CN101205474A - 一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法 - Google Patents

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Abstract

一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，属于生物柴油合成技术领域。本发明在无溶剂体系中采用华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCCM201021全细胞脂肪酶转化各种油脂生产生物柴油，通过分批次流加短链醇，转化多种油脂，可制备得到生物柴油和副产物甘油，生物柴油得率为95％。本发明以廉价油脂为原料，主要是非可食用性的麻疯籽油以及餐饮业废油、酸价油等废物资源，扩大了原料的来源；采用价格极其低廉的华根霉全细胞脂肪酶作为催化剂，有效地解决了催化剂价格高昂的问题；分批流加短链醇以解决醇对生物催化剂的毒害作用，提高短链醇转化率。在产品质量达到生物柴油国际标准的前提下，大大降低了生物酶法生产生物柴油的成本。

Description

一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法
技术领域
一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，属于生物柴油合成技术领域。特别涉及无溶剂反应体系中具有自主知识产权的华根霉(Rhizopuschinensis)CCTCC M201021全细胞脂肪酶转化各种油脂生产生物柴油新技术。
背景技术
生物柴油(Biodiesel)是指由动植物油脂与短链醇(甲醇或乙醇)进行转酯化反应所制备的脂肪酸单酯，是一种性质与柴油十分相似的可再生的生物燃料。它不但可以作为化石柴油的替代燃料以缓解近年来石油资源日益枯竭的问题，而且具有化石柴油无可比拟的环境友好性等优良特性，目前生物柴油的研究受到了广泛的关注。
目前生物柴油主要是用化学法生产，主要指将动植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸或碱性催化剂和230℃～250℃的高温下，转化成相应的甲酯或乙酯。但是化学法制备生物柴油存在着一些不可避免的缺点：
1.工艺要求使用甲醇量大大超过反应摩尔比，过量甲醇的蒸发回流增大过程能耗；
2.反应物中混有游离脂肪酸与水，对酯交换反应有妨害作用，严重影响反应的进行；
3.产物必须水洗，洗涤过程中产生含碱废液，如有残留碱，则柴油中会生皂，容易堵塞管道。
由于利用生物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、无污染物排放、用醇量少、产物无须洗涤、对原料要求低等优点，符合绿色化学的研究方向，因而日益受到人们的重视。
但是生物法主要存在以下局限性：一是生物催化剂价格昂贵；二是甲醇对生物催化剂有毒害作用；三是甲醇转化率不高，而酶法生产生物柴油进入商业化的最大障碍就是催化剂的制备成本太高这一难题。
文献(Yuji Shimada et al.Enzymatic alcoholysis for biodiesel fuel productionand application of the reaction to oil processing，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2002，17：133-142)报道了在利用生物酶法生产生物柴油的工艺过程中，采用分批加入短链醇的方式以缓解其对酶的毒害作用。Watanabe Yomi etal(Watanabe Yomi et al.Conversion of degummed soybean oil to biodiesel fuel withimmobilized Candida antarctica lipase，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2002，17：151-155)利用固定化南极假丝酵母(Novo 435)作为催化剂在10h、24h时分别流加醇油摩尔比1∶1的甲醇并取得了良好的转化效果(48h转化率93.8％)。但是Novo 435等商品化酶的价格昂贵，并不适合大规模的工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，就是为了解决上述技术中存在的不足之处，提供一种高效、廉价的生物酶法转酯化制备生物柴油的方法。在无溶剂体系中利用具有自主知识产权的价格低廉的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021全细胞脂肪酶催化非可食用性油脂生产生物柴油。
