CN101163799B - 肽稳定剂化合物及筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肽稳定剂化合物，该化合物与生物活性肽的联合能够提高生物活性肽在体内的蛋白酶消除半衰期。该肽稳定剂化合物优选地是肽序列的形式，其赋予所偶联的生物活性肽蛋白水解抗性。本发明也提供了从体外产生的文库中筛选全新蛋白水解抗性化合物的方法，以及包括以此鉴定的稳定剂化合物的药物组合物。

Description

肽稳定剂化合物及筛选方法
技术领域
本发明涉及称为肽稳定剂(peptide stabilizer)的全新化合物，其可以抵抗蛋白水解。尤其是，本发明涉及包含杂合分子的组合物，该杂合分子包含肽稳定剂部分和如生物活性分子的生物活性部分。该活性部分可包括用于诊断或治疗目的的分子。
背景技术
生物活性肽是引发生物活性的小肽类。已经确认和表征了超过500个平均具有20个氨基酸的此类肽。它们是从许多种自然或非自然***中分离出来，表现出广泛的作用，并在医学领域作为治疗剂以及在基础和应用研究中作为诊断工具而使用。在这些肽已经确定的作用模式中，发现其是源于生物活性肽与特定蛋白靶标的相互作用。在大多数情况下，生物活性肽通过极高特异性地结合蛋白靶标并使其失活而发挥作用。最近，由于天然肽具有结合并调节特异蛋白靶标活性的优异能力，因此对于应用合成的衍生生物活性肽作为全新药用试剂的兴趣大增。
在此之前，全新的生物活性肽已经通过两种不同的体外方法被工程化应用。第一种方法通过由化学合成的6-10个氨基酸肽组成的随机文库来生产候选肽(J.Eichler et al.，Med.Res.Rev.15：481-496(1995)；K.Lam，AnticancerDrug Des.12：145-167(1996)；M.Lebl et al.，Methods Enzymol.289：336-392(1997))。另一种方法通过将随机寡核苷酸库克隆入Ff丝状噬菌体基因中来合成候选肽，其可在细菌噬菌体表面表达更长的肽(H.Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：401-424(1997)；G.Smith et al.，et al.Meth.Enz.217：228-257(1993))。如今，已经制成长度达到38个氨基酸的随机肽文库，而且使用此***似乎也可制成更长的肽。使用这两种策略中任一种制成的肽库通常再与预选的与基质结合的蛋白靶标相混合。洗脱结合的肽，并对其测序。通过此信息，合成新的肽并确定其生物特性。
噬菌体展示提供了产生限制性(constrained)和非限制性(unconstrained)肽库的方法(Devlin et al.，(1990)Seience 249：404-406；Cwirla et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382；Lowman(1997)Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：401-424)。这些文库可用于鉴定和筛选那些可以结合预定靶分子的合成肽。噬菌体展示文库和化学合成文库都受到文库容量的限制，它们可产生的文库大小在106-109范围内。这一限制导致分离到亲和力相对较低且不耗时的后续成熟的肽。这一限制导致了体外产生文库技术的发展，其中包括mRNA展示(Roberts，& Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，12297-12302.(1997))、核糖体展示(Mattheakis et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，9022-9026(1994))和CIS展示(Odegrip et al Proc.Natl.Acad.Sci USA 1012806-2810(2004))等等。这些文库优于噬菌体展示文库的地方在于这些方法产生的文库容量比噬菌体展示的可能容量大2-3个数量级。然而，与噬菌体展示相比，这些文库在分离得到同时具有蛋白酶抗性和生物活性特性的肽这一方面并不具备优越性。
尽管这些体外方法被看好，但合成衍生肽的应用还没有成为制药工业的主流。存在的主要障碍是感兴趣的生物***内肽的不稳定性，可见于受体中蛋白酶和/或肽酶对具有潜力的肽的有害降解。用来处理肽降解问题的方法包括与天然的L-氨基酸相对应的D-氨基酸或被修饰的氨基酸的应用(例如，J.Eichler et al.，Med Res Rev.15：481-496(1995)；L.Sanders，Eur.J.DrugMetabol.Pharmacokinetics 15：95-102(1990))，环化肽的应用(e.g.，R.Egleton，et al.，Peptides 18：1431-1439(1997))，分离具有蛋白酶抗性的病毒颗粒(WO9958655)和开发能够在肽到达患者靶点前阻止其降解的增强转运***(例如，L.Wearley，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.8：331-394(1991)；L.Sanders，Eur.J.Drug Metabol.Pharmacokinetics 15：95-102(1990))。尽管这些用于稳定肽并从而阻止其在所选生物***(例如患者)内发生有害降解的方法具有前景，但仍然没有办法可以常规地、可靠地稳定肽类药物和候选药物。而且，许多现存的稳定和转运方法不能直接应用于筛选和开发全新的生物活性肽。因此，需要稳定生物活性肽以及鉴定全新肽稳定剂化合物的方法。这样的方法可为肽类药物研发领域提供十分需要的进展。
