CN101160414A - 检测hpv的方法及探针,引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的材料和方法,所述方法包含下述步骤:(i)扩增样品中的多核酸片段,其包含任意HPV核酸的B区域或由它组成,所述B区域表示在图1中,和(ii)使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能与HPV的B区域特异性地杂交的探针,所述B区域表示在图1中。
Description
发明领域
本发明涉及人***状瘤病毒(HPV)感染的检测和鉴别领域。
发明背景
子***是妇女的第二最常见恶性肿瘤,仅次于乳腺癌。子***的独特之处是,它是在几乎所有病例和全球的前体病变中发现HPVDNA的第一种重要实体瘤。
已经表征了超过100种HPV类型,并以分离的时间次序编号。HPV是趋上皮的,仅仅感染皮肤(皮肤类型)或呼吸道和***生殖道的粘膜(粘膜类型)。已知超过40种HPV类型会感染子宫颈。基于诱导的良性的、恶化前的或恶性的病变,将HPV分别分成低危(例如,HPV类型6,11,42,43和44)和高危类型(例如,类型16,18,31,33和45)。高危类型占所有侵入性子***的超过99%。因此,HPV类型的检测和鉴别是非常重要的。高危类型定义为总是发现在高度SIL(鳞状上皮内的病变)和原位癌中,而低危类型主要发现在低度SIL中。该流行病学观察得到了分子发现的支持。例如,来自低危类型6和11的E6和E7蛋白结合p53和pRB,该结合过于微弱,难以体外使角质形成细胞永生,或体内诱导恶性转化(Woodworth等,1990)。低危HPV类型的环状ds-DNA基因组保持是附加体,而高危HPV类型的基因组能整合进人基因组中。
通常根据Papanicoloau(PAP)***,筛选子宫颈的恶性的和恶化前的病症。通过光学显微镜术检查子宫颈涂片,按照病变严重性的递增尺度,将含有形态学上异常的细胞的标本分成PAP I至V。该细胞形态学的方法是一种间接方法,测量HPV感染的可能结果。因此,HPVDNA检测和分型在二级筛选中是重要的,以便选择进行监视(随访)和治疗的患者。这意味着,应当分析归入PAP II(非典型性鳞状细胞化生)或更高级别的子宫颈涂片,得到低危和高危HPV类型。随访研究已经证实,仅仅高危HPV类型参与细胞学上正常的子宫颈细胞向高度SIL的发展(Remminck等,1995)。这些结果表明,高危HPV类型的存在是子***发展和检测的预后标记。
通过培养来诊断HPV是不可行的。另外,通过检测HPV抗体进行诊断,似乎受到不充分的灵敏度和特异性的阻碍。诊断HPV感染的直接方法主要是基于病毒DNA基因组的检测,其中使用不同形式的DNA/DNA或RNA/DNA杂交,进行或不进行HPV DNA的事先扩增。聚合酶链反应(PCR)是能非常有效地扩增微量靶DNA的方法。现在,主要有3对不同的引物用于HPV DNA的通用扩增(″广谱引物″)。3个这样的引物对(MY11/MY09,GP5/GP6和SPF1O***)是针对不同HPV类型的LI区域中的保守区(Manos等,1989;Van den Brule等,1990,WO9914377)。也使用PGMY***,它是MY09/11的改进(参见Gravitt,P.,2000.Improved amplification of genital humanpapillomaviruses.J.Clin.Microbiol.38:357-361)。另一个引物对CPl/CPllg是针对E1区域中的保守区(Tieben等,1993),但是不经常使用CPI/II。
存在几种鉴别不同HPV类型的方法。
通过仅识别一种特定类型的PCR引物,可以对HPV DNA进行分型。该方法称作类型特异性的PCR。已经对HPV类型6,11,16,18,31和33描述了这样的方法(Claas等,1989;Cornelissen等,1989;Falcinelli等,1992;Van den Brule等,1990;Young等,1989)。该引物分别是针对类型6,11,16,18,31和33的HPV基因组的E5,L1,E6,L1,E2和E1区域(Baay等,1996)。
另一种方法是,通用扩增来自所有HPV类型的基因组部分,然后分别与区分致癌组和非致癌组的类型特异性探针的两种混合物杂交。已经描述了一种类似的分型方法,不需要事先扩增HPV DNA。在杂交体捕获测定中(Hybrid Capture Sharp Assay;Digene,SilverSprings,MD),测试每个样品的″高危″HPV类型组(例如16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68)和另一个″低危″HPV类型组(例如6,11,42,43和44)(Cox等,1995)。
在WO9914377中公开的检测和分型***,使用PCR扩增步骤、和与类型特异性探针的反向线印迹杂交。
目前,人***状瘤病毒的正式分类是基于来自L1区域的291 bp片段的序列分型(Chan等J Virol.1995 May;69(5):3074-83,DeVilliers等,Virology.2004 Jun 20;324(1):17-27)。这些序列的***进化分析,允许将不同HPV类型分类。作为定义,如果2种HPV分离物之间在该区域的序列差异高于10%,则将它们分成不同类型。因此,如果序列与任意已知HPV类型的差异超过10%,则将它归入一种新的HPV类型。差异在2-10%之间的HPV分离物,归入不同亚型。最后,如果序列变异低于2%,将2种分离物归入相同亚型中,作为不同变体。
仍然需要改进的检测和分型***。
发明简述
本发明涉及对可能存在于样品中的任意HPV核酸进行分型的方法,所述方法包含下述步骤:使任意这样的核酸接触至少一种能与HPV的D区域特异性地杂交的探针,所述区域表示在图1中,然后基于这样得到的杂交结果,分析HPV类型。
本发明还涉及一种方法,其中在杂交步骤之前,进行扩增步骤,以扩增可能存在于生物样品中的任意HPV核酸。
这样,本发明涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:
(i)扩增样品中的多核酸片段,其包含任意HPV核酸的B区域,所述B区域表示在图1中,和
(ii)使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能与HPV的B区域特异性地杂交的探针,所述B区域表示在图1中。
本发明也涉及对可能存在于生物样品中的HPV进行检测和/或分型的方法,所述方法包含:
(i)使用下述引物,扩增HPV的多核酸片段:
-5’引物,其特异性地杂交于HPV 16的基因组的‘A’区域,所述‘A’区域表示在图1中,和
-3’引物,其特异性地杂交于至少一种HPV类型的基因组的‘C’区域,所述‘C’区域表示在图1中;
(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段与至少一种探针杂交,所述探针能与HPV的‘B’区域或‘D’区域特异性地杂交,所述区域表示在图1中。
本发明还涉及一种方法,其中进行放大步骤,以放大用于检测探针与可能存在于生物样品中的任意HPV核酸的杂交的任意信号。可以在有或没有扩增可能存在于样品中的任意HPV核酸的步骤的情况下,进行信号放大。
本发明还涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行分型的方法,所述方法包含,在任意分型步骤之前或同时,检测任意HPV核酸在样品中的存在的步骤。
本发明还涉及寡核苷酸探针和引物,其能实现所述的检测和/或鉴别HPV的方法。
本发明还涉及进行所述扩增和杂交步骤所依据的方案。杂交步骤的一种形式是,例如,反向杂交形式。
本发明还涉及试剂盒,其包含用于实施本发明的引物和/或探针和/或说明书。
附图说明
图1解释了不同的HPV序列与HPV 16序列Genbank登记号K02718.1的序列的比对,并显示了A,B,C和D区域的位置。
图2解释了B区域的***树,
图3解释了PCR产物的一个实例,使用单一PCR引物,
图4解释了凝胶多路PCR,
图5解释了使用线性探针测定可能得到的结果,
图6解释了使用Luminex(基于珠子的)方案,对DNA进行检测和分型的通用方法,
图7解释了一种可行的HPV″MPF″基因型分析测定;和
图8HPV解释了HPV类型16,18,26,31,33和35的″MPF″基因型分析图谱。
发明详述
本发明一般地涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:使存在的任意这样的核酸接触至少一种能与HPV基因组的D区域特异性地杂交的探针,所述D区域表示在图1中,然后检测任意可能发生的特异性的杂交,以确定样品中是否存在HPV核酸,以及它可能属于何种HPV类型。
优选地,所述探针能特异性地杂交于HPV基因组的B区域。
我们已经确定,HPV基因组的77个核苷酸组成的D区域(参见图1),和尤其是引物间B区域的31个核苷酸,是关于HPV分型的重要信息。
本发明的方法因而通常包含,使来自HPV的核酸与探针杂交,所述探针能与HPV的D区域和/或B区域杂交,所述杂交事件,或甚至在没有杂交事件的情况下,会提供辨别不同HPV类型的信息。
在可以发生探针的特异性杂交的反应条件下,发生探针与靶核酸的杂交。
可以在不同的分辨率水平,对样品中存在的HPV类型进行分析。
分析的分辨率可以是适用于鉴别单独的HPV类型,例如,HPV 16,18,或HPV 1。
也可以在更低的分辨率进行类型的分析,例如鉴别个体是否具有特定种类的HPV类型:例如,高危癌症类型或低危癌症类型,或皮肤类型。
尽管本发明的分型测定能适当地提供在样品中发现的所有特定类型的信息,但是它不一定(从使用者的观点看)能辨别精确的HPV类型,测定的结果可能仅仅需要在HPV类型的分类水平。
本发明因而涉及HPV分型的方法,所述方法允许鉴别高危HPV类型,不需要指出在样品中存在何种具体的高危类型。
高危类型(总是在高度SIL[鳞状上皮内的损害]和原位癌中发现的那些)的种类包括HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,和68。
低危类型(主要在低度SIL中发现)的种类包括类型HPV 6,11,34,40,42,43,44,53,54,70,和74。
优选地,在本发明中使用的特异性的探针能特异性地杂交于HPV基因组中77个核苷酸组成的″D″区域、合适地杂交于31个核苷酸组成的″B″区域,其中所述区域给出在图1的序列中。这些区域与HPV 16参照序列K02718的核苷酸6543-6619(D区域)和6566-6596(B区域)相相应。
应当理解,本文中使用图1的编号指示D和B区域,包括没有特别列出的、且可能与HPV参照序列或给定的其它序列不同的其它HPV序列中的等同区域。基于例如与图1序列的序列同源性或同一性,可以鉴别出另一个HPV基因组中的等同的A,B,C或D区域。
技术人员可以容易地进行核酸同一性/同源性的序列对比,例如,使用BLAST和BLAST 2.0算法,它们分别记载在Altschul等,Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977),和Altschul等,J.MoI.Biol.215:403-410(1990)。可以使用BLAST和BLAST 2.0,例如利用缺省参数,以确定本发明的多核苷酸的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件,可从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开得到。
因而,可以看出本发明涉及探针和探针的应用,所述探针能特异性地杂交于HPV的D区域、合适地杂交于B区域,所述区域表示在图1中,或能特异性地杂交于另一个HPV基因组中的等同区域,所述等同区域通过核酸同一性和/或同源性进行评定。为了避免怀疑,单个地要求保护本文所述的所有探针、和分成(在适当时)至少5,10,15,20,25,30,35,40个探针的组,各组从探针列表中选择。
本发明也涉及核酸片段,其基本上由分离的77个碱基对组成的D区域和分离的31个碱基对组成的B区域组成,任一个区域都是单链或双链核酸形式,作为RNA或DNA,也涉及这些核酸片段区域在HPV分型中的应用。
本发明的一个特征是探针的选择。
特异性地杂交于HPV基因组的优选D或B区域的探针,优选地能提供关于存在的HPV株的类型的信息(通过杂交结果),无论是单独的,还是与来自另一种或多种探针的信息相组合。关于HPV类型的信息优选地从探针与靶核酸的杂交的阳性检测得到,但是也可以从特定探针没有杂交得到。
适宜地,本发明的探针能特异性地杂交仅一种HPV类型的基因组的D区域和/或B区域,从而当该类型存在于生物样品中时,能实现该HPV类型的特异性鉴别。
因而,本发明的一个实施方案涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行分型的方法,所述方法包含下述步骤:使任意的这样的核酸接触至少一种探针,所述探针能特异性地杂交仅一种HPV类型的基因组的D区域和/或B区域,所述区域表示在图1中,然后基于这样得到的杂交结果,分析HPV类型。
本发明的探针也可以提供有用的信息,前提是它能特异性地杂交于有限数目类型(例如,仅2种HPV类型)的基因组的D区域和/或B区域。例如,这可以实现这些类型的鉴别,或可以与来自另一种探针的信息相组合,实现每种类型的特异性鉴别。
能给出关于HPV类型的信息的探针,例如上面的那些,通常视作本文的类型特异性的探针。优选的类型特异性的探针能特异性地杂交于仅一种HPV类型的基因组的D区域和/或B区域。根据本发明另一个优选的实施方案,一种探针能特异性地杂交于仅一种HPV类型的基因组的D区域,更具体地,特异性地杂交于位于A区域和C区域之间的31bp B区域,如图1所示。
可以鉴别样品中不同类型的HPV,其中使所述HPV类型的核酸杂交至少于1种、优选至少2种、更优选至少3种、更优选至少4种、最优选至少5种寡核苷酸探针。
表4含有特异性地杂交于D区域的优选探针的列表。这些探针可以一起使用,适当地在相同的杂交和洗涤条件下。优选的是反向杂交形式,例如,线性探针测定形式。本文列出的所有探针单个地要求保护。此外,本文也包括探针的所有组合。
在表4中列出的探针特异性地杂交于HPV的B和/或D区域,并能提供关于样品中可能存在的HPV靶核酸的具体类型的信息。
本领域的技术人员显而易见,可以在所述D或B区域内选择除了在表4中列出的那些以外的探针,优选能特异性地杂交于仅一种HPV-类型和/或能提供关于HPV类型测定的信息的探针。
在本发明中使用的探针可以具有附加的间隔序列,其不形成探针本身的一部分,但是例如可以允许附着到固体支持物上。间隔区域可以酶促地或化学地添加,且可以是探针的5′或3′。
适当地,本发明的探针的应用,允许对至少5种不同的HPV类型进行分型,优选至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,3 8,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50或至少51种不同的HPV类型。最优选地,本发明允许辨别超过30种不同的HPV类型,适当地超过35、超过40、超过45、和适当地超过50种不同的HPV类型。
适当地,使用本文所述的发明,可以辨别所有或基本上所有在图2的***树中给出的HPV类型。
优选地,首先扩增存在于样品中的任意HPV核酸,例如通过PCR或其它合适的扩增方法,然后杂交。使用允许扩增样品中的所有HPV核酸(无论类型)的所谓的″广谱″引物或引物组,可以扩增任意的靶核酸。
因而,存在于样品中的HPV核酸包括已经从样品扩增的核酸,这从上下文显而易见(即在杂交前存在扩增步骤)。
适当地,任意靶DNA的扩增包括图1的31个核苷酸组成的B区域的扩增。
因而,在一个实施方案中,本发明涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:
(i)扩增样品中的多核酸片段,其包含任意HPV核酸的B区域,所述B区域表示在图1中,和
(ii)使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能特异性地杂交于HPV的B区域的探针,所述B区域表示在图1中。
适当地,任意靶核酸的扩增包括图1的77个核苷酸组成的片段(即图1的D区域)的扩增。
因而,在一个实施方案中,本发明涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:
(i)扩增样品中的多核酸片段,其包含任意HPV核酸的D区域,所述D区域表示在图1中,和
(ii)使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能特异性地杂交于HPV的D区域的探针,所述D区域表示在图1中。
在另一个实施方案中,本发明提供了对可能存在于生物样品中的HPV进行检测和/或分型的方法,所述方法包含:
(i)使用下述引物,扩增HPV的多核酸片段:
-5’引物,其特异性地杂交于HPV 16的基因组的‘A’区域,所述‘A’区域表示在图1中,和
-3’引物,其特异性地杂交于至少一种HPV类型的基因组的‘C’区域,所述‘C’区域表示在图1中;
(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段与至少一种探针杂交,所述探针能与HPV的‘B’区域或‘D’区域特异性地杂交,所述区域表示在图1中。
适当地,待扩增区域包含HPV基因组的D区域的77个核苷酸6543-6619,其中编号是参照图1的HPV 16参照序列给出,或由该区域组成,或基本上由该区域组成。
待扩增区域适当地不超过HPV基因组的片段6543-6619,其中编号是参照HPV 16参照序列给出,或其它HPV基因组中的等同区域。
根据本发明的另一个优选的实施方案,所述特异性地杂交于至少一种HPV类型的基因组的A区域的5′引物的3′末端,位于HPV 16的基因组的位置6565(参照株Genbank登记号K02718.1),或在任意其它HPV基因组的相应位置,如图1所示。
根据本发明的另一个优选的实施方案,所述特异性地杂交于至少一种HPV类型的基因组的C区域的3′引物的3′末端,位于HPV 16的基因组的位置6597(Genbank登记号K02718.1),或在任意其它HPV基因组的相应位置,如图1所示。
用于扩增样品中的核酸的优选引物包括在表1和2中列出的那些。它们单个地和以组合形式要求保护。优选的是引物对,其包含正向和反向引物。
适当地,用于在特异性分型之前通用地扩增HPV核酸的引物,能扩增存在于样品中的所有HPV核酸。优选的是能扩增样品中的所有HPV核酸的引物组,适当地,该组包含一种或多种来自表1和2列出的集合的引物。任选地,可以使用在表1和2中列出的所有引物。引物组合能适当地用于相同反应条件下。
在包含本发明的D或B区域的任意合适片段上,可以进行核酸的扩增。用于扩增的优选片段的长度小于200个核苷酸,优选小于150个核苷酸,优选小于100个核苷酸。用于扩增的优选片段短得足以允许例如在子宫颈涂片和埋入石蜡中的样品中进行检测。
在本发明的另一个方面,本发明公开的引物和探针也可以用于定量PCR方案或定量杂交方案。定量PCR(QPCR)允许定量DNA,cDNA,或RNA模板的起始量。QPCR可以基于荧光报道分子的检测,所述荧光报道分子随着PCR产物在每个扩增循环中的积累而增加。荧光报道分子包括结合双链DNA的染料(即SYBR Green I)或序列特异性的探针(即分子信标或TaqMan_探针)。
如上所讨论的,某些探针可以提供关于精确HPV类型的信息,例如,如果它们能杂交特定的类型,但是不杂交其它类型(即类型特异性的探针)。也可以使用对D区域特异探针,来更通用地确定样品中是否存在任意HPV核酸,而不需要提供分型信息。这样的探针在本文中可以称作′通用探针′。然后,使用特异性的分型方法,例如类型特异性的探针或类型特异性的PCR,可以将HPV核酸阳性的样品具体地分型。或者,可以用通用探针探测样品,并同时特异性地分型。
通用探针可以含有作为核酸探针序列的一部分的肌苷残基,其允许与靶核酸的杂交的一些灵活性,且可以允许杂交不同HPV类型的D区域。任选地,在有用时,引物也可以含有肌苷。
为了避免怀疑,特异性地杂交于样品中的任意HPV核酸的D和/或B区域的探针可以是通用的(如果它们杂交于多种HPV类型的D和/或B区域,和/或不提供特异性的分型信息),或将允许未知HPV核酸的类型特异性的探针分型。
当在分型之前扩增靶DNA时,则也可以使用落入优选的D或B区域内的通用探针来检测HPV核酸。
本发明因而也涉及探针或探针组,它们能检测任意HPV核酸在样品中的存在。
