CN101173926A - 稳定同位素18o标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于稳定同位素18O标记的蛋白质组双重定量的新方法。本方法是建立在N端肽段和C端肽段普遍标记的基础之上，通过18O化学标记与酶切标记结合的方法，可以实现对同一样本的两种18O标记的定量策略。该方法涉及蛋白质的还原烷基化和胰酶酶切、肽段的双功能试剂修饰和18O标记、多维液相色谱分离与多级串联质谱联用定量与鉴定。通过一级质谱峰峰面积来定量，蛋白质的鉴定通过串联二级质谱和数据库搜库。本发明还提供了便于该方法实施的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质组学中蛋白质双重定量的方法与试剂盒。包括一种用于定量蛋白质组学的稳定同位素18O标记结合双酸酐试剂化学标记的蛋白质的新方法与试剂盒。
背景技术
蛋白质组学已经成为当前生命科学研究的重要内容。规模化研究不同生理病理条件下细胞蛋白质的组成及其变化的定量或差异蛋白质组研究，已经成为蛋白质组学研究的热点和难点。蛋白质组研究中的准确定量问题对目前蛋白质组定量方法和技术提出了新的挑战，也越来越受到各国研究人员的重视。
目前，规模化蛋白质组定量方法主要有依赖于2DE的染色方法和稳定同位素标记的质谱检测技术。由于2-DE不能对分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和呈现，因而限制了其应用。引进稳定同位素化学标记结合质谱技术的定量策略近年来已经成为蛋白质组学的热点。目前，商品化的定量试剂盒如同位素亲和标签ICAT、iTRAQ试剂等价格都比较昂贵，方法本身也有一定的局限性，使得广泛应用受到了限制。稳定同位素标记的必需氨基酸体内标记SILAC方法仅适应细胞培养模式，不能用于组织或体液中蛋白质组的定量分析。
相比较而言，通过蛋白质酶切时酶促的方法引进18O原子，由于标记反应步骤少，体系相对简单，因此受到越来越多的关注。蛋白质在H2 18O水中酶解，在酶促的作用下C-端羧基可稳定结合一个或两个18O原子，但是由于在C-端羧基结合一个或两个18O原子是随机的，并且是胰酶依赖的，不同的肽段交换上去的18O原子时间不同，使得定量复杂化。将蛋白质在18O的水中通过Lys-N酶酶切，在一定的条件下肽段的C-端羧基可稳定结合1个18O原子。该方法的缺陷在于Lys-N酶的价格较贵。为了解决现有技术的缺陷，本专利发明了一种基于稳定同位素18O标记的蛋白质组双重定量新方法。
发明内容
本发明提供了一种基于稳定同位素18O标记的蛋白质组双重定量新方法。本方法是建立在N端肽段和C端肽段全部标记的基础之上，通过18O化学标记与酶切标记结合的方法，可以实现对同一样本的两种18O稳定同位素标记的定量策略。本发明人发现结合多维液相色谱分离手段和多级串联质谱，使用稳定同位素18O标记蛋白质组双重定量新策略，可以用来提高蛋白质组学相对定量的准确性和可靠性。
本发明提供的一种用于蛋白质组的18O标记的蛋白质组双重定量新方法，包括：
(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；
(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用胍基化试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；
(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量，其特征在于所述步骤(3)的处理方法为：
(a)用一种或多种双酸酐试剂对肽段进行修饰，使其与肽段发生乙酰化偶合反应；
(b)第一重定量标记为双酸酐试剂与肽段偶合反应的反应溶液分别为16O和18O碳酸氢三乙胺缓冲溶液；双酸酐试剂的一端发生偶合反应，另一端酸酐发生水解反应。修饰后的肽段中，反应体系在H2 18O配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液的肽段中引入了1个18O原子。
(c)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(d)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。
为进一步提高分析准确度，本方法还可以继续进行第二重定量，其步骤为：
(e)将(b)中一半的反应溶液，37℃，孵育18h。反应体系为18O的修饰肽段的C端在胰蛋白酶促的作用下羧基端的两个16O原子，交换为18O。
(f)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(g)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的第二重定量分析及蛋白质的鉴定。
其中，步骤(a)所述双酸酐试剂优选为分子内带氨基双酸酐，芳香胺双酸酐，或异硫氰酸基双酸酐活性联接基团的化合物。特别优选为二乙三胺五乙酸双酸酐。
