CN101208102B - 免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了包含来自至少一种血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitiddis)荚膜多糖的免疫原性组合物，所述荚膜多糖与载体蛋白缀合以产生脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖缀合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa以上。
Description
本发明涉及包含与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖的免疫组合物。本发明还涉及包含脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的疫苗和疫苗试剂盒、制备免疫原性组合物和疫苗的方法以及本发明疫苗和免疫原性组合物在治疗中的应用。本发明也涉及采用脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物免疫来抗奈瑟氏菌感染的方法以及脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物在制备药物中的应用。
脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是革兰氏阴性人类致病菌，其可致细菌生脑膜炎。基于生物的荚膜多糖，已鉴定出十二种血清群脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。血清群A(MenA)是撒哈拉以南非洲最常见流行病的致病原因。血清群B和C是发展中国家中存在的主要病例，其它病例则由W135和Y引起。
包含与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)糖的免疫原性组合物是本领域已知的。例如，WO 02/58737公开了包含来自纯化的与载体蛋白缀合血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖的疫苗。然而，该应用教导提取的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖应该在缀合之前通过在过氧化氢溶液中加热来解聚。
WO 03/07985公开了包含选自血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)糖的缀合疫苗。提取脑膜炎球菌荚膜多糖，然后水解，以选择荚膜多糖衍生寡糖用于与载体蛋白缀合。
WO 04/103400也公开了包含血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖的多价脑膜炎球菌衍生的多糖-蛋白缀合物。该应用教导，不使用天然较大的荚膜多糖，优选使用较小的脑膜炎球菌多糖。该文献提示，将荚膜多糖用温和氧化条件部分解聚至平均大小小于100,000道尔顿，优选12,000-25,000道尔顿。
仍需要开发出抗脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的改进的缀合物疫苗。本发明涉及提供一种脑膜炎球菌多糖缀合物疫苗，其中多糖大小较现有文献教导的大一些。现有技术的焦点在于，使用寡糖以易于缀合物生产。本发明人发现使用天然或略微按大小分级的多糖缀合物，将会实现一种或多种以下优点：1)缀合物有高免疫原性并且可过滤；2)可增强免疫记忆(如实施例3所述)；3)可改变缀合物中多糖与蛋白的比例，由此缀合物中多糖与蛋白的比例(w/w)有所增加(这可降低载体抑制效应)；4)免疫原缀合物(例如MenA缀合物)倾向于水解，可通过在缀合中使用较大多糖而稳定。使用较大多糖，可与缀合载体产生较多交联，由此，游离糖将从缀合物较少解离。现有技术中记载的缀合疫苗倾向于在缀合之前将多糖解聚以提高其缀合。本发明涉及一种不同策略，并且惊奇地发现，保留较大尺寸多糖的脑膜炎球菌缀合疫苗可对脑膜炎球菌疾病提供良好免疫应答。
因此，根据本发明一方面，提供了一种包含来自至少一种、两种、三种或四种血清群A、C、W和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖的与载体蛋白缀合的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。
根据本发明另一方面，本发明提供了包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受载体的疫苗。
根据本发明另一方面，本发明提供了用于伴随或顺序给药的疫苗试剂盒，其包括两种多价免疫原性组合物以保护宿主抵抗由百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)以及脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)所致的疾病，其中所述试剂盒包括第一容器和第二容器，
第一容器包括：
破伤风类毒素(TT)，
白喉类毒素（DT)，和
全细胞或非细胞百日咳成分，
第二容器包括：
来自血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中这些或各脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用于制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将与载体蛋白缀合的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，任选地，与药学上可接受赋形剂混合的步骤，其中这些或各脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。
本发明另一方面，本发明提供了一种免疫人类宿主以抵抗由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)所致的疾病的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗。
本发明另一方面，本发明提供了用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)所致的疾病的本发明免疫原性组合物。
本发明另一方面，本发明提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗在用于制备治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)所致的疾病的药物中的应用。
附图描述
图1-A-柱形图显示了抗MenYELISA的GMC图。ENYTT012为从天然的MenY多糖制备的Men Y-TT缀合物。ENYTT014为经历40轮微流循环、微流化从MenY多糖制备的MenY-TT缀合物。ENYTT015bis为经历20轮微流循环、微流化从Men Y多糖制备的Men Y-TT缀合物。
B-柱形图显示了抗MenY SBA分析的GMT图。ENYTT012为从天然MenY多糖制备的Men Y-TT缀合物。ENYTT014为经历40轮微流循环、微流化从Men Y多糖制备的Men Y-TT缀合物。ENYTT015bis为经历20轮微流循环、微流化从Men Y多糖制备的Men Y-TT缀合物。
发明详述
本发明的免疫原性组合物包括来自血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中至少一种、两种、三种或四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小(重量平均分子量；Mw)为50kDa、60kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。
在本发明的一个独立的方面中，免疫原性组合物包括来自血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中至少一种、两种、三种或四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖为天然的多糖或者被以至多为天然多糖重量平均分子量的x1.5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的系数调整大小。
就本发明而言，“天然的多糖”是指未经处理的多糖，其中所述处理的目的是减少多糖大小。多糖在常规纯化工艺中会有轻微的尺寸的减少。这样的多糖仍是天然的多糖。只要多糖经过调整大小的工艺，该多糖就不被认为是天然多糖。
就本发明而言，“以约x2的系数调整大小”，是指多糖经过处理，倾向于降低多糖大小但仍保留超过天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解释，即对多糖进行处理，目的是降低多糖的大小，但仍分别保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小。
在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括来自血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中至少一种、两种、三种或四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖为天然多糖。
在本发明的另一方面中，免疫原性组合物包括来自血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中至少一种、两种、三种或四种，或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖被以约x1.5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的系数调整大小。
本发明的免疫原性组合物任选地包括下列缀合物：脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群C荚膜多糖(MenC)、血清群A荚膜多糖(MenA)、血清群W135荚膜多糖(MenW)、血清群Y荚膜多糖(MenY)、血清群C和Y荚膜多糖(MenCY)、血清群C和A荚膜多糖(MenAC)、血清群C和W荚膜多糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜多糖(MenAY)、血清群A和W荚膜多糖(MenAW)、血清群W和Y荚膜多糖(MenWY)、血清群A、C和W荚膜多糖MenACW)、血清群A、C和Y荚膜多糖(MenACY)；血清群A、W135和Y荚膜多糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y荚膜多糖(MenCWY)；或者血清群A、C、W135和Y荚膜多糖(MenACWY)。这即是本文提到的“一种、两种、三种或四种”或“至少一种”血清群A、C、W和Y或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的定义。
在一个实施方式中，按照MALLS法测定的至少一种、两种、三种或四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小(或分子量)为50KDa-1500kDa、50kDa-500kDa、50kDa-300 KDa、101kDa-1500kDa、101kDa-500kDa、或101kDa-300kDa。
在一个实施方式中，MenA多糖如果存在，具有根据MALLS测定的分子量是50-500kDa、50-100kDa、100-500kDa、55-90KDa、60-70kDa、70-80kDa或60-80kDa。
在一个实施方式中，MenC多糖如果存在，具有根据MALLS测定的分子量是100-200kDa、50-100kDa、100-150kDa、101-130kDa、150-210kDa或180-210kDa。
在一个实施方式中，MenY多糖如果存在，具有根据MALLS测定的分子量是60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa、100-140kDa、140-170kDa或150-160kDa。
在一个实施方式中，MenW多糖如果存在，具有根据MALLS测定的分子量是60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa或120-140kDa。
本文多糖的分子量或平均分子量是指缀合前测定的多糖重量平均分子量(Mw)，其根据MALLS法测量。