通用探针可以用于检测HPV核酸,例如,使用DNA酶免疫测定(DEIA)技术,例如参见本文引作参考的WO991437和例如Clin DiagnVirol.1995 Feb;3(2):155-64。该方法可以用于快速且特异性地检测PCR产物。PCR产物由引物组产生,其中正向或反向引物含有位于5′末端的生物素。这允许生物素化的扩增引物结合抗生物素蛋白链菌素包被的微量滴定孔。用氢氧化钠使PCR产物变性,这允许去除未生物素化的链。特异性的标记的寡核苷酸探针(例如用洋地黄毒苷标记)与单链固定的PCR产物杂交,通过酶标记的缀合物和比色或荧光方法,检测杂交体。
在本发明中,提供了一组适用于测定HPV核酸在样品中的存在的通用探针,适当地,用DEIA技术测定。适当地,这样的探针可以用于相同的反应条件下。在表3中给出了优选的探针。其中所述的所有探针都单独地和组合地要求保护。本发明适当地提供了表3中的任意2种探针、适当地任意3、4、和5或更多种探针(优选表3中包含的所有探针)的组合,用于HPV的通用检测(即任意HPV类型的检测)。
在一个分开的实施方案中,本发明涉及特异性地杂交于HPV基因组的D区域的通用探针(例如,表3中的那些)与分型步骤先后或同时组合的应用。
探针和任意靶DNA之间杂交后,可以通过任意合适的方式,进行杂交的检测。例如,可以检测地标记探针和/或核酸靶。为了辅助检测,优选地,扩增靶和/或信号。靶DNA的PCR扩增是特别优选的。
优选地,在有固体支持物存在下,进行探针和靶之间的杂交,尽管这不是必须的。可以固定探针和靶核酸中的一种或多种,例如,固定到珠子、平板、载玻片、或微量滴定板上。
或者,探针和靶都不固定。杂交可以在液体介质背景下进行。
结合的检测可以使用流式细胞术进行,例如使用LuminexTM流式细胞术***(参见,例如,WO9714028和http://www.luminexcorp.com/)。
在本文的实施例中,公开了与基于珠子的检测***(例如,Luminex)一起使用的靶特异性的探针,和不同的靶特异性的探针的混合物,它们本身是本发明的实施方案。混合物可以包括2-100种不同探针类型,例如,5-70,10-60,20-50种探针类型,包括3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 20,25,30,35,40,45种或更多种不同探针类型的混合物。如本文所述,偶联到间隔序列上的这样的探针,以及当偶联到珠子上时,也形成本发明本身的一部分。
用于本发明的珠子,在本文中也可以称作微球,适当地是适用于流式细胞术分析的珠子。珠子适当地能偶联到探针上,以检测探针和靶之间的相互作用。在一个方面,用独特的荧光分子或分子的组合标记珠子。适当地,通过使用激光激发珠子内的一种或多种荧光染料,能鉴别出在珠子上或内部的标记。在一个方面,珠子是聚苯乙烯珠。
结合的检测可以在微阵列的背景下进行,使用例如本文引作参考的EP373203,EP386229,EP0804731和EP619321所述的方法。这样的技术是本领域技术人员众所周知的。
根据本发明的另一个优选的实施方案,前述检测和/或鉴别HPV的方法的特征也在于,杂交步骤包含反向杂交形式。在一个实施方案中,将探针固定到固体支持物上的某些位置。在另一个实施方案中,将探针杂交到珠子上,其中它们不采取彼此相对固定的位置。
适当地,如上所述扩增样品中的任意HPV核酸,并标记扩增的HPV多核酸,以便检测形成的杂交体。根据该实施方案,使用至少一种探针,或至少2种、优选至少3种、更优选至少4种、和最优选至少5种探针的集合。当使用至少2种探针时,以使它们在相同杂交条件和相同洗涤条件下特异性地杂交它们的靶序列的方式,设计所述探针。
在优选的反向杂交测定中,将寡核苷酸探针固定到固体支持物上,作为平行线(Stuyver等,1993;国际申请WO 94/12670)。与其它DNA技术或杂交形式相比,反向杂交形式具有许多实用的优点,尤其当优选使用探针的组合时,或当不可避免地寻求得到相关信息时。
任选地,在需要时,本发明的检测和分型方法包括在杂交步骤之后的类型特异性的PCR步骤,例如本文引作参考的WO03014402所述。与非特异性的引物相比,类型特异性的PCR被设计用于扩增特定的HPV核酸类型,例如仅仅HPV 16 DNA,所述非特异性的引物可以在HPV分型之前使用,且通常用于扩增来自多种HPV类型的核酸。
本发明也涉及类型特异性的引物,它们能扩增包含HPV基因组的D和/或B区域的HPV核酸。
在另一个实施方案中,本发明因而涉及包含下述步骤的方法:
1扩增来自生物样品中存在的任意HPV的核酸,
2检测生物样品中存在的任意HPV核酸,
3对样品中的HPV核酸进行分型,其中这样的HPV核酸已经通过下述方法检测到:使这样的核酸接触至少一种能特异性地杂交于HPV的D区域、适当地杂交于B区域的探针,所述区域表示在图1中,然后基于这样得到的杂交结果,分析HPV类型,和
4任选地,使用类型特异性的引物,其对步骤3中未鉴别出的类型是特异性的,扩增和检测样品中的任意核酸。
步骤2和3可以同时进行。
本发明也涉及试剂盒,其在本发明中用于检测和/或鉴别HPV类型。
试剂盒可以包含至少2种引物,所述引物适用于扩增来自HPV基因组的核酸,优选地,所述引物至少能扩增HPV基因组的片段6566-6596,例如,在表1和2中给出的引物。
试剂盒可以包含至少2种能特异性地杂交于HPV基因组的片段6543-6619的探针,编号根据图1给出。优选的探针能允许辨别不同的HPV类型,表4列出了合适的探针。
试剂盒可以包含关于实现上述HPV鉴别和分型分析方法的说明书,以及上面指出的引物和/或探针。
试剂盒可以包含上面给出的至少一种引物和至少一种探针。
试剂盒可以包含固定到固体支持物上的本发明的探针或引物。支持物可以是例如珠子、微量滴定板或载玻片。
试剂盒可以包含通用的探针,适当地,表3给出的探针。
本发明也涉及用于检测和/或鉴别可能存在于生物样品中的HPV的诊断试剂盒,其包含下述组分:(i)上面定义的至少一种合适的引物或至少一种合适的引物对;(ii)至少一种合适的探针,优选至少2种、更优选至少3种、更优选至少4种、最优选至少5种合适的探针,其任选地固定在固体支持物上。
适当地,试剂盒另外包含一种或多种下述组分:
(iii)杂交缓冲液,或生产所述缓冲液必需的组分,或制备所述缓冲液的说明书;
(iv)洗涤溶液,或生产所述溶液必需的组分,或制备所述溶液的说明书;
(v)检测形成的杂交体的工具;
(vi)用于将探针附着到固体支持物的已知位置上的工具。
下面的定义和解释有助于更好地理解本发明。
与来自L1区域的291bp片段的任意已知类型(Chan等,1995)表现出超过10%的序列差异的HPV分离物,分成不同的HPV“类型”。差异在2-10%之间的HPV分离物,归入不同“亚型”。如果序列变异低于2%,将分离物归入相同亚型中,作为不同“变体”。当应用于HPV时,术语″类型″指上面定义的3种分类中的任一种。
待分析的样品中的靶材料可以是DNA或RNA,例如基因组DNA,信使RNA,病毒RNA或其扩增形式。这些分子在本申请中也称作″核酸″或″多核酸″。
众所周知的提取和纯化操作,可以用于从样品分离RNA或DNA(例如Sambrook等,1989)。
根据本发明的术语″探针″通常指单链寡核苷酸,其设计用于特异性地杂交于HPV多核酸。
术语″引物″通常指能作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列,其与要复制的核酸链互补。引物的长度和序列必须使得它们允许引发延伸产物的合成。
优选地,引物的长度是约10-50个核苷酸。具体长度和序列取决于需要的DNA或RNA靶的复杂性,以及使用引物的条件,例如温度和离子强度。
表述″引物对″或″合适的引物对″在本发明中指一对引物,其允许扩增HPV多核酸片段的一部分或全部,探针能与所述部分结合。
本发明的探针或引物的″靶″或″靶序列″是HPV多核酸的序列,探针或引物与其完全互补或部分互补(其中部分互补允许一定程度的错配)。应当理解,在有些情况下,所述靶序列的互补序列也是合适的靶序列。本发明的探针适当地至少与它们的靶序列的中央部分互补。在大多数情况下,探针与它们的靶序列完全互补。术语″类型特异性的靶序列″指在特定HPV类型的多核酸中的靶序列,与任何其它HPV-类型相比,其含有至少一个核苷酸的差异。
探针与HPV多核酸区域的″特异性地杂交″,指所述探针与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体,且在这些条件下,所述探针不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。应当理解,设计用于特异性地杂交于HPV多核酸区域的探针,可以完全落入所述区域内,或可以在很大程度上与所述区域重叠(即与所述区域之外和之内的核苷酸形成双链体)。
适当地,探针与核酸靶区域的特异性的杂交,发生在严格杂交条件下,例如,3X SSC,0.1%SDS,50℃。
技术人员知道如何改变温度、探针长度和盐浓度等参数,以便实现特异性的杂交。杂交和洗涤条件是众所周知的,且示例在Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989),尤其是其中的第II章。在需要时,可以轻微修改探针的长度或序列,以维持在给定环境下需要的特异性和灵敏度。本文列出的探针和/或引物可以延伸1,2,3,4或5个核苷酸,例如,在任一个方向(区域D的上游或下游)。
优选的严格条件适当地是允许类型特异性的探针结合仅一种HPV类型的条件。因而,在本发明的一个实施方案中,对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行分型的方法包含使任意的这样的核酸接触至少一种探针的步骤,所述探针能在严格条件下杂交于HPV的D和/或B区域。
特异性地杂交于本文定义的HPV基因组的D和/或B区域的探针,适当地与靶序列的全长至少95%互补,适当地具有大于95%的同一性,例如,在它们的长度上与靶HPV序列96%,97%,98%,99%和最优选100%互补。本发明的探针可以与它们的靶序列在所有核苷酸位置互补,可能允许1、2或多个错配,这取决于例如探针的长度、温度、反应条件和测定的要求。
适当地,探针的每个核苷酸可以与它的相应靶核苷酸形成氢键。
优选地,通过A∶T和C∶G碱基配对的程度,评定探针与靶的互补性,使得腺嘌呤核苷酸与胸腺嘧啶配对,鸟嘌呤核苷酸与胞嘧啶配对,或反之亦然。在RNA形式,可以用U(尿嘧啶)替代T。
例如,当肌苷用于通用探针中,或用于引物中时,则互补性也可以通过肌苷(探针)-靶核苷酸相互作用的程度来评定。
这样,可以看出本发明也涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:使任意的这样的核酸接触至少一种探针,所述探针在它的长度上与HPV基因组的D区域、适当地与B区域具有1或0个核苷酸错配,所述区域表示在图1中,然后基于这样得到的杂交结果,分析HPV类型。
引物与HPV多核酸区域的″特异性杂交″指,在扩增步骤中,所述引物与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体,且在这些条件下,所述引物不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。应当理解,设计用于特异性地杂交于HPV多核酸区域的引物,可以完全落入所述区域内,或可以在很大程度上与所述区域重叠(即与所述区域之外和之内的核苷酸形成双链体)。
本发明的一个实施方案要求检测单个碱基对错配,且严格的探针杂交条件是优选的,以仅仅允许精确互补序列的杂交。但是,应当指出,由于探针的中央部分是它的杂交特性所必需的,当使用更长的探针序列时,可以允许探针序列相对于靶序列向探针末端偏离。探针长度内可能存在变异。
从本领域的常识可以想象所述偏离和变异,但是总应当实验地评价,以便检查它们是否导致与准确互补探针等同的杂交特性。
优选地,本发明的探针的长度是约5-50个核苷酸,更优选约10-25个核苷酸。特别优选的探针长度包括5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25个核苷酸(不计可能存在的任意间隔序列)。本发明使用的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和修饰的核苷酸,例如,肌苷或含有基本上不改变它们的杂交特性的修饰基团的核苷酸。
探针序列在本说明书中表述为从5′至3′末端的单链DNA寡核苷酸。本领域技术人员显而易见,可以原样使用任意的下面指出的探针,或以它们的互补形式,或以它们的RNA形式(其中用U替代T)使用。
通过克隆含有***片段(包括相应的核苷酸序列)的重组质粒,可以制备根据本发明的探针,如果需要,可以使用足够的核酸酶,将所述***片段从克隆的质粒切离,并回收它们,例如通过根据分子量的分级分离。根据本发明的探针也可以化学合成,例如通过常规的磷酸三酯方法。
在文献中充分记载了扩增引物不是必须与模板中的相应靶序列准确匹配、以保证适当扩增的事实(Kwok等,1990)。但是,当引物与它们的靶序列不是完全互补时,应当考虑扩增的片段具有引物的序列,而不是靶序列的序列。
可以用选择标记(例如生物素)来标记引物。使用的扩增方法可以是聚合酶链反应(PCR;Saiki等,1988),连接酶链反应(LCR;Landgren等,1988;Wu&Wallace,1989;Barany,1991),基于核酸序列的扩增(NASBA;Guatelli等,1990;Compton,1991),基于转录的扩增***(TAS;Kwoh等,1989),链置换扩增(SDA;Walker等,1992)或借助于QB复制酶的扩增(Lomeli等,1989)或本领域已知的任何其它适用于扩增核酸分子的方法。
用作引物或探针的寡核苷酸也可以包含核苷酸类似物,例如,硫代磷酸酯(Matsukura等,1987),烷基硫代磷酸酯或肽核酸(Egholm M,Buchardt O,Christensen L,Behrens C,Freier SM,Driver DA,Berg RH,Kim SK,Norden B,Nielsen PE.PNA hybridizes to complementaryoligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules.Nature.1993 Oct 7;365(6446):566-8),或可以含有嵌入剂(Asseline等,1984)。随着大多数其它变异或修饰导入本发明的原始DNA序列,这些变异将需要适应使用寡核苷酸的条件,以得到要求的特异性和灵敏度。但是,杂交的最终结果基本上与用未修饰的寡核苷酸得到的结果相同。这些修饰的导入可能是有利的,以便积极地影响特性,例如,杂交动力学,杂交体形成的可逆性,寡核苷酸分子的生物稳定性,等。
术语″固体支持物″可以指寡核苷酸探针可以偶联的任意底物,只要它保持它的杂交特性,且背景杂交水平保持较低。通常,固体底物是微量滴定板(例如在DEIA技术中),膜(例如尼龙或硝酸纤维素)或微球(珠子)或芯片。在应用于膜或固定之前,可以方便地修饰核酸探针,以便促进固定或提高杂交效率。这样的修饰可以包括同聚物加尾,与不同的反应基团例如脂族基团、NH2基团、SH基团、羧基偶联,或与生物素、半抗原或蛋白偶联。
如上面讨论的,杂交可以发生在液体介质中,探针与靶的结合可以通过例如流式细胞术来评定。
术语″标记的″通常指使用标记的核酸。标记可以如下实现:使用在聚合酶扩增步骤过程中掺入的标记的核苷酸,例如,如Saiki等(1988)或Bej等(1990)所述,或标记的引物,或通过本领域技术人员已知的任何其它方法。标记的性质可以是同位素(″P,″S,等)或非同位素(生物素,洋地黄毒苷等)。
″样品″可以是可能含有HPV核酸的任意材料,例如,生物材料,例如直接取自人类(或动物),或在培养(富集)后,或可以是在宿主细胞中表达的重组HPV核酸。生物材料可以是例如尿,或来自生殖泌尿道或人或动物体的任意部分的刮片/活检物。
本发明的探针集合通常包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50或更多个探针。
所述探针可以应用于固体基质上的2个或多个(可能与探针的数量一样多)不同的和已知的位置。经常优选地,将2个或多个探针一起应用于所述固体支持物的一个且同一个位置。本发明涉及附着到1个或多个本发明的探针上的固体支持物。
为了设计具有需要的特性的探针,可以使用本领域技术人员已知的下述有用指南。
因为杂交反应的程度和特异性(例如,本文所述的那些)会受到许多因素的影响,操作一个或多个这样的因素,可以确定特定探针的准确灵敏度和特异性、与它的靶是否完美互补。在本文中进一步解释了不同测定条件的重要性和效果。
应当选择[探针:靶]核酸杂交体的稳定性,使得与测定条件相容。这可以如下实现:通过避免富含AT的长序列,通过用G∶C碱基对终止杂交体,和通过设计具有适当Tm的探针。应当选择探针的起点和终点,使得长度和%GC产生比进行最终测定的温度高约2℃的Tm。探针的碱基组成是重要的,这是由于额外的氢键结合,导致G-C碱基对表现出比A-T碱基对更高的热稳定性。因而,包含更高G-C含量的互补核酸的杂交,在更高的温度会更稳定。
当设计探针时,也应当考虑使用探针的条件,例如,离子强度和温育温度。已知杂交程度会随着反应混合物离子强度的增加而增加,杂交体的热稳定性会随着离子强度的增加而增加。另一方面,能破坏氢键的化学试剂,例如,甲酰胺,脲,DMSO和醇,也会增加杂交的严格性。使用这样的试剂将氢键去稳定,可以极大地降低Tm。通常,在比特定双链体的解链温度低约5℃时,发生长度为约10-50碱基的合成寡核苷酸探针的最佳杂交。在低于最佳的温度温育,可以允许错配的碱基序列杂交,且因此可以导致降低的特异性。
需要获得仅仅在高严格性条件下杂交的探针。在高严格性条件下,仅仅会形成高度互补的核酸杂交体;不会形成没有足够程度的互补性的杂交体。因此,测定条件的严格性决定了形成杂交体的2条核酸链之间需要的互补性程度。选择严格性程度,例如使靶和非靶核酸形成的杂交体之间的稳定性差异最大化。在本发明的情况下,需要检测单个碱基对变化,这需要非常高严格性的条件。
探针序列的长度也是重要的。在有些情况下,可能存在来自特定区域的几个序列,它们的位置和长度不同,将产生具有需要的杂交特性的探针。在其它情况下,一个序列可能明显优于另一个差别仅仅在于一个碱基的序列。尽管并非完美互补的核酸可能杂交,完美互补的碱基序列的最长延伸通常基本上决定了杂交体稳定性。
尽管可以使用不同长度和碱基组成的寡核苷酸探针,本发明的优选寡核苷酸探针的长度是约5-50个(更特别是10-25个)碱基,且具有与靶核酸序列完美互补的足够序列延伸。
已知形成抑制杂交的强内部结构的靶DNA或RNA区域是不太优选的。类似地,应当避免具有广泛的自身互补性的探针。如上面所解释的,杂交是互补核酸的两条单独的链的缔合,以形成氢键结合的双链。
暗示了如果2条链中的一条完全或部分地参与杂交体,则它不太可能参与新杂交体的形成。如果存在足够的自身互补性,一类探针分子内会形成分子内和分子间杂交体。通过小心的探针设计,可以避免这样的结构。通过设计探针,使得目标序列的主要部分是单链,可以极大地增加杂交的速率和程度。可以使用计算机程序来搜索这类相互作用。但是,在某些情况下,不可能避免这类相互作用。
为了用选择的寡核苷酸探针集合鉴别不同的HPV类型,可以使用本领域已知的任何杂交方法(常规的斑点印迹,DNA印迹,夹心法,等)。但是,为了获得快速且容易的结果,如果涉及大量探针,反向杂交形式可能是最方便的。在一个优选的实施方案中,以已知的不同位置(点,线或其它图案),将选择的探针固定到固体支持物上。在另一个优选的实施方案中,以线形式,将选择的探针组固定到膜条带上。所述探针可以单个地或作为混合物,固定到固体支持物的指定位置上。在WO9914377的实施例4中,公开了上述优选方法的一个具体的且非常用户友好的实施方案,其可以适用于本发明。可以用生物素标记HPV多核酸,然后可以通过生物素-抗生物素蛋白链菌素偶联,用非放射性显色***检测杂交体。
术语″杂交缓冲液″指,在适当严格性条件下,允许探针和样品中存在的多核酸或扩增产物之间发生杂交反应的缓冲液。
术语″洗涤溶液″指能实现在适当严格性条件下形成的杂交体的洗涤的溶液。
在本说明书和随后的权利要求书中,除非上下文另有要求,词语“包含”和其变化形式例如“包括”,应当理解为包括所述的整数或步骤、或所述的整数或步骤的组,但是不排除任何其它整数或步骤、或整数或步骤的组。“包含”也包括“由......组成”和“基本上由......组成”的含义。
本发明的实施方案包括:
(a)对可能存在于样品中的任意HPV核酸进行分型的方法,所述方法包含下述步骤:
(i)使任意的这样的核酸接触至少一种能与HPV基因组的D区域特异性地杂交的探针,所述区域表示在图1中,和
(ii)基于这样得到的杂交结果,分析HPV类型;
(b)根据陈述(a)的方法,其中所述探针能杂交于HPV基因组的B区域,所述B区域表示在图1中。
(c)根据陈述(a)或(b)的方法,其中所述探针能特异性地杂交仅一种HPV类型的基因组的D或B区域。