本发明的这些和其他应用、特征和优点通过在此提供的内容使本领域技术人员将更清晰。
发明内容
第一方面，本发明提供了从体外产生的包含大量肽的文库中选择抗蛋白水解的全新化合物(称为肽稳定剂)的方法，其包括以下步骤：
a)表达大量的核苷酸构建体，其中每一个核苷酸构建体都编码杂合肽，所述杂合肽包括：
i)生物活性部分；和
ii)假定的肽稳定剂部分；
b)使表达的杂合肽暴露于一种或多种蛋白酶；
c)使表达的杂合肽暴露于靶分子，其能够以可检测的方式与生物活性部分相互作用；以及
d)如果靶分子和一个或多个表达的杂合肽的生物活性部分发生了可检测的相互作用，则将所述的一个或多个表达的杂合肽确定为包含肽稳定剂化合物。
本发明的肽稳定剂文库由例如肽或肽衍生物组成，所述肽衍生物如为天然或非天然氨基酸组成的拟肽和肽类似物。根据本发明，本发明所分离的肽稳定剂不是天然的氨基酸序列，其对例如胰蛋白酶或凝血酶这样的酶产生的蛋白水解具有抗性。优选地，该肽稳定剂是具有约6到约30个氨基酸残基，优选约7到约25个氨基酸残基，最优选约8到20个氨基酸残基的非天然氨基酸序列。
任选地，本发明针对肽稳定剂与生物活性肽的组合从而形成包含肽稳定剂部分和生物活性部分的杂合分子的选择。肽稳定剂部分的蛋白酶抗性提高了杂合分子的蛋白酶消除时间的半程时间(或半衰期)。
在本发明中，优选通过预定蛋白酶或肽酶选择具有蛋白水解抗性的化合物，即其蛋白酶消除半衰期在预定酶最佳活性条件下大于30分钟，优选大于3个小时，并且优选地对其它酶类(incidental enzyme)的蛋白水解也有抗性。这样化合物的特别实例包括线性或环状有的肽，长度优选地在大约8到20个氨基酸残基之间，及其组合，任选地在这些肽的N端或C端或两端有修饰，也包括它们的盐类和衍生物、其功能类似物和在序列末端携带氨基酸或多肽的延长肽链。
根据本发明的一个实施例，体外产生核苷酸-肽稳定剂的文库通过合适的方法产生，与生物活性部分融合，并在预定肽酶或蛋白酶存在下筛选与生物活性分子靶标的结合。对能够结合靶标并对预定蛋白酶或肽酶有抗性的文库成员回收并对其进行表征。根据本发明，预定肽酶或蛋白酶在结合到生物活性分子靶标之前、之中或之后添加到文库中。任选地，本发明提供了可以与不同的生物活性部分结合从而提高每个杂合分子的消除半衰期的肽稳定剂部分。本发明也提供了对具有两个或多个肽稳定剂部分和一个生物活性部分或其他任何本领域技术人员可想到的组合的杂合配体进行的选择。
根据本发明，还可筛选其中肽稳定剂部分并入到生物活性部分序列内的杂合分子。
这样，在本发明的一个特定实施例中，蛋白水解抗性杂合分子可以选自由生物活性部分肽序列衍生所得的序列组成的文库，所采用的筛选方法如下：
a)表达大量的核苷酸构建体，其中每一个核苷酸构建体编码由生物活性肽序列衍生得来的杂合肽，其包括：
i) 生物活性部分；和
ii)假定的肽稳定剂部分；
b)使表达的杂合肽暴露于一种或多种蛋白酶；
c)使表达的杂合肽暴露于靶分子，其能够以可检测的方式与生物活性部分相互作用；以及
d)如果靶分子和一个或多个表达的杂合肽的生物活性部分发生可检测的相互作用，则将所述的一个或多个表达的杂合肽确定为包含肽稳定剂化合物。
本发明的生物活性肽包括任何可用作治疗剂或诊断剂的化合物，其可以包括在体外合成的核苷酸编码的文库中。生物活性肽的非限制实例包括酶、激素、细胞因子、抗体或抗体片段、抗体所识别的肽片段、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、影响肾脏功能和电解质代谢的药物、作用于中枢神经***的药物和化疗药物，仅举几例。
根据本发明，与包含活性部分但缺少肽稳定剂部分的相同生物活性肽相比，包含肽稳定剂部分和生物活性部分的杂合分子提高了药代动力学和药效学性质。杂合体提高了药代动力学和药效学性质从而提供了低剂量的药物制剂和全新的药物组合物。本发明提供了使用该全新组合物的方法，其包括该杂合分子的治疗或诊断性应用。
本发明针对肽稳定剂与生物活性肽的组合，其提高了具有相对较短的蛋白酶消除半衰期的生物活性肽的蛋白酶消除半衰期。该组合根据多种设想的目的所选择，其中包括当本发明涉及该生物活性肽在体内应用时则提高生物活性肽的治疗或诊断功效，例如提高生物活性化合物的蛋白酶消除半衰期。通常，将肽稳定剂融合或化学连接(例如“偶联”)到生物活性肽上为组合物提供了延长的蛋白酶消除半衰期。