本发明的技术方案：一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，在无溶剂体系中以短链醇甲醇或乙醇直接与底物油脂通过生物催化剂华根霉全细胞脂肪酶的催化作用，进行转酯化反应合成生物柴油；反应配比：短链醇和油脂摩尔比为3～4∶1，以及油脂质量5％～15％的华根霉全细胞脂肪酶和油脂质量1％～3％的pH 7.5的磷酸缓冲溶液，在该体系含水量条件下，反应中分批次流加短链醇，于密闭体系中30℃～40℃反应48～72h，制得生物柴油和副产物甘油，生物柴油得率为95％。
所采用的生物催化剂为具有自主知识产权的华根霉Rhizopus chinensisCCTCC M201021全细胞脂肪酶。该脂肪酶已由中国专利ZL 03113274.X授权。
所采用原料油脂为麻风籽油、餐饮业废油、酸价油、蓖麻油、桐油、大豆油、花生油、棉籽油、鱼油或猪油。
主要材料与试剂
所用脂肪酶及来源：
华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶(RCL)中国典型培养物保藏中心；
南极假丝酵母Candida Antarctica脂肪酶(Novo 435)，Novo Nordisk公司；
玫瑰假丝酵母Candida rugosa脂肪酶(CRL)，Sigma公司；
猪胰Porcine pancreas脂肪酶(PPL)，Sigma公司；
洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶(PS)，Amano Pharmaceutical公司；
固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶(PS-C)，Amano Pharmaceutical公司；
主要试剂：
棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和十七碳酸甲酯均购于sigma公司。
分析方法的确定
采用Agilent 6820气相色谱仪和毛细管柱DB-5(0.25mm×30m)，FID检测器。分析条件：起始柱温180℃，保留1min后以0.8℃/min的速率升温至186℃，保留1min，再以20℃/min的速率升到300℃，保留3min；载气为氮气，分流比1∶20；进样量1μL。
以十七酸甲酯为内标，取一定量的棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯标样配成标准溶液，做脂肪酸甲酯的标准曲线，通过标准曲线计算转酯化产物中脂肪酸甲酯的含量。
脂肪酸甲酯的得率＝测得的脂肪酸甲酯含量×100％/油脂完全甲酯化的脂肪酸甲酯含量。
菌株的培养及全细胞的制备
(1)菌株的培养基组成：
斜面培养基：马铃薯-葡萄糖琼脂培养基；
摇瓶培养基：蛋白胨6％，橄榄油2％，麦芽糖1％，MgSO4·7H2O 0.05％，K2HPO4 0.2％，pH 5.5；
(2)全细胞脂肪酶的制备
斜面于30℃中培养3d，无菌水洗下孢子。将孢子悬浮液接种到30mL摇瓶培养基中(250mL三角瓶)，接种量约为106～107个/mL。在30℃下于摇床中培养72h，转速200r/min。收集发酵后的菌体，用去离子水洗涤数次，过滤收集菌丝体，0.050M，pH 7.5的磷酸缓冲液洗涤，加入一定量的该缓冲液后于-18℃冰冻，冷冻干燥(Labconco冷冻干燥机)48h，得到细胞干粉即全细胞脂肪酶。
本发明的有益效果：本发明以廉价油脂为原料，采用价格极其低廉的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶作为催化剂，分批流加短链醇以解决醇对生物催化剂的毒害作用，提高短链醇转化率，并大大降低了生物柴油的生产成本，同时微生物全细胞脂肪酶的使用具有简化酶使用前的处理过程以及产品的回收工艺，降低反应温度和避免污染的排放等优势。
本发明利用大量的廉价油脂(包括麻疯籽油、餐饮业废油、酸价油、蓖麻油、桐油、大豆油、花生油、棉籽油、鱼油、猪油)，主要是非可食用性的麻疯籽油以及餐饮业废油、酸价油等废物资源，在无溶剂***催化转酯反应转化为环保型的生物柴油，既能减少环境污染又能节约化石能源，而且可以将非可食用性油脂资源化，变废为宝，缓解我国化石柴油日益供应紧张的状况。
在产品质量达到生物柴油国际标准的前提下，大大降低了生物酶法生产生物柴油的成本。首先价格极其低廉的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶的使用简化了反应的流程，而且有效地解决了催化剂价格高昂的问题；其次，扩大了原料的来源，不仅仅局限于精制大豆油等价格较高的可食用性油脂，而主要是针对非可食用性的麻疯籽油以及废弃的餐饮业废油、酸价油等原料，废物利用，有效地降低了生物柴油的生产成本。
