CN101156967A - 丝素蛋白多孔管的制备及用途 - Google Patents

Abstract

丝素蛋白多孔管的制备及用途，涉及生物材料领域，具体涉及到组织工程支架领域。本发明是将30％－50％高浓度的丝素水溶液置于容器中，溶液在电压为500V－60kV的静电力作用下，形成直径为200nm－3000nm的丝素纤维，用旋转的金属棒或管接收丝纤维，接收距离为5－100cm，5－480min后就能在金属棒上得到管径为1－10mm、壁厚为0.01－1mm、长度不低于30cm的丝素多孔管。然后用90％－100％甲醇水溶液处理使其变性，经常温真空干燥后得到非水溶性的丝素蛋白多孔管。本发明的丝素管管径可控，兼有的生物相容性和多孔性利于细胞生长，可用于组织工程支架，且制备过程简单易行，成本低，可实现商业化生产。

Description

丝素蛋白多孔管的制备及用途

技术领域

本发明为制备具有良好生物相容性的丝素蛋白多孔管的新方法，涉及生物材料领域，具体涉及到组织工程支架领域。

背景技术

近年来，动脉硬化等血管闭塞性疾病的发病日渐增多，需要进行血管移植手术的病人也越来越多。由于异体血管的排异反应以及自体血管的有限性，移植手术所用的血管多来源于人造血管。目前，直径大于6毫米，特别是大于10毫米的人造血管已经实现了商品化，而小于6毫米的小口径血管则成为一个国际性难题，其主要原因在于血栓的形成和新生内膜的增厚，导致血管堵塞，而使移植失败。在中小直径的人造血管中，过去多使用ePTFE(膨化聚四氟乙烯)和Dacron(涤纶)，但其血管顺应性较差，临床资料表明ePTFE人造血管通畅率仅为30％。

1987年美国自然科学基金工程理事会在生物工程研讨会上提出了组织工程概念，为小口径血管的制备提供了一个新的思路，即“应用工程学和生命学的原理和方法来了解正常的和病理的哺乳类动物的组织结构-功能的关系，并研制生物组织代用品，用于修复、维持和改善人体组织的功能”。对于血管来说，由于合成材料在体内长期使用会对人体带来负面影响，制备一种能修复和替代原有的小口径血管显得尤为必要。组织工程的基本原理和方法是，将体外培养的高浓度组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(ECM)材料上，形成细胞-生物材料复合物。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行新陈代谢，使细胞按预制形态的三维支架生长；然后将这种复合体植入机体所需部位。种植的细胞在生物支架降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有原来特殊功能和形态的相应组织和器官，从而可达到修复组织外形和功能重建的目的。理想的组织工程支架材料或细胞载体应具有以下条件：①良好的生物相容性；②适宜的生物降解性；③有效的表面活性；④一定的可塑性；⑤具有三维多孔结构。组织在体内常为三维空间构型，给细胞的生长提供了适宜的营养条件和空间条件，有利于组织发挥特定的生理功能。因此，植入物的设计应主要考虑载体材料的空间构型，如孔的尺寸、孔之间的连通性、材料内部的表面积等。开孔材料表面可以比普通的材料表面更有利于细胞伪足的攀附，增加细胞层与基底材料之间的物理作用力。基底材料上的开孔有利于水分、无机盐以及其它营养物质和细胞代谢产物的运输和交换，从而更有利于细胞的正常生长和生理代谢。为了进行多层细胞的体外培养，如何制备三维多孔结构的细胞载体材料已成为材料科学研究的热点。目前，应用在组织工程中的主要结构形式有纤维支架和多孔泡沫两种。

组织工程支架的制备方法主要有纤维编织法，盐析法，气体发泡法，熔融成型法，相分离法、冷冻干燥技术以及静电纺丝等方法。对于血管组织工程支架来说，不仅需要材料具备良好的生物相容性，实际应用中还需要将支架制备成呈三维管材。目前，制备多孔管状支架的方法多为编织法，低温挤出成形，多孔膜绕成圆柱状后喷涂聚合物溶液，模具中冷冻干燥成型。静电纺丝作为一种制备多孔材料有其独特的优点，其过程是：溶液在电场力的作用下分化成纳米到微米级的纤维，溶剂在到达接收装置的过程中挥发掉，所得到的纤维在接收装置表面相互搭接而成多孔材料。近来，用静电纺丝的方法制备基因重组蜘蛛丝蛋白管状支架已有报道。