因此，本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包括至少一种上述方法所鉴定的肽稳定剂化合物，生物活性分子和合适的载体。本发明的药物组合物根据常规标准制成，可以通过口腔、静脉、鼻腔、眼部或其他标准途径施用。该药物组合物的剂型可以是：片剂、丸剂、洗剂、凝胶剂、液体、散剂、栓剂、混悬剂、喷雾剂、脂质体、微粒或其他本领域已知的合适剂型。
本发明的另一方面提供了赋予生物活性肽分子以蛋白水解抗性的方法，其包括将以上描述的方法所鉴定的肽稳定剂化合物连接到生物活性肽分子上。
在此引用的所有参考文献通过引用将其全部内容纳入本文。除非其他说明，在此使用的所用技术和科学名词与本发明所属技术领域内普通技术人员常识相同的意思。
附图说明
图1显示了在实施例1的凝血酶抗性肽库 中鉴定肽稳定剂序列所使用的构建体的图示说明。X-X-X代表了分离FLAG表位和凝血酶裂解位点的随机12mer肽库。箭头显示了潜在的凝血酶(Pro-Arg)和胰蛋白酶裂解位点(Lys或Arg)。
图2显示了5轮筛选后的凝血酶抗性肽。数值以百分比表示((与凝血酶温育后读取的OD450nm)/(无凝血酶的温育读取的OD450nm))。100％表示对凝血酶裂解的完全保护。对照棒图是SEQ NO：002所示的肽所观察到的抗性。
图3显示了胰蛋白酶抗性肽。A.含胰蛋白酶温育的非选择文库肽。B.不含胰蛋白酶温育的非选择文库肽。C.含胰蛋白酶温育的5轮凝血酶筛选肽。D.不含胰蛋白酶温育的5轮凝血酶筛选肽。
图4显示了在实施例2的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抗性肽库中鉴定肽稳定剂序列所使用的构建体的图示说明。
图5显示了实施例2中1-4轮的PCR回收物的溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳图，并使用抗FLAG抗体与胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶处理(CT)或无蛋白酶处理(NP)进行选择。
图6显示了PCR引物的核苷酸序列，这些序列用于实施例2的文库构建。
发明内容
在此使用的名词“肽”、“肽稳定剂”、“生物活性肽”和“杂合分子”是指大量的氨基酸在线性链上连接在一起。因此，此使用的名词“肽”、“肽稳定剂”、“生物活性肽”和“杂合分子”包括二肽、三肽、寡聚肽和多聚肽。一个二肽包含2个氨基酸；一个三肽包含3个氨基酸；名词寡聚肽通常用来描述具有2到大约50或更多氨基酸的肽。大于大约50的肽通常指多聚肽或蛋白质。根据本发明的目的，名词“肽”、“肽稳定剂”、“生物活性肽”和“杂合分子”不限于任何特定数目的氨基酸。然而优选地，它们包含约2到约50个氨基酸，更优选地约2到约40个氨基酸，最优选地约2到约20个氨基酸。
在此使用的“肽稳定剂”、“生物活性肽”和“杂合分子”是上述的氨基酸序列，所述氨基酸序列可包含天然和非天然的氨基酸残基。因此，包括模拟特定氨基酸或肽的非氨基酸化学结构的所谓的“拟肽”和“肽类似物”，在本发明文中也可以是肽稳定剂。这样的模拟物或类似物的特征通常表现为相似的物理特征，例如其肽对应体中发现的在适当空间方向中的大小、电荷或疏水性。拟肽化合物的一个特定实例是一个化合物，其一个或多个氨基酸间的酰胺键被碳-碳键或其他本领域已知的键所取代(可见，例如Sawyer，inPeptide Based Drug Design pp.378-422(ACS，Washington DC.1995))。
因此，名词本发明范围内的“氨基酸”使用了其最广泛的涵义，且其意包括天然的L.α-氨基酸或残基。在此使用常用的天然氨基酸的一个和三个字母简写(Lehninger，A.L.，Biochemistry，2d ed.，pp.71-92，(1975)，WorthPublishers，New York)。标准单字母编码和标准三字母编码之间的对应关系是本领域技术人员熟知的，在此复述如下：A＝Ala；C＝Cys；D＝Asp；E＝Glu；F Phe；G＝Gly；H His；I＝Ile；K＝Lys；L＝Leu；M＝Met；N＝Asn；P＝Pro；Q＝Gln；R＝Arg；S＝Ser；T＝Thr，V＝Val；W＝Trp；Y＝Tyr。该术语包括D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸例如氨基酸类似物、那些通常不包含在蛋白质中的天然氨基酸(如己氨酸)和具有本领域内已知的氨基酸特征的化学合成化合物。例如，苯基丙氨酸或脯氨酸的类似物或者模拟物，其具有与自然Phe或Pro相同的肽化合物构象限制性，它们包括在氨基酸的定义之内。这样的类似物和模拟物在此称为氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他实例可见Roberts and Vellaccio The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Grossand Meiehofer，eds.，Vol.5 p.341，Academic Press，Inc.，N.Y.1983，其通过引用的方式纳入本文。
