CN101173227A - 产甘草黄酮的重组酵母菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种产甘草黄酮的重组酵母，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产甘草皂苷的重组酵母菌，其分别为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2181和热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2179。实现重组酵母菌发酵生产甘草黄酮的技术突破，将对于干旱半干旱荒漠地区生态环境的保护和发展具有重要意义。
Description
发明领域
本发明涉及产甘草黄酮重组酵母菌的技术领域，具体地，本发明涉及通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得产甘草黄酮的重组酵母菌。
背景技术
酵母菌与人类的关系源远流长，目前已建立了酵母菌的基因组数据库和蛋白质组数据库。酵母菌作为单细胞低等生物，具有易培养、繁殖快、便于基因操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生或很少有毒物质等特性，已成为外源基因表达的合适宿主。
甘草(Glycyrrhiza)是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papiliantae Taub.)，属多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐热、抗盐碱等优良特性，适应性强，生命力旺盛，根系发达，是荒漠、半荒漠地区保持水土、改良土壤、防风固沙的重要药用植物，被国家列为重点药材。国内外学者对甘草的化学成分和药理作用进行了许多研究，认为其主要有效成分是甘草酸和黄酮类化合物。到目前为止，国内外对甘草酸的研究已经很深入，现已形成规模化生产。而对甘草黄酮的研究主要集中在化学成分和药理作用上，对它的提取研究较少。所以在甘草有效成分的生产和开发中，将黄酮作为次要成分随药渣弃去，造成资源的极大浪费。随着对甘草的深入研究，人们逐步认识到从甘草中提取这两种物质的重要性，并已做了初步研究，但这些研究大多是利用常规的提取方法，时间长、成本高、效率低，这些都制约着黄酮工业化生产的发展。
甘草黄酮在医药、保健品、化妆品、食品添加剂等行业上有优良作用，国内外市场需求日益增大。不少企业投资拟建甘草黄酮生产厂，但目前大部分甘草加工企业为传统加工，多为原料级粗产品生产，规模效益低，生产水平差，企业粗放经营，粗加工生产附加值低，主要产品单一，产品多限于甘草切片、甘草膏、甘草霜、甘草酸粉等甘草类制品。甘草作为一种重要药用资源，过于简单的原料加工，是对资源的一种严重浪费，而重要有益的甘草黄酮类物质成分随着甘草废渣一起丢弃，无疑是对企业、国家都是一种重巨大的损失。面对21世纪天然产物药物提取、药理研究的大浪潮，药用植物的深度开发、应用是每个中草药加工企业生存的必然要求。
甘草作为国家重点保护的二级野生药材物种。保护甘草资源，合理开发利用，不仅对现有脆弱的生态环境具有重要意义，而且对国民经济的可持续发展具有一定的促进作用。甘草黄酮作为一类生物活性较强的成分，在医药、保健品、化妆品、食品添加剂等方面具有广泛的应用价值，其市场需求日益强劲。开发出从甘草渣中提取中提取黄酮类物质的研究，有利于资源的科学利用，对提高产品副加值，农民增收等具有重要的意义。
传统的黄酮提取方法有水浸法、酸碱浸提法、醇提法等，其利用简单的物理方法提取甘草中的黄酮，效率低且易造成环境污染。而近来利用微波、超声波辅助提取法、超临界CO2萃提法等新型物理仪器提取黄酮的方法，因提取效率较高而受到广泛关注，但由于在生产应用中存在一次性投资过大、操作烦琐，使其在工业应用中受到一定程度的制约。
离子束介导转基因是20世纪90年代中国科学院离子束生物技术重点实验室在研究注入离子与生物体相互作用的基础上，首先提出的一种新的转基因方法。作为一种全新的转基因手段，离子注入介导转基因有其自身的特点：首先，不需要事先知道或克隆出目的DNA片段，其次可转移DNA大片段，适于多基因或基因簇的转导；其次，转入的外源DNA是直接整合入宿主总DNA中，因此具有较好的遗传稳定性。注入离子对细胞具有极强的刻蚀作用，致使细胞表面形成可使外源DNA进入的通道，这一点与基因枪方法并无差异。注入离子对细胞的刻蚀和溅射作用属于冷加工性质，不伤及邻近组织和细胞，比产生热效应的激光束法具有明显的优势。同时由于注入正离子的积累，大大降低了细胞表面的负电性，从而减少了细胞对溶液中带负电的外源DNA的静电斥力，有利于外源基因的导入。加之通道局部区域也由于带正电，便于吸引带负电性的DNA主动进入受体细胞。另一方面，目前离子注入在真空环境中进行，真空造成的负压使细胞内部的部分水分蒸发，当干燥的细胞进入含有DNA的缓冲液中时，由于吸胀作用加强，也增加了外源DNA进入通道的机会。此外，离子注入会对受体细胞内染色体造成直接损伤(如断裂)和间接损伤(如自由基作用)，也增加了外源DNA与受体细胞DNA重组和整合的机会。正是这些因素使得离子束介导DNA大分子的遗传转化具有较高的转化率。
实现微生物发酵生产甘草皂苷的技术突破，将对中国干旱半干旱荒漠地区生态环境的保护和民族制药业的发展产生深远的影响。
发明内容
本发明通过对照现有技术，针对甘草黄酮的提取采用微生物发酵获得未见报道，而通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得有效的微生物菌种发酵获得甘草黄酮也未见报道。本发明的目的是提供一种为获得甘草黄酮的重组酵母菌株。
本发明的技术方案：本发明提供了重组酵母工程菌菌株，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产甘草黄酮的重组酵母菌，其分别为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC 2181和热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC 2179，这两种菌种通过传统的发酵工艺都可以有效获得甘草黄酮。
本发明技术方案中所述的两种菌种都为酵母菌属，具有常规酵母菌的一些共同的技术特征，都通过传统的发酵技术有效获得甘草黄酮，是基于提取甘草黄酮共同技术要求前提下实现。
具体地，本发明采用已公开的技术，具体技术已经通过申报国家发明专利，其申请号为，即通过改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis)并获得总DNA，通过在酵母中转化从而获得本发明产甘草黄酮的两株重组酵母菌。
本发明技术方案所用酵母菌并不限于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)和其他酵母属通过发酵可获得甘草黄酮，本发明技术效果的再现，同时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。具体地，本发明优选为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2181的和热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC.No.2179。