(d)根据陈述(a)的方法,其中所述探针选自由表4列出的序列组成的列表。
(e)根据任一项前面陈述的方法,其中在杂交之前,扩增样品中存在的任意HPV核酸。
(f)根据陈述(e)的方法,其中所述扩增步骤使用选自下组的引物:HPV-MPF1F1,HPV-MPF1F2,HPV-MPF1F3,HPV-MPF1F4,HPV-MPF1F5,HPV-MPF1F6,HPV-MPF1F7,HPV-MPF1F8,HPV-MPF1F9,HPV-MPF1F10,HPV-MPF2R1,HPV-MPF2R2,HPV-MPF2R3,HPV-MPF2R4,HPV-MPF2R5,HPV-MPF2R6,HPV-MPF2R7,HPV-MPF2R8。
(g)根据任一项前面陈述的方法,其中在分型步骤之前,证实样品中存在HPV核酸。
(h)根据任一项前面陈述的方法,其中探针和靶之间的杂交在有固体支持物存在下进行。
(i)根据陈述(h)的方法,其中所述杂交步骤使用反向杂交形式。
(j)根据陈述(h)的方法,其中所述探针固定在珠子上。
(k)根据陈述(j)的方法,其中使用流式细胞术分析杂交的检测。
(l)试剂盒,其包含至少2种引物,所述引物适用于扩增来自HPV基因组的B或D区域的核酸。
(m)根据陈述(l)的试剂盒,其中所述引物选自:HPV-MPF1F1,HPV-MPF1F2,HPV-MPF1F3,HPV-MPF1F4,HPV-MPF1F5,HPV-MPF1F6,HPV-MPF1F7,HPV-MPF1F8,HPV-MPF1F9,HPV-MPF1F1O,HPV-MPF2R1,HPV-MPF2R2,HPV-MPF2R3,HPV-MPF2R4,HPV-MPF2R5,HPV-MPF2R6,HPV-MPF2R7和HPV-MPF2R8。
(n)试剂盒,其包含至少2种探针,所述探针能特异性地杂交于HPV基因组的D区域或B区域。
(o)根据陈述(n)的试剂盒,其中所述探针是选自表4的任意2种探针。
(p)试剂盒,其包含表1或2的任意引物、或表3的任意探针、和用于实现上述HPV鉴别和分型分析的方法的说明书。
(q)试剂盒,其包含附着在固体支持物上的能特异性地杂交于HPV基因组的D区域或B区域的探针。
(r)根据陈述(l)-(q)之一的试剂盒,其另外包含表3的任意探针。
(s)适用于陈述A的方法的探针,所述探针选自表4。
(t)适用于陈述(e)的方法的引物,所述引物选自表1和2。
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实施例1
下面的方案可以用于对HPV DNA进行分型。
PCR混合物的组成(扩增来自样品的HPV DNA)
组分 | μl/反应 |
10x PCR缓冲液 | 5 |
1mM dNTP′s | 10 |
25mM MgCl2 | 5 |
正向引物20pmol/μl | 1 |
反向引物20pmol/μl | 1 |
AmpliTaq Gold(5U/μl) | 0.3 |
水 | 17.7 |
总体积 | 40 |
加入10μl靶DNA,补至终体积50μl。
使用的通用引物
HPV-MPF1F1(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F2(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F3(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F4(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F5(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F6(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F7(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F8(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F9(10pmol/μl) |
HPV-MPF1F10(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R1-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R2-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R3-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R4-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R5-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R6-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R7-bio(10pmol/μl) |
HPV-MPF2R8-bio(10pmol/μl) |
PCR程序
9min 94℃,激活AmpliTaq Gold
40个循环,包含:
30秒94℃
45秒52℃
45秒72℃
最后温育5min 72℃
下面的含有HPV基因组DNA的质粒已经用于多路PCR(完全MPF集合):
-HPV16
-HPV18
-HPV31
-HPV33
-HPV45
-HPV52
-HPV56
-HPV66
-HPV35
-HPV67
-HPV11
-HPV26
-HPV53
-HPV58
-HPV71
-HPV13
-HPV39
-HPV54
-HPV69
-HPV70
-HPV74
-HPV7
都产生预期大小的片段。
下面的含有HPV基因组DNA的质粒已经用于单个PCR(单个正向+单个反向):
-HPV16
-HPV35
-HPV59
-HPV18
-HPV56
-HPV68
-HPV39
-HPV33
-HPV6
-HPV51
-HPV26
-HPV40
-HPV43
都产生预期大小的片段。
PCR产物的实例,使用单个PCR引物(参见图3)
泳道1:标志物
泳道2:HPV18
泳道3:HPV56
泳道4:HPV39
泳道5:HPV26
泳道6:HPV43
泳道7:HPV33
凝胶多路PCR(参见图4)
泳道1:标志物
泳道2:HPV16
泳道3:HPV18
泳道4:HPV31
泳道5:HPV33
泳道6:HPV45
泳道7:HPV52
泳道8:HPV56
泳道9:标志物
反向杂交(线性探针测定)条件
将10μl PCR产物与含有一些选择的探针的条带杂交。要使用的适当条件如下:
反向杂交方案
步骤 | 温度 | 温育时间 |
变性 | 室温 | 10min |
杂交 | 50℃ | 60min |
严格洗涤 | 50℃ | 30min |
缀合 | 室温 | 30min |
底物 | 室温 | 30min |
适当地在3X SSC,0.1%SDS,50℃进行杂交。得到图5的结果。
表
通用引物集合
表1.正向引物(MPF正向)
名称 | 序列 5′→3′ |
HPV-MPF1F1 | GATGCCCAAATATTCAATAAACC |
HPV-MPF1F2 | GATGCICAAATATTTAATAAACC |
HPV-MPF1F3 | GAITCICAATTATTTAATAAACC |
HPV-MPF1F4 | GAIGCICAGTTGTTTAATAAACC |
HPV-MPF1F5 | GATTCICAATTGTTTAACAAACC |
HPV-MPF1F6 | GAITCICAGTTATTTAACAAGCC |
HPV-MPF1F7 | GAITCICAGTTATTTAATAAGCC |
HPV-MPF1F8 | GAIGCICAATTGTTTAATAAGCC |
HPV-MPF1F9 | GAITCICAATTATTTAATAAGCC |
HPV-MPF1F10 | GATTCTCAAATTTTTAATAAGCC |
表2.反向引物(MPF反向)
名称 | 序列 5′→3′ |
HPV-MPF2R1 | TTICCCCAICAAATGCCATT |
HPV-MPF2R2 | TTITTCCAICAAATGCCATT |
HPV-MPF2R3 | TTICCAAAACAAATGCCATT |
HPV-MPF2R4 | TCATTAAACCAACAAATGCCATT |
HPV-MPF2R5 | TGATTAAACCAICAAATACCATT |
HPV-MPF2R6 | TTATGCCAGCAAACACCATT |
HPV-MPF2R7 | TGATTATGCCAACAIATACCATT |
HPV-MPF2R8 | TTICCCCAACAIATACCATT |
用于MPF扩增引物的通用检测的通用探针
表3.DEIA探针
探针名称 | 序列 5′-3′ | 在图1中的起始位置 |
HPV_MPF_P1 | AAGCCITAITGGCTGCA | 19 |
HPV_MPF_P1-2 | AAIAAGCCITAITGGCTGCA | 16 |
HPV_MPF_P1-3 | TTTAAIAAGCCITAITGGCTGCA | 13 |
HPV_MPF_P2 | TGGATICAAAAIGCCCAGG | 28 |
HPV_MPF_P2-2 | TGGATICAAAAIGCCCAGGG | 28 |
HPV_MPF_P3 | TTTAATAAACCATATTGGITGCAA | 13 |
HPV_MPF_P4 | TTTAATAAACCATATTGGTTACA | 13 |
HPV_MPF_P5 | TTTAATAAICCTTATTGGTTGCA | 13 |
HPV_MPF_P6 | TTTAATAAGCCITAITGGTTACA | 13 |
HPV_MPF_P6-2 | TTTAATAAGCCITAITGGTTACAA | 13 |
HPV_MPF_P7 | AATAAGCCITATTGGCTACA | 16 |
HPV_MPF_P7-2 | TTTAATAAGCCITATTGGCTACA | 13 |
HPV_MPF_P8 | AATAAACCTTATTGGTTACAACGA | 16 |
优选的探针是:
HPV_MPF_P1 | AAGCCTTATTGGCTGCA | 19 |
HPV_MPF_P2 | TGGATICAAAAIGCCCAGG | 28 |
HPV_MPF_P3 | TTTAATAAACCATATTGGITGCAA | 13 |
HPV_MPF_P4 | TTTAATAAACCATATTGGTTACA | 13 |
HPV_MPF_P5 | TTTAATAAICCTTATTGGTTGCA | 13 |
HPV_MPF_P6-2 | TTTAATAAGCCITAITGGTTACAA | 13 |
HPV_MPF_P7-2 | TTTAATAAGCCITATTGGCTACA | 13 |
HPV_MPF_P8 | AATAAACCTTATTGGTTACAACGA | 16 |
表4-类型特异性的探针.
类型特异性的探针 探针序列5′→3′
探针名称 | 序列 5′-3′ | 极性 | 在图1中的起始位置 | 长度 |
11L1nPr1 | GGCTTCAAAAGGCTCAG | + | 29 | 17 |
13L1nPr1 | ATTGGTTACAAAAGGCC | + | 26 | 17 |
13L1nPr2 | TGGTTACAAAAGGCCC | + | 28 | 16 |
16L1nPr1 | TTATTGGTTACAACGAGCA | + | 24 | 19 |
16L1nPr2 | TTATTGGTTACAACGAGC | + | 24 | 18 |
16L1nPr3 | CTTATTGGTTACAACGAG | + | 23 | 18 |
18L1nPr1 | AGGCACAGGGTCATAAC | + | 38 | 17 |
18L1nPr2 | AGGCACAGGGTCATAAg | + | 38 | 17 |
18L1nPr3 | AAGGCACAGGGTCATAAg | + | 37 | 18 |
18L1nPr4 | GTTACATAAGGCACAGG | + | 30 | 17 |
26L1nPr1 | GTGCACAGGGTCATAAT | + | 38 | 17 |
26L1nPr2 | TGGTTACAACGTGCACA | + | 28 | 17 |
30L1nPr1 | TACTGGTTGCAACGCG | + | 25 | 16 |
30L1nPr2 | TTACTGGTTGCAACGCG | + | 24 | 17 |
31L1nPr1 | GGATGCAACGTGCTCA | + | 29 | 16 |
31L1nPr2 | GGATGCAACGTGCTC | + | 29 | 15 |
32L1nPr1 | ACAGCAGGCACAAGGC | + | 33 | 16 |
33L1nPr1 | CATATTGGCTACAACGTG | + | 23 | 18 |
33L1nPr2 | CCATATTGGCTACAACG | + | 22 | 17 |
33L1nPr3 | CCATATTGGCTACAACGa | + | 22 | 18 |
34L1nPr1 | CCCAGGGACAAAACAA | + | 41 | 16 |
35L1nPr1 | AACCATATTGGTTGCAAC | + | 20 | 18 |
35L1nPr2 | TTGCAACGTGCACAAG | + | 31 | 16 |
35L1nPr3 | ACCATATTGGTTGCAAC | + | 21 | 17 |
39L1nPr1 | CCTTATTGGCTACATAAGG | + | 22 | 19 |
39L1nPr2 | CTTATTGGCTACATAAGG | + | 23 | 18 |
40L1nPr1 | AAGCCATTGTGGATACAA | + | 19 | 18 |
42L1nPr1 | CAACAAGCACAAGGACA | + | 34 | 17 |
43L1nPr2 | AACCCTTArGGATACAAAAG | + | 20 | 20 |
43L1Pr1 | AACCCTTATGGATACAAAA | + | 20 | 19 |
44L1nPr1 | AAGGCGCAGGGCCAC | + | 37 | 15 |
44L1nPr2 | TTTTGGTTGCAAAAGGC | + | 25 | 17 |
45L1nPr1 | GGTTACATAAGGCCCAG | + | 29 | 17 |
45L1nPr2 | GGTTACATAAGGCCCA | + | 29 | 16 |
45L1nPr3 | AGCCCAGGGCCATAAg | + | 39 | 16 |
45L1nPr4 | CCCAGGGCCATAACA | + | 41 | 15 |
45L1nPr5 | CCAGGGCCATAACAAg | + | 42 | 16 |
51L1nPr1 | TATTGGCTCCACCGTG | + | 25 | 16 |
51L1nPr2 | TTATTGGCTCCACCGT | + | 24 | 16 |
51L1nPr3 | ATTGGCTCCACCGTG | + | 26 | 15 |
52L1nPr1 | CGTACTGGTTACAACGTG | + | 23 | 18 |
52L1nPr2 | CCGTACTGGTTACAACGa | + | 22 | 18 |
52L1nPr3 | GCCGTACTGGTTACAAC | + | 21 | 17 |
53L1nPr1 | ACGTGCCCAGGGACAT | + | 37 | 16 |
54L1nPr1 | GCCCAGGGTCAAAACA | + | 40 | 16 |
54L1nPr2 | ACTGGTTACAACGGGC | + | 26 | 16 |
55L1nPr1 | TTTTTGGTTGCAAAGGG | + | 24 | 17 |
55L1nPr2 | TTTTGGTTGCAAAGGGC | + | 25 | 17 |
56L1nPr1 | CCCAAGGCCATAATAAT | + | 41 | 17 |
56L1nPr2 | GCCCAAGGCCATAATA | + | 40 | 16 |
56L1nPr3 | TGCCCAAGGCCATAAT | + | 39 | 16 |
56L1nPr4 | GCCCAAGGCCATAATAAg | + | 40 | 18 |
57L1nPr1 | TTACTGGCTGCGGAGG | + | 24 | 16 |
58L1nPr1 | CTTATTGGCTACAGCGT | + | 23 | 17 |
58L1nPr2 | CTTATTGGCTACAGCGTG | + | 23 | 18 |
59L1nPr1 | AAGGCTCAGGGTTTAAAC | + | 37 | 18 |
66L1nPr1 | TTGCAACGTGCACAGG | + | 31 | 16 |
66L1nPr2 | TGCAACGTGCACAGG | + | 32 | 15 |
67L1nPr1 | CAACGCGCACAAGGTC | + | 34 | 16 |
67L1nPr2 | ACAACGCGCACAAGGT | + | 33 | 16 |
68L1nPr1 | GGCACAGGGACACAAC | + | 39 | 16 |
68L1nPr2 | GGCACAGGGACACAAg | + | 39 | 16 |
69L1nPr1 | GGTTACAGCGTGCCCA | + | 29 | 16 |
6L1nPr1 | GGCTACAAAAAGCCCAG | + | 29 | 17 |
6L1nPr2 | TGGCTACAAAAAGCCCA | + | 28 | 17 |
70L1nPr1 | CCTATTGGTTGCATAAGG | + | 23 | 18 |
70L1nPr2 | TATTGGTTGCATAAGGC | + | 25 | 17 |
70L1nPr3 | CCCTATTGGTTGCATAA | + | 22 | 17 |
71L1nPr1 | GCCTTACTGGCTACAAC | + | 21 | 17 |
72L1nPr1 | CTATTGGCTACAGCGC | + | 24 | 16 |
72L1nPr2 | CGCCCAGGGTCACAA | + | 39 | 15 |
73L1nPr1 | GCACAGGGACAAAATAA | + | 40 | 17 |
74L1nPr1 | CCTTTTGGCTACAAAAGG | + | 23 | 18 |
7L1nPr1 | AACCTTTGTGGATACAAAA | + | 20 | 19 |
81L1nPr1 | GCTACAACGGGCACAG | + | 30 | 16 |
81L1nPr2 | CCTTATTGGCTACAACG | + | 22 | 17 |
82L1nPr1 | TTATTGGTTGCATCGCG | + | 24 | 17 |
83L1nPr1 | TACTGGCTGCATCGTG | + | 25 | 16 |
84L1nPr1 | TACTGGTTGCAAAAGGC | + | 25 | 17 |
85L1nPr1 | CTGCACAAAGCCCAGG | + | 31 | 16 |
85L1nPr2 | CTGCACAAAGCCCAG | + | 31 | 15 |
85L1nPr3 | TGCACAAAGCCCAGG | + | 32 | 15 |
86L1nPr1 | GGTTACAGAAGGCGCA | + | 29 | 16 |
87L1nPr1 | TATTGGCTGCAGCGGG | + | 25 | 16 |
89L1nPr1 | TATTGGCTGCACCGTG | + | 25 | 16 |
90L1nPr1 | TACTGGCTGCAACGAG | + | 25 | 16 |
91L1nPr1 | AACCGCTTTGGATGCAA | + | 20 | 17 |
小写核苷酸不是HPV特异性的
其它信息,指示着在需要时可以在3′末端加T-尾的上述探针
名称 | 探针序列 | 起点 | 长度 | T-尾 |
11L1nPr1 | GGCTTCAAAAGGCTCAG | 29 | 17 | |
13L1nPr1 | ATTGGTTACAAAAGGCC | 26 | 17 | |
13L1nPr2 | TGGTTACAAAAGGCCC | 28 | 16 | |
16AF1L1p1.CH | ggtGTTGCAACGAGCACA | 27 | 15 | |