在本发明文中使用的肽稳定剂可与生物活性肽“偶联”。名词“偶联”使用其最广泛的意思以包括本领域内已知的所有附着和连接方法。例如，肽稳定剂可以是生物活性肽C-或N-末端的氨基酸延长。另外，可以在与生物活性肽和肽稳定剂之间有短的氨基酸连接序列。在这种情况下，肽稳定剂、任选的连接子和生物活性肽通过核酸编码，该核酸包含编码生物活性肽的序列和编码肽稳定剂的序列，所述的编码生物活性肽的序列可操作地连接于任选的编码短多聚肽的连接子序列(意思是该核酸序列是连续的且在阅读框架内)。在这一典型情况下，认为肽稳定剂任选地通过一个连接序列与生物活性肽“偶联”。根据本发明，只要该肽稳定剂氨基酸序列的***不干扰生物活性肽的功能，该肽稳定剂氨基酸序列就可以打断或替换生物活性肽氨基酸序列的一部分。任选地，本发明提供了一种“偶联物”，其由核酸编码，该核酸包括编码生物活性肽的序列，所述序列编码生物活性肽的序列被编码肽稳定剂的序列打断并可操作地连接至编码肽稳定剂的序列。本发明进一步提供了杂合分子，其中肽通过任选的连接子序列化学偶联到生物活性肽或者其他治疗性化合物。通常，肽稳定剂可以通过氨基酸侧链(在生物活性肽中间的某些不干扰生物活性肽活性的位置)连接到生物活性肽上。此时再次认为该肽“偶联”到生物活性肽上。
“蛋白酶消除半程时间/半衰期”根据Goodman and Gillman′s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25(Alfred Goodman Gilman，Louis S.Goodman，and Alfred Gilman，eds.，6th ed.1980)的描述来使用。简要地说，该名词意指包括药物被蛋白水解活性消除的时程的定量测定。因为药物浓度经常不接近消除过程满足所需要的浓度，所以大多数药物的消除是指数式的(即符合一阶动力学)。指数过程的比率可以用其比率常数K表示，其表示了每单位时间的微量变化，或者用其半衰期t1/2，表示，其是该过程完成50％所需的时间。这两个系数的单位分别是时间-1和时间。反应的一阶比率常数和半衰期是简单相关的(k.times t1/2＝0.693)并且可以做相应的互换。因为一阶消除动力学显示了每单位时间内丧失固定量的药物，药物浓度的对数对时间的图在起始分布期之后(即，药物吸收和分布完成后)的所有时间内都是线性的。蛋白酶或肽酶活性的药物消除半衰期可以从这样的图形中准确地确定。
本发明描绘了通过对体外产生的文库同时筛选具生物活性和稳定性的肽，从而在肽药物开发领域内产生的显著进步。
合成编码大量肽的体外产生的核酸文库，并在一个或多个预定蛋白酶或肽酶存在下筛选其对靶标的结合。不能结合靶标，或更重要的，不能在预定蛋白酶或肽酶存在下结合靶标的文库成员通过洗脱或其他本领域技术人员已知的方法去除。编码肽稳定剂部分和生物活性肽部分的文库成员会保持对靶标的结合。这些编码肽稳定剂和生物活性肽文库成员并结合靶标的杂合分子其后被回收，并通过相关核酸的测序、所编码的杂合分子的表达或合成分别对其进行表征，以确认肽稳定剂部分上的生物活性肽靶标的结合和预定蛋白酶或肽酶的抗性。任选地，本发明提供了杂合分子，其惊人地效果在于仍具有一个或多个预定蛋白酶或肽酶的已知裂解位点，但通过肽稳定剂部分可以保持对该蛋白酶或肽酶裂解的抗性。
根据本发明，编码多个肽以及一种独立的生物活性肽的体外产生的核酸文库是以这样的方式合成的，即使得生物活性肽的蛋白酶裂解可以打断编码核酸和生物活性肽以及文库肽之间的连接。该文库在一个或多个预定蛋白酶或肽酶存在下用来筛选对生物活性肽靶标的结合。不能结合靶标的文库成员，或更重要的，在预定蛋白酶或肽酶存在下不能保护生物活性肽以免降解的文库成员通过洗脱或其他本领域技术人员已知的方法去除。这些编码肽稳定剂和生物活性肽文库成员的靶标结合杂合分子其后被回收，并通过对相关核酸的测序、所编码的杂合分子的表达或合成来对其分别进行表征，以确认肽稳定剂部分上的生物活性肽靶标的结合和预定蛋白酶或肽酶的抗性。根据本发明，分离得到的肽稳定剂部分预计可以保护其他未在筛选中使用的生物活性肽。任选地，根据本发明分离得到的肽稳定剂部分预计可以保护此或其他生物活性肽对抗没有在筛选中使用的肽酶和蛋白酶，如同实施例1中描述的凝血酶抗性肽稳定剂部分另外具有抗胰蛋白酶的能力。实施例1中描述的肽稳定剂部分在阻止生物活性肽的蛋白水解降解方面有用。通过实施例的方法，本发明的肽稳定剂部分可以与生物活性肽副甲状腺激素相连从而产生本发明的具有提高了的蛋白酶抗性的杂合分子。这样的杂合分子用做治疗骨质疏松的改进药物化合物，这种改进是由升高的蛋白酶抗性和延长的生物活性所产生的。
任选地，根据本发明分离的编码肽稳定剂部分的某些核酸库，例如实施例1中描述的那些，可以用于阻止生物活性肽的蛋白水解降解。通过实施例的方法，从实施例1中描述的第4或第5轮筛选而富集的本发明肽稳定剂部分的核酸库可以与编码任何生物活性肽的核酸融合，从而产生本发明的杂合分子。这样的库可以通过本发明的方法或本领域技术人员已知的任何方法进一步筛选，得到对预定生物活性肽最合适的肽稳定剂部分。