MALLS技术是本领域的公知技术，通常以实施例2所述的记载进行。就脑膜炎球菌糖的MALLS分析而言，可组合使用两种柱子(TSKG6000和5000PWxI TOSOH Bioscience)，并且用水洗脱糖。将这些糖用光散色检测器(例如，装备10mW488nm氩激光器的WyattDawnDSP)和干涉仪折射计(例如，装备P100光电元件和498nm红光过滤的Wyatt Otilab DSP)进行检测。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏菌(N.menmgitidis)多糖为天然多糖，或者为在常规提取步骤中大小已经减小的天然多糖。
在个实施方案中，通过机械裂解，例如微流化或超声调整脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的大小。微流化和超声具有充分降低较大天然多糖大小，从而提供可过滤缀合物的优点。调整大小以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3、x2或x1.5的系数进行。
在一个实施方式中，免疫原性组合物包括脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)缀合物，其由天然多糖和被以不超过x20的系数调整大小的多糖的混合物所制成。例如，MenC和/或MenA多糖是天然多糖。例如，MenY和/或MenW多糖被以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3、x2或x1.5的系数调整大小。例如，免疫原性组合物包含由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA制成的缀合物，其中它们被以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3、x2或x1.5的系数调整大小，并且/或者微流化。例如，免疫原性组合物包含由天然MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY制备的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC制备的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和MenA制备的缀合物，其中它们被以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3、x2或x1.5的系数调整大小，并且/或者被微流化。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和MenY制备的缀合物，其中它们被以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3、x2或x1.5的系数调整大小，并且/或者被微流化。
在一个实施方案中，多糖的多分散性为1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05、而且与载体蛋白缀合后，缀合物的多分散性为1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性测量以MALLS技术进行。
任选地，与从细菌中分离的多糖的大小相比，多糖的尺寸可至多被调整1.5、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20倍。
在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物进一步包括来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B的抗原。任选地，该抗原为脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B荚膜多糖(MenB)或者是被调整大小的多糖或衍生寡糖。任选地，该抗原为EP301992、WO 01/09350、WO 04/14417、WO 04/14418和WO 04/14419中记载的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B的外膜囊泡制备物。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包括与载体蛋白缀合的流感嗜血杆菌(H.influenzae)b(Hib)荚膜糖。
包含在本发明的药物组合物中的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖(和任选地Hib荚膜糖)可与下列载体蛋白缀合，例如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素非毒性突变体、白喉类毒素、CRM197、白喉毒素的其它非毒性突变体[例如CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等人J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM9，CRM45，CRM02，CRM103和CRM107以及其它突变体，它们在Nicholls and Youle in Genetically EngineeredToxins，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中有记载；Glu-148至Asp，Gln或Ser的缺失或突变，和/或Ala 158至Gly的缺失或突变，以及其它突变体，它们被公开在US4709017或US 4950740中；Lys516，Lys526，Phe530和/或Lys534的至少一个或多个残基突变以及其它突变体，它们被公开在US5917017或US6455673中；或者US5843711中公开的片段]、肺炎球菌溶血素、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常提取自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B-EP0372501)、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热休克蛋白(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO91/01146)，诸如N19蛋白(Baraldoi et al(2004)Infect lmmun72；4884-7)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)肺炎球菌溶血素(Kuo et al(1995)Infect lmmun63；2706-13)的含不同病原衍生抗原的多价人 CD4+T细胞表位人工蛋白(Falugietal(2001)Eur J Immunol 31；3816-3824)、铁吸收蛋白(WO01/72337)、困难肠梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)或者蛋白D(EP594610和WO 00/56360)。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物将同样的载体蛋白(独立地)用于至少两种、三种、四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖。在一个实施方案中，当Hib存在时，Hib可与至少一种、两种、三种、四种或者每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖相同的载体蛋白缀合。例如，1、2、3或4种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖可分别与破伤风类毒素缀合，以制备1、2、3或4种缀合物。
在一个实施方案中，单个载体蛋白可载有多于一个的糖抗原(WO04/083251)。例如，单个载体蛋白可与MenA和MenC；MenA和MenW；MenA和MenY；MenC和MenW；MenC和MenY；Men W和 MenY；MenA、MenC和MenW；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW和MenY；MenC、MenW和MenY；MenA、MenC、MenW和MenY；Hib和MenA；Hib和MenC；Hib和MenW；或者Hib和MenY，缀合。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖，其中所述载体蛋白选自由TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D所组成的组。
在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物包括与载体蛋白缀合的Hib糖，其中所述载体蛋白选自由TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D所组成的组。
任选地，本发明免疫原性组合物包括至少一种脑膜炎球菌糖(例如MenA；MenC；MenW；MenY；MenA和MenC；MenA和MenW；MenA和MenY；MenC和Men W；Men C和MenY；MenW和MenY；MenA、MenC和MenW；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW和MwnY；MenC、MenW和MenY；或者MenA、MenC、MenW和MenY)的缀合物，其中所述缀合物Men糖与载体蛋白的比例为1∶5-5∶1、1∶2-5∶1、1∶0.5-1∶2.5或1∶1.25-1∶2.5(w/w)。
任选地，本发明的免疫原性组合物包括Hib糖缀合物，其具有的Hib和载体蛋白的比例为1∶5-5∶1；1∶2-2∶1；1∶1-1∶4；1∶2-1∶3.5；或者为大约或正好1∶2.5或1∶3(w/w)。“大约”是指所述比例的10％范围内。
缀合物中糖与载体蛋白的比例(w/w)可以采用灭菌缀合物进行测定。蛋白量，用Lowry分析测定(例如Lowry等人(1951)J.Biol.Chem.193，265-275或Peterson等人Analytical Biochemistry 100，201-220(1979))；多糖量，对MenA用ICP-OES(诱导偶联等离子体-光学发射光谱法)测定，对MenC用DMAP分析测定，对MenW和MenY则用Resorcinol分析测定(Monsigny等人(1988)Anal.Biochem.175，525-530)。
在一个实施方案中，通过连接子，例如双功能连接子，将本发明的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖和/或Hib糖的免疫原缀合物与载体蛋白缀合。任选地，连接子为异双功能或同双功能连接子，例如其有1个反应氨基和1个反应羧基、2个反应氨基或者2个反应羧基。连接子例如具有4-20、4-12、5-10个碳原子。一种可行的连接子是ADH。其它连接子包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever et al(1979)Med.Microbiol.Immunol.165；171-288)、卤烷卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574，US4808700)、己烷二胺和6-氨基己酸(US4459286)。
在本发明的免疫原性组合物中存在的多糖缀合物，可用任何已知的偶联技术制备。缀合方法可依赖于用1-氰基-4-二甲氨基吡啶
四氟硼酸盐(CDAP)将糖活化，形成氰酸酯而进行。由此，活化的糖可直接或经由间隔臂(连接子)基团，连接至载体蛋白氨基。例如，间隔臂可以是胱胺或半胱胺，以给予硫化多糖，其中所述多糖可经由与马来酰亚胺活化载体蛋白(例如使用GMBS)或卤乙酰载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺或N-琥珀酰亚胺溴乙酸盐)反应后所获得的硫酯键与载体连接。任选地，氰酸酯(任选地，以CDAP化学法制备)可与己二胺或ADH连接，由此，氨基衍生化的糖可采用碳化二亚胺化学(例如EDAC或EDC)与载体蛋白缀合。这样的缀合物被记载在PCT公开的申请WO93/15760(Uniformed Services University)、WO95/08348和WO96/29094中。
其它的合适技术，可以使用碳亚胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多都记载在WO98/42721中。缀合可涉及羰基连接子，其由糖的游离羟基先与CDI反应(Bethell等人J.Biol.Chem.1979，254；2572-4，Hearn et al J.Chromatogr.1981.218；509-18)再与蛋白反应，形成氨基甲酸酯键而形成。该过程可涉及末端异头碳还原成伯羟基，任选地，涉及伯羟基与CDI的伯羟基的保护/去保护反应，以形成CDI氨基甲酸酯中间体，接着，将CDI氨基甲酸酯中间体，与蛋白的氨基连接。