步骤(b)所述稳定同位素为18O，缓冲溶液分别为16O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲盐和18O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲盐溶液。
步骤(d)和(g)所述质谱优选LC-ESI-MS/MS电喷雾离子化串联质谱，或MALDITOF/TOF基质辅助激光解离飞行时间串联质谱，更优选使用液质联用；质谱数据的解析及蛋白质的鉴定优选采用数据库搜索方法。
该方法可对两种不同生理状态的蛋白质酶切产生的肽段进行双酸酐试剂的修饰；再用双重18O稳定同位素进行标记，两种标记方法得到的18O与16O标记的肽段分别等比例混合，通过两次多维色谱分离和串联质谱分析测定来实现蛋白质组的双重定量。在第一重的18O标记方法中引入了1个18O原子，一级质谱图中16O和18O标记的一对肽段质量数差异为2Da(单电荷)，不存在18O和16O原子之间的交换；在第二重的18O标记方法中引入了3个18O原子，一级质谱图中16O和18O标记的一对肽段质量数差异为6Da(单电荷)，避免了同位素峰的重叠。16O和18O标记的一对肽段的离子强度比例，也就是相应的两种比较蛋白质的相对比例，双电荷的肽段对的质量数差异为原质量数差的二分之一，依此类推。通过二级质谱进行数据库检索来鉴定蛋白质。
双酸酐试剂为分子内或带氨基双酸酐，或带芳香胺双酸酐，或带异硫氰酸基双酸酐活性联接基团的化合物。如二乙三胺五乙酸双酸酐(bicyclic anhydride diethylenetriamine N，N，N’，N”，N”-pentaacetic dianhydride，DTPAA)为双酸酐试剂，它一端能够与肽段的胺基偶合，另一端能够发生水解反应。该试剂价格低廉。该方法与目前传统的18O酶切标记的方法相比，没有16O和18O原子之间的交换，可减少定量实验的误差，提高定量的准确性。另外的一种标记策略是在第一种标记方法的基础之上建立的。由于反应体系的相容性，建立了质量数差异为6Da的定量方法，该方法与传统的18O酶切的方法相比，避免了同位素峰的重叠。
另一方面，本发明还提供了用于蛋白质组学中18O稳定同位素标记蛋白质的双重定量的试剂盒，该试剂盒的组分包含：
(a)一种或多种能与肽段偶合的双酸酐试剂；
(b)偶合反应的16O水和18O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液；
(c)能进行肽段色谱分离的色谱柱。
其中，组分(a)优选分子内带氨基双酸酐，芳香胺双酸酐，或异硫氰酸基双酸酐活性联接基团的化合物；组分(c)优选反相柱或离子交换柱，更优选在线联用色谱柱。
如本领域技术人员所知，以上组分仅是示意性的。为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种：用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有一种或多种用于肽段色谱分离的缓冲体系；国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于对两种不同状态的组织或细胞的蛋白质差异表达进行相对的定量，该方法快速，使用方便。可同时比较不同生理病理条件下两种样本的蛋白质表达水平上的差异，从而简便快速准确地筛选到表征该生理病理条件的差异蛋白质，进而寻找生物标志物，为疾病诊断及药物筛选提供了一种简单快速的分析工具。蛋白质定量与定性分析可在一个实验周期中同步完成。特别适用于生物学、医学和药物学领域中进行差异蛋白质组或比较蛋白质组分析。
本方法是蛋白质差异表达相对定量分析工具，大大降低蛋白质组学中相对定量的成本。并且反应条件相对温和，操作简单，容易实现。蛋白质定量与定性分析可在一个实验周期中同步完成。本方法是建立在N端肽段和C端肽段普遍标记的基础之上，通过18O化学标记与酶切标记结合的方法，可以实现对同一样本的两种18O稳定同位素标记的定量策略。本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于：在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质组研究。
附图说明
图1.是本方法的实验流程示意图
图2.肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR与16O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR等比例混合后的一级质谱图，为第一重18O标记定量，在图中按照m/z为1981.6384和1983.6417的同位素峰的面积的实际比值来进行相应肽段的比例计算。计算参照参考文献(Sekhar Rao K.C.，Carruth R.T.，and Miyagi M.，Proteolytic 18O Labeling by Peptidyl-LysMetalloendopeptidase for Comparative Proteomics，Journal of Proteome Research，2005，4，507-514)。计算得到的比例为1∶1.02，与理论值1∶1接近。