本发明提供了基于已有的生物活性肽序列的偏爱性体外核苷酸-肽文库，这样在该生物活性肽上的任何位点，大部分文库将编码生物活性肽上存在的氨基酸。使用化学DNA寡聚核苷酸合成和PCR产生这种文库的许多方法是本领域内的技术人员已知的，如利用三核苷酸密码子突变(Sondek&Shortle，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3581-3585)的偏爱性核苷酸的应用(biasing nucleotide usage)(Wolf & Kim，Protein Sci.8：680-688(1999))，并且这些可以用于所有的体外展示文库方法。在一个或多个预定蛋白酶或肽酶存在下，筛选文库与生物活性肽靶标的结合。不能结合靶标的文库成员，或更重要的，在预定蛋白酶或肽酶存在下不能保护生物活性肽以免降解的文库成员通过洗脱或其他本领域技术人员已知的方法去除。这些编码肽稳定剂和生物活性肽文库成员的靶标结合杂合分子其后被回收，并通过对相关核酸的测序、编码杂合分子的表达或合成来分别表征，以确认肽稳定剂部分上的生物活性肽靶标的结合和预定蛋白酶或肽酶的抗性。根据本发明，发现该肽稳定剂部分或者在生物活性部分的内部或者与其偶联。任选地，两个或更多的肽稳定剂部分是在生物活性肽部分内被编码。因此，本发明提供了肽稳定剂部分，其可以保护或增强生物活性部分的生物活性而没有改变杂合分子的大小，即没有使杂合分子与原始生物活性部分的大小有所不同。从生物活性部分衍生得到的本发明的杂合分子可以通过延长或增强患者体内的生物活性而用作改进的治疗剂。所述延长或增强的生物活性来源于肽稳定剂部分。
任选地，本发明提供了本文分离出的蛋白酶抗性的杂合分子，并且，该并入了肽稳定剂部分的杂合分子适用于口服施用。优选地，该口服施用的杂合分子只包含天然的L-氨基酸。所述的杂合分子可任选地通过酰胺化或羧化或者本领域技术人员已知的其他方法在N-和C-端修饰。通过实施例的方式，也不排除其它方式，如WO-A-0215923(用于治疗动脉硬化)中描述的生物活性肽，其只包含L-氨基酸，当其包含于本发明的杂合分子中时，将适用于口服施用。由WO-A-0215923的生物活性部分衍生得到的本发明的杂合分子可用作在患者体内通过延长生物活性而改进的治疗剂。所述的延长的生物活性从本发明的肽稳定剂部分衍生得到。这样，本发明所确定的杂合分子可以用作阻止心脏疾病的药物化合物，并且可以静脉、肌肉注射施用，或更优选地口服施用。
也有可以使用在此描述的“肽稳定剂”的变体。有一些变体是可行的。变体可以制备并测试其蛋白酶抗性，例如，使用如ELISA这样的结合测试。变体的一个类型是在此描述的“肽稳定剂”的截断变体。在此实施例中，变体通过从“肽稳定剂”的N或C端去除一个或多个氨基酸残基来制备。在一些实例中，制备并测试了一系列此种变体。测试该系列得到的信息用于确定对蛋白酶抗性必须的“肽稳定剂”的区域。内部删除或***的系列可以相似地构建和测试。
变体的另一种类型是取代。在一个实施例中，对“肽稳定剂”进行丙氨酸扫描以确定有利于稳定活性的残基。在另一个实施例中，构建在一个或多个位点取代的文库。该文库对原始残基可以是非偏爱性的，或如果多位点是变化的，则可为偏爱性的。在一些实例中，取代局限于保守取代。
变体的一个相关类型是“肽稳定剂”，其包括一个或多个非天然的氨基酸。这样的变体配体可以通过化学合成产生。一个或多个位点可以用非天然的氨基酸取代。在一些实例中，取代的氨基酸可以与原始天然残基化学相关(例如，脂肪族、带电的、碱性、酸性、芳香的、亲水的)或是原始残基的电子等排物。
也可以包括非肽连接和其他化学修饰。例如，“肽稳定剂”的部分或全部可以合成为肽模拟物，例如类肽(可见，例如Simon et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-71 and Horwell(1995)Trends Biotechnol.13：132-4)。肽可以包括一个或多个(例如全部)不可水解键。许多不可水解肽键，以及合成含这些键的肽的工艺是本领域已知的。示例性的不可水解键包括--[CH.sub.2NH]-还原氨基肽键，--[COCH2]--酮亚甲基肽键(ketomethylenepeptide bond)，--[CH(CN)NH]--(氰亚甲基)氨基肽键，--[CH2CH(OH)]--羟基亚乙基肽键，--[CH2O]-肽键，和--[CH2S]--硫亚甲基肽键(可见例如，U.S.Pat.No.6,172,043)。
实施例
本申请使用的以下工艺在Sambrook，J.，et al.，1989 supra.：analysis ofrestriction enzyme digestion products on agarose gels and preparation ofphosphate buffered saline中有描述。
通用试剂购自SIGMA-Aldrich Ltd(Poole，Dorset，U.K.)。寡聚核苷酸来自Eurogentec Ltd(Southampton，U.K.)。氨基酸，和S30提取物来自PromegaLtd(Southampton，Hampshire，U.K.)。蛋白酶购自SIGMA-Aldrich Ltd(Poole，Dorset，U.K.)或Novagen(Nottingham，UK)。Vent和Taq DNA聚合酶来自New England Biolabs(Cambridgeshire，U.K.)。抗人IgK抗体来自Immunologicals Direct Ltd (Oxfordshire，U.K.)以及M2抗-FLAG多克隆抗体来自SIGMA-Aldrich Ltd，(Poole，Dorset，U.K.)。