缀合物也可按US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中记载的直接还原胺化法制备。其它方法记载在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
进一步的方法涉及通过碳二亚胺聚合法(Chu C.et al Infect.Immunity，1983245 256)，例如使用EDAC，将溴化氰(或CDAP)活化的被己二酰肼(ADH)衍生化的糖与蛋白载体连接。
在一个实施方案中，糖上的羟基(任选活化的羟基，例如氰酸酯活化的羟基)可直接或间接(通过连接子)与蛋白的氨基或羧基连接。当存在连接子时，糖羟基任选地与连接子的氨基连接，例如用CDAP缀合法连接。连接子例如ADH的多余氨基可与蛋白上的羧基偶联，例如用碳化二亚胺化学法连接，如使用EDAC。在一个实施方案中，Hib或脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，在连接子与载体蛋白缀合之前，先与连接子缀合。
在一个实施方案中，Hib糖，如果存在，用CNBr，或CDAP，或者CDAP与碳化二亚胺化学(例如EDAC)的组合，或者CNBr与碳化二亚胺化学物(例如EDAC)的组合，将其与载体蛋白缀合。任选地，用CNBr和碳化二亚胺化学(可选EDAC)，将Hib进行缀合。例如，将CNBr用于连接糖和连接子，然后将碳化二亚胺化学物用于将连接子连接至蛋白载体。
在一个实施方案中，将至少一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖直接与载体蛋白缀合；任选地，使MenW和/或MenY和/或MenC糖直接与载体蛋白缀合。例如，使MenW；MenY；MenC；MenW和MenY；MenW和MenC；MenY和MenC；或者MenW、MenY和MenC，直接与载体蛋白连接。任选地，通过CDAP使至少一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.memngitidis)荚膜多糖直接缀合。例如，通过CDAP使MenW；MenY；MenC；MenW和MenY；MenW和MenC；MenY和MenC；或者MenW、MenY和MenC，与载体蛋白直接连接(参见WO95/08348和WO96/29094)。在一个实施方案中，所有脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖与破伤风类毒素缀合。
任选地，Men W和/或Y糖与载体蛋白的比例为1∶0.5-1∶2(w/w)，和/或MenC糖与载体蛋白的比例为1∶0.5-1∶4或1∶1.25-1∶1.5或1∶0.5-1∶1.5(w/w)，特别是当任选地使用CDAP使这些糖与蛋白直接连接时。
在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，通过连接子，例如双功能连接子，与载体蛋白缀合。任选地，连接子为异双功能或同双功能连接子，例如其有1个反应性氨基和1个反应性羧基、2个反应性氨基或者2个反应性羧基。例如，连接子具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的连接子是ADH。
在一个实施方案中，MenA；MenC；或者MenA和MenC，通过连接子与载体蛋白(例如破伤风类毒素)缀合。
在一个实施方案中，用CDAP和EDAC，通过连接子使至少一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖与载体蛋白缀合。例如，使用如上所述的CDAP和EDAC，通过连接子(例如末端含有两个肼基的连接子，如ADH)将MenA；MenC；或者MenA和MenC与蛋白缀合。例如，使用CDAP将糖与连接子缀合，而EDAC用于将连接子与蛋白缀合。对MenA；MenC；或者MenA和MenC而言，任选地，借助连接子的缀合，可产生多糖与载体蛋白的比例为1∶0.5-1∶6；1∶1-1∶5或1∶2-1∶4。
在一个实施方案中，MenA荚膜多糖，如果存在，其至少部分地被O-乙酰化，使得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元在至少一个位点处被O-乙酰化。例如，O-乙酰化至少出现在至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元的O-3位点处。
在一个实施方案中，MenC荚膜多糖，如果存在，其至少部分地被O-乙酰化，使得至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的(α2-＞9)连接的NeuNAc重复单元在至少一个或两个位点处被O-乙酰化。例如，O-乙酰化出现在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元的O-7和/或O-8位点处。
在一个实施方案中，MenW荚膜多糖，如果存在，其至少部分的被O-乙酰化，使得至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元在至少一个或两个位点处被O-乙酰化。例如，O-乙酰化出现在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元的O-7和/或O-9位点处。
在一个实施方案中，MenY荚膜多糖，如果存在，其至少部分地被O-乙酰化，由此至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元在至少一个或两个位点处被O-乙酰化。O-乙酰化出现在至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的重复单元的7和/或9位点处。
O-乙酰化百分比是指含O-乙酰化的重复单元的百分数。这可在缀合前和/或缀合后的多糖中测量。
在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括Hib糖缀合物和至少两种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物，其中Hib缀合物的糖剂量比至少两种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的平均糖剂量低。任选地，Hib缀合物的糖剂量比至少两种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的每种糖剂量都低。例如，Hib缀合物的剂量比至少两种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的平均糖剂量或最低糖剂量低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
术语“糖”包括多糖或寡糖。多糖分离自细菌或分离自细菌，并用已知方法(参见例如EP497524和EP497525)，以及任选地，用微流化方法，将其大小调整至一定程度。将多糖进行大小调整，可降低多糖样品的粘度并且/或者提高缀合的产品的过滤性。寡糖典型地特征在于是具有少量重复单元的水解多糖(典型地，5-30个重复单元)。
平均剂量是通过将所有“进一步的”多糖的剂量相加，再除以“进一步的”多糖的数量而确定的。“进一步的”多糖是指在免疫原性组合物内除Hib之外的所有多糖，其包括脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖。“剂量”在给予人类免疫原性组合物或疫苗的数量中。
Hib糖是流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型聚核糖磷酸(PRP)荚膜多糖或其衍生的寡糖。
“至少两种进一步的细菌糖缀合物”，是指除Hib缀合物之外的至少两种添加细菌糖缀合物。至少两种进一步的细菌糖缀合物，包括脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖缀合物。
本发明免疫原缀合物可包括来自一种或多种脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、A群链球菌(Group AStreptococci)、B群链球菌(Group B Streptococci)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的进一步的糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包括，来自一种或多种血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的荚膜多糖或寡糖。进一步的实施方案包括来自肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖或寡糖。肺炎球菌荚膜多糖或寡糖抗原任选地选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(任选地，选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。进一步的实施方案包括，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的5型、8型或336型荚膜多糖或寡糖。进一步的实施方案包括，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的I型、II型、或III型荚膜多糖。进一步的实施方案包括来自伤寒沙门氏菌(S.typhi)的Vi糖(多糖或寡糖)。进一步的实施方案包括B群链球菌的Ia型、Ic型、II型、III型或V型荚膜多糖或寡糖。进一步的实施方案包括A群链球菌的荚膜多糖或寡糖，任选地，可进一步包括至少一种M蛋白以及任选地包括多种类型的M蛋白。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其剂量为0.1-20μg；1-10μg；2-10μg，2.5-5μg，或者约为或准确地为5μg；或者约为或准确地为2.5μg。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物例如包含Hib糖缀合物，其糖剂量为0.1-9μg，1-5μg或2-3μg，或者约为或准确地为2.5μg，并且其包含每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物，其糖剂量为2-20μg、3-10μg或4-7μg，或者约为或准确地为5μg。
就本发明而言，“约”或“大约”是指大于或小于给定数字的10％范围内。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有Hib糖缀合物的糖剂量，例如该剂量低于至少两种、三种、四种或每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的平均糖剂量的90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。例如，Hib糖的糖剂量为至少两种、三种、四种或每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物平均糖剂量的20％-60％、30％-60％、40％-60％或者约或准确地为50％。
在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物含有Hib糖缀合物的糖剂量，例如低于至少两种、三种、四种或每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的最低糖剂量的90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。例如，Hib糖的糖剂量为至少两种、三种、四种或每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物最低糖剂量的20％-60％、30％-60％、40％-60％或者约或准确地为50％。
在本发明实施方案中，至少两种、三种、四种或每一种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的每一种糖剂量，任选地为相同或大约相同。
本发明免疫原性组合物的实例，为由下列组分组成的，或者包括下列组分的组合物：
Hib缀合物和MenA缀合物和MenC缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1 、1∶4∶2、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA糖剂量大于MenC糖剂量。
Hib缀合物和MenC缀合物和MenY缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1 、 1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenC糖剂量大于MenY糖剂量。