一方面，本发明提供了一种重组酵母菌株的菌株，命名为1027，其主要次生代谢产物为甘草黄酮。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2007年9月19日，保藏号是CGMCC.No.2181。根据受体菌的来源，经微生物学鉴定，1027菌为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)，该菌株的菌落呈颜色乳白色，中央***，边缘圆整；斜面菌种培养温度28-30℃，培养时间24h；液体摇瓶培养温度28-30℃，转速200-220r/m，培养时间96h。可采用如下方法对其进行保存：采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，常规培养和保存即可。或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏即可。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的***工艺流程技术。
另一方面，本发明提供了一种重组酵母菌株，命名为2163，其主要次生代谢产物为甘草黄酮。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2007年9月19日，保藏号是CGMCC.No.2179。根据受体菌的来源，经微生物学鉴定，2163菌为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，该菌株的菌落呈乳白色，中央***，边缘圆整；斜面菌种培养温度30-32℃，培养时间24h；液体摇瓶培养温度30-32℃，转速200-220r/m，培养时间96h。可采用上述保存1027菌的方法对其进行保存。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以通过技术方案获得的二株重组酵母菌，即酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC 2181和热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC 2179，通过传统的微生物发酵技术手段有效获得甘草黄酮的有益效果。
附图说明：无
具体实施方式
实施例一：产甘草黄酮的重组酿酒酵母菌
采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的总DNA。
取细胞浓度为1.0×107CFU/mL的酿酒酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布于直径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注入机小真空靶室的无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15×1015ions/cm2，真空度10-3Pa。
用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28℃温育2h后，洗脱至YEPD平板。
其中，YEPD培养基的成分为(w/v)：酵母膏1.0％、蛋白胨2.0％、葡萄糖2.0％、琼脂2.0％，其余为无菌水。
将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液，进行薄层色谱(TLC)检测。获得一株编号为1027的重组酿酒酵母菌，其培养液中含有与甘草黄酮标准样品相同Rf值的物质。
重组酿酒酵母菌1027于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2181。
实施例二：产甘草黄酮的重组热带假丝酵母菌
采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的总DNA。
取细胞浓度为1.0×107CFU/mL的热带假丝酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布于直径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注入机小真空靶室的无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15×1015ions/cm2，真空度10-3Pa。
用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28℃温育2h后，洗脱至YEPD平板。
其中，YEPD培养基的成分为(w/v)：酵母膏1.0％、蛋白胨2.0％、葡萄糖2.0％、琼脂2.0％，其余为无菌水。
将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液，进行薄层色谱(TLC)检测。获得一株编号为2163的重组热带假丝酵母菌，其培养液中含有与甘草黄酮标准样品相同Rf值的物质。
重组热带假丝酵母菌2163于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2179。
实施例三：甘草渣中黄酮类物质的定性、定量测定
定性分性：以氯仿∶甲酸∶甲醇＝5∶0.5∶1为展层剂，硅胶薄板层析，利用黄酮类物质与显色剂作用在紫外光下有特异的绿色荧光，确定甘草黄酮存在。定量分析：以芦丁为标准品，吸取1ml 80％乙醇溶解的适量芦丁加入10ml的容量瓶中，加0.4ml 5％NaNO2摇均放置6Min，加0.4ml 10％Al(NO3)摇均放置6Min，再加4ml 4％NaOH，加80％乙醇定容至10ml摇均放置15Min，用扫描分光光度计扫描，可见其在350、505nm各有一个峰，其中505处为黄酮类物质特有吸收峰，确定最佳测定波长为505nm。本实施例可以有效验证提供的菌种发酵获得产物。
通过上述的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当被理解为用来限制本发明的范围。本发明所用酵母菌并不限于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)和其他酵母属通过发酵可获得甘草黄酮，同时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指重量百分比。
Claims (1)
1.一种产甘草黄酮的重组酵母，其特征在于，所选用的重组酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2181和热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2179。
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| CN101851590B (zh) * | 2010-01-15 | 2013-11-06 | 新疆大学 | 产醌类化合物的重组酵母菌 |
| CN107028823A (zh) * | 2016-02-04 | 2017-08-11 | 北京工商大学 | 一种制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的甘草发酵液的微生物发酵方法及其产品 |
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