图3.肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O与16O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O等比例混合后的一级质谱图，为第二重18O标记定量，在图中按照m/z为1982.1433和1988.1532的同位素峰的面积29265.2852与28576.7188的实际比值来进行相应肽段的比例计算。计算得到的比例为1∶1.02，与理论值1∶1接近。
图4.A图为肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR的二级质谱图；B图为肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O的二级质谱图。A和B图中得到的母离子的二级碎片峰均为连续的得到的母离子的二级碎片峰均为连续的y离子(从y1到y15)，使得图谱大大简化，可显著提高肽段鉴定的可靠性。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1马心肌红蛋白的双重定量标记
1.1取0.1mg马心肌红蛋白，溶于100μL 50mM pH7.0的碳酸氢三乙胺缓冲溶液中。95℃加热5分钟蛋白质变性。肌红蛋白的氨基酸序列中没有半胱氨酸残基，故不需要还原烷基化步骤。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切2小时。再补加2ug胰蛋白酶，37℃酶切10小时。将酶切得到的肌红蛋白肽段平均分为四份，其中两份沸水浴加热十分钟然后冰浴迅速冷却，使胰蛋白酶灭活。然后和其余的两份一起真空干燥机中完全干燥。在得到的固体粉末中，取其中一份胰酶灭活和一份胰酶没有灭活的样品溶于25μL18O水配置的50mM pH7.0的碳酸氢三乙胺缓冲溶液中。剩余的两份溶于25μL50mM pH7.0的碳酸氢三乙胺缓冲溶液中。然后将四份混合物分别加入到360μg二乙三胺五乙酸双酸酐的固体粉末中，剧烈涡震1min后，常温放置1小时。将胰蛋白酶已经灭活的溶液按照1∶1的比例混合。混合样品直接LC-Packing分离点靶，MALDI-TOF/TOF检测鉴定。胰蛋白酶没有灭活的溶液，放置于37℃水浴中，孵育18h。然后按照1∶1的比例混合，混合样品在LC-MS分离鉴定前，沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶充分失活。
1.2各取0.6μL混合后的样品用美国Dionex-LC Packings纳升级毛细管液相色谱***分离。毛细管反相色谱柱为15cm×75μm i.d.二氧化硅玻璃管，内装Vydac C18，直径5μm，孔径为
的填料。预柱为5mm×320μm i.d.，填料为PepMap C18，直径5μm，孔径为
。流动相A：水/乙腈(95/5，V/V)，含0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈/水(95/5，V/V)，含0.1％三氟乙酸，分流后流速为200nl/min，检测波长214nm。分离采用非线性梯度：100％A，20min，0％～20％B，10min；20％～60％B，40min；60％～100％B，10min；100％B，10min；100％B～100％A，5min；100％A，15min。洗脱30min后，在线馏分自动收集点靶，待馏分完全干燥后，每点补加0.5μl的5mg/ml a-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，待干燥后进行MALDI-TOF/TOF质谱分析。
美国ABI公司4700Proteomics Analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF)。一级质谱数据采集使用MS-1KV反射模式，加速电压20KV，扫描范围700-3500m/z。二级质谱数据采用MS/MS-1KV反射模式，从一级谱图中选择信噪比大于20的峰，依据信号强度由高到低选择8个母离子进行串联分析。
检索软件为Mascot v1.9，数据库为Swiss-prot。搜索参数包括可变修饰在肽段的N端标记O-DTPA标签的质量数加上376.1Da，在肽段的N端标记了18O-DTPA标签的质量数加上378.1Da；第二种标记方法中肽段标签为O-DTPA-20的质量数加上379.13Da，肽段标签为18O-DTPA-218O的质量数加上385.13Da。