Hib缀合物和MenC缀合物和MenW缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1 、 1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenC糖剂量大于MenW糖剂量。
Hib缀合物和MenA缀合物和MenW缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA糖剂量大于MenW糖剂量。
Hib缀合物和MenA缀合物和MenY缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶4∶2、1∶4∶1、1∶8∶4、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenA糖剂量大于MenY糖剂量。
Hib缀合物和MenW缀合物和MenY缀合物，任选地，其糖剂量比为1∶2∶2、1∶2∶1、1∶1∶2、1∶4∶2、1∶2∶4、1∶4∶1、1∶1∶4、1∶3∶6、1∶1∶3、1∶6∶3、1∶3∶3、1∶4∶4、1∶5∶5、1∶6∶6(w/w)。任选地，MenY糖剂量大于MenW糖剂量。
MenA、MenC、MenW和MenY，其糖剂量比为1∶1∶1∶1或2∶1∶1∶1或1∶2∶1∶1或2∶2∶1∶1或1∶3∶1∶1或1∶4∶1∶1(w/w)。
本发明的进一步方面，是包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受赋形剂的疫苗。
在一个实施方式中，本发明免疫原性组合物被缓冲至或者调整至pH7.0-8.0、pH7.2-7.6或者约或准确地为pH7.4。
本发明的免疫原性组合物或疫苗，任选地在稳定剂存在情况下，例如在多醇物质如蔗糖或海藻糖存在情况下，被冷冻干燥。
任选地，本发明的免疫原性组合物或疫苗包含足以增强免疫原免疫应答的一定量佐剂。合适的佐剂包括但不限于，铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁肽、皂苷衍生物、分支杆菌细胞壁制备物、单磷酸脂A、分支酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈酸衍生物、以及例如Takahashi等人(1 990)Nature 344：873-875中记载的免疫刺激缀合物(ISCOMs)。
就上述讨论的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)或HibMen组合物而言，不用任何铝盐佐剂或者不使用任何佐剂，是优选的。
就所有免疫原性组合物或疫苗而言，免疫原的免疫有效量需根据经验确定。考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其它载体缀合或共价连接、给药途径以及给予的免疫剂量。这些因素是疫苗领域已知的，免疫学技术人员无需过多实验，可熟练作出这样的决定。
活性试剂可以多种浓度存在在本发明药物组合物或疫苗中。典型地，物质的最小浓度为取得所需应用的必需量，最大浓度则为可保持于溶液或均一悬浮在初始混合物内的最大量。例如，治疗剂的最小量，任选地以单一治疗有效剂量提供。对生物活性物质而言，最小浓度为重构生物活性的必需量，最大浓度则为均一悬液不能被再维持的量。在单一剂量单位情况下，该量为单一治疗应用所需的量。通常，可以预期，各剂量包括1-100μg的蛋白抗原，任选地包括5-50μg或5-25μg。细菌糖剂量的实例为10-20μg、5-10μg、2.5-5μg或1-2.5μg。物质的优选量随物质变化而变化，本领域技术人员容易确定。
经由***或粘膜途径给药所述疫苗，本发明的疫苗制备物可用于保护或治疗易感染的哺乳动物(例如人类患者)。人类患者任选地为婴儿(12月以下)、学步儿童(12-24、12-16或12-14个月)，儿童(2-10，3-8或3-5岁)、青少年(12-25、14-21或15-19岁)或成人(超过12，15，18或21的任何年龄)。这些给药包括肌内注射、腹膜内注射、皮内注射或皮下注射；或者经由粘膜给药至口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内给予疫苗对于治疗肺炎或中耳炎是优选的(因为可更有效地预防鼻咽滑膜肺炎双球菌，由此可减轻早期感染)。虽然本发明的疫苗可单剂量给予，但是其组分也可同时或分时共同给予(例如在糖存在于疫苗中的情况下，这些组分可以同时分别给予或者在给予细菌蛋白疫苗之后1-2周给予，以最佳地协同相互之间的免疫应答)。除了单一给药途径以外，可以使用两种不同的给药途径。例如，将病毒抗原以ID(皮内)给予，将细菌蛋白以IM(肌内)或IN(鼻内)给予。在多糖存在的情况下，可以将其以IM(或D)给予，细菌蛋白则以IN(或ID)给予。此外，也可以将本发明的疫苗以IM作为引发剂量给予，以IN则作为激发剂量给予。
疫苗制备通常在Vaccine Design(″The subunit and adjuvant approach″(edsPowell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)中有记载。脂质体包埋技术在Fullerton，US Patent 4,235,877中有记载。
本发明的进一方面为伴随或顺序给药的疫苗试剂盒，其中所述试剂盒包括两种多价免疫原性组合物以保护宿主免受由百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)以及任选地，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)所致的疾病。例如，试剂盒任选地包括第一容器和第二容器，第一容器包括一种或多种下列物质：
破伤风类毒素(TT)，
白喉类毒素(DT)，和
全细胞或非细胞百日咳成分，
第二容器包括：
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以，任选地，其是被冷冻干燥的；
或者
Hib糖缀合物，和
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上，任选地，其是被冷冻干燥的。
Hib缀合物和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的制剂实例，如上文所记载。
本发明的进一方面为伴随或顺序给药的疫苗试剂盒，其中所述试剂盒包括两种多价免疫原性组合物以保护宿主免受由肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)以及任选地流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)所致的疾病。例如，试剂盒任选地包括第一容器和第二容器，第一容器包括：
一种或多种载体蛋白与肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)荚膜多糖缀合物[其中荚膜多糖任选地选自由下列组成的组的肺炎球菌血清群：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F]。
第二容器包括：
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa，任选地，其是被冷冻干燥的；
或者
Hib糖缀合物，和
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以，任选地，其是被冷冻干燥的。
Hib缀合物和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖缀合物的实例，如上文所记载。
典型地，本发明的疫苗试剂盒中的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)疫苗，包括糖抗原(任选地，进行缀合)，其中多糖来自选自由下列组成的组的至少四种肺炎球菌血清群：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。任选地，四种血清群包括6B、14、19F和23F。任选地，至少7种血清群被包括在组合物中，例如它们来自血清群4、6B、9V、14、18C、19F、和23F。任选地，多于7种血清群被包括在组合物中，例如至少10、11、12、13或14种血清群。例如，在一个实施方案中，组合物包括11种来自血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(任选地，进行缀合)。在本发明的一个实施方案中，至少包括13种多糖抗原(任选地，进行缀合)，尽管更多的多糖抗原，例如23价抗原(例如，血清群1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、 14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)，也被包括在本发明范围内。
肺炎球菌糖可分别与任何已知载体蛋白缀合，例如如上所述的CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D或任何其它载体蛋白。
任选地，本发明的疫苗试剂盒包括第三组分。例如，试剂盒任选地包括第一容器和第二容器以及第三容器，第容器包括一种或多种下列物质：
破伤风类毒素(TT)，
白喉类毒素(DT)和
全细胞或非细胞百日咳成分，
第二容器包括：
一种或多种载体蛋白与肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)荚膜多糖的缀合物[其中荚膜多糖任选地选自由下列组成的组的肺炎球菌血清群：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F]。
第三容器包括：
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上，任选地，其是被冷冻干燥的；
或者
Hib糖缀合物，和
来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种、三种或四种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上，任选地，其是被冷冻干燥的。
含脑膜炎球菌缀合物例如HibMenC、HibMenAC、HibMenAW、HibMenAY、HibMenCW、HibMenCY、HibMenWY、MenAC、MenAW、MenAY、MenCW、MenCY、MenWY或MenACWY的免疫原性组合物，包括与上述组合物相似组合物的试剂盒，任选地，都可包括来自麻疹和/或腮腺炎和/或风疹和/或水痘的抗原。例如，脑膜炎免疫原性组合物包含麻疹、腮腺炎和风疹抗原，或者包含麻疹、腮腺炎、风疹和水痘抗原。在一个实施方案中，这些病毒抗原任选地存在在脑膜炎和/或Hib糖缀合物的同一容器中。在一个实施方案中，这些病毒抗原已被冷冻干燥。
本发明的进一方面是制备本发明免疫原性组合物的方法，其包括将来自A、C、W和Y血清群中的至少一种、两种或三种、与载体蛋白缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖，与细菌糖缀合物混合的步骤，其中每一种种脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)多糖的平均大小为50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa以上。
疫苗制备通常在Vaccine Design(″The subunit and adjuvant approach″(edsPowell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press NewYork)中有记载。脂质体包埋技术在Fullerton，US Patent 4,235,877中有记载。
本发明的进一方面是免疫人类宿主以抵抗由脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)和任选地，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)感染所致的疾病的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。
本发明的进一方面是用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)和任选地，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)感染所致的疾病的本发明免疫原性组合物。
本发明的进一方面是本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒，在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)和任选地，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)感染所致疾病药物中的应用。