16AF1L1p2.CH | ggGGTTGCAACGAGCAC | 27 | 15 | |
16AF1L1p3.CH | ATATTGGTTGCAACGAG | 24 | 17 | |
16AF1L1p4.CH | CTATTGGTTGCAACGAG | 24 | 16 | |
16AF1L1p5.CH | TTGGTTGCAACGAGC | 27 | 15 | 3′100×T |
16AF1L1p6.CH | GGTTGCAACGAGCA | 29 | 14 | 3′100×T |
16AF1L1p7.CH | TGGTTGCAACGAGC | 28 | 14 | 3′100×T |
16L1nPr1 | TTATTGGTTACAACGAGCA | 24 | 19 | |
16L1nPr2.CH | TTATTGGTTACAACGAGC | 24 | 18 | |
16L1nPr3.CH | CTTATTGGTTACAACGAG | 23 | 18 | |
16L1nPr4.CH | GAGCACAGGGCCAC | 38 | 14 | 3′100×T |
16L1nPr5.CH | AGCACAGGGCCACA | 39 | 14 | 3′100×T |
18L1nPr1 | AGGCACAGGGTCATAAC | 38 | 17 | |
18L1nPr2 | AGGCACAGGGTCATAAg | 38 | 16 | |
18L1nPr3 | AAGGCACAGGGTCATAAg | 37 | 17 | |
18L1nPr4 | GTTACATAAGGCACAGG | 30 | 17 | |
18L1nPr4.CH | agtGTTACATAAGGCACAGG | 27 | 17 | |
18L1nPr5.CH | agttTTACATAAGGCACAGG | 27 | 16 | |
18L1nPr6.CH | ccccTTACATAAGGCACAGG | 27 | 16 | |
18L1nPr7.CH | TTACATAAGGCACAGG | 31 | 16 | 3′100×T |
26L1nPr2 | TGGTTACAACGTGCACA | 28 | 17 | |
26L1nPr1.CH | GTGCACAGGGTCATAAT | 38 | 17 | |
26L1nPr3.CH | GTGCACAGGGTCATAA | 38 | 16 | |
26L1nPr4.CH | ACGTGCACAGGGTC | 36 | 15 | |
26L1nPr5.CH | TGCACAGGGTCATAATA | 39 | 17 | 3′100×T |
26L1nPr6.CH | TGCACAGGGTCATAAT | 39 | 16 | 3′100×T |
26L1nPr7.CH | GTTACAACGTGCACAG | 30 | 16 | 3′100×T |
30L1nPr1 | TACTGGTTGCAACGCG | 25 | 16 | |
30L1nPr2 | TTACTGGTTGCAACGCG | 24 | 17 | |
31L1nPr1 | GGATGCAACGTGCTCA | 29 | 16 | |
31L1nPr2 | GGATGCAACGTGCTC | 29 | 15 | |
31L1nPr3.CH | ggGGATGCAACGTGCTC | 27 | 15 | |
31L1nPr4.CH | ACCATATTGGATGCAAC | 21 | 17 | |
31L1nPr5.CH | CATATTGGATGCAACG | 23 | 16 | |
31L1nPr6.CH | GGATGCAACGTGCTC | 29 | 15 | 3′100×T |
32L1nPr1 | ACAGCAGGCACAAGGC | 33 | 16 | |
33L1nPr1 | CATATTGGCTACAACGTG | 23 | 18 | |
33L1nPr2 | CCATATTGGCTACAACG | 22 | 17 | |
33L1nPr3 | CCATATTGGCTACAACGa | 22 | 17 | |
33L1nPr3.CH | CCATATTGGCTACAACG | 22 | 17 | |
33L1nPr4.CH | CATATTGGCTACAACGT | 23 | 17 | |
34L1nPr1 | CCCAGGGACAAAACAA | 41 | 16 | |
35L1nPr1 | AACCATATTGGTTGCAAC | 20 | 18 | |
35L1nPr2.CH | TTGCAACGTGCACAAG | 31 | 16 |
35L1nPr3.CH | ACCATATTGGTTGCAAC | 21 | 17 | |
35L1nPr4.CH | GTGCACAAGGCCATAAg | 38 | 16 | 3′100×T |
35L1nPr5.CH | TTGCAACGTGCACAAG | 31 | 16 | 3′100×T |
35L1nPr6.CH | GTGCACAAGGCCATA | 38 | 15 | 3′100×T |
35L1nPr7.CH | TGCACAAGGCCATA | 39 | 14 | 3′100×T |
39L1nPr1 | CCTTATTGGCTACATAAGG | 22 | 19 | |
39L1nPr2 | CTTATTGGCTACATAAGG | 23 | 18 | |
39L1nPr3.CH | AGCCTTATTGGCTACATAA | 20 | 19 | |
39L1nPr4.CH | GCCTTATTGGCTACATAA | 21 | 18 | |
39L1nPr5.CH | AAGCCTTATTGGCTACATAAc | 19 | 20 | 3′100×T |
39L1nPr6.CH | GCCTTATTGGCTACATAAG | 21 | 19 | |
40L1nPr1 | AAGCCATTGTGGATACAA | 19 | 18 | |
42L1nPr1 | CAACAAGCACAAGGACA | 34 | 17 | |
43L1nPr1 | AACCCTTATGGATACAAAA | 20 | 19 | |
43L1nPr2 | AACCCTTATGGATACAAAAG | 20 | 20 | |
44L1nPr1 | AAGGCGCAGGGCCAC | 37 | 15 | |
44L1nPr2 | TTTTGGTTGCAAAAGGC | 25 | 17 | |
45L1nPr1 | GGTTACATAAGGCCCAG | 29 | 17 | |
45L1nPr2 | GGTTACATAAGGCCCA | 29 | 16 | |
45L1nPr3 | AGCCCAGGGCCATAAg | 39 | 15 | |
45L1nPr4 | CCCAGGGCCATAACA | 41 | 15 | |
45L1nPr5 | CCAGGGCCATAACAAg | 42 | 15 | |
45L1nPr6.CH | ggtGTTACATAAGGCCCAG | 27 | 16 | |
45L1nPr7.CH | CCAGGGCCATAACAA | 42 | 15 | |
45L1nPr8.CH | CCAGGGCCATAACAAg | 42 | 15 | 3′100×T |
45L1nPr9.CH | AAGCCATATTGGTTACATA | 19 | 19 | 3′100×T |
45L1nPr10.CH | TTACATAAGGCCCAGG | 31 | 16 | 3′100×T |
51L1nPr1 | TATTGGCTCCACCGTG | 25 | 16 | |
51L1nPr3 | ATTGGCTCCACCGTG | 26 | 15 | |
51L1nPr2.CH | TTATTGGCTCCACCGT | 24 | 16 | |
51L1nPr4.CH | ggATTGGCTCCACCGTG | 24 | 15 | |
52L1nPr1 | CGTACTGGTTACAACGTG | 23 | 18 | |
52L1nPr2 | CCGTACTGGTTACAACGa | 22 | 17 | |
52L1nPr3a | GCCGTACTGGTTACAAC | 21 | 17 | |
52L1nPr3.CH | CCGTACTGGTTACAAC | 22 | 16 | |
52L1nPr4.CH | ACCGTACTGGTTACAAC | 21 | 17 | |
53L1nPr1.CH | ACGTGCCCAGGGACAT | 36 | 16 | |
53L1nPr2.CH | AACGTGCCCAGGGAC | 35 | 15 | |
c53L1nPr3.CH | ACGTGCCCAGGGAC | 36 | 14 | |
53L1nPr4.CH | TGCCCAGGGACATA | 39 | 14 | 3′100×T |
53L1nPr5.CH | GCCCAGGGACATAAT | 40 | 15 | 3′100×T |
53L1CPr6.CH | ATATTGGCTGCAACGT | 24 | 16 | |
53L1CPr7 | TATTGGCTGCAACGT | 25 | 15 | |
54L1nPr1 | GCCCAGGGTCAAAACA | 40 | 16 | |
54L1nPr2 | ACTGGTTACAACGGGC | 26 | 16 | |
55L1nPr1 | TTTTTGGTTGCAAAGGG | 24 | 17 | |
55L1nPr2 | TTTTGGTTGCAAAGGGC | 25 | 17 | |
56L1nPr1 | CCCAAGGCCATAATAAT | 41 | 17 | |
56L1nPr2 | GCCCAAGGCCATAATA | 40 | 16 | |
56L1nPr3 | TGCCCAAGGCCATAAT | 39 | 16 | |
56L1nPr4 | GCCCAAGGCCATAATAAg | 40 | 17 |
56L1nPr4.CH | gGCCCAAGGCCATAATAA | 39 | 17 | |
56L1nPr5.CH | gGCCCAAGGCCATAATA | 39 | 16 | |
56L1nPr6.CH | TGCCCAAGGCCATAAT | 39 | 16 | |
57L1nPr1 | TTACTGGCTGCGGAGG | 24 | 16 | |
58L1nPr2 | CTTATTGGCTACAGCGTG | 23 | 18 | |
58L1nPr1.CH | CTTATTGGCTACAGCGT | 23 | 17 | |
58L1nPr3.CH | CTTATTGGCTACAGCG | 23 | 16 | |
59L1nPr1 | AAGGCTCAGGGTTTAAAC | 37 | 18 | |
59Pr2.CH | CAAGGCTCAGGGTTTAAA | 36 | 18 | |
59L1nPr3.CH | CAAGGCTCAGGGTTTAA | 36 | 17 | |
61L1nCPr1 | AGGGCCACAACAATG | 44 | 15 | |
61L1nCPr2 | GGGCCACAACAATG | 45 | 14 | |
66L1nPr1 | TTGCAACGTGCACAGG | 31 | 16 | |
66L1nPr2 | TGCAACGTGCACAGG | 32 | 15 | |
66L1nPr2.CH | gTGCAACGTGCACAGG | 31 | 15 | |
66L1nPr3.CH | ggGCAACGTGCACAGG | 31 | 14 | |
66L1nPr4.CH | TGCAACGTGCACAGG | 32 | 15 | 3′100×T |
c66L1nPr5.CH | GCAACGTGCACAGG | 33 | 14 | 3′100×T |
66L1nPr6.CH | TGCACAGGGCCATA | 39 | 14 | 3′100×T |
66L1nPr7.CH | TGCAACGTGCACAG | 32 | 14 | 3′100×T |
67L1nPr1 | CAACGCGCACAAGGTC | 34 | 16 | |
67L1nPr2 | ACAACGCGCACAAGGT | 33 | 16 | |
68L1nPr1 | GGCACAGGGACACAAC | 39 | 16 | |
68L1nPr2 | GGCACAGGGACACAAg | 39 | 15 | |
68L1nPr2.CH | GGCACAGGGACACAA | 39 | 15 | |
68L1nPr3.CH | AGGCACAGGGACACA | 38 | 15 | |
68L1nPr4.CH | GGCACAGGGACACA | 39 | 14 | |
68L1nPr5.CH | GGCACAGGGACACA | 39 | 14 | 3′100×T |
68L1nPr6.CH | CCCTATTGGCTGCAC | 22 | 15 | 3′100×T |
68L1nPr7.CH | GCTGCACAAGGCACA | 30 | 15 | 3′100×T |
68L1nPr8.CH | CTGCACAAGGCACAG | 31 | 15 | 3′100×T |
68L1nPr9.CH | GCTGCACAAGGCAC | 30 | 14 | 3′100×T |
68L1nPr10.CH | GCACAAGGCACAGG | 33 | 14 | 3′100×T |
69L1nPr1 | GGTTACAGCGTGCCCA | 29 | 16 | |
6L1nPr1 | GGCTACAAAAAGCCCAG | 29 | 17 | |
6L1nPr2 | TGGCTACAAAAAGCCCA | 28 | 17 | |
70L1nPr1 | CCTATTGGTTGCATAAGG | 23 | 18 | |
70L1nPr2 | TATTGGTTGCATAAGGC | 25 | 17 | |
70L1nPr3.CH | CCCTATTGGTTGCATAA | 22 | 17 | |
70L1nPr4.CH | CCTATTGGTTGCATAAGG | 23 | 18 | |
71L1nPr1 | GCCTTACTGGCTACAAC | 21 | 17 | |
72L1nPr1 | CTATTGGCTACAGCGC | 24 | 16 | |
72L1nPr2 | CGCCCAGGGTCACAA | 39 | 15 | |
73L1nPr1 | GCACAGGGACAAAATAA | 40 | 17 | |
74L1nPr1 | CCTTTTGGCTACAAAAGG | 23 | 18 | |
7L1nPr1 | AACCTTTGTGGATACAAAA | 20 | 19 | |
81L1nPr1 | GCTACAACGGGCACAG | 30 | 16 | |
81L1nPr2 | CCTTATTGGCTACAACGn | 22 | 17 | |
82L1nPr1 | TTATTGGTTGCATCGCG | 24 | 17 | |
82L1nPr2.CH | gTATTGGTTGCATCGCG | 24 | 16 | |
82L1nPr3.CH | ATTGGTTGCATCGCG | 26 | 15 | 3′100×T |
83L1nPr1 | TACTGGCTGCATCGTG | 25 | 16 | |
84L1nPr1 | TACTGGTTGCAAAAGGC | 25 | 17 | |
85L1nPr1 | CTGCACAAAGCCCAGG | 31 | 16 | |
85L1nPr2 | CTGCACAAAGCCCAG | 31 | 15 | |
85L1nPr3 | TGCACAAAGCCCAGG | 32 | 15 | |
86L1nPr1 | GGTTACAGAAGGCGCA | 29 | 16 | |
87L1nPr1 | TATTGGCTGCAGCGGG | 25 | 16 | |
89L1nPr1 | TATTGGCTGCACCGTG | 25 | 16 | |
90L1nPr1 | TACTGGCTGCAACGAG | 25 | 16 | |
91L1nPr1 | AACCGCTTTGGATGCAA | 20 | 17 |
小写核苷酸不是特异性的
介绍实施例2-12
材料和方法
根据上面Wallace等(2005)的标准杂交操作(逐步的)如下:
1.选择适当的寡核苷酸偶联的微球集合。
2.通过涡旋和超声处理,重悬微球约20秒。
3.通过在1.5x TMAC(1x TMAC=2mol/l TMAC/0.15%Sarkosyl/75mmol/l Tris,6mmol/l EDTA)杂交缓冲液中稀释偶联的微球原液至每个集合150个微球/μl,制备工作微球混合物(注:每个反应需要33μl工作微球混合物)。
4.通过涡旋和超声处理,混合工作微球混合物约20秒。
5.向每个样品或背景孔中,加入33μl工作微球混合物。
6.向每个背景孔中,加入17μl dH2O。
7.向每个样品孔中,加入扩增的生物素化的DNA和dH2O,至总体积17μl(注:7μlPCR反应物用于检测)。
8.通过上下吸液几次,轻轻混合反应孔。
9.在热循环仪中在99℃温育5分钟,使扩增的生物素化的DNA变性。
10.在杂交温度(55℃)温育反应板15分钟。
11.在温育过程中,通过用冰冷的1x TMAC冲洗2次,准备过滤板。接着,用冰冷的1x TMAC填充过滤板的每个孔。
12.在温育过程中,通过在1x TMAC杂交缓冲液中稀释抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白至2μg/ml,制备新鲜的报道混合物(注:每个反应需要75μl报道混合物),并置于杂交温度的恒温箱或水浴中。
13.通过将整个反应物转移至含有冰冷的洗涤缓冲液的过滤板,终止杂交反应。
14.转移后,通过***真空过滤,用冰冷的1x TMAC洗涤缓冲液严格地洗涤过滤板2次。
15.向每个孔中加入75μl报道混合物,通过上下吸液几次,轻轻混合。
16.使整个平板达到室温约30分钟。
17.在杂交温度温育反应板30分钟。
18.通过真空过滤,终止温育。
19.通过***真空过滤,用1x TMAC洗涤缓冲液洗涤2次。
20.通过***真空过滤,将反应物溶于1x TMAC洗涤缓冲液。
21.根据***手册,在室温,在LuminexTM 100分析仪上进行分析。
[参见图6.Wallace等(2005)所述的工作流程的通用概况]
测试的灵敏度和特异性是基于探针和靶核酸序列之间的特异性杂交。因此,杂交和洗涤,以及与PE一起温育,都是该操作的关键步骤。通过优化不同的参数,例如温度和扩散动力学,调整该方案,以便使反应的特异性和灵敏度最大化。在优化的杂交方案中指出了这些调整(参见下文)。
材料:
A.缓冲液
0.1M MES pH4.5(偶联缓冲液)
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/250ml |
MES(2[N-吗啉代]乙磺酸) | Sigma M-2933 | 0.1M | 4.88g |
dH2O | - | - | 补至250ml |
5N NaOH | Fisher SS256-500 | - | 约5滴 |
过滤器(45μm)除菌,并保存在4℃
0.02%吐温(洗涤缓冲液I)
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/250ml |
吐温20(聚氧乙烯去水山梨糖醇单月桂酸酯) | Sigma P-9416 | 0.02% | 50μl |
dH2O | - | - | 250ml |
过滤器(45μm)除菌,并保存在室温
20%Sarkosyl
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/250ml |
Sarkosyl(N-月桂酰基肌氨酸) | Sigma L-9150 | 20% | 50g |
dH2O | - | - | 250ml(调至) |
过滤器(45μm)除菌,并保存在室温
TE pH8.0(样品稀释液)
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/250ml |
Tris EDTA缓冲液pH8.0 100X | Sigma T-9285 | 1X | 2.5ml |
dH2O | - | - | 247.5ml |
过滤器(45μm)除菌,并保存在室温
4.5x SSC/0.15%Sarkosyl杂交缓冲液(微球稀释液)
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/50ml |
20x SSC(3M氯化钠,0.3M柠檬酸钠脱水物,pH 7.0) | Cambrex US51232 | 4.5X | 11.25ml |
