CN101173949A - 硒诊断/测定试剂盒及硒浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出硒浓度的大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
硒的生物学意义最早由克山病的病理生理研究所确立，这种疾病首先在中国的15岁以下儿童和妊娠妇女被发现，属于地方性硒缺乏病。硒的这种缺乏使红细胞的谷胱甘肽过氧化酶活性降低，出现溶血增加和形成甲基血红蛋白。由于硒补充不足，引起了骨骼和心肌的肌纤维功能失调。
红细胞谷胱甘肽超氧化物酶的活性是反映体内硒储藏的指标，由于硒不能与年老的红细胞结合，只有血流中的年轻红细胞可结硒，达到激活谷胱甘肽氧化酶的水平。因此，红细胞的谷胱甘肽氧化酶至少在补充硒四周后才能被用于监测治疗效果，而血浆中的谷胱甘肽氧化酶活性在数天内即可升高。
怀疑硒摄入不足，尤其是在完全胃肠外营养者，临床症状包括肌无力、心肌病以及怀疑慢性肾功能不全。急性中毒症状包括眼睛和气道的刺激与皮炎；慢性中毒的症状包括持续性的呼气或汗液中出现大蒜味，头痛、上气道刺激、胃肠道症状和神经衰弱。
目前的检测方法仅有：荧光测定法及原子吸收分光光度测定法可采用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下：
这种方法应用需要硒离子激活的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase；EC 1.11.1.9)(偶)联过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应速率比色法。谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料-吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小；通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出硒浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷胱甘肽二硫 6mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 6000U/L
还原型色原体组合 0.1-20mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽过氧化物酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫。
试剂3
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷胱甘肽二硫 6mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 6000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷胱甘肽二硫 6mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 6000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
谷胱甘肽二硫 6mmol/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 6000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出硒的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
Claims (7)
1.一种酶比色法及酶联法技术的硒浓度测定方法，其方法原理如下：
谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽过氧化物酶/Se2+
2谷胱甘肽+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出硒浓度大小测定结果。
2.一种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-50mmol/L
谷胱甘肽二硫 1-50mmol/L
过氧化物酶 500-80000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 1000-80000U/L
还原型色原体组合 0.1-20mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080507 |