附图说明
图1不同来源脂肪酶对转酯反应的影响。
(1)南极假丝酵母Candida Antarctica脂肪酶(Novozym 435)；(2)洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶(PS)；(3)固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶(PS-C)；(4)玫瑰假丝酵母Candida rugosa脂肪酶(CRL)；(5)猪胰Porcine pancreas脂肪酶(PPL)；(6)华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶(RCL)。
具体实施方式
实施例1：生物催化剂脂肪酶的选择
将摩尔比为1∶1的大豆油(9.65g)和甲醇在无溶剂体系下，对具有相同酯合成酶活单位的6种脂肪酶在30℃的恒温摇床上分别振荡反应24h时的转化情况，如图1所示。(1)Novo 435的转化效果最佳，脂肪酸甲酯得率可以达到30％左右，即甲醇的转化率可以达到90％以上；其次是(6)华根霉全细胞脂肪酶，其转酯化效果与Novo 435相比差别不大，甲醇的转化率也可以达到90％以上。
实施例2：将总摩尔比为4∶1的甲醇和麻风籽油(麻风籽油9.65g)和基于油脂质量10％的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶以及2％的pH 7.5磷酸缓冲液装入50mL具塞三角瓶中，置于可控温的空气摇床中，分别于10h、24h、48h流加甲醇三次，30℃振荡72h，生物柴油得率为95％。
实施例3：将总摩尔比为3∶1的甲醇和酸价油(酸价油9.65g，酸价50)和基于油脂质量10％的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶以及2％的pH 7.5磷酸缓冲液装入50mL具塞三角瓶中，置于可控温的空气摇床中，分别于10h、24h流加甲醇两次，30℃振荡48h，生物柴油得率可达90％。
实施例4：将总摩尔比为3∶1的甲醇和棉籽油(棉籽油9.65g)和基于油脂质量8％的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶以及3％的pH 7.5磷酸缓冲液装入50mL具塞三角瓶中，置于可控温的空气摇床中，分别于10h、24h流加甲醇两次，30℃振荡48h，生物柴油得率可达88％。
实施例5：将总摩尔比为3∶1的甲醇和鱼油(鱼油9.65g)和基于油脂质量15％的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶以及2％的pH 7.5磷酸缓冲液装入50mL具塞三角瓶中，置于可控温的空气摇床中，分别于10h、24h流加甲醇两次，40℃振荡48h，生物柴油得率可达89％。
实施例6：将总摩尔比为4∶1的乙醇和麻风籽油(麻风籽油9.65g)和基于油脂质量10％的Rhizopus chinensis CCTCC M201021全细胞脂肪酶以及2％的pH 7.5磷酸缓冲液装入50mL具塞三角瓶中，置于可控温的空气摇床中，分别于10h、24h、48h流加乙醇三次，40℃振荡72h，生物柴油得率可达98％。

Claims (3)

1.一种无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，其特征是无溶剂体系中以短链醇甲醇或乙醇直接与底物油脂通过生物催化剂华根霉全细胞脂肪酶的催化作用，进行转酯化反应合成生物柴油；反应配比：短链醇和油脂摩尔比为3～4∶1，以及油脂质量5％～15％的华根霉全细胞脂肪酶和油脂质量1％～3％的pH 7.5的磷酸缓冲溶液，在该体系含水量条件下，反应中分批次流加短链醇，于密闭体系中30℃～40℃反应48～72h，制得生物柴油和副产物甘油，生物柴油得率为95％。
2.根据权利要求1所述无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，其特征是所采用的生物催化剂为具有自主知识产权的华根霉Rhizopus chinensisCCTCC M201021全细胞脂肪酶。
3.根据权利要求1所述无溶剂体系中生物转化油脂制备生物柴油的方法，其特征是所采用原料油脂为麻风籽油、餐饮业废油、酸价油、蓖麻油、桐油、大豆油、花生油、棉籽油、鱼油或猪油。
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