20%Sarkosyl | - | 0.15% | 0.375ml |
dH2O | - | - | 38.375ml |
过滤器(45μm)除菌,并保存在室温
3x SSC/0.1%Sarkosyl/1mg/ml酪蛋白严格洗涤缓冲液
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/50ml |
20x SSC | Cambrex US51232 | 3X | 7.5ml |
20%Sarkosyl | - | 0.1% | 0.250ml |
50mg/ml酪蛋白(pH7.2) | VWR BDHA440203H | - | 1ml |
dH2O | - | - | 41.25ml |
过滤器(45μm)除菌,并保存在4℃
1x SSC/0.1%Sarkosyl/1mg/ml酪蛋白洗涤缓冲液
试剂 | 目录编号 | 终浓度 | 量/50ml |
20x SSC | Cambrex US51232 | 1X | 2.5ml |
20%Sarkosyl | - | 0.1% | 0.250ml |
50mg/ml酪蛋白(pH 7.2) | VWR BDHA440203H | - | 1ml |
dH2O | - | - | 46.25ml |
过滤器(45μm)除菌,并保存在4℃
B.珠子
1.使用的珠子类型是L100-C123-01直到L100-C172-01(LuminexTM Corp.,Austin,TX)。
C.探针(参见实施例)
1.探针由Eurogentec(Seraing,Belgium)供给。
D.设备
设备 | 型号 |
热循环仪 | ABI GeneAmp PCR system 9700 |
热混合仪 | Eppendorf Themomixer comfort |
水浴 | GFL 1001 |
温育箱 | Memmert U25U |
LuminexTM | LuminexTM X100 |
方法和方案:
I.探针偶联
1.使新鲜的-20℃等分试样、烘干的Pierce EDC[1-乙基-3-[二甲基氨基丙基]碳二亚胺氢氯化物]粉末达到室温。
2.将胺取代的寡核苷酸(″探针″或″捕获″寡聚物)在dH2O中重悬至0.2mM(0.2nmol/μl)。
3.通过涡旋和超声处理,重悬微球原液约20秒。
4.将5.0×106微球原液转移至USA Scientific微量离心试管。
5.通过在≥8000xg微量离心1-2分钟,沉淀微球原液。
6.去除上清液,通过涡旋和超声处理约20秒,将沉淀的微球重悬于50μl 0.1M MES,pH4.5中。
7.在dH2O中制备0.2mM捕获寡聚物的1∶10稀释液(0.02nmol/μl)。
8.将2μl(0.04nmol)1∶10稀释的捕获寡聚物加入重悬的微球,并通过涡旋进行混合。
9.制备20mg/ml EDC在dH2O中的新鲜溶液。最多在使用前1分钟,将10mg EDC溶于500μl dH2O。将与硅胶包装在一起的10mg EDC等分试样(粉末)干燥保存在-80℃。
10.对于每个反应,逐个将2.5μl新配制的20mg/ml EDC加入微球,并通过涡旋进行混合(注:现在应当弃去EDC等分试样粉末)。
11.在室温,在黑暗中温育30分钟。
12.制备20mg/ml EDC于dH2O中的第二种新鲜溶液。
13.对于每个反应,逐个将2.5μl新配制的20mg/ml EDC加入微球,并通过涡旋进行混合(注:现在应当弃去EDC等分试样粉末)。
14.在室温,在黑暗中温育30分钟。
15.将1.0ml 0.02%吐温-20加入偶联的微球。
16.通过在≥8000xg微量离心1-2分钟,沉淀偶联的微球。
17.去除上清液,通过涡旋,将偶联的微球重悬于1.0ml 0.1%SDS中。
18.通过在≥8000xg微量离心1-2分钟,沉淀偶联的微球。。
19.去除上清液,通过涡旋和超声处理约20秒,将偶联的微球重悬于100μl TE,pH8.0。
20.通过在≥8000xg微量离心1-2分钟,沉淀偶联的微球。
21.去除上清液,通过涡旋和超声处理约20秒,将偶联的微球重悬于100μl TE,pH8.0。
22.通过血细胞计数器,计数偶联的微球:
a.在dH2O中1∶100稀释重悬的、偶联的微球。
b.通过涡旋彻底混合。
c.将10μl转移至血细胞计数器。
d.计数在血细胞计数器的4个大正方形网格中的微球。
e.微球/μl=(4个大正方形中的微球总数)x2.5x100(稀释因数)(注:最大是50,000微球/μl)。
23.在黑暗中,在2-10℃保存冷冻的偶联微球。
II.优化的杂交和洗涤方案
1.选择适宜的寡核苷酸偶联的微球集合。
2.通过涡旋和超声处理约20秒,重悬微球。
3.通过在4.5xSSC/0.15%Sarkocyl杂交缓冲液中稀释偶联的微球原液至每个集合150个微球/μl,制备工作微球混合物(注:每个反应需要33μl工作微球混合物)。
4.通过涡旋和超声处理约20秒,混合工作微球混合物。
5.向每个样品或背景孔中,加入33μl工作微球混合物。
6.向每个背景孔中,加入17μl TE,pH8。
7.向每个样品孔中,加入扩增的生物素化的DNA和TE,pH8.0,至总体积17μl(注:4μl强烈的50μl PCR反应物通常对于检测是足够的)。
8.通过上下吸液几次,轻轻混合反应孔。
9.在热循环仪中在95-100℃温育5分钟,使扩增的生物素化的DNA变性。
10.在热循环仪中在60℃温育反应板3分钟。
11.将反应板转移至在杂交温度预热的热混合仪(注:可以使用8-通道吸管操纵器来同时转移8个孔中的反应物)。
12.在杂交温度和500rpm,温育反应板15分钟。
13.在温育过程中,通过用蒸馏水冲洗,准备Millipore过滤板。接着,在杂交温度用200μl 3xSSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗涤缓冲液填充过滤板的每个孔,并置于杂交温度的恒温箱中。
14.在温育过程中,通过在3xSSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白严格洗涤缓冲液中稀释抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白至2μg/ml,制备新鲜的报道混合物(注:每个反应需要75μl报道混合物),并置于杂交温度的恒温箱或水浴中。
15.通过将整个反应物转移至在杂交温度的含有洗涤缓冲液的过滤板,终止杂交反应。
16.转移后,通过***真空过滤,用杂交温度的100μl3xSSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白严格洗涤缓冲液洗涤过滤板2次。
17.向每个孔中加入75μl报道混合物,通过上下吸液几次,轻轻混合。
18.在杂交温度温育反应板15分钟。
19.通过真空过滤,终止温育。
20.通过***真空过滤,用室温下的100μl 1xSSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗涤缓冲液洗涤2次。
21.在室温,将反应物溶于100μl 1xSSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白洗涤缓冲液中。
22.根据***手册,在室温,在LuminexTM 100分析仪上分析50μl。
III.读出
1.使用LuminexTM 100 IS 2.3版软件,读出数据。
2.在测量过程中,使用下面的参数:
a.样品体积:50μl
b.样品超时:60秒
c.XY加热器温度(℃):35
d.双重鉴别器闸门:
i.下限:8000
ii.上限:18500
e.统计:中间值
IV.数据管理
1.将数据保存在未加工的CSV文件(逗号分隔的*.csv)中,后者含有LuminexTM100 IS2.3软件提供的所有标准输出。
2.将得到的中间信号转移至Excel文件,用于计算靶/探针比,和信噪比(也参见布局和计算)。
本发明解决了LuminexTM程序的不同项目,包括探针设计的优化和实验方案的优化。
在下文中,按照图2所示的工作流程的次序,表述数据。
图6.调整的工作流程的通用概况
实施例中的结果说明(布局和计算):
下面指出和解释了涉及的实施例和权利要求。将结果主要表达为含有原始数据的表(MFI=中间荧光强度),变量(例如温度),探针,和分析的靶,计算值和备注。计算值包括靶/探针比(%靶/探针)和信噪比(信号/噪音)。
根据探针计算靶/探针比,并将各个信号显示为设定为100%的阳性对照的百分比(也参见实施例表15)。
也根据探针计算信噪比。将每个信号除以得到的所有信号的中值(也参见实施例表16)。
靶/探针比和信噪比会给出信号强度和特异性的良好总指标。
某些实施例使用来自本文整体引作参考的EP 1012348所述的SPF1O引物和探针集合的探针。该专利提供了在本专利申请中使用的技术的技术背景。
SPF1O引物集合会产生长仅65bp的小扩增引物,引物间区域是22核苷酸。这严重限制了针对所有HPV基因型之间的不同错配放置探针的可能性。
实施例2
目的:
检查在杂交步骤之后维持杂交温度是否对信号特异性具有显著的积极影响。
简介:
固定在珠子上的探针和溶液中的变性靶序列之间杂交后,在与报道试剂抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白(PE)一起温育之前,需要洗掉未结合的物质。这通过使用过滤板(MSBVN12,Millipore)来实现,其中珠子和所有附着的分子都与溶液中的游离分子相分离。反应体积较小,因此易受环境的快速温度变化的影响。我们检查了杂交温度之后温度的变化的影响。
材料和方法:
使用SPF1O模型***,研究了低于杂交温度的温育对LuminexTM信号的影响。
使用LuminexTM珠子,其携带HPV 31的探针(探针31 SLPr31,参见表5a)。该探针对用SPF1O引物集合扩增的HPV 31序列的鉴别是特异性的。为了评估交叉反应性,使用了HPV44和HPV 16的扩增引物。HPV 31和HPV 44的靶序列的差异在于1个位置,HPV 31和HPV16的靶序列的差异在于4个位置(表5b)。
在50℃进行杂交,一式两份地进行测定。随后,根据标准方案处理一组反应物,并在4℃在过滤板中立即洗涤珠子。首先在室温(RT)温育重复组的反应物1分钟,然后在4℃开始相同的标准洗涤。与Wallace等(2005)不同,在将样品转移至过滤板之后,加入洗涤缓冲液(也参见实施例3)。
结果:
结果如表5c所示。经证实,在杂交后和严格洗涤之前在室温仅温育1分钟,会造成信号的增加,但是也会降低特异性(如观察到HPV44的更高的信号所证实的)。这可以通过严格性的降低来解释,后者由杂交后短暂的温度下降造成。
结论:
在杂交步骤后,应当维持反应温度。杂交后,应当没有任何延迟、尽可能快地洗涤珠子,以防止温度的任何降低。
实施例3
目的:
检查在杂交之后立即稀释洗涤是否对信号特异性具有显著的积极影响。
简介:
如果没有在杂交步骤之后立即洗涤,标准的LuminexTM测定操作包含导入非特异性结合的风险(也参见实施例2)。为了使该风险最小化,检查了杂交之后立即稀释样品。
材料和方法:
为了研究该作用,使用了2种LuminexTM珠子的混合物,一种珠子携带HPV 31的探针(名称:31 SLPr31,参见表6a),另一种珠子携带HPV 51的探针(名称:51SLPr2,参见表6a)。这些探针分别对用SPF1O引物集合扩增的HPV 31和HPV 51序列的鉴别是特异性的。为了观察与31SLPr31的可能的交叉反应性,使用了HPV44和HPV 16的扩增引物。HPV 31和HPV 44和16的靶序列的差异分别在于1个和4个位置(表6b)。为了观察与51SLPr2的可能的交叉反应性,使用了HPV33和HPV 16的扩增引物。HPV 51和HPV 44和16的靶序列的差异在于4个位置(表6c)。
使用标准方案,在50℃进行杂交。
随后,在4℃立即在过滤板中洗涤第一组反应物,没有任何其它洗涤。与Wallace等(2005)不同,在将样品转移至过滤板之后,加入洗涤缓冲液。
如下研究了在杂交步骤之后立即进行的额外的直接的和间接的稀释洗涤操作的影响。对于该直接的和间接的操作程序,在50℃使用洗涤缓冲液(3x SSC/0.1%Sarkocyl/1mg/ml酪蛋白,这是严格洗涤缓冲液)。
通过直接操作,洗涤第二组珠子。该直接操作包含,在热循环仪中,在杂交温度,用200μl洗涤缓冲液稀释杂交混合物(50μl),随后将所有稀释的样品转移至过滤板。
通过间接操作,洗涤第三组杂交反应物。该间接操作包含,通过将50μl杂交混合物快速转移至已经在杂交温度预装200μl洗涤缓冲液的过滤板,进行稀释(也参见Wallace等,2005)。
结果:
结果如表6d所示。与标准操作相比,2种额外的洗涤操作都导致了绝对信号的降低,但是同时,信号的特异性显著增加。直接的和间接的洗涤操作之间没有显著差异。在实践中,在热循环仪中的直接稀释洗涤更难实现,因此,间接的稀释洗涤操作是优选的。
结论:
在杂交之后使用一个额外的稀释-洗涤步骤,对信号特异性具有显著的积极影响。鉴于实践的原因,间接的稀释洗涤操作是优选的。
实施例4
目的:
检查在与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白温育之前,在严格洗涤过程中维持杂交温度是否对信号特异性具有显著的积极影响。
简介:
如上所述的严格杂交之后温度下降的消极作用,暗示着严格洗涤温度本身也是影响因素。因此,研究了50℃、室温或4℃的严格洗涤温度的影响。
材料和方法:
如下使用SPF10模型***,研究了在杂交步骤之后、与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白一起温育之前,不同的严格洗涤缓冲液温度的影响。
为了研究该作用,使用了LuminexTM珠子,其携带HPV 31的探针(名称:31SLPr31,参见表7a)。该探针对用SPF1O引物集合扩增的HPV 31序列的鉴别是特异性的。为了观察与31SLPr31的可能的交叉反应性,使用了HPV44和HPV16的扩增引物。HPV 31和HPV 44和16的靶序列的差异分别在于1个和4个位置(表7b)。
在50℃进行杂交。随后,将反应物集合转移至分别含有50℃、室温或4℃的洗涤缓冲液的过滤板。
结果:
结果如表7c所示。阳性对照信号的绝对水平在50℃和室温之间没有差别,在4℃洗涤后轻微下降。但是,在50℃的洗涤导致信号特异性的显著增加,而在室温或4℃的洗涤导致信号特异性的降低。因此,在50℃杂交温度的间接稀释洗涤操作是优选的。
结论:
在与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白一起温育之前,在严格洗涤过程中维持杂交温度,对信号特异性具有显著作用。
实施例5
目的:
检查热混合仪的应用是否对信号强度具有显著的积极作用。
简介:
通过在反应过程中混合组分,可以影响杂交反应的动力学。
因此,我们研究了在杂交过程中使用热混合仪的影响。
材料和方法:
如下使用MPF模型***,研究了在杂交过程中使用热混合仪对扩散动力学的影响。
使用了2种LuminexTM珠子,其携带HPV 18的探针(名称:18MLPr7,参见表8a)或HPV51的探针(名称:51MLPr2,参见表8a)。这些探针对用MPF引物集合扩增的HPV 18和HPV51序列的鉴别是特异性的。将2种珠子混合到一起,并与HPV 18和HPV 51的MPF扩增引物杂交。HPV18和HPV51的靶序列的差别在于7个位置(表8b和c)。一式两份地测试反应。
不经摇动,在热循环仪中变性和杂交一份反应物(也参见Wallace等,2005)。
在热循环仪中变性用于变性的重复反应物,并立即转移至热混合仪,用于杂交。在50℃进行杂交。随后使用优化的杂交和洗涤方案,在50℃立即在过滤板中洗涤珠子。
结果:
结果如表8d所示。热混合仪的使用显著增加了阳性对照的绝对信号,而背景未受影响。这导致信号特异性的总体增加。
这些结果证实,通过使用热混合仪,可以增加(提高)信号强度。
结论:
热混合仪的使用对信号强度和特异性具有显著的积极作用。
实施例6
目的:
检查在杂交温度与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白温育是否对信号强度具有显著的积极作用。
简介:
通常,温度会影响任何反应的动力学,包括用报道物PE检测杂交体。因此,研究了温度对PE温育和随后的洗涤的影响。
材料和方法:
使用了LuminexTM珠子,其携带HPV51的探针(名称:51SLPr2,参见表9a)。该探针对用SPF10引物集合扩增的HPV 51序列的鉴别是特异性的。为了观察与该探针的可能的交叉反应性,使用了HPV33和HPV 16的SPF1O扩增引物。HPV 51,HPV33和HPV16的靶序列的差异在于4个位置(表9b)。
使用本文所述的优化的杂交和洗涤方案,一式两份地在50℃进行杂交。严格洗涤后,一组反应物与PE在50℃温育(也参见Wallace等,2005),另一组与PE在室温温育。随后,在50℃、在过滤板中洗涤珠子。
在另一个实验中,使用优化的杂交和洗涤方案,一式两份地在50℃进行杂交。严格洗涤后,将所有反应物与PE在50℃温育(也参见Wallace等,2005),与PE在50℃温育后,在50℃洗涤一组反应物(也参见Wallace等,2005),在室温洗涤重复组反应物。
结果:
不同温度的PE温育具有显著作用,如表9c所示。与在室温的PE温育相比,在50℃杂交温度的PE温育会产生更高的绝对信号。但是,信号的特异性没有显著差异。
因此,在杂交温度与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白温育是优选的。相反地,温育之后在室温或杂交温度洗涤,没有显著作用,尽管这在有些情况下可能更易实现。
温度对PE温育之后的洗涤步骤的影响不显著。绝对信号和特异性似乎不会受到洗涤温度的影响。
结论:
在与抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白温育过程中维持杂交温度,对信号强度有显著影响,但是对信号特异性没有影响。PE温育之后的洗涤温度没有显著影响。
实施例7
目的:
检查通过1x SSC的最终洗涤,是否可以防止LuminexTM取样探针的堵塞。
简介:
在我们的优化的杂交和洗涤方案中,在3x SSC中进行杂交。在该浓度,SSC会堵塞LuminexTM取样探针,严重阻碍样品的处理。因此,研究了更低的SSC浓度对最终洗涤的影响。
结果:
最初,我们尝试维持杂交的SSC浓度。但是,由于3xSSC的最终洗涤导致LuminexTM取样探针的严重堵塞,不能产生显著数据。简单地用1xSSC进行该洗涤步骤,确实产生了显著数据。因此,由于缺少数据,没有显示数据对比。已经研究了其它SSC浓度。
结论:
1x SSC的最终洗涤会预防LuminexTM取样探针的堵塞。
实施例8
目的:
检查最终洗涤之后在4℃保存已经准备好测量的样品至少4天,是否对信号具有任何显著影响。
简介:
为了增加工作场所的灵活性,我们使用LuminexTM***,针对直接杂交实验方案,分析了几个步骤。更具体地测试的一个操作是,在直接杂交操作的2个步骤之间的保存。因此,我们研究了在4℃保存的影响。
材料和方法:
如下使用SPF1O模型***,研究了最终洗涤操作后在4℃保存的影响。
为了研究该作用,使用了LuminexTM珠子,其携带HPV 51的探针(名称:51SLPr2,参见表10a)。该探针对用SPF1O引物集合扩增的HPV51序列的鉴别是特异性的。为了观察与51SLPr2的可能的交叉反应性,使用了HPV31的扩增引物。HPV 51和HPV 31的靶序列的差异在于4个位置(表10b)。
在最终洗涤操作后,在4℃保存反应物集合分别0,4,24,和96小时。接着,在室温测量这些反应物集合。
结果:
结果如10c所示。如证实的,最终洗涤步骤之后的保存没有影响信号强度或特异性。然而,这样的保存似乎会随着时间导入非常轻微的粗信号强度的提高。因此,如果需要,可以在最终洗涤步骤之后保存最多4天,维持原始信号。
结论:
最终洗涤步骤之后的保存对信号强度和信号特异性没有显著影响,增加了工作场所的灵活性。
探针(间隔物)设计-简介
LuminexTM***的关键原理是,将特异性的寡核苷酸探针固定在微珠表面上,其用作独特标记,这是由于各个珠子类型的彩色组分。
在分子规模,珠子比特异性的寡核苷酸探针大的多。结果,特异性的探针序列的位置非常接近LuminexTM珠子的表面。由于位阻和各种珠子表面效应,例如表面疏水性,该探针位置对于固定的探针和溶液中的靶分子之间的杂交动力学可能是最佳的。
下面的实施例描述了许多改变探针在珠子表面上的定位的方案,以便优化探针和靶之间的杂交动力学。
测试了探针设计中的下述变体:
1.使用可变长度的碳间隔物
2.使用一种额外的可变长度的寡核苷酸间隔物
3.使用可变组成的寡核苷酸间隔物