本文中的术语“包括”“包含”在本发明人意为，任选地分别在每实例中，可与术语“由……组成”相互替换。
本专利说明书引用的所有参考文献或专利申请，都在此被并入作为参考。
将在下列实施例中举例说明本发明。下列实施例都使用本领域技术人员公知的和常规的标准技术进行，除非另有详述。实施例是解释性的，其并不会限制本发明。
实施例
实施例1-多糖缀合物的制备
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)PRP多糖与TT的共价结合，按照Chu等人(Infection and Immunity 1983，40(1)；245-256)发展的偶联化学进行。通过加入CNBr，pH 10.5温育6分钟，将HibPRP多糖活化。将pH降低至pH8.75，加入脂肪酸酰肼(ADH)，再继续温育90分钟。将活化的PRP用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)经由碳化二亚胺浓缩法，与纯化的破伤风类毒素偶联。将EDAC加入至活化的PRP，直至达到终比例0.6mgEDAC/mg活化PRP。调整pH至5.0，加入纯化的破伤风类毒素至2mg TT/mg活化PRP。将所得溶液放置三天，温和搅拌。通过0.45μm滤膜过滤后，将缀合物在用0.2M NaCl平衡的sephacryl S500HR柱子(Pharmacia，Sweden)上纯化。
用天然多糖(MALLS测量150kDa以上)制备MenC-TT缀合物。用天然多糖或实施例2MALLS方法所测60kDa以上的轻微微流化的多糖制备MenA-TT缀合物。用MALLS测量的约100-200kDa大小的大小经过调整的多糖制备(参见实施例2)MenW和MenY-TT缀合物。使用Emulsiflex C-50均化器装置通过微流化来调整大小。然后，将多糖穿过0.2μm滤膜过滤。
活化和偶联按WO96/29094和WO 00/56360记载的方法进行。简而言之，将2MNaCl pH5.5-6.0中的10-20mg/ml浓度的多糖与CDAP溶液(100mg/ml，在乙氰/WFI，50/50溶剂中新鲜制备)混合，直至CDAP/多糖最终比例达到0.75/1或1.5/1。1.5分钟后，用氢氧化钠升高pH至pH10.0。三分钟后，加入破伤风类毒素直至蛋白/多糖比例为1.5/1(对MenW而言)、1.2/1(对MenY而言)、1.5/1(对MenA而言)、1.5/1(对MenC而言)。反应继续进行1-2小时。
在偶联步骤之后，加入甘氨酸直至最终比例甘氨酸/PS(w/w)7.5/1并调整pH至pH9.0。将混合物静置30分钟。用10μm Kleenpak过滤器将缀合物澄清，然后用150mM NaCl，10mM或5mM Tris pH7.5洗脱缓冲液，将其上载至Sephacryl S400HR柱子。将临床分装缀合物用Opticap 4滤膜过滤。所得缀合物的平均多糖：蛋白比例为1∶1-1∶5(w/w)。
为了将MenA荚膜多糖与破伤风类毒素通过间隔臂缀合，可使用下列方法。多糖与间隔臂(ADH)共价结合，可在氰化剂1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)在控制的条件下活化多糖，用偶联化学进行。将间隔臂通过肼基与氰基化的PS反应，由此在间隔臂与多糖之间形成稳定的异脲连接。
将10mg/ml MenA溶液用新鲜制备的100mg/ml CDAP乙氰/水(50/50(v/v))溶液处理，以获得CDAP/MenA比例为0.75(w/w)。在1.5分钟后，将pH升高至pH10.0。在三分钟后，加入ADH，获得ADH/MenA比例为8.9。将溶液pH降低至8.75，进行反应2小时。
在缀合反应前，将纯化的TT溶液和PSAAH溶液稀释至10mg/ml的PSAAH浓度和10mg/ml的TT浓度。
将EDAC加入至PSAAH溶液中，直至获得最终比例0.9mg EDAC/mgPSAAH。将pH调整至5.0。用蠕动泵加入纯化的破伤风类毒素(在60分钟内)，直至获得2mg TT/mg PSAAH。将所得溶液在+25℃在搅拌条件下放置60min，直至达到120min的最终偶联时间。将缀合物用10μm滤膜澄清，再用SephacrylS400HR柱子纯化。
实施例2-用MALLS测定分子量
将检测器与洗脱样品的HPLC大小排阻柱偶联。一方面，将激光散射检测器用于在16个角度下测量大分子溶液的散射光强度，另一方面，在线放置的干涉仪折射计允许测量洗脱样品的数量。从这些强度，可以测量溶液中大分子的大小和形状。
重量平均分子量(Mw)是指，所有物种的重量乘以它们各自分子量的总和再除以所有物质的重量总和。
a)重量平均分子量：-Mw-
Mw＝∑Wi.Mi/∑Wi＝m2/m1
b)数量平均分子量：-Mn-
Mn＝∑Ni.Mi/∑Ni＝mi/m0
c)均方根半径：-Rw-，其中R2w为平方半径，定义为：
R2w或(r2)w＝∑mi.ri 2/∑mi
(-mi-为分布中心i的质量，-ri-为分布中心i与大分子重心之间的距离)
d)多分散性被定义为-Mw/Mn-的比例。
通过上载至两个联用的HPLC柱子(TSKG6000和5000PWxI)，通过MALLS分析脑膜炎球菌多糖。将25μl多糖上载至柱子，用0.75ml过滤水洗脱。用光散色检测器(装备10mW488nm氩激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉仪折射计(装备P100光电元件和498nm红光过滤的Wyatt Otilab DSP)检测多糖。
通过德拜方法用Astra4.72软件1次多项式拟合对所有样品的分子量多分散性和回收率进行计算。
实施例3-采用Meningitec或较大尺寸的Men C-TT缀合物的临床实验比较免疫
进行II期开放对照研究，以将GSK Biologicals公司的脑膜炎球菌血清群C缀合疫苗(MenC)与GSK Biologicals公司的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b-脑膜炎球菌血清群C缀合物疫苗(Hib-MenC)或Meningitec
进行比较。每剂量Meningitec
含有与15μg CRM197缀合的10μg脑膜炎球菌血清群C寡糖，其由Wyeth公司制备。GSK Men C缀合物含有与破伤风类毒素(TT)缀合的约200kDa的天然多糖。
研究包括五组，每组计划含100个对象，分成如下两平行类：
在本研究中，所有两类对象都在12-15个月时(研究月为0)，接受1/5剂量的MencevaxTM ACWY和伴随剂量的InfanrixTM hexa。从所有对象收集两种血液样品(研究月为0和研究月为1)。第1类由进行初免研究的四组组成，它们在3、4和5个月用下列疫苗对它们进行引发：
●组K：未吸附至铝盐(未添加佐剂)的MenC(10μg)-破伤风类毒素(TT)缀合物和InfanrixTM hexa(MenC10-TT+InfanrixTM hexa)
●组L：Hib(10μg)-MenC(10μg)的未添加佐剂TT缀合物和InfanrixTMpenta(Hib10-MenC10-TT+InfanrixTM penta)
●组M：Hib(5μg)-MenC(5μg的未添加佐剂TT缀合物和InfanrixTMpenta(Hib5-MenC5-TT+InfanrixTM penta)
● 组N：MeningitecTM和InfanrixTM hexa(MeningitecTM+InfanrixTM hexa)
两Hib-MenC-TT疫苗组(组L和M)在确切候选疫苗制剂激发研究中，保持双盲。
第2类(组O)由以前未接种脑膜炎血清群C疫苗(未进行过免疫)但接受过德国免疫常任委员会规定的常规儿科疫苗的适龄对象组成。
评价标准
免疫原性：在免疫前和免疫后大约1月获得的所有对象的血样中，通过杀菌实验测定抗脑膜炎球菌C的杀菌性抗体(SBA-MenC)的滴度(截止值：1∶8稀释度)，通过ELISA测量抗脑膜炎球菌血清群C抗体(分析截止值：0.3μg/ml)、抗Hib多糖PRP抗体(分析截止值：0.15μg/ml)以及抗破伤风类毒素抗体(分析截止值：0.1IU/ml)。
统计方法：
人口统计学：测定ATP免疫人群和全免疫人群的平均月龄(中值、范围和标准偏差[SD])、种族及性别组成。
免疫原性：
基于ATP免疫原性人群(用于分析免疫记忆和加强应答)或ATP安全人群(用于分析持久性)，进行两种免疫原性分析。这些包括：
测量对MenC的免疫应答和对Hib和破伤风的加强应答(在给予1/5剂量常规多糖疫苗之前和一个月后)：
●在95％置信区间内(95％CI)，确定几何平均滴度和浓度(GMTs和GMCs)。
●在95％CI内，确定具有在建议的截止值以上的抗体滴度/浓度的个体百分数(血清阳性/血清保护率)
●使用反向累积曲线研究免疫后抗体的滴度/浓度
●对引发组(组K、L、M和N)和未引发组(组O)之间的血清阳性/血清保护率之间的差异，计算标准渐近95％CI
●在95％CI内，测定SBA-MenC滴度超过抗-PSC浓度的个体比率的几何平均值
●用ANOVA模型对免疫后GMT/C比率进行95％CI测量，对抗PRP和抗破伤风而言，在组K、L、M和对照组N之间测量，对SBA-MenC和抗-PSC而言，在各引发组(组K、L、M和N)和未引发组(组O)之间测量。
结果
表1加强免疫后SBA-MenC滴度和抗-PSC抗体浓度
| 抗体 | 组 | N | GMT/C | 95％CILL | 95％CIUL |
| SBA-MenC | K-MenC-TTL-HibMenCM-HibMenCN-MeningitecO-对照 | 7179818591 | 3508.92530.15385.41552.69.3 | 2580.11831.74425.01044.46.3 | 4772.23494.76554.22307.913.6 |
| 抗-PSC | K-MenC-TTL-HibMenCM-HibMenCN-MeningitecO-对照 | 7071767894 | 28.1030.0134.5816.593.05 | 22.5924.0929.1012.982.36 | 34.9537.3841.0921.213.93 |
组K：用MenC10-TT+Infanrix.hexa引发的对象；组L：用Hib10-MenC10-TT+Infanrix.penta引发的对象；组M：用Hib5-MenC5-TT+Infanrix.penta引发的对象；组N：用Meningitec.+Infanrix.hexa引发的对象；组O：对照对象(即未用MenC缀合疫苗引发的对象)；N：可获得结果的对象数量
与Menngitec寡糖缀合疫苗相比，用较大MenC多糖缀合疫苗(组K，L和M)引发，可产生更高抗MenC的抗体滴度和更高的SBA滴度。
表2：SBA MenC滴度/抗-PSC浓度的几何平均比率
| 组 | 时间 | N | GMR | LL | UL |
| K | 免疫前免疫后 | 7066 | 49.470126.138 | 34.939101.419 | 70.044156.882 |
| L | 免疫前免疫后 | 7670 | 36.52890.200 | 25.84970.153 | 51.621115.975 |
| M | 免疫前免疫后 | 7774 | 51.298164.950 | 36.478139.304 | 72.139195.318 |
| N | 免疫前免疫后 | 8476 | 22.57190.168 | 16.52167.757 | 30.837119.991 |
| O | 免疫前免疫后 | 387 | 91.6342.708 | 0.6511.767 | 12889 84.149 |
在所有四组引发组中(组K、L、M和N)，GMR从加强免疫前至加强免疫后显著增加，表明存在抗体的成熟和功能化。组M(用Hib5-MenC5-TT引发)比组N(用MeningitecTM引发)的GMR要高。
表3：刚好在给予加强疫苗前12-15个月龄时的持久性
| 终点 | 组 | N | ％ | 组 | N | ％ | 差异 | 值％ |
| SBAMenC≥1∶8 | KLM | 798485 | 88.693.387.1 | NNN | 919191 | 80.280.280.2 | N-KN-LN-M | -8.4-3.1-6.8 |
| SBAMenC≥1∶128 | KLM | 798485 | 65.856.064.7 | NNN | 919191 | 51.651.651.6 | N-KN-LN-M | -14.2-4.3-13.1 |
| 抗-PSC≥0.3μg/ml | KLM | 798488 | 100.0100.098.9 | NNN | 919191 | 100.0100.0100.0 | N-KN-LN-M | 0.00.01.1 |
| 抗-PSC≥2μg/ml | KLM | 798488 | 72.264.364.3 | NNN | 919191 | 81.381.381.3 | N-KN-LN-M | 9.217.08.6 |
| 抗-PRP≥0.15μg/ml | KLM | 818690 | 88.996.598.9 | NNN | 919191 | 85.785.785.7 | N-KN-LN-M | -3.2-10.8-13.2 |