1.3从一级质谱图上可以得到不同肽段的相应的峰面积比例。如图2为肌红蛋白肽段18O-DTPA-peptide与16O-DTPA-peptide等比例混合后18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR与16O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR的一级质谱图。真实的峰面积比例计算方法参照文献(Sekhar RaoK.C.，Carruth R.T.，and Miyagi M.，Proteolytic 18O Labeling by Peptidyl-LysMetalloendopeptidase for Comparative Proteomics，Journal of Proteome Research，2005，4，507-514)。计算得到的比例为1∶1.02，与理论值1∶1接近。图3为肌红蛋白肽段18O-DTPA-peptide-218O与16O-DTPA-peptide-218O等比例混合后18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O与16O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O的一级质谱图。计算得到的比例为1∶1.02，与理论值1∶1接近。并且两种方法得到的实验结果一致，可以相互验证。大大提高了定量的准确性和可靠性。图4A图为肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR的二级质谱图；B图为肌红蛋白肽段18O-DTPA-VEADIAGHGQEVLIR-218O的二级质谱图。从图中可以看出在它们的二级图谱中得到了连续的y系列离子，使得图谱大大简化，可显著提高肽段鉴定的可靠性。
实施例2六种标准蛋白混合物的双重定量
2.1六种标准蛋白混合物均购自美国Sigma公司，按照以下的比例进行配置(混合物A和B，μg/mL)：β-酪蛋白(10，10)；β-乳球蛋白(10，40)；肌红蛋白(60，20)；牛血清白蛋白(40，20)；溶菌酶(50，50)；转铁蛋白(30，60)。蛋白混合物溶于50μL pH7.0，50mM碳酸氢三乙胺溶液，95℃加热变性5min。加入50mM还原剂三羧乙基磷2μL，60℃孵育1h。然后加入2μL 250mM烷基化试剂碘乙酰胺，暗处放置10分钟，按照比例(1∶20w/w)加入胰蛋白酶，37℃，18h。将酶切得到的蛋白质肽段溶液真空干燥，加入18O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液溶解，与过量5倍的双酸酐固体粉末室温反应30min。得到的肽段N端标记有一个18O原子。将该混合物平均分为两份，其中一份沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后进行LC-MS分离鉴定。另外一份溶液放置于37℃水浴中，孵育18h。LC-MS分离鉴定前，沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶充分失活。分别按照1∶1的比例混合。混合样品直接LC-Packing分离点靶，MALDI-TOF/TOF检测鉴定。胰蛋白酶没有灭活的溶液，放置于37℃水浴中，孵育18h。然后按照1∶1的比例混合，混合样品在LC-MS分离鉴定前，沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶充分失活。
2.2各取0.6μL混合后的样品用美国Dionex-LC Packings纳升级毛细管液相色谱***分离。毛细管反相色谱柱为15cm×75μm i.d.二氧化硅玻璃管，内装Vydac C18，直径5μm，孔径为
的填料。预柱为5mm×320μm i.d.，填料为PepMap C18，直径5μm，孔径为。流动相A：水/乙腈(95/5，V/V)，含0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈/水(95/5，V/V)，含0.1％三氟乙酸，分流后流速为200nl/min，检测波长214nm。分离采用非线性梯度：100％A，20min，0％～20％B，10min；20％～60％B，40min；60％～100％B，10min；100％B，10min；100％B～100％A，5min；100％A，15min。洗脱30min后，在线馏分自动收集点靶，待馏分完全干燥后，每点补加0.5μl的5mg/ml a-氰基-4-羟基肉桂酸基质，待干燥后进行MALDI-TOF/TOF质谱分析。
美国ABI公司4700Proteomics Analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF)。一级质谱数据采集使用MS-1KV反射模式，加速电压20KV，扫描范围700-3500m/z。二级质谱数据采用MS/MS-1KV反射模式，从一级谱图中选择信噪比大于20的峰，依据信号强度由高到低选择8个母离子进行串联分析。
检索软件为Mascot v1.9，数据库为Swiss-prot。搜索参数包括第一重标记中可变修饰在肽段的N端标记O-DTPA标签的质量数加上376.1Da，在肽段的N端标记了18O-DTPA标签的质量数加上378.1Da。在第二重标记方法中肽段标签为O-DTPA-20的质量数加上376.1Da，肽段标签为18O-DTPA-218O的质量数加上382.1Da。
2.3在质谱测定的结果中，所有的MSMS数据通过数据库检索鉴定出了这六个标准蛋白，表1为六种标准蛋白18O标记蛋白质组双重定量结果。实验结果如表1所示。从表中可以看出，18O标记的两种定量策略实验误差均在20％以内，证明该方法具有在蛋白质组学中实际应用的价值。
表1标准蛋白18O标记蛋白质组双重定量结果
Claims (12)