探针具有3个不同的区域,其具有不同的功能;
1.偶联基团,例如,NH2基团,其允许探针共价偶联到珠子表面上;
2.间隔物,其可以用于建立珠子表面和特异性的探针序列之间的距离,和/或(b)将特异性的探针更多地置于亲水环境中;和
3.实际的靶-特异性的探针序列。对于探针的该部分,适用本领域的正常参数,例如,探针组成和长度。
实施例9
目的:
确定使用可变长度的碳间隔物的效果。
材料和方法:
使用LuminexTM珠子,其携带具有C12间隔物的HPV51探针(名称:51SLPr2,参见表1 Ia)或具有C18间隔物的HPV51探针(名称:51SLPr2C18,参见表1Ia)。这些探针对用SPF1O引物集合扩增的HPV 51序列的鉴别是特异性的。为了观察与这些探针的可能的交叉反应性,使用了HPV33的扩增引物。HPV 51和HPV33的靶序列的差异在于4个位置(表11b)。
结果:结果如表11c所示。C18间隔物导致绝对信号的降低,但是特异性比C12探针高。发现该现象不仅存在于51SLPr2C18,而且也存在于具有C18碳间隔物的其它探针(例如33SLPr21C18:表11a,c,和d)。
结论:
不同的碳间隔物长度的使用,对信号特异性具有显著影响。关于例如51SLPr2,最佳探针含有C18碳间隔物。
实施例10
目的:
确定可变长度的寡核苷酸间隔物的效果。
材料和方法:
使用LuminexTM珠子,其携带具有0、10、20、30或40个胸腺嘧啶组成的间隔物的HPV51探针(名称:51SLPr2,51 SLPr2T10,51SLPr2T20,51SLPr2T30,51SLPr2T40,参见表12a)。每个珠子类型携带不同的探针变体。这些探针对用SPF1O引物集合扩增的HPV 51序列的鉴别是特异性的。为了观察与这些探针的可能的交叉反应性,使用了HPV33的扩增引物。HPV 51和HPV33的靶序列的差异在于4个位置(表12c)。
除了SPF1O模型***以外,还使用如下的MPF模型***研究了该效应。使用LuminexTM珠子,其携带具有0、20、30或40个胸腺嘧啶组成的间隔物的HPV52探针(名称:52MLPr2,52MLPr2T20,5MLPr2T30,52MLPr2T40,参见表12b)。每个珠子类型携带不同的探针变体。这些探针对用MPF引物集合扩增的HPV 52序列的鉴别是特异性的。为了观察与这些探针的可能的交叉反应性,使用了HPV16的扩增引物。HPV 52和HPV16的靶序列的差异在于2个位置(表12d)。
结果:
结果如表12e和12f所示。用胸腺嘧啶片段延长间隔物,会显著增加绝对信号水平。与没有额外的胸腺嘧啶间隔物的间隔物相比,特异性也显著增加。与具有不同长度的间隔物相比,需要最少20个胸腺嘧啶残基来产生最佳信号(例如51SLPr2)。总之,当它们含有40个核苷酸组成的间隔物时,探针表现最佳(例如51SLPr2,和52MLPr2)。因此,该间隔物长度是优选的。
结论:
不同间隔物的使用,不仅对信号强度有显著影响,而且也对特异性有显著影响。关于51SLPr2Tn,好的探针含有能增加信号强度和特异性的至少20个胸腺嘧啶核苷酸组成的间隔物,通常,至少40个核苷酸组成的间隔物长度表现最佳。
实施例11
目的:
确定改进的聚(T)间隔物的使用是否会阻止假阳性反应性。
简介:
众所周知,许多Taq DNA聚合酶会在合成链的3′末端添加一个额外的A-核苷酸。不知道是否也会在3′末端添加多个A,从而产生在3′末端具有寡聚A尾的分子亚群。尽管这样的分子仅仅代表PCR产物总量中非常小的比例,由于检测方法的高灵敏度,这些分子可以导致假阴性结果。这是因为PCR产物的这种寡聚A片段和探针的聚(T)间隔物之间发生杂交的事实。
该PCR伪迹发生在有些样品中,且难以在PCR水平再现。它似乎依赖于反应条件的非常微小的波动。背景在检测水平是非常可再现的,即PCR产物的产生背景也是非常可再现的。
该PCR伪迹也可以在线性探针测定(LiPA)***中造成假阳性结果,因为该***也包含T-加尾的探针,在LiPA测定中,这会导致微弱的与所有探针相同的(背景)信号,无论它们的具体序列。在LuminexTM***中,也观察到了这样微弱的背景信号读出。因此,研究了改进的间隔物的效果。
材料和方法:
使用LuminexTM珠子,其携带具有T40间隔物或改进的(TTG)13间隔物的HPV18探针(名称:18MLPr7T40和18MLPr7(TTG)13,参见表13a)。这些探针对用MPF引物集合扩增的HPV18序列的鉴别是特异性的。选择(TTG)三联体作为替代间隔物,因为它表现出与聚(A)的最差理论结合效率之一。
为了观察与18MLPr7T40和18MLPr7(TTG)13的可能的交叉反应性,使用了源自表现出该假阳性背景的样品的扩增引物(称作nc8)。
结果:
结果如表13b所示。
13个″TTG″核苷酸三联体的间隔物显然能几乎完全消除使用T40间隔物时观察到的背景信号。
结论:
替代性的基于T的间隔物例如(TTG)13的使用,对信号特异性具有显著的积极影响,消除了由富含A的PCR伪迹诱发的假阳性信号。
实施例12
目的:
检查在探针5′-或3′-末端放置基于胸腺嘧啶的间隔物,是否会阻止与侧翼于探针-靶结合位点的富含A的靶区域结合。
简介:
已知在探针/靶中间的错配对它的结合能具有最大的影响。接近结合区域侧面的错配更难以辨别。与侧翼于探针/靶结合区域的富含A的片段的位置相组合,这可能对探针的选择性强度有害。因此,我们研究了间隔物位置的影响,以便使它与侧翼于探针-靶结合位点的富含A的靶区域的结合最小化。
材料和方法:
如下使用MPF模型***,研究了置于LuminexTM珠子和特异性的探针序列之间的探针5′-或3′-末端的间隔物位置的影响。
为了研究该影响,使用了LuminexTM珠子,其携带具有基于胸腺嘧啶的间隔物的HPV18和HPV45的探针(名称:18MLPr7T40N5,18MLPr7T40N3,45MLPr8T40N5和45MLPr8T40N3,参见表14a)。这些探针分别对用MPF引物集合扩增的HPV 18和HPV45序列的鉴别是特异性的。为了观察与18MLPr7T40n的可能的交叉反应性,使用了HPV39的扩增引物。HPV 18和HPV39的靶序列的差异在于2个位置(表14b)。为了观察与45MLPr8T40n的可能的交叉反应性,使用了HPV13,39,和40的扩增引物。HPV 45和HPV13,39和40的靶序列的差异分别在于3,2,和1个位置(表14c)。
结果:
结果如表14d所示。如证实的,在探针3′-末端(而不是5′-末端)的间隔物,会降低它与侧翼于探针-靶结合位点的富含A的靶区域的结合,影响结合能(dG)和解链温度(Tm)。靶与间隔物和探针的结合,可以解释这些非特异性信号的排除。这些结果表明,靶与间隔物的结合,可以妨碍探针特异性,这应当加以预防。原则上,使用″TTG″核苷酸三联体间隔物,可以涉及类似的机理。因此,当使用基于胸腺嘧啶的间隔物时,间隔物和邻近特定靶区域的序列之间微弱交叉杂交,可以增加探针:靶杂交体的稳定性,产生在探针设计时应当考虑的假阳性信号。
结论:
基于胸腺嘧啶的间隔物在探针5′或3′末端的定位,可以对与侧翼于探针-靶结合位点的富含A的靶区域的结合产生显著影响。
参考文献:
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Wallace J,Woda BA,Pihan G.Facile,comprehensive,high-throughput genotyping of humangenital papillomaviruses using spectrally addressable liquid bead microarrays.J Mol Diagn.2005 Feb;7(1):72-80.
表实施例2:
名称 | 探针组成 |
31SLPr31 | NH2-C12-GGCAATCAGTTATTTG |
表5a.5a.31SLPr31=SPF10探针31版本31,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针31SLPr31的比对 | 错配数 |
HPV31 | GGCAATCAGTTATTTG | 0 |
HPV44 | --A------------- | 1 |
HPV16 | --T-C-AC-------- | 4 |
表5b.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 杂交后的温度(℃) | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 50 | 4457 | 100 | 48 | 特异性的 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 50 | 1279 | 29 | 14 | 交叉反应 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10HPV16 | 50 | 19 | <1 | <1 | 阴性的 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10HPV31 | RT | 7544 | 100 | 13 | 特异性的 | ID27 |
31SLPr31 | SPF10HPV44 | RT | 3783 | 50 | 6 | 交叉反应 | ID27 |
31SLPr31 | SPF10HPV16 | RT | 24 | <1 | <1 | 阴性的 | ID27 |
表5c.
表实施例3:
名称 | 探针组成 |
31SLPr31 | NH2-C12-GGCAATCAGTTATTTG |
51SLPr2 | NH2-C12-CTATTTGCTGGAACAATC |
表6a.31SLPr31=SPF10探针31版本31,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针31SLPr31的比对 | 错配数 |
HPV31 | GGCAATCAGTTATTTG | 0 |
HPV44 | --A------------- | 1 |
HPV16 | --T-C-AC-------- | 4 |
表6b.相同的核苷酸用“-”表示。
靶物 | 与探针51SLPr2的比对 | 错配数 |
HPV51 | CTATTTGCTGGAACAATC | 0 |
HPV33 | T------T---GG----- | 4 |
HPV16 | -------T---GGT--C- | 4 |
表6c.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 额外的洗涤操作 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 无 | 4457 | 100 | 48 | 特异性的 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 无 | 1279 | 29 | 14 | 交叉反应 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | 无 | 19 | <1 | <1 | 阴性的 | ID28 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 直接 | 2765 | 100 | 41 | 特异性的 | ID31 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 直接 | 117 | 4 | 2 | 阴性的 | ID31 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | 直接 | 20 | 1 | <1 | 阴性的 | ID31 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 间接 | 3843 | 100 | 171 | 特异性的 | ID32 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 间接 | 25 | 1 | 1 | 阴性的 | ID32 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | 间接 | 15 | <1 | 1 | 阴性的 | ID32 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 无 | 2316 | 100 | 201 | 特异性的 | ID28 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 无 | 631 | 27 | 55 | 交叉反应 | ID28 |
51SIPr2 | SPF10 HPV16 | 无 | 11 | <1 | 1 | 阴性的 | ID28 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 直接 | 2057 | 100 | 110 | 特异性的 | ID31 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 直接 | 432 | 21 | 23 | 交叉反应 | ID31 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | 直接 | 18 | 1 | 1 | 阴性的 | ID31 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 间接 | 1571 | 100 | 209 | 特异性的 | ID32 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 间接 | 354 | 23 | 47 | 交叉反应 | ID32 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | 间接 | 7 | <1 | 1 | 阴性的 | ID32 |
表6d.
表实施例4:
名称 | 探针组成 |
31SLPr31 | NH2-C12-GGCAATCAGTTATTTG |
表7a.31SLPr31=SPF10探针31版本31,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针31SLPr31的比对 | 错配数 |
HPV 31 | GGCAATCAGTTATTTG | 0 |
HPV 44 | --A------------- | 1 |
HPV 16 | --T-C-AC-------- | 4 |
表7b.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 洗涤温度(℃) | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 50 | 5747 | 100 | 162 | 特异性的 | ID90 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 50 | 56 | 1 | 2 | 阴性的 | ID90 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | 50 | 20 | <1 | <1 | 阴性的 | ID90 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | RT | 5701 | 100 | 33 | 特异性的 | ID86 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | RT | 2422 | 42 | 14 | 交叉反应 | ID86 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | RT | 13 | <1 | <1 | 阴性的 | ID86 |
31SLPr31 | SPF10 HPV31 | 4 | 4889 | 100 | 44 | 特异性的 | ID34 |
31SLPr31 | SPF10 HPV44 | 4 | 417 | 9 | 4 | 交叉反应 | ID34 |
31SLPr31 | SPF10 HPV16 | 4 | 33 | 1 | <1 | 阴性的 | ID34 |
表7c.
表实施例5:
名称 | 探针组成 |
18MLPr7T40 | NH2-C12-(T)40-TTACATAAGGCACAGG |
51MLPr2T40 | NH2-C12-(T)40-TTATTGGCTCCACCGT |
表8a.18MLPr7=MPF探针18版本7,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针18MLPr7的比对 | 错配数 |
HPV18 | TTACATAAGGCACAGG | 0 |
HPV51 | C-C--CCGT--G---- | 7 |
表8b.相同的核苷酸用“-”表示。
靶物 | 与探针51MLPr2的比对 | 错配数 |
HPV51 | TTATTGGCTCCACCGT | 0 |
HPV18 | A------T-A--TAAG | 7 |
表8c.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 杂交过程 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
18MLPr7T40 | MPF HPV18 | 热循环仪 | 1082 | 100 | 144 | 特异性的 | ID148 |
18MLPr7T40 | MPF HPV51 | 热循环仪 | 6 | 1 | 1 | 阴性的 | ID148 |
51MLPr2T40 | MPF HPV51 | 热循环仪 | 1410 | 100 | 123 | 特异性的 | ID148 |
51MLPr2T40 | MPF HPV18 | 热循环仪 | 20 | 1 | 1 | 阴性的 | ID148 |
18MLPr7T40 | MPF HPV18 | 热混合仪 | 2154 | 100 | 287 | 特异性的 | ID148 |
18MLPr7T40 | MPF HPV51 | 热混合仪 | 6 | 0 | 1 | 阴性的 | ID148 |
51MLPr2T40 | MPF HPV51 | 热混合仪 | 2725 | 100 | 210 | 特异性的 | ID148 |
51MLPr2T40 | MPF HPV18 | 热混合仪 | 25 | 1 | 2 | 阴性的 | ID148 |
表8d.
表实施例6:
名称 | 探针组成 |
51SLPr2 | NH2-C12-CTATTTGCTGGAACAATC |
表9a.51SLPr2=SPF10探针51版本2,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针51SLPr2的比对 | 错配数 |
HPV 51 | CTATTTGCTGGAACAATC | 0 |
HPV 33 | T------T---GG----- | 4 |
HPV 16 | -------T---GGT---- | 4 |
表9b.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | PE温育温度(℃) | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 50 | 3681 | 100 | 194 | 特异性的 | ID44 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 50 | 345 | 9 | 18 | 交叉反应 | ID44 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | 50 | 30 | 1 | 2 | 阴性的 | ID44 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | RT | 3074 | 100 | 615 | 特异性的 | ID43 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | RT | 259 | 8 | 52 | 交叉反应 | ID43 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | RT | 5 | <1 | 1 | 阴性的 | ID43 |
表9c.