实施例1.鉴定抵御凝血酶和胰蛋白酶裂解的肽稳定剂
为例证本发明，凝血酶蛋白酶抗性肽选自N-末端cis展示文库，其通常与RepA融合，并且在tac启动子调控下，构建后包括：
a.能够结合抗-FLAG抗体(生物活性肽1)的FLAG肽部分，和
b.12氨基酸的随机文库，用其筛选具有凝血酶抗性的肽稳定剂部分，和
c.能够被凝血酶蛋白酶(生物活性肽2)裂解的4氨基酸的部分。
如图1所示，文库构建以及体外转录和翻译根据Odegrip等(Proc.Natl.Acad.Sci USA 101 2806-2810(2004)的描述进行。tac-FLAG-NNB-凝血酶裂解位点-RepA-CIS-ori PCR构建体的制备：通过PCR使用引物TRL(SEQ ID NO：001)附加FLAG表位和12-mer的NNB文库(其中N是核苷，B是C、T或G中一种)及其后连接的一个凝血酶裂解序列(编码GPRS，其中“R”＝P1)到tac启动子后，然后将其连接到RepA-CIS-ori区域上，再进行PCR扩增。体外传录和翻译在大肠杆菌S-30溶菌液***(30)中于30℃进行30分钟，其后使用封闭缓冲液(含2％BSA，0.1mg/ml青鱼***DNA的PBS)稀释。典型地，每50μl溶菌液中添加2μg线性DNA。加入生物素化的抗-FLAG(M2)(SIGMA)抗休，使其最终浓度为1单位/ml。加入人凝血酶(SIGMA)抗体，使其最终浓度为0.1单位/ml。溶液在筛选步骤的1、2和3轮中于25℃温育2小时，在4和5轮中于37℃温育2小时。向溶液中以溶液浓度50μl/ml添加链酶亲和素包裹的Dynal M280顺磁珠，在室温下温育10分钟，再用PBS/0.1％Tween-20尽力洗涤。根据以上描述，洗脱、纯化DNA，扩增N-末端文库区并与RepA-CIS-ori组装在一起，为下一步筛选产生输入DNA(input DNA)。为使筛选发挥作用，生物活性肽的凝血酶底物序列必须用随机文库区编码的肽稳定剂保护以免裂解。
从第五轮筛选回收的DNA使用PCR来扩增，纯化并使用NotI和NcoI来消化。DNA再连接到相似消化的M13 gpIII噬菌体粒载体上，并转化到大肠杆菌XL-1蓝细胞内，涂布到2％琼脂糖，2×TY，100μg/ml氨苄青霉素的平板上。单个菌落生长生产前述的噬菌体颗粒(Odegrip et alProc.Natl.Acao.Sci USA 101 2806-2810(2004))。NUNC Maxisorp平板使用100ng/孔的抗-FLAG M2抗体的PBS在4℃包裹过夜。使用结合的噬菌体在含2％BSA的PBS和+/-人凝血酶(0.1单位/ml)中温育1小时来做ELISA测试。测试是通过使用SureBlue TMB过氧化酶底物(Insight Biotechnology，Middlesex，UK)进行显色，在450nm处读取数值。
在五轮筛选后，发现了对凝血酶的抗性范围(图2)，其中，所有的第五轮筛选到的肽比对照FLAG表位-凝血酶底物序列DYKDDDRSGGSGLGPRSG(SEQ ID NO：002)具有更高的抗性，该底物序列在凝血酶中温育1小时没有抗-FLAG结合。序列分析显示几乎所有的肽(70％)保留了凝血酶裂解位点(SEQ ID NO：003-SEQ ID NO：027)，说明文库成员肽保护了凝血酶底物肽免于裂解。
为研究对其它蛋白酶的抗性，从未筛选文库或五轮凝血酶抗性筛选后文库中来源的94个克隆与胰蛋白酶-琼脂糖一同在25℃温育2小时，再使用针对抗-FLAG抗体(该抗体是胰蛋白酶敏感的，因此要分开温育)的ELISA分析。胰蛋白酶在R或K后裂解，这样在FLAG表位和凝血酶底物序列上确定有2个胰蛋白酶位点。由于未对胰蛋白酶抗性进行筛选，而且FLAG表位易于被胰蛋白酶裂解，所以即使是对胰蛋白酶的部分抗性也是惊人的。这样的抗性在凝血酶抗性的第五轮筛选中可见，但在未筛选文库的肽中没有(图3)。惊人的是，特定的肽稳定剂组分能够保护生物活性肽免于其它蛋白酶(incidental protease)的裂解(见表1)。
实施例2.显示对抵御胰凝乳蛋白酶裂解的肽稳定剂的富集
为进一步例证本发明，蛋白酶抗性肽选自混合长度的N-末端cis展示文库，其通常与RepA融合，并且在tac启动子调控下，构建后包括：
a.能够结合抗-FLAG抗体(生物活性肽1)的FLAG肽部分，和
b.包含12、9和6氨基酸的混合文库，用其筛选蛋白酶抗性肽稳定剂部分，和
c.能够被一些蛋白酶，包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(生物活性肽2)所裂解的9氨基酸的部分，见图4。
