特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体、微型抗体、线性抗体、螯合重组抗体、三体、双体、内抗体、纳米抗体、小分子免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH的抗体，或者这些抗体或片段中任一种的变体或衍生物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包括含有SEQ ID NO：27氨基酸序列的轻链可变区。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列之一，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列之一。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
23.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有低于3pM的解离常数。
24.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有大约2pM或更低的解离常数。
25.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或抗体片段(i)具有用于抑制由IL-1β刺激从人成纤维细胞释放IL-6的大约0.5nM或更低的IC50，(ii)以大约1pM或更低的解离常数结合IL-1β，以及(iii)  与未给药抗体或抗体片段的IL-1β刺激的动物中血清IL-6水平相比，在以有效量对动物给药所述抗体或抗体片段时，抑制动物中IL-1β诱导的血清IL-6表达的至少50％。
26.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或抗体片段以大约6pM至大约50pM的解离常数结合人IL-1β，并且其中所述抗体具有用于抑制由IL-1β刺激从人成纤维细胞释放IL-6的大约5pM至大约200pM的IC50。
27.根据权利要求26所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段以大约13pM至大约25pM的解离常数结合人IL-1β。
28.根据权利要求26-27所述的抗体或抗体片段，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
29.根据权利要求26-28所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段不会可检测地结合IL-1α。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段不会与IL-1β以外的靶交叉反应。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段结合啮齿类IL-1β、灵长类IL-1β、狗IL-1β和兔IL-1β中的一种或多种。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或片段以比大鼠IL-1β高的亲和力结合小鼠IL-1β。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或片段不结合豚鼠IL-1β。
35.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段包含对SEQ ID NO：28氨基酸序列的一个或多个替代、缺失或添加，并且所述抗体或片段具有与在SEQ ID NO：28中所列氨基酸序列相同或基本相同的抗原决定簇结合亲和力和特异性。
36.一种IL-1β结合抗体或其IL-1β结合片段，其中，所述抗体或片段包含对SEQ ID NO：27氨基酸序列的一个或多个替代、缺失或添加，并且所述抗体或片段具有与在SEQ ID NO：27中所列氨基酸序列相同或基本相同的抗原决定簇结合亲和力和特异性。
37.一种核酸，其编码权利要求1-35中任一项所述的抗体或抗体片段。
38.根据权利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：38的序列。
39.根据权利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：39的序列。
40.一种核酸，其包含编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的核酸序列，其中，所述核酸编码包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变区。
42.一种核酸，其包含编码抗体轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
43.一种载体，其包含权利要求37-41中任一项所述的核酸。
44.一种细胞，其包含权利要求37-41中任一项所述的核酸或权利要求42所述的载体。
45.根据权利要求44所述的细胞，其中，所述细胞是胚胎干细胞或受精卵。
46.一种转基因动物，其包含权利要求44或45所述的细胞。
47.一种杂交瘤，其产生权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗体片段。
48.一种组合物，其包含(a)权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求37-41中任一项所述的核酸或权利要求42所述的载体；以及(b)适当的运载体。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中，所述运载体是药物上可以接受的运载体。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中，所述组合物是适合关节内、皮下、静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、损伤内、口服或吸入给药的形式。
51.根据权利要求49所述的组合物，其中，所述组合物含有冻干保护剂、表面活性剂、填充剂、粘合剂和/或膨胀剂。
52.根据权利要求49所述的组合物，其中，所述组合物是可控释放或持续释放的药物组合物。
53.一种治疗或预防哺乳动物中IL-1相关疾病或病症的方法，其包括为需要治疗的哺乳动物给药有效量的(a)权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗体片段、(b)权利要求37-41中任一项所述的核酸、(c)权利要求42的载体或(d)权利要求48-54任一项所述的组合物，这样哺乳动物中的疾病得到治疗或预防。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述IL-1相关疾病或病症是炎症疾病、自体免疫疾病或癌症。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述IL-1相关疾病或病症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、败血性休克、慢性阻塞性肺部疾病、哮喘、移植物抗宿主疾病、动脉粥样硬化、成人T细胞性白血病、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、中风或阿尔茨海默病。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中，所述IL-1相关疾病或病症是新生儿多***炎症性疾病(NOMID/CINCA)、全身性幼年特发性关节炎、CIAS1相关周期性综合症(CAPS)、斯蒂尔病或穆-韦二氏综合症。
57.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中，所述IL-1相关疾病或病症是全身性幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉硬化或重症肌无力。
58.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的方法，其中，与不存在抗体的血清IL-6水平相比，所述有效量的所述抗体或抗体片段有效抑制动物中IL-1β诱导的血清IL-6表达的至少50％。
60.一种制备亲和力成熟的IL-1β结合多肽的方法，其包括：
(a)提供第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码IL-1β结合多肽的核酸序列，其中所述IL-1β结合多肽包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，其中第二核酸序列包含与第一核酸序列至少有一个核苷酸不同的核酸序列；
(b)进行核酸混编以提供两种或者更多种突变的核酸；
(c)选择突变的核酸，其编码以下多肽，所述多肽能够或者(i)以比第一核酸所编码的多肽高的亲和力与IL-1β结合，(ii)对IL-1β具有高于IL-1α的选择性，该选择性大于第一核酸所编码的多肽的选择性，(iii)对于IL-1β具有低于第一核酸所编码的多肽的平衡结合解离常数，或者(iv)抑制IL-1β诱导的动物中血清IL-6的表达的程度比第一核酸所编码的多肽高；以及
(d)表达所选择的突变核酸，
以提供亲和力成熟的IL-1β多肽。
61.根据权利要求60所述的方法，其还包括在选择突变的核酸之前提供以下抗体，所述抗体包含由所述突变的核酸所编码的多肽，其中通过对所述抗体进行检验来进行对突变的核酸的选择。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中，重复步骤(b)和(c)，其中使用(i)至少一种步骤(c)所选择的的突变核酸和(ii)至少一种核酸，其具有与所选择的突变核酸有至少一个核苷酸不同的核酸序列，来进行步骤(b)的核酸混编。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中，重复步骤(b)和(c)直到选择到最佳的核酸。
64.根据权利要求60-63中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸编码含有SEQ ID NO：1-26中任一氨基酸序列的多肽。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸编码含有SEQ ID NO：27-35或SEQ ID NO：42-57中任一氨基酸序列的多肽。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的方法，其中，重复步骤(b)和(c)直到选择到编码以下多肽的核酸，所述多肽(i)具有用于抑制IL-1β刺激从人成纤维细胞释放IL-6的大约0.5nM或更低的IC50；(ii)以低于3pM的解离常数结合IL-1β；以及(iii)与未给药抗体或片段的IL-1β刺激的动物中血清IL-6水平相比，抑制动物中IL-1β诱导的血清IL-6表达的至少50％。
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