| 抗-PRP≥1μg/ml | KLM | 818690 | 33.355.874.4 | NNN | 919191 | 28.628.628.6 | N-KN-LN-M | -4.8-27.2-45.9 |
| 抗破伤风≥0.1IU/ml | KLM | 818690 | 100.0100.0100.0 | NNN | 919191 | 96.796.796.7 | N-KN-LN-M | -3.3-3.3-3.3 |
组K：用MenC10-TT+Infanrix.hexa引发的对象；组L：用Hib10-MenC10-TT+Infanrix.penta引发的对象；组M：用Hib5-MenC5-TT+Infanrix.penta引发的对象；组N：用Meningtec.+Infanrix.hexa引发的对象；N：可获得结果的对象数量。
与用MenC-寡糖缀合物Menmgitec引发相比，用较大MenC引发(组K、L和M)，可取得更高的抗MenC SBA滴度。
免疫记忆(ATP免疫原性群)
给予1/5剂量的普通多糖ACWY疫苗，在所有四组引发组中都产生了非常高的SBA-MenC滴度，其中用候选疫苗体系引发的98.7％-100％的对象和97.5％-100％的对象，分别显示出滴度≥1∶8和≥1∶128。在用MeningitecTM体系的引发组中，倾向于较低比例对象显示有滴度≥1∶128(91.8％)。相比较而言，17.6％的未引发对象，显示有SBA-MenC滴度≥1∶8和≥1∶128。
实施例4与DTPw-HeDB混合的HibMenAC-TT缀合疫苗II期临床实验
研究设计：五个组的开放的随机的(1∶1∶1∶1∶1)单中心研究。使这五组在6、10和14周龄时，分别接受下列免疫方案。
●Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 2.5μg/2.5μg/2.5μg：以下称为2.5/2.5/2.5
● Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 2.5μg/5μg/5μg：以下称为2.5/5/5
● Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC5μg/5μg/5μg：以下称为5/5/5
●Tritanrix.-HepB+Hiberix.：以下称为Hiberix
●Tritanrix.-HepB/Hiberix.+Menmgitec：以下称为Meningitec
血液样品取自第一次免疫剂量时间(Pre)和第三次免疫剂量后一个月(剂量3后)。
Tritanrix是GlaxoSmithKlme Biologicals S.A公司的商业DTPw疫苗。
在五组中的每一组使用105个对象，在该研究中总共使用525个对象。
表4GSK疫苗制剂的内容
| 每个剂量的成分(0.5ml) | 2.5/2.5/2.5* | 2.5/5/5 | 5/5/5 |
| 与破伤风类毒素(TT)缀合的Hib荚膜多糖PRP | 2.5μg | 2.5μg | 5μg |
| 与TT缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)A荚膜多糖(PSA) | 2.5μg | 5μg | 5μg |
| 与TT缀合的脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)C荚膜多糖(PSC) | 2.5μg | 5μg | 5μg |
*2.5/2.5/2.5疫苗为GSK Biologicals的Hib-MenAC5/5/5疫苗的剂量稀释物，其含有2.5μg每种PRP-TT、MenA-TT和MenC-TT。
将Hib-MenAC疫苗制剂与Tritanirix-HepB即时混合。GSK Biologicals公司的联合白喉-破伤风-全细胞博德百日咳-乙肝(DTPw-HB)疫苗(Tritanrix-HepB)，含有不少于30国际单位(IU)的白喉类毒素、不少于60IU的破伤风类毒素、不少于4IU的灭活博德氏百日咳以及10μg重组乙肝表面抗原。
参照治疗、剂量、给药方式、批号：
兔疫方案/位置：一组在6、10和14周龄，在左大腿肌内接受Thtanrix-HepB疫苗并在右大腿肌内接受HiberixTM。另一组在6、10和14周龄，在左大腿肌内接受TritanrixTM-HepB/HiberixTM疫苗并在右大腿肌内接受Meningitec疫苗。
疫苗/组成/剂量/批号：使用的TntanrixTM-HepB疫苗，如上所述。
1剂量(0.5ml)GSK Biologicals的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus infiuenzae)缀合疫苗：HiberixTM含有10μg与破伤风类毒素缀合的PRP。在HiberixTM组中，将其与无菌稀释液混合，在MeningitecTM组中，将其与TritanrixTM-HepB混合。
1剂量(0.5ml)Wyeth Lederle的MENINGITECTM疫苗含有：与15μg白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)CRM197蛋白缀合的10μg C群脑膜炎球菌荚膜寡糖和铝盐。
结果-产生抗Hib.MenA和MenC的免疫应答
表5a抗-PRP(ug/ml)
| 组 | 25/25/25 | 25/5/5 | 5/5/5 | HiberixTM | MeningitecTM | ||||||||||
| ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ||||||
| CMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | |
| ％≥0.15 | 100 | 96.5 | 100 | 99.0 | 94.8 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 100 | 96.5 | 100 |
| GMC | 20.80 | 15.96 | 27.10 | 22.62 | 17.72 | 28.88 | 19.36 | 15.33 | 24.46 | 38.55 | 29.93 | 49.64 | 10.94 | 8.62 | 13.88 |
表5b SBA-MenC
| 组 | 25/25/25 | 25/5/5 | 5/5/5 | HiberixTM | MeningitecTM | ||||||||||
| ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ||||||
| GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UI | GMC/T | LL | UL | |
| ％≥1∶8 | 99 | 94.7 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 29 | 0.6 | 8.4 | 100 | 96.5 | 100 |
| GMT | 3132 | 2497 | 3930 | 4206 | 3409 | 5189 | 3697 | 3118 | 4384 | 4.7 | 3.9 | 5.6 | 4501 | 3904 | 5180 |
表5cSBAMenA
| 组 | 25/25/25 | 25/5/5 | 5/5/5 | HiberixTM | MeningtecTM | ||||||||||
| ％ | 95％CL | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％I | ％ | 95％CL | ||||||
| GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC /T | LL | UI | GMC/T | LL | LL | GMC/T | LL | UL | |
| ％≥1∶8 | 99.7 | 91.9 | 99.7 | 100 | 95.8 | 100 | 100 | 96.2 | 100 | 6.8 | 2.5 | 14.3 | 9.1 | 4.0 | 17.1 |
| GMT | 316.7 | 251.4 | 398.9 | 418.5 | 358.6 | 488.5 | 363 | 310.5 | 424.4 | 5.6 | 4.3 | 7.4 | 5.6 | 4.4 | 7.2 |
表5d抗-PSC(ug/ml)
| 组 | 25/25/25 | 25/5/5 | 5/5/5 | HibeixTM | MeningitecTM | ||||||||||
| ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ||||||
| GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | |
| ％≥0.3 | 100 | 96.5 | 100 | 100 | ％4 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 8.2 | 3.6 | 15.6 | 100 | 96.5 | 100 |
| GMC | 49.03 | 43.24 | 55.59 | 71.11 | 62.49 | 80.92 | 61.62 | 54.88 | 69.20 | 0.17 | 0.15 | 0.19 | 58.02 | 51.42 | 65.46 |
表5e抗-PSA(ug/ml)
| 组 | 25/25/25 | 25/5/5 | 5/5/5 | MeningtecTM | MeningitecTM | ||||||||||
| ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ％ | 95％CI | ||||||
| GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | GMC/T | LL | UL | |
| ％≥0.3 | 100 | 96.4 | 100 | 100 | 96.5 | 100 | 99.0 | 94.8 | 100 | 1.0 | 0.0 | 5.4 | 5.9 | 22 | 125 |
| GMC | 18.10 | 15.34 | 21.35 | 26.51 | 22.93 | 30.79 | 23.40 | 20.05 | 27.30 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.17 | 0.15 | 0.18 |
结论
用寡糖MenC-CRM197缀合物疫苗和三种含多糖的MenA-TT和MenC-TT缀合物GSK制剂，取得的免疫原性结果比较显示，多糖Men缀合物能产生与寡糖缀合物疫苗Meningitec相似的良好免疫原性应答。所有测试制剂在100％患者中对MenC应答。
实施例5-按2、3和4月方案给予Hib MenCY并伴随给予Infanrix penta的II期临床实验
研究设计：II期，开放的(部分双盲*)，随机的控制的多中心研究，其包括5组接受了如下疫苗的三剂量初免方案
组Hib-MenCY 2.5/5/5：Hib-MenCY (2.5/5/5)+InfanrixTM penta
组Hib-MenCY 5/10/10：Hib-MenCY(5/10/10)+InfanrixTM penta
组Hib-MenCY 5/5/5：Hib-MenCY (5/5/5)+InfanrixTM penta
组Hib-MenC：Hib-MenC(5/5)+InfanrixTM penta
组Menjugate：MenjugateTM**+InfanrixTM hexa(对照)。
*Hib-MenCY2.5/5/5、Hib-MenCY5/10/10和Hib-MenC以双盲方式给予，Hib-MenCY5/5/5组和Menjugate组则是开放的。2.5/5/5、5/10/10和5/5/5Hib-MenCY制剂，含有的是MenC天然多糖和微流化MenY多糖。
**MenjugateTM每剂量含有与12.5-25μg CRM197缀合的10μg MenC寡糖，其由Chiron公司生产。
在+/-2、3、4月免疫(研究月0、月1和月2)，血液样品(3.5ml)取自初免之前和初免后一个月的所有个体(研究月0和月3)。
研究疫苗、剂量、给药方式、批号：将三剂量以一月间隔，在约2、3、4月，肌内注射如下：
表6：疫苗给予(研究和对照)、组、方案/位置以及剂量
| 组 | 方案(月时间) | 给予的疫苗剂量位置：左上大腿 | 给予的伴随疫苗位置：右上大腿 |
| Hib-MenCY2.5/5/5 | 2、3和4 | Hib(25μg)-MenC-TT(5μg)-MenY-TT(5μg) | DTPa-HBV-IPV(InfanrixTM penta) |
| Hib-MenCY5/10/10 | 2、3和4 | Hib(5μg)-MenC-TT(10μg)-MenY-TT(10μg) | DTPa-HBV-IPV(InfanrixTM penta) |