文库构建以及体外转录和翻译根据Odegrip等(Proc.Natl.Acad.Sci USA101 2806-2810(2004)的描述进行。tac-FLAG-NNB-蛋白酶裂解位点-RepA-CIS-ori PCR构建体的制备：通过PCR使用引物309、310或311(SEQID NOS：034-036)附加FLAG表位和12-mer、9-mer或6-mer的NNB文库(其中N是核苷，B是C、T或G中一种)及其后连接的一个蛋白酶裂解序列(编码FSGPRTLTY，其中对于胰蛋白酶和凝血酶“R”＝P1，对于胰凝乳蛋白酶“Y”＝P1)到tac启动子后，然后将每一个连接到RepA-CIS-ori区域上，再使用PCR扩增。混合每种构建体的等量产物以产生在蛋白酶抗性肽稳定剂部分内编码12、9或6个氨基酸的文库。如实施例1那样进行体外转录和翻译，并使用封闭缓冲液(含2％BSA和0.1mg/ml青鱼***DNA的PBS)以1∶10稀释，再加入十分之一体积的10x凝血酶消化缓冲液(200mMTris-HCl pH8.4，1.5M NaCl，25mM CaCl2)。第一轮筛选在150μl S-30溶菌液中表达9μg线性DNA，同时在后续轮次中使用5μgDNA和100μl溶菌液。通过添加胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行蛋白酶消化，每种蛋白酶已经固化在琼脂糖珠(SIGMA)中，其后倒置混合，并在室温下温育2小时。在第一轮中，使用0.8个单位的胰凝乳蛋白酶和1.0个单位的胰蛋白酶，而在第二、三和四轮中分别使用0.4和0.5个单位，0.6和0.75个单位，以及0.8和1.0个单位。通过离心去除蛋白酶，上清使用在实施例1中描述的生物素化的抗FLAG(M2)(SIGMA)抗体和抗生蛋白链菌素包裹的Dynal M280顺磁珠进行筛选。这些筛选中不考虑凝血酶消化。如实施例1中描述的，对DNA洗脱、纯化和组装用于其后轮次的筛选。
1-4轮之后产生的等量的文库DNA在表达和蛋白酶消化之后，对其蛋白酶抗性产物的恢复进行比较，结果显示了蛋白酶抗性肽稳定剂部分的筛选和富集。1-4轮筛选后产生的等量(3.2μg)文库DNA在100μl溶菌液中表达并如上所述稀释。每一种文库分为相等的两部分，每部分中添加0.4个单位的胰凝乳蛋白酶和0.5个单位的胰蛋白酶-琼脂糖。温育后，去除蛋白酶，使用如上所述的生物素化的抗FLAG(M2)(SIGMA)抗体和抗生蛋白链菌素包裹的Dynal M280顺磁珠筛选受保护的肽，PCR回收的产物进行琼脂糖凝胶电泳(图5)。在无蛋白酶消化的情况下，从1-4轮中的DNA中产生了大约等量的产物，说明由此材料而来的表达、筛选和回收没有差异。有蛋白酶消化时，第一轮产生了相对不存在时而言很少的产物。然而，在随后的轮次中这一差异不那么显著，第四轮材料产生的产物在有或无蛋白酶降解时都大约相等。这证明了文库中能够稳定生物活性肽蛋白酶抗性的物质的富集。
尽管在此详细的公开了本发明的特定实施例，但其只是通过实施例的方法完成并仅用于说明本发明。上述实施例对后面所附权利要求的范围并不构成限制。发明人指出，在不背离本发明的精神以及权利要求书种所限定的本发明的范围的前提下，可对本发明进行多种替代，改造和修饰。
表1-肽稳定剂序列
SEQID001 5’-GGCGTACCGATGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCGGATCGAGGACCVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNVNNGTGCCAGTAATCATCAAACTTGTAGTC
 SEQID002 凝血酶对照序列 DYKDDDRSGGSGLGPRSG
 SEQID003 凝血酶抗性 HYPPPSTPYTTD
 SEQID004 凝血酶抗性 PTPTNPPQSAAD
 SEQID005 凝血酶抗性 ESPRPPARPPND
 SEQID006 凝血酶抗性 NHPTTNDGPSVK
 SEQID007 凝血酶抗性 PNRNFQQNTNHN
 SEQID008 凝血酶抗性 PATNPHTNSNAN
 SEQID009 凝血酶抗性 HNVNPNQPHNDT
 SEQID010 凝血酶抗性 VPTSTYAITDPT
 SEQID011 凝血酶抗性 PTMTRPSNTEAE
 SEQID 凝血酶抗性 PTPSHSTHRDPE
  012
  SEQID013   凝血酶抗性   HPHHPSNQAPTD
  SEQID014   凝血酶抗性   AAPDETTTPNRD
  SEQID015   凝血酶抗性   VNFAATSSNDRD
  SEQID016   凝血酶抗性   HDGRPPQHHHPH
  SEQID017   凝血酶抗性   MTMGTRPTRDTH
  SEQID018   凝血酶抗性   VNKQTTASQAHH
  SEQID019   凝血酶抗性   TNFSKDEQPTPD
  SEQID020   凝血酶抗性   GRPATAPCTHGN
  SEQID021   凝血酶抗性   DRSRASTRRDRH
  SEQID022   凝血酶抗性   SRHRTNAGETDH
  SEQID023   凝血酶抗性   ATGPIPHTPQGS
  SEQID024   凝血酶抗性   TDPPANDNAQPH