丝素蛋白作为天然生物蛋白，以其优异的生物相容性，低炎症反应性和良好的力学性能，受到生物材料界广泛的研究。在生物医学领域，丝素作为手术缝合线已有几百年的历史，在人造皮肤，人造韧带，人造骨，人造血管，药物缓释材料以及酶固定化材料方面已取得了一系列的基础研究成果，显示了巨大的应用潜力。由于丝素蛋白支链有细胞生长和黏附因素，且可以通过再生制得纳米级到微米级的蛋白纤维，与体内组织结构相似，因此在组织工程领域也得到广泛的研究。

丝素蛋白不仅拥有优异的生物相容性，而且价廉易得，使得丝素蛋白受到更为广泛的关注，更利于商业化生产。丝素蛋白通过各种不同的方法，包括静电纺丝，冷冻干燥，盐析法等制备成多孔支架，但是丝素蛋白多孔管的制备尚没有报道。由于丝素蛋白的特殊理化性质，通过模具难以制备出均匀的管材。而丝素蛋白的静电纺丝已经研究的比较全面，而且研究证明由静电纺丝法制备的丝素蛋白无纺布适于细胞生长繁殖。

本文通过直接用静电纺丝的方法将丝素水溶液制备成多孔管。这种方法综合了丝素水溶液纺丝的优点以及避免了由膜制管过程中交联剂的使用，使制备过程简单易行。制备出的丝素管管径可控，兼有良好的生物相容性及多孔性利于细胞生长，有望用于组织工程血管支架。

发明内容

本发明的目的是为了制备丝素蛋白多孔管支架，以利用丝素蛋白良好的生物相容性，以及电纺丝纤维所具有的高比表面积，从而开发丝素蛋白多孔管在组织工程支架领域的应用，包括血管组织工程支架、气管组织工程支架、尿道组织工程支架及其他管状支架。

本发明是这样实现的：

制备高浓度的丝素蛋白水溶液同专利“不溶性丝素蛋白薄膜及丝素蛋白管的制备”(专利号为03131142.3)，即白厂丝经脱胶、溶解、透析、抽滤、浓缩得到浓度为30％-50％(w/w)的丝素蛋白水溶液。

本发明将30％-50％(w/w)高浓度的丝素蛋白水溶液置于容器中，溶液在电压为500V-60kV的静电力作用下，形成直径为200nm-3000nm的丝素蛋白纤维，用旋转的金属棒或管接收丝纤维，接收距离为5-100cm，5-480min后就能在金属棒上得到管径为1-10mm、壁厚为0.01-1mm、长度不低于30cm的丝素多孔管，然后用90％-100％(v/v)甲醇水溶液处理使其变性，经常温真空干燥后得到非水溶性的丝素蛋白多孔管。所使用的金属棒或管的直径及长度根据需要可调。所制备的丝素蛋白多孔管用于组织工程支架，包括血管组织工程支架、气管组织工程支架、尿道组织工程支架及其他管状支架。

制备出的丝素蛋白多孔管取其中的样品用扫描电子显微镜观察其微观形貌，用傅立叶变换红外光谱，X射线衍射测定材料中丝素蛋白的结构，并对管材进行力学性能分析。测试结果表明材料中丝素蛋白主要为无规线团结构，干态拉伸强度不小于0.37MPa，断裂伸长率23.3％，用甲醇进行后处理后silk II结构增加，材料不溶于水，湿态下拉伸强度为1.17MPa，断裂伸长率82.2％，弹性模量为3.6MPa，显示出了良好的韧性。