1.一种用于蛋白质组双重定量的稳定同位素18O标记蛋白质的方法，包括：
(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；
(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；
(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量；
其特征在于所述步骤(3)的处理方法为：
(a)用一种或多种双酸酐试剂对肽段进行修饰，使其与肽段发生乙酰化偶合反应；
(b)第一重定量标记为双酸酐试剂与肽段偶合反应的反应溶液分别为16O和18O碳酸氢三乙胺缓冲溶液；双酸酐试剂的一端发生偶合反应，另一端酸酐发生水解反应。修饰后的肽段中，反应体系在H2 18O配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液的肽段中引入了1个18O原子。
(c)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(d)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括如下第二重定量步骤：
(e)将(b)中一半的反应溶液，37℃，孵育18h。反应体系为18O的修饰肽段的C端在胰蛋白酶促的作用下羧基端的两个16O原子，交换为18O。
(f)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(g)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的第二重定量分析及蛋白质的鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(a)所述双酸酐试剂为分子内带氨基双酸酐，芳香胺双酸酐，或异硫氰酸基双酸酐活性联接基团的化合物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(a)所述双双酸酐试剂为二乙三胺五乙酸双酸酐。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(b)所述稳定同位素为18O，缓冲溶液分别为16O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲盐和18O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲盐溶液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(d)和(g)所述质谱是LC-ESI-MS/MS电喷雾离子化串联质谱，或MALDI TOF/TOF基质辅助激光解离飞行时间串联质谱。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(d)和(g)所述质谱数据的解析及蛋白质的鉴定方法为使用数据库搜索。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的处理方法为：
(a)用二乙三胺五乙酸双酸酐对肽段进行修饰，使其与肽段发生乙酰化偶合反应；
(b)第一重定量标记为二乙三胺五乙酸双酸酐与肽段偶合反应的反应溶液分别为16O水配置的碳酸氢三乙胺缓冲盐和18O水配置的碳酸氢三乙胺18O缓冲盐；
(c)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(d)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。
(e)第二重定量标记为，将(b)中一半的反应溶液，37℃，孵育18h。反应体系为18O的修饰肽段的C端在胰蛋白酶促的作用下羧基端的两个16O原子，交换为18O。
(f)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；
(g)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的处理方法为同一样本的两种18O标记方法，可以实现两种方法的双重定量。
10.一种用于定量蛋白质组学稳定同位素18O标记蛋白质组的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组分包含：
(a)一种或多种能与肽段偶合的双酸酐试剂；
(b)偶合反应的H2 16O和H2 18O的碳酸氢三乙胺缓冲溶液；
(c)能进行肽段色谱分离的色谱柱。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于组分(a)所述双酸酐试剂为分子内带氨基双酸酐，芳香胺双酸酐，或异硫氰酸基双酸酐活性联接基团的化合物。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于组分(c)所述色谱柱为反相柱或离子交换柱。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20080507 |