  SEQID025   凝血酶抗性   RFVSDHNITAAD
  SEQID026   凝血酶抗性   QPHNHPRPIKQH
  SEQID027   凝血酶和胰蛋白酶抗性   ITPPDNSHTPDE
  SEQID028   凝血酶和胰蛋白酶抗性   HGHSPSDNANTR
  SEQID029   凝血酶和胰蛋白酶抗性   HCVHEPQTKHES
  SEQID030   凝血酶和胰蛋白酶抗性   PSCPNKQDPTHD
  SEQID   凝血酶抗性   TDCSHNPTDPCE
  031
  SEQID032   凝血酶抗性   RAGELGAPADPD
  SEQID033   凝血酶抗性   QKPNHDTERELD
Figure I2006800120721I00011
Figure I2006800120721I00021
Figure I2006800120721I00031
Figure I2006800120721I00041
Figure I2006800120721I00051
Figure I2006800120721I00071
Figure I2006800120721I00081
Figure I2006800120721I00091
Figure I2006800120721I00101
Figure I2006800120721I00111
Figure I2006800120721I00131

Claims (17)

1.从体外产生的核酸库体外鉴定肽稳定剂化合物的方法，其包括如下步骤：
a)表达大量的核酸构建体，其中每个核酸构建体编码杂合肽，
该杂合肽包括：
i)生物活性部分；和
ii)假定的肽稳定剂部分；
b)使表达的杂合肽暴露于一种或多种蛋白酶；
c)使表达的杂合肽暴露于靶分子，该靶分子能够以可检测的方式与生物活性部分相互作用；和
d)如果靶分子和一个或多个表达的杂合分子的生物活性部分之间发生可检测的相互作用，确定所述的一个或多个表达的杂合肽包含肽稳定剂化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将一个或多个步骤(d)中表达的杂合肽与相应的核酸构建体相关联，从而确定该肽稳定剂化合物的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)和(c)以先(c)后(b)的顺序进行，或者同时进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中的肽稳定剂部分包括长度在2到20个残基之间的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中的肽稳定剂部分被包含在生物活性部分之内。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中的生物活性部分包括以下构成的组中的一个或多个：酶、激素、细胞因子、抗体、抗体片段、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、影响肾脏功能和电解质代谢的药物、作用于中枢神经***的药物和化疗药物。
7.肽稳定剂化合物，其由序列SEQ ID NO：003组成。
8.生物活性肽，其包括生物活性部分和权利要求7所述的肽稳定剂化合物。
9.根据权利要求8所述的生物活性肽，其中的生物活性部分选自如下构成的组：酶、激素、细胞因子、抗体、抗体片段、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、影响肾脏功能和电解质代谢的药物、作用于中枢神经***的药物和化疗药物。
10.药物组合物，其包括肽稳定剂化合物SEQ ID NO：003、生物活性分子和合适的载体。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中的生物活性分子选自如下构成的组：酶、激素、细胞因子、抗体、抗体片段、镇痛剂、解热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、影响肾脏功能和电解质代谢的药物、作用于中枢神经***的药物和化疗药物。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其中的肽稳定剂连接到生物活性分子上。
13.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其中的肽稳定剂被包含在生物活性分子内。
14.根据权利要求10或11所述的药物组合物，其中的组合物适于口服施用。
15.赋予生物活性肽分子蛋白水解抗性的方法，其包括将肽稳定剂化合物SEQ ID NO：003连接到生物活性肽分子上。
16.根据权利要求15所述的方法，其中的肽稳定剂化合物偶联到生物活性分子上。
17.根据权利要求15所述的方法，其中的肽稳定剂化合物与生物活性分子为遗传学上的融合。
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