| Hib-MenCY5/5/5 | 2、3和4 | Hib(5μg)-MenC-TT(5μg)-MenY-TT(5μg) | DTPa-HBV-IPV(InfanrixTM penta) |
| Hib-MenC | 2、3和4 | Hib(5μg)-MenC(5μg) | DTPa-HBV-IPV(InfanrixTMPenta) |
| MenjugateTM | 2、3和4 | MenjugateTM | DTPa-HBV-IPV/Hib(InfanixTM hexa) |
免疫原性：测量抗每种疫苗抗原的抗体滴度/浓度：
在第一次剂量前(月0)和在第三次剂量约1个月后(月3)，针对所有对象对SBA-MenC和SBA-MenY、抗-SC和抗-PSY、抗-PRP、抗-T、抗-FHA、抗-PRN以及抗-PT进行检测。使用抗脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群C和Y的血清杀菌活性(SBA-MenC和SBA-MenY截止值：1∶8和1∶128)，进行检测；ELISA分析截止值：对抗-脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群C和Y多糖而言(抗-PSC IgG和抗-PSY IgG)，≥0.3μg/ml和≥2μg/ml；对Hib多糖聚核糖-核糖醇-磷酸而言(抗-PRP IgG)，≥0.15μg/ml和≥1.0μg/ml；对抗-FHA、抗-PRN、抗-PT而言，5EL.U/ml；对抗-破伤风类毒素而言(抗-TT)，≥0.1IU/ml。在第三次剂量恰好一个月后(月3)，在所有对象中对抗-D、抗-HBs以及抗-灰质炎1、2和3进行检测。使用下列截止值ELISA分析：对抗-白喉(抗-D)而言，0.1IU/ml；对抗乙肝(抗-HBs)而言，≥10mIU/ml；微量中和实验截止值：对抗-灰质炎1、2和3型(抗-灰质炎1、2和3)而言，1∶8。
统计方法：
在95％置信区间(95％CI)，对每组对血清保护/血清阳性率和几何平均浓度/滴度(GMCs/GMTs)进行计算，对SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY、抗-PRP、抗-破伤风、抗-PT、抗-FHA和抗-PRN而言，在免疫前和免疫后一个月进行计算；对抗-白喉、抗-HBs、抗-灰质炎1、抗-灰质炎2和抗-灰质炎3而言，在免疫后一个月进行计算。对抗-PT、抗-PRN和抗-FHA在95％CI的疫苗应答(初始血清阴性个体具有抗体出现，或者初始血清阳性个体抗体浓度至少被维持)，也在免疫一个月后进行计算。也提供每抗体在月3时的反向累积曲线。根据(1)在标准渐近95％CI内，超过特定截止值或具有疫苗应答个体百分数，MenjugateTM组(减去)Hib-MenCY和Hib-MenC组之差，(2)在95％CI内，MenjugateTM组与Hib-MenCY和Hib-MenC组的GMC或GMT之比，对除SBA-MenY和抗-PSY之外的每种抗体以探索性方式，评估Hib-MenCY和Hib-MenC组与MenjugateTM对照组之间的差异。进行相同比较，评估每对Hib-MenCY制剂，在抗-PRP、SBA-MenC、抗-PSC、SBA-MenY、抗-PSY和抗-TT抗体之间的差异。
血清保护/血清阳性率&GMC/Ts(ATP免疫原性群)
表7a抗-PRP(μg/ml)
| 组 | N | ％≥0.15 | LL | UL | ≥1 | LL | UL | GMC | LL | UL |
| HibMenCY2.5/5/5 | 67 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 98.5 | 92.0 | 100.0 | 9.01 | 7.25 | 11.21 |
| HibMenCY5/10/10 | 67 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 98.5 | 92.0 | 100.0 | 9.49 | 7.72 | 11.65 |
| HibMenCY5/5/5 | 70 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 98.6 | 92.3 | 100.0 | 8.08 | 6.53 | 9.98 |
| HibMebC | 74 | 100.0 | 95.1 | 100.0 | 98.6 | 92.7 | 100.0 | 10.44 | 8.49 | 12.83 |
| MenjugateTM | 71 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 80.3 | 69.1 | 88.8 | 2.60 | 1.97 | 3.43 |
表7b SBA-MenC(滴度)
| 组 | N | ％≥0.8 | LL | UL | ≥1∶128 | LL | UL | GMT | LL | UL |
| Hib MenCY2.5/5/5 | 70 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 95.7 | 88.0 | 99.1 | 1005.8 | 773.5 | 1308.0 |
| Hib MenCY5/10/10 | 67 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 94.0 | 85.4 | 98.3 | 1029.8 | 799.7 | 1326.0 |
| Hib MenCY5/5/5 | 71 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 94.4 | 86.2 | 98.4 | 906.9 | 691.3 | 1189.8 |
| Hib MenC | 74 | 100.0 | 95.1 | 100.0 | 95.9 | 88.6 | 99.2 | 871.0 | 677.3 | 1120.0 |
| MenjugateTM | 71 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 3557.6 | 2978.8 | 4248.8 |
表7c抗-PSC(μg/ml)
| 组 | N | ％≥0.3 | LL | UL | ≥2 | LL | UL | GMC | LL | UL |
| HibMenCY2.5/5/5 | 69 | 100.0 | 94.8 | 100.0 | 100.0 | 94.8 | 100.0 | 21.70 | 18.36 | 25.65 |
| HibMenCY5/10/10 | 66 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 27.26 | 23.26 | 31.95 |
| HbMenCY5/5/5 | 70 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 19.02 | 16.49 | 21.93 |
| HibMenC | 74 | 100.0 | 95.1 | 100.0 | 100.0 | 95.1 | 100.0 | 21.08 | 18.24 | 24.35 |
| MenjugateTM | 71 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 38.49 | 33.64 | 44.05 |
表7d SBA-MenY(滴度)
| 组 | N | ％≥1∶8 | LL | UL | ≥1∶128 | LL | UL | GMT | LL | UL |
| HibMenCY2.5/5/5 | 69 | 97.1 | 89.9 | 99.6 | 92.8 | 83.9 | 976 | 470.7 | 351.1 | 631.2 |
| HibMenCY5/10/10 | 66 | 97.0 | 89.5 | 99.6 | 86.4 | 75.7 | 93.6 | 437.1 | 322.0 | 593.4.8 |
| HibMenCY5/5/5 | 71 | 98.6 | 92.4 | 100.0 | 95.8 | 88.1 | 99.1 | 635.3 | 501.5 | 804.8 |
| HibMenC | 74 | 21.6 | 12.9 | 32.7 | 13.5 | 6.7 | 23.5 | 9.3 | 6.3 | 13.7 |
| MenjugateTM | 71 | 19.7 | 11.2 | 30.9 | 9.9 | 4.1 | 19.3 | 7.5 | 5.4 | 10.4 |
表7e抗-PSY(μg/ml)
| 组 | N | ％≥0.3 | LL | UL | ≥2 | LL | UL | GMC | LL | UL |
| HibMenCY2.5/5/5 | 69 | 100.0 | 94.8 | 100.0 | 100.0 | 94.8 | 100.0 | 26.86 | 22.86 | 31.56 |
| HibMenCY5/10/10 | 66 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 37.02 | 31.84 | 43.04 |
| HibMenCY5/5/5 | 70 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 23.57 | 19.94 | 27.86 |
| HibMenC | 74 | 8.1 | 3.0 | 16.8 | 4.1 | 0.8 | 11.4 | 0.19 | 0.15 | 0.25 |
| MenjugateTM | 71 | 5.6 | 1.6 | 13.8 | 1.4 | 0.0 | 7.6 | 0.17 | 0.15 | 0.19 |
表7f抗-破伤风(IU/ml)
| 组 | N | ％≥0.1 | LL | UL | GMC | LL | UL |
| HibMenCY2.5/5/5 | 68 | 100.0 | 94.7 | 100.0 | 3.06 | 2.63 | 3.55 |
| HibMenCY5/10/10 | 67 | 100.0 | 94.6 | 100.0 | 3.25 | 2.88 | 3.68 |
| HibMenCY5/5/5 | 70 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 2.97 | 2.59 | 3.41 |
| HibMenC | 74 | 100.0 | 95.1 | 100.0 | 3.15 | 2.73 | 3.64 |
| MenjugateTM | 71 | 100.0 | 94.9 | 100.0 | 1.66 | 1.39 | 1.97 |
组Hib-MenCY 2.5/5/5：Hib-MenCY(2.5/5/5)+InfanrixTMpenta
组Hib-MenCY 5/10/10：Hib-MenCY(5/10/10)+InfanrixTMpenta
组Hib-MenCY 5/5/5：Hib-MenCY(5/5/5)+lnfanrixTM penta
组Hib-MenC：Hib-Men(5/5)+InfanrixTM hexa
组Menjugate：MenjugateTM+InfanrixTM penta
N＝可获得结果的个体数量；％＝特定范围浓度/滴度的个体百分数
GMC/T：几何平均浓度/滴度；95％CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限
结论
MenC和Y多糖缀合物在所有个体中都产生了良好免疫应答，其中100％个体产生了对MenC和MenY超过0.3μg/ml的应答。
实施例6-三种MenACWY-TT制剂与Meningitec MenC-CRM197寡糖缀
合物疫苗的II期临床比较实验
本实施例报告了II期，开放的(部分双盲)、随机的、控制剂量范围的研究，评估以单剂量给予12-14月儿童时，三种不同GlaxoSmithKlne BIological公司的脑膜炎球菌血清群A、C、W-135、Y破伤风类毒素缀合物(MenACWY-TT)疫苗制剂，与MenC寡糖-CRM197缀合物疫苗制剂(Meningitec)的比较免疫原性。
临床实验是开放的(部分双盲*)、控制的、多中心研究，其中符合条件的12-14个月的对象被随机(1∶1∶1∶1)分到50个对象的四个平行组之一中，在第1次访问时间接受单初免剂量如下：
制剂1T：含有2.5μg缀合破伤风类毒素(TT)的MenA多糖、2.5μg缀合TT的MenC多糖、2.5μg缀合TT的MenW多糖以及2.5μg缀合TT的MenY多糖剂量的MenACWY-TT
制剂2T：含有5μg缀合TT的MenA多糖、5μg缀合TT的MenC多糖、5μg缀合TT的MenW多糖、以及5μg缀合TT的MenY多糖剂量的MenACWY-TT
制剂3T：含有2.5μg缀合TT的MenA多糖、10μg缀合TT的MenC多糖、2.5μg缀合TT的MenW多糖以及2.5μg缀合TT的MenY多糖剂量的MenACWY-TT
对照T：与12.5-25μg CRM197缀合的10μg MenC寡糖(MeningitecTM).