本发明的优点是：

1.直接制备出了丝素蛋白多孔管，避免了有机粘结剂的使用以及丝素模具加工难的问题。

2.采用静电纺丝的方法，工艺简单，耗量少，易实现商业生产。

3.丝素蛋白水溶液纺丝，安全环保，避免有机溶剂的使用，生物相容性好，且成本低。

4.制备出的丝素蛋白多孔管具有高孔隙率，孔具有好的连通性，利于细胞生长，营养物质传输。

故本发明对丝素蛋白多孔管在生物医学上的应用具有重大意义和实用价值。

附图说明

图1-是本发明的丝素蛋白多孔管的宏观图。

具体实施方式

实施例1：

将蚕丝在0.5％(w/w)的Na₂CO₃溶液中100℃下煮60min以脱去蚕丝表层的丝胶蛋白，脱胶后的丝素蛋白用蒸馏水多次洗涤后干燥，获得纯的丝素蛋白。将一定量的丝素蛋白溶于CaCl₂/H₂O/CH₃CH₂OH(摩尔比为1∶8∶2)三元溶液或其它浓盐溶液中，在蒸馏水中透析三天以除去溶液中的氯化钙和乙醇，过滤溶液即得到浓度为3％(w/w)的丝素蛋白水溶液。

实施例2：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：500mL纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌18h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为30％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：采用直径为4mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到丝直径在700nm左右，厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥24h得到厚度为0.2mm，管内径为4mm的丝素蛋白多孔管。

实施例3：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：500mL纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌22h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为50％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：采用直径为4mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到丝直径为2500nm，厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥24h得到厚度为0.2mm，管内径为4mm的丝素蛋白多孔管。

实施例4：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：采用直径为1mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到丝直径在2000nm左右，厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥24h得到厚度约为0.2mm，内径为1mm的丝素蛋白多孔管。

实施例5：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：采用直径为10mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥24h得到厚度约为0.2mm，内径为10mm的丝素蛋白多孔管。

实施例6：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：采用直径为4mm，长度为20mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥后得到内径为4mm，厚度约为0.2mm，长度为20mm的丝素蛋白多孔管。(见图1)

实施例7：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：直径为4mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，2h后，金属棒上接收到厚度约为0.4mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于90％甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥后得到厚度约为0.2mm，内径为4mm的丝素蛋白多孔管。

实施例8：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：直径为4mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，5min后，金属棒上接收到厚度约为0.01mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥后得到内径为4mm，厚度约为0.005mm，长度为300mm的丝素蛋白多孔管。

实施例9：

制备纯的丝素蛋白水溶液如实施例1所示。

1.纺丝液制备：纯丝素蛋白水溶液在70℃下加热搅拌20h，搅拌速度为50rpm，得到浓度为40％的丝素蛋白水溶液。

2.静电纺丝过程：直径为4mm，长度为300mm的金属棒旋转接收，旋转速度为5rpm，接收距离为20cm，针头处电压为20kV，纺丝速度为0.15mL/min，480min后，金属棒上接收到厚度约为1mm的蓬松状丝素蛋白纤维。

3.多孔管形成：蓬松状丝素蛋白纤维置于甲醇溶液中处理1h，常温真空干燥后得到内径为4mm，厚度约为0.5mm，长度为300mm的丝素蛋白多孔管。

Claims (4)

1.丝素蛋白多孔管的制备及用途，其特征在于：将30％-50％(w/w)高浓度的丝素蛋白水溶液置于容器中，溶液在电压为500V-60kV的静电力作用下，形成直径为200nm-3000nm的丝素蛋白纤维，用旋转的金属棒或管接收丝纤维，接收距离为5-100cm，5-480min后就能在金属棒上得到管径为1-10mm、壁厚为0.01-1mm、长度不低于30cm的丝素多孔管，然后用90％-100％(v/v)甲醇水溶液处理使其变性，经常温真空干燥后得到非水溶性的丝素蛋白多孔管。

2.丝素蛋白多孔管的制备及用途，其特征在于：所制备的丝素蛋白多孔管用于组织工程支架。

3.如权利要求1所述的丝素蛋白多孔管的制备及用途，其特征在于：所使用的金属棒或管的直径及长度根据需要可调。

4.如权利要求2所述的丝素蛋白多孔管的制备及用途，其特征在于：组织工程支架包括血管组织工程支架，气管组织工程支架，尿道组织工程支架及其它管状支架。

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