探针 | 杂交于靶 | 洗涤温度(℃) | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 50 | 2433 | 100 | 187 | 特异性的 | ID90 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 50 | 423 | 16 | 33 | 交叉反应 | ID90 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | 50 | 8 | <1 | 1 | 阴性的 | ID90 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | RT | 2777 | 100 | 179 | 特异性的 | ID90 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | RT | 374 | 13 | 24 | 交叉反应 | ID90 |
51SLPr2 | SPF10 HPV16 | RT | 10 | <1 | 1 | 阴性的 | ID90 |
表9d.
表实施例8:
名称 | 探针组成 |
51SLPr2 | NH2-C12-CTATTTGCTGGAACAATC |
表10a.51SLPr2=SPF10探针51版本2,C12=12碳原子片段
靶物 | 与探针51SLPr2的比对 | 错配数 |
HPV51 | CTATTTGCTGGAACAATC | 0 |
HPV 31 | T------T---GG----- | 4 |
表10b.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 保存4℃(小时) | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 0 | 1573 | 100 | 51 | 特异性的 | ID110 |
51SLPr2 | SPF10 HPV31 | 0 | 30 | 2 | 1 | 阴性的 | ID110 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 4 | 1611 | 100 | 59 | 特异性的 | ID111 |
51SLPr2 | SPF10 HPV31 | 4 | 28 | 2 | 1 | 阴性的 | ID111 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 24 | 1783 | 100 | 60 | 特异性的 | ID113 |
51SLPr2 | SPF10 HPV31 | 24 | 34 | 2 | 1 | 阴性的 | ID113 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 96 | 1707 | 100 | 52 | 特异性的 | ID114 |
51SLPr2 | SPF10 HPV31 | 96 | 33 | 2 | 1 | 阴性的 | ID114 |
表10c.
表实施例9:
名称 | 探针组成 |
51SLPr2 | NH2-C12-CTATTTGCTGGAACAATC |
51SLPr2C18 | NH2-C18-CTATTTGCTGGAACAATC |
33SLPr21 | NH2-C12-GGGCAATCAGGTATT |
33SLPr21C18 | NH2-C18-GGGCAATCAGGTATT |
表11a.51SLPr2=SPF10探针51版本2,C12=12碳原子片段,C18=18碳原子片段
靶物 | 与探针51SLPr2的比对 | 错配数 |
HPV51 | CTATTTGCTGGAACAATC | 0 |
HPV33 | T------T---GG----- | 4 |
表11b.相同的核苷酸用“-”表示。
靶物 | 与探针33SLPr21的比对 | 错配数 |
HPV33 | GGGCAAATCAGGTATT | 0 |
HPV51 | -AA---------C-T-- | 4 |
表11c.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 4291 | 100 | 172 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 358 | 8 | 14 | 交叉反应 | ‘’ |
51SLPr2C18 | SPF10 HPV51 | 3515 | 100 | 216 | 特异性的 | ID67 |
51SLPr2C18 | SPF10 HPV33 | 16 | 0 | 1 | 阴性的 | ‘’ |
33SLPr21 | SPF10 HPV33 | 429 | 100 | 48 | 特异性的 | ID77 |
33SLPr21 | SPF10 HPV51 | 52 | 12 | 6 | 交叉反应 | ‘’ |
33SLPr21C18 | SPF10 HPV33 | 429 | 100 | 61 | 特异性的 | ‘’ |
33SLPr21C18 | SPF10 HPV51 | 4 | 1 | 1 | 阴性的 | ‘’ |
表11d.
表实施例10:
名称 | 探针组成 |
51SLPr2 | NH2-C12-CTATTTGCTGGAACAATC |
51SLPr2T10 | NH2-C12-(T))10-CTATTTGCTGGAACAATC |
51SLPr2T20 | NH2-C12-(T)20-CTATTTGCTGGAACAATC |
51SLPr2T30 | NH2-C12-(T)30-CTATTTGCTGGAACAATC |
51SLPr2T40 | NH2-C12-(T)40-CTATTTGCTGGAACAATC |
表12a.51SLPr2=SPF10探针51版本2,C12=12碳原子片段,(T)40=40个胸腺嘧啶核苷酸组成的片段
名称 | 探针组成 |
52MLPr2 | NH2-C12-CCGTACTGGTTACAACGA |
52MLPr2T20 | NH2-C12-(T)20-CCGTACTGGTTACAACGA |
52MLPr2T30 | NH2-C12-(T)30-CCGTACTGGTTACAACGA |
52MLPr2T40 | NH2-C12-(T)40-CCGTACTGGTACAACGA |
表12b. 52MLPr2=MPF探针52版本2,C12=12碳原子片段,(T)40=40个胸腺嘧啶核苷酸组成的片段
靶物 | 与探针51SLPr2的比对 | 错配数 |
HPV51 | CTATTTGCTGGAACAATC | 0 |
HPV33 | T------T---GG----- | 4 |
表12c.相同的核苷酸用“-”表示。
靶物 | 与探针52MLPr2的比对 | 错配数 |
HPV52 | CCGTACTGGTTACAACGA | 0 |
HPV16 | --T--T------------ | 2 |
表12d.相同的核苷酸用“-”表示。
探针 | 杂交于靶 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51SLPr2 | SPF10 HPV51 | 4291 | 100 | 172 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2 | SPF10 HPV33 | 358 | 8 | 14 | 交叉反应 | ID64 |
51SLPr2T10 | SPF10 HPV51 | 4688 | 100 | 122 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2T10 | SPF10 HPV33 | 34 | 1 | 1 | 阴性的 | ID64 |
51SLPr2T20 | SPF10 HPV51 | 8712 | 100 | 387 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2T20 | SPF10 HPV33 | 32 | 0 | 1 | 阴性的 | ID64 |
51SLPr2T30 | SPF10 HPV51 | 8077 | 100 | 414 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2T30 | SPF10 HPV33 | 30 | 0 | 1 | 阴性的 | ID64 |
51SLPr2T40 | SPF10 HPV51 | 7356 | 100 | 320 | 特异性的 | ID64 |
51SLPr2T40 | SPF10 HPV33 | 32 | 0 | 1 | 阴性的 | ID64 |
表12e.
探针 | 杂交于靶 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
51MLPr2 | MPF HPV52 | 423 | 100 | 13 | 特异性的 | ID69 |
51MLPr2 | MPF HPV16 | 32 | 8 | 1 | 交叉反应 | ID69 |
51MLPr2T20 | MPF HPV52 | 1233 | 100 | 95 | 特异性的 | ID69 |
51MLPr2T20 | MPF HPV16 | 11 | 1 | 1 | 阴性的 | ID69 |
51MLPr2T30 | MPF HPV52 | 1250 | 100 | 139 | 特异性的 | ID69 |
51MLPr2T30 | MPF HPV16 | 8 | 1 | 1 | 阴性的 | ID69 |
51MLPr2T40 | MPF HPV52 | 1510 | 100 | 126 | 特异性的 | ID69 |
51MLPr2T40 | MPF HPV16 | 9 | 1 | 1 | 阴性的 | ID69 |
表12f.
表实施例11:
名称 | 探针组成 |
18MLPr7T40 | NH2-C12-(T)40-TTACATAAGGCACACG |
18MLPr7(TTG)13 | NH2-C12-(TTG)13-TTACATAAGGCACAGG |
表13a.18MLPr7=MPF探针18版本7,C12=12碳原子片段,(T)40=40个胸腺嘧啶核苷酸组成的片段(TTG)13=13个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤核苷酸三联体的片段(共39个核苷酸)
探针 | 杂交于靶 | 信号(MFI) | 靶/探针(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
18MLPr7T40 | MPF HPV18 | 2001 | 100 | 13 | 特异性的 | ID169 |
18MLPr7T40 | nc8 | 1104 | 54 | 7 | 交叉反应 | ID169 |
18MLPr7T40 | DNA- | 2 | 0 | 0 | 阴性的 | ID169 |
18MLPr7(TTG)13 | MPF HPV18 | 2390 | 100 | 199 | 特异性的 | ID169 |
18MLPr7(TTG)13 | nc8 | 23 | 1 | 2 | 阴性的 | ID169 |
18MLPr7(TTG)13 | DNA- | 2 | 0 | 0 | 阴性的 | ID169 |
表13b.nc8=在LiPA测定中表现出与所有探针的交叉反应的阴性对照8,DNA-=阴性对照
表实施例12:
名称 | 探针组成 |
18MLPr7T40N5 | NH2-C12-(T)40-TTACATAAGGCACAGG |
18MLPr7T40N3 | TTACATAAGGCACAGG-(T)40-C12-NH2 |
45MLPr8T40N5 | NH2-C12-(T)40-CCAGGGCCATAACAAG |
45MLPr8T40N3 | CCAGGGCCATAACAAG-(T)40-C12-NH2 |
表14a.18MLPr7=MPF探针18版本7,C12=12碳原子片段,(T)40=40个胸腺嘧啶核苷酸组成的片段N5=5’-末端氨基接头,N3=3’-末端氨基接头,
表14b.18MLPr7=MPF探针18版本7,N5=5’-末端氨基接头,N3=3’-末端氨基接头,加灰框的序列=可以结合胸腺嘧啶间隔物(小写)和探针序列(大写)的靶核甘酸,粗体且加下划线=与探针序列错配。
表14c.45MLPr8=MPF探针45版本8,N5=5’-末端氨基接头,N3=3’-末端氨基接头,加灰框的序列=可以结合胸腺嘧啶间隔物(小写)和探针序列(大写)的靶核甘酸,粗体且加下划线=与探针序列错配。
探针 | 杂交于靶 | 信号(MFI) | 靶/探针(%)(%) | 信噪比 | 评注 | 实验 |
18MLPr7T40N5 | MPF HPV18 | 1146 | 100 | 85 | 特异性的 | ID141 |
18MLPr7T40N5 | MPF HPV39 | 518 | 45 | 38 | 交叉反应 | ID141 |
18MLPr7T40N3 | MPF HPV18 | 694 | 100 | 139 | 特异性的 | ID141 |
18MLPr7T40N3 | MPF HPV39 | 12 | 2 | 2 | 阴性的 | ID141 |
45MLPr8T40N5 | MPF HPV13 | 611 | 38 | 51 | 交叉反应 | ID141 |
45MLPr8T40N5 | MPF HPV39 | 284 | 18 | 24 | 交叉反应 | ID141 |
45MLPr8T40N5 | MPF HPV40 | 1021 | 64 | 85 | 交叉反应 | ID141 |
45MLPr8T40N5 | MPF HPV45 | 1600 | 100 | 133 | 特异性的 | ID141 |
45MLPr8T40N3 | MPF HPV13 | 47 | 8 | 8 | 交叉反应 | ID141 |
45MLPr8T40N3 | MPF HPV39 | 17 | 3 | 3 | 阴性的 | ID141 |
45MLPr8T40N3 | MPF HPV40 | 116 | 19 | 19 | 交叉反应 | ID141 |
45MLPr8T40N3 | MPF HPV45 | 615 | 100 | 103 | 特异性的 | ID141 |
表14d.
表15a和b:
%靶/探针:
A1,a=988/988*100=100%;
A1,c=19/988*100=2%
表16a和b:
信噪比:
A1,a=988/12(=中值 (988,13,19,5,3,11,14,3))=82;
A1,c=19/12(中值 (988,13,19,5,3,11,14,3))=2.
实施例13
适用于基于珠子的方案的HPV探针,例如适用于基于Luminex的方案:
表17
名称 | 探针序列 |
16MLP4T40N3 | GAGCACAGGGCCAC(T)40 |
18MLPr7T40N3 | TTACATAAGGCACAGG(T)40 |
26MLP7T40N3 | GTTACAACGTGCACAG(T)40 |
31MLPr6T40N3 | GGATGCAACGTGCTC(T)40 |
33MLPr4T40N5 | (T)40CATATTGGCTACAACGT |
35MLPr6T40N3 | GTGCACAAGGCCATA(T)40 |
39MLPr4T40N5 | (T)40GCCTTATTGGCTACATAA |
45MLPr6T40N5 | (T)40ggtGTTACATAAGGCCCAG |
45MLPr8T40N3 | CCAGGGCCATAACAAg(T)40 |
51MLPr2T40N5 | (T)40TTATTGGCTCCACCGT |
52MLPr2T40N5 | (T)40CCGTACTGGTTACAACGa |
53MLPr6T40N5 | (T)40ATATTGGCTGCAACGT |
56MLPr4T40N5 | (T)40GGCCCAAGGCCATAATAA |
58MLPr1T40N5 | (T)40CTTATTGGCTACAGCGT |
58MLPr5T40N3 | ACAGCGTGCACAAGG(T)40 |
59MLPr3T40N5 | (T)40CAAGGCTCAGGGTTTAA |
66MLPr6T40N3 | TGCACAGGGCCATA(T)40 |
66MLPr7T40N3 | TGCAACGTGCACAG(T)40 |
68MLPr8T40N5 | (T)40CTGCACAAGGCACAG |
68MLPr10T40N3 | GCACAAGGCACAGG(T)40 |
70MLPr4T40N5 | (T)40CCTATTGGTTGCATAAGG |
82MLPr3T40N3 | ATTGGTTGCATCGCG(T)40 |
在本发明的一个方面,任意的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21或所有22种上述探针可以用于在相同条件下的基于珠子的多路反应中,以同时检测样品中存在的任何HPV靶DNA。这样的珠子集合适用于上述的优化的反应方案中。可以掺入额外的多碳间隔物。
实施例14:HPV MPF扩增引物在96孔微量滴定板测定中的通用检测,DNA酶免疫测定(DEIA)
简介
本实施例描述了8个探针的混合物在用MPF引物进行的广谱PCR后得到的HPV扩增引物的通用检测中的应用。
(在本工作中,我们将图1区域的分析称作MPF分析,将其中使用的引物和探针称作MPF引物和探针。扩增的区域是MPF扩增引物。以此方式,从本实验室开发的″SPF1O″引物和探针集合鉴别出引物和探针,用于分析L1基因的不同区域。)
材料和方法
对于HPV MPF扩增引物的通用检测,从图1 HPV序列的比对,选择探针。在表3中列出了通用DEIA探针的序列。
通过扩增含有HPV基因型6,11,13,16,18,26,30,31,32,33,34,35,39,43,44,45,51,52,53,54,55,56,57,58,59,66,67,68,69,70,71和74的HPV质粒(由E-M.de Villiers博士,R.Ostrow博士,A.Lorincz博士,T.Matsukura博士,和G.Orth博士馈赠),或代表HPV基因型7,40,42,61,72,73,81-87,90,91和HPV基因型16的2个变体序列的寡核苷酸序列,得到MPF扩增引物。
在50μl的终体积中,进行HPV DNA扩增,其中含有10μl靶DNA,1x PCR缓冲液II(Perkin Elmer),3.0mM MgCl2,0.2mM脱氧核苷三磷酸,10pmol每种正向和反向引物(表1和2)和1.5UAmpliTaqGold(Perkin Elmer,Branchburg,New Jersey,USA)。PCR条件如下:在94℃预热9min,然后是在94℃30秒、在52℃45秒、和在72℃45秒的40个循环,最后在72℃延伸。
通过与8种HPV-特异性的探针混合物(参见表3优选的探针)的杂交,检测由生物素化的MPF PCR引物合成的扩增引物。在100μl杂交缓冲液(150mmol/L NaCl,15mmol/L柠檬酸钠,pH7.0,0.1%吐温20)中稀释10微升PCR产物,并在抗生物素蛋白链菌素-包被的微量滴定板中在42℃温育30分钟。通过用杂交缓冲液洗涤3次,去除未捕获的物质。通过加入100μl变性溶液(100mmol/L NaOH),使捕获的双链PCR产物变性,并在室温温育5分钟,然后用杂交缓冲液洗涤3次。在杂交缓冲液中稀释洋地黄毒苷(DIG)-标记的HPV-特异性探针的混合物(参见表3优选的探针),加入孔中,并在42℃温育45分钟。洗涤孔3次,加入抗-DIG碱性磷酸酶缀合物,在42℃温育15分钟。洗涤5次后,加入底物,在室温温育15分钟。通过加入100μl 0.5mmol/LH2SO4,终止反应。在微量滴定板读数器中,测量在450nm的光密度(OD)。如果OD450比阴性(截止值)PCR对照高2.5倍,则认为样品是阳性的。在每轮中,与样品一起测试阴性对照以及阳性和临界阳性对照。
结果
HPV基因型6,7,11,13,16,18,26,30-35,39,40,42-45,51-59,66-74,81-87,90,91和HPV基因型16的2种变体序列的所有扩增引物,都可与8种选择的探针的混合物反应。
讨论
开发了8种探针的混合物,用于HPV MPF扩增引物的通用检测。8种选择的探针在各种HPV基因型的检测中是成功的,尽管HPV基因型51,57,71,84,87,13,91,11,59,30,44,55,70,52,69,84,86,74和HPV基因型16的2种变体的扩增引物表现出与最佳匹配探针的1个核苷酸的错配。
实施例15:HPV MPF基因型分析测定的开发
简介
本实施例描述了用于同时检测和鉴别HPV基因型的HPV MPF基因型分析测定。使用MPF引物进行HPV广谱扩增后,可以通过与应用于反向杂交条带上的基因型特异性的探针的杂交,检测和鉴别合成的扩增引物。
材料和方法
探针的选择:
基于位于表1和2的正向和反向引物靶序列之间的31bp序列,选择类型特异性的探针。这些探针序列列在下面的表4和表18中。
HPV质粒和HPV寡聚物
分析选择的探针的分析灵敏度和特异性。通过使用在5′末端含有生物素基团的10种MPF正向引物和8种MPF反向引物进行PCR,得到HPV MPF扩增引物,参见表1和2。如实施例1所述,进行HPVPCR。
HPV MPF反向杂交基因型分析测定的开发:
为了同时检测和鉴别不同的HPV基因型,开发了反向杂交基因型分析测定。在单个杂交步骤中分析多个探针,需要选择具有类似杂交特性的类型特异性的探针。
在该实验中,选择HPV类型16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,70,82的探针以及类型53和66的2种证实探针。除了为证实选择的探针以外,探针名称从HPV类型编号开始。那些探针从′c′开始,随后是HPV类型编号。除了类型61以外,选择探针c53L1nPr3;除了类型89以外,选择探针c66L1nPr5。