*三种不同MenACWY-TT制剂以双盲形式给予。
接种方案位按随机指定在第1次访问时间(研究月0)在左三角肌、肌内给予单疫苗。所有候选疫苗以冻干的小球以单剂量瓶提供(用补充性盐稀释液重构后为0.5ml)。
免疫原性：在所有对象中在研究疫苗剂量前(月0)和研究疫苗剂量后约1月(月1)所获血样中，测量抗脑膜炎球菌疫苗抗原成分的抗体滴度/浓度。通过杀菌实验(分析截止值：1∶8和1∶128稀释度)测量抗脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群A、C、W-135和Y的杀菌性抗体滴度(SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW和SBA-MenY)，ELISA测量抗脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群A、C、W-135和Y的抗体(抗-PSA、抗-PSC、抗-PSW和抗-PSY，分析截止值≥0.3μg/ml和≥2μg/ml)，以及抗破伤风类毒素的抗体(抗-破伤风分析截止值0.1IU/ml)。
结果
接种一个月(初免终点)，以SBA-MenA、SBA-MenC、SBA-MenW和SBA-MenY应答者百分数统计的抗体应答被显示在表8中。应答，对血清阳性对象，被定义为大于或等于4-倍增加；对接种前血清阴性个体，被定义为血清转变。
表8：接种一个月后，SBA抗体免疫应答
| 抗体 | 组 | N | ％ | LL | UL |
| SBA-MenA | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 42394036 | 61.982.162.511.1 | 45.666.545.83.1 | 76.492.577.326.1 |
| SBA-MenC | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 46434449 | 97.8100.095.591.8 | 88.591.884.580.4 | 99.9100.099.497.7 |
| SBA-MenW | 制剂1T制剂2T | 4543 | 100.097.7 | 92.187.7 | 100.099.9 |
| 制剂3TMeningitecTM | 4546 | 100.015.2 | 92.16.3 | 100.028.9 | |
| SBA-MenY | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47444549 | 97.988.693.34.1 | 88.775.481.70.5 | 99.996.298.614.0 |
表9显示了SBA滴度超过截止值1∶8和1∶128的对象数量和GMTs值。
表9：接种一个月后SBA抗体的血清阳性率和GMTs
| 抗体 | 组 | N | ％ | ≥1∶8LL | UL | ％ | ≥1∶128LL | UL | GMT |
| SBA-MenA | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 46454841 | 10010097.951.2 | 92.392.188.935.1 | 10010099.967.1 | 10097.897.943.9 | 92.388.288.928.5 | 10099.999.960.3 | 1457.31776.91339.542.8 |
| SBA-MenC | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454750 | 97.910095.794.0 | 88.792.185.583.5 | 99.910099.598.7 | 78.784.485.162.0 | 64.370.571.747.2 | 89.393.593.875.3 | 281.3428.6478.4200.1 |
| SBA-MenW | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454848 | 10010010027.1 | 92.592.192.615.3 | 10010010041.8 | 10010097.96.3 | 92.592.188.91.3 | 10010099.917.2 | 2529.12501.62300.29.4 |
| SBA-MenY | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454849 | 10010010049.0 | 92.592.192.634.4 | 10010010063.7 | 10010097.928.6 | 92.592.188.916.6 | 10010099.943.3 | 1987.42464.82033.725.0 |
采用所有三种ACWY-TT多糖缀合物制剂免疫可产生对MenA、MenC、MenW和MenY的良好SBA应答，其中95-100％的对象滴度大于1∶8。特别地，5/5/5/5和2.5/10/2.5/2.5多糖缀合物制剂与寡糖Meningitec疫苗相比，可产生更高的MenC应答，这一点可由具有滴度大于1∶128的更高比例对象和GMT读数看出。
表10接种1个月后，抗多糖抗体的血清阳性率和GMCs
| 组 | N | ％ | ≥0.3μg/mlLL | UL | ％ | ≥2μg/mlLL | UL | GMCμg/ml | |
| 抗-MenA | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454850 | 93.610095.810.0 | 82.592.185.73.3 | 98.710099.521.8 | 68.164.437.52.0 | 52.948.824.00.1 | 80.978.152.610.6 | 2.353.111.650.18 |
| 抗-MenC | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454749 | 10010010098.0 | 92.592.192.589.1 | 10010010099.9 | 10010097.993.9 | 92.592.188.783.1 | 10010099.998.7 | 9.5712.5319.297.95 |
| 抗-MenW | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454850 | 10010093.80.0 | 92.592.182.80.0 | 10010098.77.1 | 80.993.372.90.0 | 66.781.758.20.0 | 90.998.684.77.1 | 4.566.832.880.15 |
| 抗-MenY | 制剂1T制剂2T制剂3TMeningitecTM | 47454750 | 10010097.92.0 | 92.592.188.70.1 | 10010099.910.6 | 97.910087.20.0 | 88.792.174.30.0 | 99.910095.27.1 | 8.9012.785.670.15 |
所有三种ACWY-TT多糖缀合物疫苗制剂都可产生对MenA、MenC、MenW和MenY的良好免疫应答，其中93％-100％的个体具有滴度大于0.3μg/ml。与MeningiteCTM相比，5/5/5/5和2.5/10/2.5/2.5ACWY-TT多糖缀合物疫苗制剂可取得更高的GMC读数。
实施例7-天然的和调整大小的MenY多糖缀合物的免疫原性比较
将小鼠(6-8周的雌性DBA/2小鼠)通过皮下途径接受两次间隔2周的PSY-TT注射。在第二次注射14天后采集血样，用S1975menY株进行抗-PSYELISA和SBA。每次注射，让小鼠接受1μgPSY-TT(冻干未添加佐剂制剂)。
使用表11记载的缀合物。
表11
| 缀合物 | ENYTT012 | ENYTT014 | ENYTT015bis |
| PSY微流化 | 否 | 是(40循环 | 是(20循环 |
| TT/PS比例 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |
结果
结果(图1)显示，采用调整大小的PSY制备的缀合物倾向于具有高免疫原性。图1A显示了针对从天然MenY(ENYTT012)、40循环微流化MenY(ENYTT014)和20循环微流化MenY(ENYTT015bis)所制备的缀合物所产生的抗血清ELISA的GMC结果。当MenY-TT是从微流化的MenY制备的时，可获得更高的GMCs。
通过SBA分析评估抗血清，获得了类似的结果(图1B)。同样，采用从微流化的MenY制备的缀合物，得到了更高的GMT值。
Claims (32)
1.包含来自至少一种血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)荚膜多糖的免疫原性组合物，所述荚膜多糖包括具有100kDa以上的平均大小的脑膜炎奈瑟氏菌血清群C荚膜多糖，所述荚膜多糖与载体蛋白缀合以产生脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖缀合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌多糖的平均大小为50kDa以上。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其包括来自至少一种血清群A、C、W135和Y的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖，所述荚膜多糖与载体蛋白缀合而形成脑膜炎奈瑟氏菌缀合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌多糖为天然多糖或者被以不超过x10的系数调整大小。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖为天然多糖。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中通过微流化对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖进行调整大小。
5.权利要求1的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖被以不超过x10的系数调整大小。
6.权利要求1的免疫原性组合物，其中脑膜炎奈瑟氏菌缀合物由天然多糖和被以不超过x10的系数调整大小的多糖的混合物所制成。
7.权利要求6的免疫原性组合物，其中来自血清群Y的荚膜多糖被以不超过x10的系数调整大小。
8.权利要求6的免疫原性组合物，其中来自血清群A和C的荚膜多糖为天然的，而来自血清群W135和Y的多糖被以不超过x10的系数调整大小。
9.权利要求1的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖的平均大小为50kDa-200kDa。
10.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有50-100kDa的平均大小的MenA荚膜多糖。
11.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有60-80kDa的平均大小的MenA荚膜多糖。
12.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有100-200kDa的平均大小的MenC荚膜多糖。
13.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有160-200kDa的平均大小的MenC荚膜多糖。
14.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有100kDa以上的平均大小的MenY荚膜多糖。
15.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有120-140kDa平均大小的MenY荚膜多糖。
16.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有60-190kDa的平均大小的MenW荚膜多糖。
17.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有150-170kD的平均大小的MenW荚膜多糖。
18.权利要求1的免疫原性组合物，其包含具有110-140kDa的平均大小的MenW荚膜多糖。
19.权利要求1的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖与独立地选自由下列组成的组的载体蛋白缀合：TT、DT、CRM197、TT的片段C以及蛋白D。
20.权利要求1的免疫原性组合物，其中每一种脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖与选自由下列组成的组的相同载体蛋白缀合：TT、DT、CRM197、TT的片段C以及蛋白D。
21.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包括与载体蛋白缀合的流感嗜血杆菌(H.influenzae)b荚膜多糖。
22.权利要求21的免疫原性组合物，其中流感嗜血杆菌b荚膜多糖与任一选自由下列组成的组的载体蛋白缀合：TT、DT、CRM197、TT的片段C以及蛋白D。
23.权利要求21的免疫原性组合物，其包括Hib糖缀合物和至少两种其它细菌糖缀合物，其中Hib缀合物以低于至少两种其它细菌糖缀合物的平均剂量的剂量存在。
24.权利要求23的免疫原性组合物，其中Hib缀合物以比至少两种其它细菌糖缀合物的每种剂量低的剂量存在。
25.权利要求21的免疫原性组合物，其中将相同载体蛋白用于Hib缀合物以及至少两种其它细菌糖缀合物中的两种或多种中。
26.权利要求1的免疫原性组合物，其包括脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的外膜囊泡制备物或荚膜糖。
27.权利要求21的免疫原性组合物，其包括脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的外膜囊泡制备物或荚膜糖。
28.包含权利要求1-27中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受载体的疫苗。
29.用于伴随或顺序给药的疫苗试剂盒，其包括两种多价免疫原性组合物以保护宿主抵抗由百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)以及脑膜炎奈瑟氏菌所致的疾病，其中所述试剂盒包括第一容器和第二容器，第一容器包括：
破伤风类毒素(TT)，
白喉类毒素(DT)，和
全细胞或非细胞百日咳成分，
第二容器包括：
权利要求1-27中任一项的免疫原性组合物。
30.用于制备权利要求28的疫苗的方法，其包括将权利要求1-27中任一项的免疫原性组合物与药学上可接受载体混合的步骤。
31.权利要求1-27的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌感染所致的疾病的疫苗中的应用。
32.权利要求1-27中任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏菌感染所致的疾病的药物中的应用。
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