选择寡核苷酸探针,并分别用5′或3′末端的聚-T尾排序。将这些探针成平行线固定在硝酸纤维素条带上。为了控制缀合物和底物的反应,将生物素化的DNA也应用于该条带上。在图7中显示了可以使用的条带的可能概要。
通过加入10μl NaOH溶液,使10微升PCR产物变性,所述PCR产物含有位于引物5′末端的生物素基团。10min后,将反向杂交条带置于盘中。加入2毫升预热的(37℃)杂交缓冲液(3x SSC[1x SSC是15mM柠檬酸钠和150mM NaCl],0.1%十二烷基硫酸钠),并在54±0.5℃温育1h。在Auto-LiPA中,自动化地进行所有温育和洗涤步骤。在54℃,用2ml杂交溶液,将条带洗涤2次,每次30秒,并洗涤1次30min。在该严格洗涤后,将条带与2ml碱性磷酸酶-抗生物素蛋白链菌素缀合物一起在室温温育30min。用2ml冲洗溶液(含有NaCl、Triton和0.5%NaN3的磷酸盐缓冲液)洗涤条带2次,并用2ml底物缓冲液洗涤1次。加入2毫升底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑),并在室温温育30min。通过抽吸底物溶液,并加入2ml蒸馏水,终止反应。干燥后,目检条带结果。
结果:
在反向杂交实验中使用从HPV类型16,18,26,31,33和35得到的扩增引物,以确定从表18选择的探针的特异性。
表18
名称 | 探针序列 | 起点 | 长度 | T.尾100×T |
16L1nPr5.CH | AGCACAGGGCCACA | 39 | 14 | 3′ |
18L1nPr7.CH | TTACATAAGGCACAGG | 31 | 16 | 3′ |
26L1nPr7.CH | GTTACAACGTGCACAG | 30 | 16 | 3′ |
31L1nPr4.CH | ACCATATTGGATGCAAC | 21 | 17 | 5′ |
33L1nPr3.CH | CCATATTGGCTACAACG | 22 | 17 | 5′ |
35L1nPr6.CH | GTGCACAAGGCCATA | 38 | 15 | 3′ |
39L1nPr6.CH | GCCTTATTGGCTACATAAG | 21 | 19 | 5′ |
45L1nPr10.CH | TTACATAAGGCCCAGG | 31 | 16 | 3′ |
51L1nPr4.CH | ggATTGGCTCCACCGTG | 24 | 15 | 5′ |
52L1nPr4.CH | ACCGTACTGGTTACAAC | 21 | 17 | 5′ |
53L1CPr6.CH | ATATTGGCTGCAACGT | 24 | 16 | 5′ |
c53L1nPr3.CH | ACGTGCCCAGGGAC | 36 | 14 | 5′ |
56L1nPr6.CH | TGCCCAAGGCCATAAT | 39 | 16 | 5′ |
58L1nPr1.CH | CTTATTGGCTACAGCGT | 23 | 17 | 5′ |
59L1nPr3.CH | CAAGGCTCAGGGTTTAA | 36 | 17 | 5′ |
66L1nPr6.CH | TGCACAGGGCCATA | 39 | 14 | 3′ |
c66L1nPr5.CH | GCAACGTGCACAGG | 33 | 14 | 3′ |
68L1nPr10.CH | GCACAAGGCACAGG | 33 | 14 | 3′ |
70L1nPr4.CH | CCTATTGGTTGCATAAGG | 23 | 18 | 5′ |
82L1nPr3.CH | ATTGGTTGCATCGCG | 26 | 15 | 3′ |
小写字母不是类型特异性的序列
结果如图8所示。
结论
反向杂交测定至少允许HPV类型16,18,26,31,33和35的阳性鉴别。因而,相应的探针也可以同时用于多路反应中。通过加入所有其它生殖道HPV类型的探针,可以扩展该测定。
实施例16:用于检测13种高危HPV基因型的高危MPF HPVDNA酶免疫测定(HR MPF HPV DEIA)
简介
本实施例描述了13种洋地黄毒苷-标记的HPV类型-特异性的寡核苷酸探针的混合物在DNA酶免疫测定(DEIA)中的应用,所述测定用于在微量滴定板中特异性地且同时地检测在广谱PCR之后得到的13种(选择的)高危HPV基因型(类型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,和68)的扩增引物,而其它HPV基因型的扩增引物保持不被检测到。
材料和方法
通用HPV扩增后,通过与13种高危HPV-特异性的洋地黄毒苷-标记的寡核苷酸探针的混合物(最佳选择见表19)的杂交,可以在DEIA中检测合成的生物素化的扩增引物。从图1的HPV序列比对中,选择这些探针的序列,并列在表19中。有些寡核苷酸探针含有锁定的核酸(LNA)。
表19-高危MPF DEIA探针
寡核苷酸探针 | 序列5′>3′ | 修饰 | 起点 |
16pr4_dig | tggttacaacgagcac | 5′-DIG | 29 |
16prM1_dig | gttacaacgagcac | 5′-DIG | 31 |
16prM2_dig | ttacaacgagcac | 5′-DIG | 32 |
16prM3_dig* | gagcacagggccaca | 5′-DIG | 39 |
18prM1_dig* | gttacataaggcacagggtc | 5′-DIG | 31 |
31prM1_dig | aaccatattggatgcaacgt | 5′-DIG | 21 |
31prM2_dig | aaccatattggatgcaacg | 5′-DIG | 21 |
31prM3_dig | aaccatattggatgcaac | 5′-DIG | 21 |
31prM3LAAG_dig* | aAccatattggAtGcaac | 5′-DIG+LNA | 21 |
31prM4_dig | aaaccatattggatgcaac | 5′-DIG | 20 |
33pr5_dig | aacgtgcacaaggtcat | 5′-DIG | 36 |
33prM1_dig | cgtgcacaaggtc | 5′-DIG | 38 |
33prM2_dig | gtgcacaaggtcat | 5′-DIG | 39 |
33prM3_dig | aacgtgcacaaggt | 5′-DIG | 36 |
33prM4mm6T_dig* | gctactacgtgcacaaggtc | 5′-DIG | 31 |
33prM4mm13T_dig | gctacaacgtgctcaaggtc | 5′-DIG | 31 |
35prM1_dig* | cgtgcacaaggccata | 5′-DIG | 38 |
39prM1_dig | ttattggctacataaggccc | 5′-DIG | 25 |
39prM1LA_dig* | ttattggctacaTaaggccc | 5′-DIG+LNA | 25 |
39prM2_dig | ttattggctacataaggccca | 5′-DIG | 25 |
45pr6a_dig | gttacataaggcccag | 5′-DIG | 31 |
45pr7_dig | ccagggccataacaa | 5′-DIG | 43 |
45prM1_dig | ttacataaggccca | 5′-DIG | 32 |
45prM2_dig | gttacataaggcc | 5′-DIG | 31 |
45prM3_dig | ggttacataaggcc | 5′-DIG | 30 |
45prM4_dig | catattggttacataaggccc | 5′-DIG | 24 |
45prM5_dig | gtcatattggttacataaggccc | 5′-DIG | 22 |
45prM6_dig | catattggttacataaggcc | 5′-DIG | 24 |
45prM6LTdig | catattggttacaTaaggcc | 5′-DIG+LNA | 24 |
45prM6LA_dig | cAtattggttacataaggcc | 5′-DIG+LNA | 24 |
45prM6LAT_dig* | cAtattggttacaTaaggcc | 5′-DIG+LNA | 24 |
51prM1_dig* | gctccaccgtgcgc | 5′-DIG | 31 |
52pr3_dig | ccgtactggttacaac | 5′-DIG | 23 |
52pr4_dig | accgtactggttacaac | 5′-DIG | 22 |
52prM1_dig | acccgtactcggttac | 5′-DIG | 22 |
52prM2_dig | accgtactggtta | 5′-DIG | 22 |
52prM3_dig* | aaccgtactggttacaacg | 5′-DIG | 21 |
56pr4a_dig | gcccaaggccataataa | 5′-DIG | 41 |
56prM1_dig* | cgtgcccaaggccata | 5′-DIG | 38 |
58prM1_dig* | gctacagcgtgcacaag | 5′-DIG | 31 |
59prM1_dig* | cacaaggctcagggtttaa | 5′-DIG | 35 |
68prM1_dig* | gctgcacaaggcacag | 5′-DIG | 31 |
大写字母是锁定的核酸(LNA)修饰
DIG是洋地黄毒苷
*=最佳选择寡核苷酸探针
为了评价DEIA的特异性,通过扩增含有HPV基因型6,11,16,18,26,30,31,33,34,35,39,43,44,45,51,52,53,54,55,56,58,59,66,67,68,69,70,71和74的HPV质粒(由E-M.de Villiers博士,R.Ostrow博士,A.Lorincz博士,T.Matsukura博士,和G.Orth博士馈赠),或代表HPV基因型7,40,42,61,72,81,82,83,84,85,87,91和HPV基因型16的2个变体序列的寡核苷酸序列,得到MPF扩增引物。
在50μl的终体积中,进行HPV DNA扩增,其中含有10μl靶DNA,1x PCR缓冲液II(Perkin Elmer),3.0mM MgCl2,0.2mM脱氧核苷三磷酸,10pmol每种正向和反向引物(表1和2)和1.5UAmpliTaqGold(Perkin Elmer,Branchburg,New Jersey,USA)。PCR条件如下:在94℃预热9min,然后是在94℃30秒、在52℃45秒、和在72℃45秒的40个循环,最后在72℃延伸5分钟。
在100μl杂交缓冲液(150mmol/L NaCl,15mmol/L柠檬酸钠,pH7.0,0.1%吐温20)中稀释10微升由生物素化的MPF PCR引物合成的PCR产物,并在抗生物素蛋白链菌素-包被的微量滴定板中在45℃温育30分钟。通过用杂交缓冲液洗涤3次,去除未捕获的物质。通过加入100μl变性溶液(100mmol/L NaOH),使捕获的双链PCR产物变性,并在室温温育5-15分钟,然后用杂交缓冲液洗涤3次。在杂交缓冲液中稀释洋地黄毒苷(DIG)-标记的HPV-特异性探针的混合物(参见表3优选的探针),加入孔中,并在45℃温育45分钟。用严格洗涤溶液(37.5mmol/L NaCl,3.75mmol/L柠檬酸钠,pH7.0,0.025%吐温20)洗涤孔3次,向孔中加入300μl严格洗涤溶液,在45℃温育45分钟。用严格洗涤溶液洗涤孔2次,并用杂交缓冲液洗涤孔2次。随后,加入抗-DIG碱性磷酸酶缀合物,在45℃温育15分钟。洗涤5次后,加入底物,在室温温育15分钟。通过加入100μl 0.5mmol/L H2SO4,终止反应。在微量滴定板读数器中,测量在450nm的光密度(OD)。如果OD45O比阴性PCR对照高2.5倍,则认为样品是阳性的。在每轮中,与临床样品一起测试阴性对照以及阳性和临界阳性对照。
结果
HPV基因型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,和68和HPV基因型16的2个变体序列的所有扩增引物都可与13种选择的探针的混合物反应,而HPV基因型6,7,11,26,30,34,40,42,43,44,53,54,55,61,66,61,69,70,71,72,74,81,82,83,84,85,87,和91的扩增引物保持不被检测到。
讨论
所述的HR MPF HPV DEIA可以同时检测HPV高危基因型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,和68,而其它HPV基因型保持不被检测到。使用在本申请中所述的新开发的引物集合进行通用PCR后,可以检测13种选择的高危基因型。使用其它潜在高危HPV基因型的探针,仍然可以扩展该检测测定。
实施例17:通用MPF HPV DEIA和HR MPF HPV DEIA的灵敏度
简介
本实施例描述了通用MPF HPV DEIA和HR MPF HPV DEIA的分析灵敏度的测定,和与SPF1O检测和分型***的对比。
材料和方法
为了评价通用MPF HPV DEIA和HR MPF HPV DEIA的分析灵敏度,通过扩增含有HPV基因型18,31,33,35,和45的HPV质粒(由E-M.de Villiers博士,R.Ostrow博士,A.Lorincz博士,T.Matsukura博士,和G.Orth博士馈赠)的10倍稀释液,得到MPF扩增引物。
根据Kleter等1998和1999[Kleter,B.,L.J.van Doom,L.Schrauwen,A.Molijn,S.Sastrowijoto,J.ter Schegget,J.Lindeman,B.terHarmsel,and W.G.V.Quint.1999.Development and clinical evaluationof a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay fordetection and identification of anogenital human papillomavirus.J.Clin.Microbiol.37:2508-2517;Kleter,B.,L.J.van Doorn,J.terSchegget,L.Schrauwen,C.van Krimpen,M.P.Burger,B.ter Harmsel,and W.G.V.Quint.1998.A novel short-fragment PCR assay for highlysensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses.Am.J.Pathol.153:1731-1739],进行SPF1O PCR和扩增引物分析。
结果-见下文
使用阴性对照的OD450的2.5倍的边界,通用MPF HPV DEIA和HR MPF HPV DEIA的计算分析灵敏度分别是12-72ag(相当于病毒基因组的约2-15个拷贝的等同物)和48-722ag(相当于病毒基因组的约10-150个拷贝的等同物)。尚未确定检测测试的正式界限。
结果-表20a-e
约1个拷贝
HPV18 | 4.8fg/PCR | 480ag/PCR | 48ag/PCR | 4.8ag/PCR |
SPF10DEIA | + | + | + | + |
SFP10LiPA | + | + | + | + |
MPF DEIA | + | + | + | - |
HR MPFDEIA | + | + | + | - |
20a
HPV31 | 5.6fg/PCR | 560ag/PCR | 56ag/PCR | 5.6ag/PCR |
SPF10DEIA | + | + | + | - |
SFP10 LiPA | + | + | + | - |
MPF DEIA | + | + | + | - |
HR MPFDEIA | + | + | + | - |
20b
HPV33 | 4.9fg/PCR | 490ag/PCR | 49ag/PCR | 4.9ag/PCR |
SPF10DEIA | + | + | - | - |
SFP10LiPA | + | + | +/- | - |
MPF DEIA | + | + | + | - |
HR MPFDEIA | + | + | + | - |
20c
HPV35 | 7.22fg/PCR | 722ag/PCR | 72.2ag/PCR | 7.22ag/PCR |
SPF10DEIA | + | + | + | - |
SFP10 LiPA | + | + | + | - |
MPF DEIA | + | + | + | - |
HR MPFDEIA | + | + | - | - |
20d
HPV45 | 12fg/PCR | 1.2fg/PCR | 120ag/PCR | 12ag/PCR |
SPF10DEIA | + | + | + | - |
SFP10 LiPA | + | + | + | - |
MPF DEIA | + | + | + | + |
HR MPFDEIA | + | + | + | - |
20e
讨论
总之,通用MPF HPV DEIA和HR MPF HPV DEIA具有与SPF1ODEIA和LiPA类似的灵敏度。
Claims (23)
1.对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测和/或分型的方法,所述方法包含下述步骤:
(i)扩增样品中的多核酸片段,其包含任意HPV核酸的B区域或由它组成,所述B区域表示在图1中,和
(ii)使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能与HPV的B区域特异性地杂交的探针,所述B区域表示在图1中。
2.根据权利要求1的方法,其中样品中的扩增的多核酸片段包含任意HPV核酸的D区域或由它组成,所述D区域表示在图1中。
3.根据权利要求2的方法,其中使来自步骤(i)的任意扩增的片段接触至少一种能与HPV的D区域特异性地杂交的探针,所述D区域表示在图1中。
4.根据任一项前述权利要求的对可能存在于生物样品中的HPV进行检测和/或分型的方法,所述方法包含:
(i)使用下述引物,扩增HPV的多核酸片段:
-5’引物,其特异性地杂交于HPV 16的基因组的‘A’区域,所述‘A’区域表示在图1中,和
-3’引物,其特异性地杂交于至少一种HPV类型的基因组的‘C’区域,所述‘C’区域表示在图1中;
(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段与至少一种探针杂交,所述探针能与HPV的‘B’区域或‘D’区域特异性地杂交,所述区域表示在图1中。
5.根据任一项前述权利要求的方法,其中所述探针能特异性地杂交仅一种HPV类型的基因组的D或B区域。
6.根据权利要求1的方法,其中所述探针选自在表4,5-14,17,18,19中或在任意实施例中列出的序列组成的列表。
7.根据任一项前述权利要求的方法,其中所述扩增步骤使用选自下组的引物:HPV-MPF1F1,HPV-MPF1F2,HPV-MPF1F3,HPV-MPF1F4,HPV-MPF1F5,HPV-MPF1F6,HPV-MPF1F7,HPV-MPF1F8,HPV-MPF1F9,HPV-MPF1F10,HPV-MPF2R1,HPV-MPF2R2,HPV-MPF2R3,HPV-MPF2R4,HPV-MPF2R5,HPV-MPF2R6,HPV-MPF2R7,HPV-MPF2R8。
8.根据任一项前述权利要求的方法,其中在分型步骤之前,证实样品中存在HPV核酸。
9.根据任一项前述权利要求的方法,其中探针和靶之间的杂交在有固体支持物存在下进行。
10.根据权利要求9的方法,其中所述杂交步骤使用反向杂交形式。
11.根据权利要求9的方法,其中所述探针直接或间接附着在珠子上,任选荧光珠。
12.根据权利要求11的方法,其中使用流式细胞术分析杂交的检测。
13.包含至少2种引物的试剂盒,所述引物适用于扩增来自HPV基因组的B或D区域的核酸。
14.根据权利要求13的试剂盒,其中所述引物选自:HPV-MPF1F1,HPV-MPF1F2,HPV-MPF1F3,HPV-MPF1F4,HPV-MPF1F5,HPV-MPF1F6,HPV-MPF1F7,HPV-MPF1F8,HPV-MPF1F9,HPV-MPF1F10,HPV-MPF2R1,HPV-MPF2R2,HPV-MPF2R3,HPV-MPF2R4,HPV-MPF2R5,HPV-MPF2R6,HPV-MPF2R7和HPV-MPF2R8。
15.包含至少2种探针的试剂盒,所述探针能特异性地杂交于HPV基因组的D区域或B区域。
16.根据权利要求15的试剂盒,其中所述探针是选自表4,5-14,17,18,19中的任一个或任意实施例的任意2种探针。
17.试剂盒,其包含表1或2的任意引物、或表3的任意探针、和用于实现上述HPV鉴别和分型分析的方法的说明书。
18.试剂盒,其包含附着在固体支持物上的能特异性地杂交于HPV基因组的D区域或B区域的探针。
19.根据权利要求13-17之一的试剂盒,其另外包含表3的任意探针。
20.适用于权利要求1-12之一的方法的探针,所述探针选自表3,4,5-14,17,18,19或任意实施例。
21.HPV探针集合,该集合包含至少5种选自下述的探针:表3的DEIA探针;表3的优选的DEIA探针;表4的探针;表17的探针;表18的探针;表19的探针。
22.根据权利要求21的HPV探针集合,其包含至少8种来自每个组的探针。
23.适用于权利要求1-12的方法的引物,所述引物选自表1和2。
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